pruebas de diagnostico veterinario

PATOLOGIA CLINICA Integrantes:

Magda GarzónVerónica ObandoEdwin TapiaBladimir PantojaFernando Portillo Julio Rubio

Profesor: Carlos Alberto Chávez

Universidad de Nariño

SERODIAGNÓSTICO Técnica de laboratorio que permite

mediante la formación de reacciones inmunológicas provocadas en el suero sanguíneo (pruebas serológicas) determinar la aparición de anticuerpos, frente al agente infectante.

http://serologiade.blogspot.com.co/

SEROLOGÍA Es un examen de sangre que se utiliza

para detectar la presencia de anticuerpos contra un microorganismo. En los análisis serológicos se buscan anticuerpos específicos producidos por el sistema.

http://www.suizavet.com/toma-de-muestras.php

Las respuestas inmunitarias contra la mayoría de los antigenos inducen la producción especifica de anticuerpos y linfocitos T efectores.

Este reconocimiento entre el antigeno – anticuerpo o linfocito sienta las bases del diagnostico inmunológico.

SEROLOGIA La medición de las interacciones

Antigeno- Anticuerpo con fines diagnósticos.

Se realizan en 2 vías: Utilización de anticuerpos específicos

para detectar el antigeno.(diagnostico directo)

Utilización de antigenos específicos para detectar anticuerpos. (diagnostico indirecto)

La reacción entre el Ag y el Ac es de naturaleza física y química.

La fuerzas que los mantienen unidos, son de tipo no covalente, como la atracción electrostática, los puentes de hidrógeno y las fuerzas de Van der Waals.

CARACTERÍSTICAS

• Es la fuerza de unión entre el Ac con su Ag

• Determina la atracción entre ellos.

• Esa fuerza es la suma de las fuerzas de los enlaces que intervienen en la unión.

AFINIDAD DEL ANTICUERPO

Es una medida de la fuerza de unión y estabilidad del complejo: Ag multivalente – Ac multivalente.

• Ac multivalentes: Tienen más de un punto de unión para Antígenos.

• Ag multivalentes: Tienen varios determinantes antigénicos (más de un punto de unión para los Ac).

• La fuerza de unión es mayor que la suma de las afinidades de cada uno de los puntos de unión

AVIDEZ DEL ANTICUERPO

ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO • Si un anticuerpo reacciona solo con un

Ag: Es muy específico. • Si un Ac reacciona con varios Ag:

Tiene una especificidad baja. Se habla de REACTIVIDAD CRUZADA.

• Esto ocurre porque varios antígenos tienen uno o más determinantes antigénicos iguales o similares, capaces por tanto de unirse al mismo Ac.

TOMA DE MUESTRA Muestra: suero.Se debe obtener en forma aséptica.No usar anticoagulante.Dejar coagular la sangre en forma

inclinada.No refrigerar hasta que el coagulo se

haya retraído.Transportar en refrigeración.Almacenar el suero en congelación.

VOLUMEN RECOMENDADOLa cantidad de sangre que se obtendrá depende de la especie animal:

Bovinos 10 ml.Equinos 10 ml.Cerdos 5 ml.Ovinos y caprinos 5 ml.Pollos 1 ml.Gallinas 2 ml.Perros y gatos 2 – 3 ml.

REACTIVOS ANTIGENOS. Constituidos por el microorganismo o

parásito.1. Antigenos crudos: presentan el

inconveniente de dar reacciones heteroespecificas.

2. Antigenos puros.3. Antigenos altamente purificados: Anticuerpos monoclonales. Gérmenes recombinantes.

BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO Los sueros deben estar en buenas

condiciones no hemolisados. El suero debe agitarse suavemente, pues

los anticuerpos sedimentan. Los antigenos deberán conservarse en

refrigeración. Realizar controles de calidad a los

antigenos, periódicamente. Monitorear la temperatura del laboratorio

(18 – 26 grados centigrados)

BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO El tiempo de incubación debe

controlarse con precisión. No se debe mantener los reactivos a

temperatura ambiente mas de lo necesario.

Manejar los materiales que se usaron como si fueran infecciosos.

Utilizar controles positivos y negativos. No se debe hacer modificaciones al

protocolo de la prueba recomendado.

CARACTERISTICAS DESEABLES EN LAS PRUEBAS DE INMUNODIAGNOSTICO

Utilizar pequeñas cantidades de reactivos.

Sensibles y especificas. Reproducible.(Ínter laboratorios) Antigenos inactivados. Sencilla. Equipo y reactivos accesibles,

económicos.

CATEGORIAS DE LAS PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS1. Pruebas de unión primaria. Miden la cantidad de

inmunocomplejos (unión antigeno-anticuerpo), utilizando radioisótopos, colorantes fluorescentes o enzimas.

ELISA Inmunofluorescencia.

PRUEBAS DE UNION SECUNDARIA Los complejos se agregan y originan

fenómenos perceptibles visualmente. Son reacciones no reversibles.

Dependen en gran medida del estado físico del antigeno, de la temperatura, de los electrolitos presentes en la reacción, de la afinidad y avidez en la interacción antigeno-anticuerpo, proporción entre ambos, tipo de inmunoglobulina presente.

CATEGORIAS DE PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS2. Pruebas de unión secundaria: La reacción antigeno – anticuerpo va

seguida de una segunda reaccion. Si el antigeno es soluble la reacción

que se da es de precipitación. Si el antigeno es particulado

(suspensión) la reacción es de aglutinación.

Son de menor sensibilidad que las primarias, pero mas clásicas.

PRUEBAS DE UNION SECUNDARIA Aglutinación: en placa, en tubo. Precipitación: Inmunodifusion en agar,

inmunoelectroforesis Hemoaglutinación. Inhibición de la hemoaglutinación. Fijación de complemento. Neutralización y Seroneutralizacion

realizadas in vitro.

CATEGORIAS DE PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS Pruebas de unión terciaria. Evalúan la capacidad de los anticuerpos

de neutralizar la capacidad biológica de un antigeno ( virus, toxinas).

Identificación de toxinas. Identificación de virus Medir la actividad de un anticuerpo para

neutralizar a un microorganismo. Pruebas de protección (anticuerpos)

Se basan en la medición de las manifestaciones biológicas que el sistema inmune desarrolla frente a un antígeno en el animal, incluyendo la evaluación del efecto protector real de los anticuerpos o su capacidad de neutralizar la acción biológica del antígeno.

OBJETIVOS DE LA SEROLOGIA

Identificación de problemas de salud. Determinación de la distribución de una

enfermedad. Determinación de la incidencia y

prevalencia de una enfermedad. Evaluación del sistema inmune del

individuo o de una población. Medición de la inmunidad materna. Programación de calendarios de

vacunación. Evaluación de programas o campañas de

vacunación.

patología clínicaserología

HEMOAGLUTINACION

CONCEPTOS

hemaglutinación

Rta inmune

serologia

diagnostico

Inmunidad

ANTICUERPOS Y HEMAGLUTINACIÓN

La aglutinación es un agregado de células o partículas debido a una formación entrelazadas, En las reacciones de aglutinación, un anticuerpo puede unirse a la vez a dos antígenos, así mismo cada antígeno puede unirse a varios anticuerpos y formar un entramado de complejos antígeno-anticuerpo.

ANTÍGENOS

RX AG----AC Anticuerpos policlonales y monoclonales

HEMAGLUTINACIÓN

Dos fases básicas:

1.- Rx Ag---Ac2.- partículas agregadas

HEMAGLUTINACIÓNEn estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos etc.

Hemoaglutinación directa

La presencia de antígenos en la superficie de los glóbulos rojos se puede detectar por la hemoaglutinación producida cuando se añade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antígenos.

• identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes: anti-A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habrá aglutinación cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero añadido. De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinación de los distintos grupos Rh.

Hemoaglutinación indirecta

Se basa en el principio de la inhibición de la hemoaglutinación. Para su realización se precisan glóbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar.

Incompatibilidad en las transfusiones de

sangre

aglutinación

Grupo A: Tiene proteína A en la superficie del glóbulo rojo. Grupo B: Tiene proteína B en la superficie del glóbulo rojo.

Grupo AB: Tiene ambas proteínas A y B. Grupo O: No tiene ninguna (A o B) en la superficie del glóbulo rojo

E.L.I.S.A Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay

https://www.pig333.com/3tres3_common/art/pig333/4500/company_news_4500_ELISAjpg

Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el campo de la microbiología y parasitología, por los grupos de Alister Voller y Dennis Ruiteberg en el Institutr of Public Health del estado de Dutch.

Voller y Bidwell introdujeron el uso de placas de 96 pocillos.

IMPORTANCIA Son Utilizados en el Dx Medico, la industria

de alimentosy el estudio y control del medio ambiente.

En estudios Serologicos, hematológicos, endocrinológicos, oncologicos en los transplantes. En M. forence y Antropologia.

Con propósitos médicos se han utilizado en la determinación de hormonas y Proteinas Plasm., Ag tumorales, drogas, Ag y Ac de m.o. parasitos, hongos, bacterias y virus.

Los resultadoselementos Dx, Info de Enfm. y coadyuvan a la planificación del Tto.

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAS.

El ELISA se basa e el uso de Ag o Ac marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática.

Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción Ag-Ac quedará inmovilizada

Fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

Modelo analítico que depende de la Rx Ag-Ac Determinacion de (Ag) o un (Ac) mediante el

uso de uno de ellos inmovilizado en fase solida y el otro en solución

Cualitativo, cuantitativo Dependiendo del diseño se puede emplear

Ag, hatenos o Ac marcados con una enzima para revelar Ag, Ac, hormonas o fármacos presentes en fluidos corporales.

El producto de la Rx puede ser detectado y cuantificado mediante marcador enzimático con un sustrato apropiado.

PRINCIPIO BASICO La Rx consiste: Al suero problema se le

agrega un conjugado que son Ac dirigidos contra Ac especificos o Ag. Los cuales se unirán a una enzima.

Las enzimas son capaces de modificar al sustrato en presencia de un cromógeno produciendo un producto coloreado que es detectado visualmente o por espectofotometria.

TIPOS DE ELISA

Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sándwich

Doble (DAS) Heterólogo (HADAS)

Antígeno marcado ELISA competitivo

CARACTERISTICAS Aalta Sensibilidad y Especificidad,Sencillo, bajo costo

reproducible y adaptable Versatil. SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la tecnica

para detectar las menores concentraciones posibles de los anticuerpos(o antigenos) buscados

ESPECIFICIDAD: expresa la capacidad de esta tecnica para diferenciar los anticuerpos especificos(o antigenos) buscados de otros presentes en el material de estudio.

Consigue mediante el uso de fase solida una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

Puede detectar sustancias en el orden de los nanogramos y picogramos/ml

Automatizacion

Poca cant. de muestra, suero problema (ul)

Enzimas de menor costo y seguras para el operador

Menor tiempo Mas estables, mayor periodo de validez Pureza, estabilidad y cant del Ag Pureza y calidad del Ac conjugado

PASOS GENERALES DE UN ELISA. 1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo. 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de

antígenos o anticuerpos. 3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo

o antígeno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o

anticuerpo no unido 5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no

unida 8. Adición del substrato 9. Unión del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:

ELISAs para detectar Ag: ELISAs sándwich.

ELISAs para detectar Ac: ELISAs indirectos.

LECTURA

DISEÑOS COMPETITIVO

Con reactivo limitante, para dosificar partículas pequeñas con relativa pureza en una muestra y pueden ser marcados con una enzima

Detectan Ac específicos independientemente de su isotipo

NO COMPETITIVOTambien llamado inmunometrico “Reactivo

en exceso” (Inmunopatologia de Enf. Infecciosas)

Detectan Ag y Ac

FASE SOLIDA Se puede utilizar 2 tipos de ustancias: Las que favorecen la adsorción física

(por fuerzas electrotaticas) de las mol. De Ag o Ac: Poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y silicona

Las que permiten fijación covalente de eos reactivos: Acrilamida, celulosa e isotiocianato

Tubos, placas de microtitulacion requieren menor cantidad de reactivos, muestra y son aptas para la automatización

INMUNOREACTIVOS Clasificacion

Solubles: Proteinas, Glicoproteinas , CHOS y Acidos Nucleicos: Unidos a fase solida (Adsorcion)(Union covalente)(adsorción-fijación—Glutaraldehido)

Particulados: Celulas

REACTIVOS Ag Por sensibilidad es necesario contar con

un Ag purificado y estable que asegure la reproducibilidad

Ag parasitario= Mezclas complejas de macromoléculas inmunogenicas entre las que se hallan Ag específicos y sust. Ag que provienen del medio de cultivo o del huésped

La puruficacion de Ag ha mejorado sustancialemente con empleo de Ing. Genetica, AcMo y sueros

MARCADORES Enzimaticos (Ps Alcalina,Peroxidasa) Fluorescentes (Fluoroinmunoensayo) Ligandos (Biotina, Avidina) Luminiscentes (Luminoinmunoensayo) Particulas (Liposomas) Espectofotometria Fluorescencia Quimioluminiscencia (Luminol) Electro-quimica

ENZIMAS Actividad especifica Pureza Estabilidad Solubilidad Facil medición y detección No se reduce la actividad por la conjugación Bajo costo Estables en amplio intervalo de condiciones

del ensayo Con grupos funcionales adecuados para su

acción Ac o Ag

LAVADOS Luego de la incorporación de cada

componente (Ag-Ac conjugado, sustrato enzimático), debe efectuarse una serie de lavados con el fin de eliminar el exceso que no se le haya fijado (físico-inmunológico) al sopsorte solido

Dependiendo del ensayo, habitualmente se realizan de 3 a 6 en c/u de las etapas

El tiempo también depende del ensayo Como solución se emplea buffer pH 7,2

que tiene además Tween 20, el cual facilita la separación de las sustancias actuando como humectante, detergente y fungicida

INTERPRETACION CUALITATIVA

INTERPRETACION CUANTITATIVA

PRUEBAS SEROLOGICAS

FIJACION DEL COMPLEMETO

www.lookfordiagnosis.com

JULES BORDET (1870-1961) Nació en Soignies el

13 de junio de 1870.

La reacción de fijación del complemento -- (antes “alexina”) descrita por Bordet (fenómeno de Bordet, o fenómeno de Bordet-Gengou)

http://www.historiadelamedicina.org/bordet.html

FIJACION DEL COMPLEMENTO Método de elección para el Dx indirecto

de enfermedades infecciosas importantes en veterinaria: brucelosis, paratuberculosis.

Posee alta especificidad y sensibilidad.

Tiene como fundamento la utilización de una cantidad precisa de complemento sérico (cobayo) – se utiliza de manera total en presencia de la reacción de un Ag con su Ac homologo.

www.scielo.org.co

Una segunda parte de la prueba consiste en: una suspensión de glóbulos rojos de carnero (sensibilizados con Ac anti-globulos rojos) – en el complemento producen hemolisis del glóbulo rojo dando un fenómeno claramente visible.

Si en la primera fase la reacción del complemento presente se utiliza, en la segunda fase no hay complemento y el fenómeno hemolítico no ocurre.

Pero si en la primera fase el complemento no se utiliza porque no hay reacción Ag-Ac el complemento queda libre y se utiliza en la segunda fase dando un fenómeno visible de hemolisis.

http://es.slideshare.net/cocogonzalez790/brucelosis-46381424

Son pruebas de tipo cuantitativas – determinar concentraciones del Ac

Son complicadas y de mayor duración que otras pruebas serológicas. Se emplean en el Dx de algunas infecciones (brucelosis, perineumonía contagiosa virus respiratorio sincitial etc.)

http://es.slideshare.net/bill12/pruebas-serologicas-14841066

INMUNOFLUORECENCIAINMUNOFLUORECENCIAINMUNOFLUORECENCIAINMUNOFLUORECENCIA

1954

1940

Albert H. Coons

Desarrollo de la Inmunofluorecencia

1912-1978

McDevitt,t , memorias biográficas de la Academia Nacional de Ciencias.

Fluorocromo

Isotiocianato de fluoreceina Isotiocinato de tetrametilrodamina

INMUNOFLUORECENCIA

MICROSCOPIO

lámparaFiltroExcitación

Filtro de barrido

Lente ocular

Espejo dicroico

Lente objetivo

Fluorocromo Longitud de onda de absorción (nm)

Longitud de onda de emisión (nm)

Cascade blue 374-403 422-430

Fluoresceína (FITC) 494 520

Rodamina (TRITC) 540 570

Naranja de acridina 460-502 526-650

Yoduro de propidio 536 617

Uso uso

INMUNOFLUORECENCIA

Directa Indirecta Citometría de flujo

INMUNOFLUORECENCIA DIRECTA FUNDAMENTO

Inmunofluorescencia Directa

INMUNOFLUORECENCIA DIRECTA

Ventajas desventajas

RápidaAmplificación

mínima

Unión especifica

duracion

Marcaje

APLICACIONES RABIA CAMPYLOBACTER LISTERIA CLOSTRIDIUM MICOBACTERIUM

INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA FUNDAMENTO

INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA

APLICACIONES ViLeF DISTEMPER IBR LEUCOSIS RABIA Síndrome Respiratorio y Reproductivo

Porcino (PRRS) DEL VIRUS DE NEWCASTLE Y GUMBORO

Ventajas desventajas

Sensibilidad No cultivosRapida

CostoTrabajopersonal

Citometría de flujo:

Análisis de células Núcleos Cromosomas mitocondrias otras partículas en suspensión

Utiliza Ac monoclonales fluorescentes para la detección de Ag de superficie celular mediante un láser de luz que separa específicamente las células marcadas.

UN CLITÓMETRO DE FLUJO TIENE CINCO COMPONENTES La celda de flujo laminar,. Un sistema de medición --los sistemas ópticos. Un sistema de iluminación lámparas (Hg, xenón)

láseres (argón, criptón, tinturas), láseres (de argón ), láser rojo de helio-neón , verde de helio-neón, ultravioleta de helio-cadmio; láseres de diodo (azul, verde, rojo, violeta).

Un detector y un conversor de señales, ----computador.

Un sistema de amplificación, lineal o logarítmico.

Un ordenador para el análisis de las señales

VENTAJAS Rápida Sencilla Suficientemente sensible Económica Fácil 

APLICACIONES

lupus eritematoso sistémico identificación precoz del rechazo en

pacientes que han recibido un trasplante anemia aplásica enfermedades inmunológicas del pulmón Leucemias

Si bien la citometría de flujo no se aplica mucho en veterinaria, su uso en futuro cercano aumentará de manera considerable en la medida que sea difundida la posibilidad de su aplicación en otras especies distintas a pequeños roedores

BIBLIOGRAFIA Lequin. R.M. Enzyme Inmunoassay (EIA),

Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemestry. 2005

Van Weemen, B.K. The Rise of EIA/ELISA Clinical Chemestry. 2005

Yuan, Y.; Wang, W.; Chiou, N.-R.; Epstein, A.J.; Lee, L.J. Design and Testing of a

Microfluidic Biochip for Cytokine Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Biomicrofluidics 2009