practica 12-citoquininas-prueba de expansion de cotiledones de rabano

PRCTICAS DE FISIOLOGA VEGETAL

CITOQUININAS -PRUEBA DE EXPANSIN DE COTILEDONES DE RBANO

1. INTRODUCCIN

El trmino citoquinina surgi como nombre genrico de una serie de sustancias, naturales

o sintticas, capaces de estimular la divisin celular (citocinesis). Actualmente sabemos que las

citoquininas, como las restantes hormonas vegetales, ejercen un amplio abanico de efectos

sobre el desarrollo de las plantas. As por ejemplo se ha comprobado que son eficaces en la

formacin de yemas en cultivo de tejidos de meristemo de tabaco y en el aumento del tamao

de hojas, debido a la elongacin de las clulas. Adems se observ su efecto en la dominancia

apical, la cual logr vencerse mediante aplicaciones de quinetina en el guisante (Pisum

sativum). Tambin se ha visto que retrasan la senescencia foliar y que promueven la

maduracin de cloroplastos y la movilizacin de nutrientes.

El descubrimiento de las citoquininas se logr en 1956, cuando F. Skoog y sus

colaboradores (Universidad de Wisconsin) aislaron la quinetina a partir del DNA de esperma de

arenque tratado en autoclave. Aunque la quinetina tiene gran actividad biolgica, no es

sintetizada por las plantas. La primera citoquinina natural se aisl en 1963 por Millar y recibi el

nombre de Zeatina.

Lehman (1968) estableci la prueba de expansin de cotiledones de rbano que se

basa en la respuesta de crecimiento que stos presentan ante las citoquininas. Es bastante,

rpida, slo 3-4 das, y resulta muy apropiada para probar gran nmero de muestras. Lehman

la utiliz ampliamente al aislar citoquininas naturales. Adems de fomentar la divisin celular,

las citoquininas influyen en la diferenciacin de los cultivos. Interactan con las auxinas para

mostrar expresiones diferentes de crecimiento. Skoog y Millar (1957) demostraron in vitro el

modo en que cualquier cambio en el equilibrio citoquininas/auxinas puede afectar a las

expresiones del crecimiento en los cultivos de tejidos.

2. OBJETIVOS

a) Conseguir semillas de rbano germinadas y libres de contaminacin.

b) Preparar diluciones seriadas a partir de una solucin stock de quinetina (100 mg/ml)

c) Observar los efectos de la quinetina.

3. MATERIAL

Semillas de rbano (Raphanus spp.)

Solucin de hipoclorito sdico al 10%

Solucin stock de quinetina (100 mg/l)

Vaso de precipitado de 50 o 100 ml

Pipeta de 10 ml

Probeta de 100 ml

Balanza

Pinzas metlicas

Cmara de flujo laminar

Placas de Petri estriles

Cuchilla enmangada

Cmara de germinacin (25C)

Cmara de cultivo (25C)

4. METODOLOGA

Las semillas de rbano (100-120 semillas) se desinfectan durante 5 min. con hipoclorito

sdico al 10% y se lavan 3 veces con agua destilada estril. Se siembran, trabajando en la

cmara de flujo laminar o en la encimera cerca de un mechero encendido, en una placa de

Petri provista de una base de papel de filtro estril. Se cubren a continuacin con otro disco

estril, se humedecen con 10 ml de agua destilada y se dejan germinar en la cmara de

germinacin a 25C y en oscuridad durante tres das.

Transcurrido ese tiempo se seleccionan plntulas uniformes a las que se les elimina el

hipocotilo, obtenindose los cotiledones. Es muy importante la uniformidad de stos. Cada

cotiledn se separa y se va depositando en una placa de Petri con disco de papel estril y

humedecido con agua destilada. Por supuesto, todo el proceso se har en condiciones de

esterilidad.

Se preparan diluciones de quinetina a partir de la solucin stock (100 mg/l) hasta obtener

concentraciones de 10, 1, 01 y 0,001 mg/l. Se aaden 10 ml de cada una de estas soluciones a

sendas placas de Petri (6 en total), poniendo en la ltima 10 ml de agua destilada (control).

Sobre el disco estril de cada placa, con la solucin correspondiente, se colocan 10

cotiledones, cuidando la igualdad de su desarrollo (es importante que sean uniformes).

Las placas as preparadas se incuban durante 72 h a 25C bajo luz fluorescente. Pasado

dicho tiempo se sacan las placas de la cmara de cultivo y se procede a pesar los cotiledones

de cada una de las placas, habindose secado previamente stos con papel de filtro. En esta

ltima etapa no es necesario trabajar en condiciones aspticas, ya que los cotiledones una vez

pesados se desechan.

5. RESULTADOS

a) Hacer una tabla con los pesos obtenidos, comparando los resultados de los cotiledones

tratados con los del control.

b) Representar grficamente el peso de los cotiledones (ordenadas) frente al logaritmo de la

concentracin del regulador (abscisas).

6. CUESTIONES

a) Indique la frmula de la quinetina.

b) Cul es la funcin principal de las citoquininas?

c) Cmo calcularamos la concentracin de una solucin o de un extracto vegetal utilizando

este bioensayo?