practica 12-citoquininas-prueba de expansion de cotiledones de rabano

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PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL CITOQUININAS-PRUEBA DE EXPANSIÓN DE COTILEDONES DE RÁBANO 1. INTRODUCCIÓN El término citoquinina surgió como nombre genérico de una serie de sustancias, naturales o sintéticas, capaces de estimular la división celular (citocinesis). Actualmente sabemos que las citoquininas, como las restantes hormonas vegetales, ejercen un amplio abanico de efectos sobre el desarrollo de las plantas. Así por ejemplo se ha comprobado que son eficaces en la formación de yemas en cultivo de tejidos de meristemo de tabaco y en el aumento del tamaño de hojas, debido a la elongación de las células. Además se observó su efecto en la dominancia apical, la cual logró vencerse mediante aplicaciones de quinetina en el guisante (Pisum sativum). También se ha visto que retrasan la senescencia foliar y que promueven la maduración de cloroplastos y la movilización de nutrientes. El descubrimiento de las citoquininas se logró en 1956, cuando F. Skoog y sus colaboradores (Universidad de Wisconsin) aislaron la quinetina a partir del DNA de esperma de arenque tratado en autoclave. Aunque la quinetina tiene gran actividad biológica, no es sintetizada por las plantas. La primera citoquinina natural se aisló en 1963 por Millar y recibió el nombre de Zeatina. Lehman (1968) estableció la prueba de expansión de cotiledones de rábano que se basa en la respuesta de crecimiento que éstos presentan ante las citoquininas. Es bastante, rápida, sólo 3-4 días, y resulta muy apropiada para probar gran número de muestras. Lehman la utilizó ampliamente al aislar citoquininas naturales. Además de fomentar la división celular, las citoquininas influyen en la diferenciación de los cultivos. Interactúan con las auxinas para mostrar expresiones diferentes de crecimiento. Skoog y Millar (1957) demostraron in vitro el modo en que cualquier cambio en el equilibrio citoquininas/auxinas puede afectar a las expresiones del crecimiento en los cultivos de tejidos. 2. OBJETIVOS a) Conseguir semillas de rábano germinadas y libres de contaminación. b) Preparar diluciones seriadas a partir de una solución stock de quinetina (100 mg/ml) c) Observar los efectos de la quinetina. 3. MATERIAL Semillas de rábano (Raphanus spp.) Solución de hipoclorito sódico al 10% Solución stock de quinetina (100 mg/l) Vaso de precipitado de 50 o 100 ml Pipeta de 10 ml Probeta de 100 ml Balanza

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fisiologia vegetal, prácticas citoquininas

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  • PRCTICAS DE FISIOLOGA VEGETAL

    CITOQUININAS -PRUEBA DE EXPANSIN DE COTILEDONES DE RBANO

    1. INTRODUCCIN

    El trmino citoquinina surgi como nombre genrico de una serie de sustancias, naturales

    o sintticas, capaces de estimular la divisin celular (citocinesis). Actualmente sabemos que las

    citoquininas, como las restantes hormonas vegetales, ejercen un amplio abanico de efectos

    sobre el desarrollo de las plantas. As por ejemplo se ha comprobado que son eficaces en la

    formacin de yemas en cultivo de tejidos de meristemo de tabaco y en el aumento del tamao

    de hojas, debido a la elongacin de las clulas. Adems se observ su efecto en la dominancia

    apical, la cual logr vencerse mediante aplicaciones de quinetina en el guisante (Pisum

    sativum). Tambin se ha visto que retrasan la senescencia foliar y que promueven la

    maduracin de cloroplastos y la movilizacin de nutrientes.

    El descubrimiento de las citoquininas se logr en 1956, cuando F. Skoog y sus

    colaboradores (Universidad de Wisconsin) aislaron la quinetina a partir del DNA de esperma de

    arenque tratado en autoclave. Aunque la quinetina tiene gran actividad biolgica, no es

    sintetizada por las plantas. La primera citoquinina natural se aisl en 1963 por Millar y recibi el

    nombre de Zeatina.

    Lehman (1968) estableci la prueba de expansin de cotiledones de rbano que se

    basa en la respuesta de crecimiento que stos presentan ante las citoquininas. Es bastante,

    rpida, slo 3-4 das, y resulta muy apropiada para probar gran nmero de muestras. Lehman

    la utiliz ampliamente al aislar citoquininas naturales. Adems de fomentar la divisin celular,

    las citoquininas influyen en la diferenciacin de los cultivos. Interactan con las auxinas para

    mostrar expresiones diferentes de crecimiento. Skoog y Millar (1957) demostraron in vitro el

    modo en que cualquier cambio en el equilibrio citoquininas/auxinas puede afectar a las

    expresiones del crecimiento en los cultivos de tejidos.

    2. OBJETIVOS

    a) Conseguir semillas de rbano germinadas y libres de contaminacin.

    b) Preparar diluciones seriadas a partir de una solucin stock de quinetina (100 mg/ml)

    c) Observar los efectos de la quinetina.

    3. MATERIAL

    Semillas de rbano (Raphanus spp.)

    Solucin de hipoclorito sdico al 10%

    Solucin stock de quinetina (100 mg/l)

    Vaso de precipitado de 50 o 100 ml

    Pipeta de 10 ml

    Probeta de 100 ml

    Balanza

  • Pinzas metlicas

    Cmara de flujo laminar

    Placas de Petri estriles

    Cuchilla enmangada

    Cmara de germinacin (25C)

    Cmara de cultivo (25C)

    4. METODOLOGA

    Las semillas de rbano (100-120 semillas) se desinfectan durante 5 min. con hipoclorito

    sdico al 10% y se lavan 3 veces con agua destilada estril. Se siembran, trabajando en la

    cmara de flujo laminar o en la encimera cerca de un mechero encendido, en una placa de

    Petri provista de una base de papel de filtro estril. Se cubren a continuacin con otro disco

    estril, se humedecen con 10 ml de agua destilada y se dejan germinar en la cmara de

    germinacin a 25C y en oscuridad durante tres das.

    Transcurrido ese tiempo se seleccionan plntulas uniformes a las que se les elimina el

    hipocotilo, obtenindose los cotiledones. Es muy importante la uniformidad de stos. Cada

    cotiledn se separa y se va depositando en una placa de Petri con disco de papel estril y

    humedecido con agua destilada. Por supuesto, todo el proceso se har en condiciones de

    esterilidad.

    Se preparan diluciones de quinetina a partir de la solucin stock (100 mg/l) hasta obtener

    concentraciones de 10, 1, 01 y 0,001 mg/l. Se aaden 10 ml de cada una de estas soluciones a

    sendas placas de Petri (6 en total), poniendo en la ltima 10 ml de agua destilada (control).

    Sobre el disco estril de cada placa, con la solucin correspondiente, se colocan 10

    cotiledones, cuidando la igualdad de su desarrollo (es importante que sean uniformes).

    Las placas as preparadas se incuban durante 72 h a 25C bajo luz fluorescente. Pasado

    dicho tiempo se sacan las placas de la cmara de cultivo y se procede a pesar los cotiledones

    de cada una de las placas, habindose secado previamente stos con papel de filtro. En esta

    ltima etapa no es necesario trabajar en condiciones aspticas, ya que los cotiledones una vez

    pesados se desechan.

    5. RESULTADOS

    a) Hacer una tabla con los pesos obtenidos, comparando los resultados de los cotiledones

    tratados con los del control.

    b) Representar grficamente el peso de los cotiledones (ordenadas) frente al logaritmo de la

    concentracin del regulador (abscisas).

    6. CUESTIONES

    a) Indique la frmula de la quinetina.

    b) Cul es la funcin principal de las citoquininas?

  • c) Cmo calcularamos la concentracin de una solucin o de un extracto vegetal utilizando

    este bioensayo?