pcr en tiempo real ii

PCR EN TIEMPO REAL(Real-Time PCR) (RT-PCR)

Benjamín Paz Aliaga UCSM-2004

Mientras la PCR tradicional detecta la amplificación en el punto final de la reacción

con RT-PCR se detecta la amplificación mientras ocurre la reacción

PCR

KARY B MULLIS , EL DESCUBRIDOR DE LA PCR PREMIO NOBEL EN QUIMICA EN 1993

PCR EN TIEMPO REAL(Real-Time PCR) (RT-PCR)

Benjamín Paz Aliaga UCSM-2004

Mientras la PCR tradicional detecta la amplificación en el punto final de la reacción

con RT-PCR se detecta la amplificación mientras ocurre la reacción

LIMITACIONES DE MEDIR LA AMPLIFICACION EN EL PUNTO FINAL DE LA REACCION EN LA

PCR TRADICIONAL (I)

1. Los resultados que se analizan en el gel de agarosa son obtenidos del punto final de la reacción.

2. Toma mucho tiempo, algunas veces hasta varios días.

3. No es muy precisa la discriminación en cuanto al tamaño

4. El punto final de la reacción varía de muestra a muestra

LIMITACIONES DE MEDIR LA AMPLIFICACION EN EL PUNTO FINAL DE LA REACCION EN LA

PCR TRADICIONAL (II)

5. En el gel de agarosa la resolución es muy pobre, las diferencias en cuanto a la amplificación tienen que ser de más de 10 veces para poder diferenciar la intensidad de la banda; en RT-PCR se pueden diferenciar amplificaciones tan pequeñas como del doble.

REAL TIME PCR

• kinetic approach

• early stages

• while still linear

www.biorad.com

2a. excitation filters

2b. emission filters

1. halogen tungsten lamp

4. sample plate

3. intensifier

5. ccd detector 350,000 pixels

FASES DE LA PCR

• LA REACCION DE AMPLIFICACION EN LA PCR TIENE 3 FASES:

1. Fase exponencial

2. Fase lineal

3. Fase horizontal (plateau)

FASES DE LA PCR

1.FASE EXPONENCIALCorresponde al inicio de la

reacción– En cada ciclo se dobla el

producto– La eficiencia es del 100%– Es muy específica y precisa

FASES DE LA PCR

2. FASE LINEALLos componentes de la reacción se están consumiendo

– La reacción se hace más lenta– Los productos comienzan a ser degradados

FASES DE LA PCR

3. FASE HORIZONTAL– Corresponde al punto final– Es cuando se hace la detección por gel en el PCR

tradicional– La reacción está detenida, no se forman más

productos– Si dejamos más tiempo los productos comienzan a

degradarse

SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS