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Dr. Claudio Martínez DebatVersión Original: Dra Mónica Marín

2o19Sección Bioquímica

Módulo III:Vías de la información genética

Regulación de la expresión génica:Generalidades

ProcariotasOperones lac y trp

Eucariotas

• La estructura de la cromatina, • el inicio de la transcripción, • el splicing alternativo• vida media, y “disponibilidad” del ARNm• Inicio de la traducción• Modificaciones postraduccionales• Vida media de proteínas

Diferenciación celular y desarrollo

Mutantes homeóticos enDrosophila melanogaster

OP LacOP Trp

CAP o CRP

Bacterias: mecanismos moleculares

Adaptación y optimización del crecimiento y multiplicación

En función de las condiciones ambientales– Disponibilidad de nutrientes– Condiciones fisicoquímicas– Agentes tóxicos : antibióticos, radiación

uv, infección por bacteriófagos, etc.

σ70

σ32

Interacciones ADN-proteína

Otros aács.: D, K, …

Motivos de unión al DNA

Represor Lac y trp CRP

Receptor de Glucocorticoides

Estrategias de regulación transcripcional en procariotas

● ADN, la naturaleza del promotor● Grado de superenrollamiento del ADN● Organización en Operones, Regulones● Actividad de activadores y represores de la

transcripción● Alteración de la ARN pol

– sustitución de la subunidad σ● Regulación en el tiempo:

– Antiterminadores (atenuación; fago λ)– Transcripción en cascada (sustitución de σ )

● La respuesta a condiciones de estrés– La respuesta estricta (ppGpp)– Respuesta frente al aumento de presión osmótica

- Operón lactosa- Operón triptofano

Regulación de la expresión génica en procariotas

Operón

● Un promotor: controla la expresión de varios genes funcionalmente relacionados

● ARN policistrónico ● Genes estructurales y genes

reguladores

Operón Lactosa

Operón Triptofano

Operón LactosaFunción: permite la utilización de la lactosa

Lactosa → Glucosa + Galactosa

Enzima: β-galactosidasa

Lactosa

E. coli

Estudio del crecimiento en distintos medios de cultivo ± lactosa

(± glucosa)

(Jacob y Monod, 1961)

Síntesis de β-galactosidasa: inducible por lactosa

en ausencia de glucosa

+ lactosa

- lactosa

β gal (enzima)

β gal (ARNm)

tiempo (min)

Act. Enz

Modelo del “Operón lactosa” Jacob y Monod, 1961

En realidad hay 3 sitios “operador” en el Operon lac,de secuencia palindrómica.

En realidad hay 3 sitios “operador” en el Operon lac,de secuencia palindrómica.

CAP – proteina activadoraRNAP – RNA polimerasa

Unión del inductor

Unión al ADN

Estructura del Represor (monómero)

7 repeticiones de leucina

Cooperatividad de los operadores:El represor lac (tetrámero) puede unir 2 secuencias de operador.

LacI Tetramero(2 dimeros unidos abajo)

DNA

Represor lac (tetrámero)

unido a 2 sitios Operador

distantes en la secuencia

de ADN lineal

(Gal(β 1 6)Glc)

Inductores del Operón Lactosa

Alolactosa

Lactosa

IPTGIsopropil tiogalactósido

(Sintético)

Regulación en el operón lactosa

● ARNm policistrónico● inducible por lactosa / alolactosa● regulación negativa :

– represor que se une al operador● regulación positiva :

– CRP-cAMP que se une próximo al promotor

– cAMP depende de la concentración de glucosa

T = 0:Medio de cultivo con Glucosa + lactosa

ATP cAMP + PPi

Adenilato ciclasa cataliza la formación de cAMP

Stop del gen i

CRP-cAMP

ARNpol

operador

inicio gen z

(promotor)

-80

-50

-10

-35

+10

+40

CAP (catabolite activator protein) = CRP (cAMP receptor protein)

● CAP (dímero) activador si está unido a cAMP

● CAP-cAMP estimula la transcripción● CAP-cAMP (dímero) se une a una

secuencia palindrómica (~20 bp)

Secuencia ADN consenso para la unión de CAP (dímero)

2 subunidades de 22 kDa

AANTGTGANNTNNNTCANATTNNTTNACACTNNANNNAGTNTAANNEn diferentes localizaciones respecto al inicio de la transcripción y con diferente orientación!

CAP-cAMP curva el ADN

Hipótesis : CAP-cAMP (dímero) interactua con el CTD de la subunidad α de la ARNp

CTD - carboxy-terminal domainNTD - amino-terminal domain

Curvatura puede favorecer la interacción de la ARNp con elementos distantes

Modelo : complejo ADN, Represor, CAP-AMPc

● Operón● inducible● constitutivo● fenotipo, genotipo● operador● represor, activador● inductor● genes estructurales, genes reguladores● regulación positiva, regulación negativa● promotor

Conceptos básicos :

Regulación de la biosíntesis de Trp

Mapa del operón trp

Promotor Operador Lider Atenuador

Trp: interviene en la regulación de su biosíntesis a distintos niveles:

● 1) inhibidor de la enzima codificada por el gen trpE

retroinhibición

2) Trp: en control negativo como co-represor

3) Trp participa en la atenuación

Codones para Trp

La ubicación del ribosoma determina la formación de las horquillas en el

ARNm

Terminador transcripcional

● El Trp regula su biosíntesis a 3 niveles; uno de ellos es la atenuación

● Es un mecanismo frecuente de regulación de biosíntesis de aa.

• Se basa en el acoplamiento transcripción-traducción. (exclusivo de procariotas)

● En el inicio del ARNm hay varios codones para el aa producto de la biosíntesis.

● La ausencia del aa implica ausencia del aa-ARNt y por lo tanto una pausa en la traducción.

● La pausa del ribosoma sobre el ARNm, impide la formación de la horquilla de terminación de la transcripción. La ARNpol continua la síntesis de todo el ARNm policistrónico.

Atenuación, en otros operones biosintéticos, especialmente de aminoácidos:

   operón his: síntesis de histidina

   operón phe: síntesis de fenilalanina;

   operón leu: síntesis de leucina;

   operón thr: síntesis de treonina;

   operón ilv: síntesis de isoleucina y de valina.

Algunos de estos (como el His) sólo poseen atenuación como mecanismo de control, mientras que otros tienen además regulación por represión.       

Otros mecanismos de regulación● Respuesta al shock térmico y otras

formas de estrés celular : genes HS (Sustitución de subunidad σ70 de la ARNpol)

● anti terminadores en el fago lambda● ppGpp inhibe la síntesis de la maquinaria traduccional cuando faltan aa.● Otros…

Sustitución de la subunidad σ70 en la ARN pol

σ determina el reconocimiento de los promotoresAlternativos:

σ32 : respuesta al shock térmico σΕ: lo mismo, a mayor temperatura σ54: falta de amonio. Induce la expresión de genes

que permiten la utilización de fuentes alternativas de nitrógeno.

σ28 : genes “flagelares”, en respuesta a cambios del ambiente

σF : quimiotoaxis, genes flagelares. σS : stress, esporulación

σ70

σ32 (choque térmico, stress)

Factores de especificidad: σ

Regulación en trans por sARNSσS

“0 stress”

“tres esstress”

Stress oxidativo

Regulación en cis por sARNS

TPP, tiamina PPi, vit. B1

Identificación y cuantificación de variaciones del nivel de ARNm específicosen respuesta a determinada situación

Mutagénesis y cultivo en medio selectivo

Estudio comparativo del nivel de ARNmNorthern blot, PCR cuantitativo, Real time PCR, microarrays, etc

Microarrays

www.ou.edu/.../oubcf/docs/growth_trans.shtml

Identificación de proteínas/ ARNs reguladoras (activadores, represores)

Métodos para estudiar mecanismos de regulación:Identificación de :

sitios en el ADN regiones de l a proteína / regulador co-reguladores

Estudios dinámicos y funcionales

Regulación en Eucariotas

• La estructura de la cromatina, • el inicio de la transcripción, • el splicing alternativo• vida media, y “disponibilidad” del ARNm• Inicio de la traducción• Modificaciones postraduccionales• Vida media de proteínas

• Los ARNm son monocistrónicos• Predomina la regulación positiva, por

activadores• La estructura de la cromatina, • el inicio de la transcripción, • el splicing alternativo• la vida media, y la disponibilidad del

ARNm• plegamiento

bacterias

levadura

Regiones reguladoras en el genoma de bacterias, levaduras y humano

humano

Diferenciación celular y desarrollo

Acetilación de histonas : modificación de la accesibilidad al ADN

Remodelación de la cromatina por activadores

Acetilación de histonasRemodelado de nucleosomas

Las hormonas afectan la expresión de ciertos genes

Los receptores de hormonas esteroidean son factores transcripcionales

Receptores Tipo IMonoméricosCitoplasmáticosEjs.: estrógenos,Progesterona,Cortisol

Receptores Tipo IIDiméricosNuclearesEj.: Hormona Tiroidea

Motivos “dedos de Zn”

Motivo“hélice-vuelta-hélice”de unión al ADN

Proteínas de unión al ADN

Represores Traduccionales

Síntesis y maduración de los miRNA

Regulación de la expresión génica en eucariotas

Información posicional: genes con homeobox

ExpresionEctópica

De eyelessMurino

En Drosophila

http://www.genome.gov/encode/

Ventajas clave del ARN (como regulador):

Especificidad de secuencia (“digital”) Codificación compacta y minimización del ruido en redes regulatorias complejas

Reconfiguración flexible (mutaciones puntuales) Digital analógico .:. ARN:ARN o ADN:ARN Proteínas (ARN como adaptador)

Regulación mediada por familias de RNAs no codificantes

● tRNAs, RNA ribosomales

● Long non coding, lncRNAs ● microRNAs, ● siRNAs, ● snRNAs, ● exRNAs, ● piRNAs,

Definición revisada del flujo de la Información Génica en Eucariotas. Formación de Redes Complejas de Interacciones Estructurales, Funcionales y Regulatorias

ADN

ARN

Proteína

La transcripción NO codificante es x lo – 4x la codificante! Concepto de gen .. Modelo lineal Modular …

Pueden ser clasificados según su tamaño: largos (>200Nts) o cortos, Sentido (S) o Antisentido (AS)Codificantes o no codificantesPor su modo de acción, etc

Ejs de funciones de ncARNs largos Remodelamiento cromatínico Cambios epigenéticos por reclutamiento de complejos remodeladores de la cromatina a loci genómicos específicos

HOTAIR: Hox transcript AS RNA--| 40 kb de HOXD en trans

Locus HOXC

Xist/RepA: inactivación de cromosoma X(imprinting)

Locus Xist RepAPRC2 es inactivado en el otro X por Tsix (AS de Xist)

Modelo alternativo: Xist-Tsix siRNA ( inactivación de cromosoma X)H3

PRE

Mecanismos epigenéticos de regulación de la expresión génica

• Metilación del DNA (mC)Elevada metilación se asocia con silenciamiento génico. La dieta y

factores ambientales pueden afectar el patrón de metilación• Modificación de histonasAcetilación, fosforilación, metilación, etc afectan la expresión de genes• RNA no codificantesEj MicroRNA de interferencia que regulan la traducción

Qué es un Gen?

Aproximaciones actuales para el estudio de la expresión génica

● Múltiples proyectos “Genoma”● Construcción de bancos de datos con

las secuencias génicas● Bancos de las

secuencias”expresadas”, de los ARNm● Estudio de la expresión de genes, de

distintos organismos, en distintas condiciones, normales y patológicas.

Hibridación de ácidos nucleicos : aproximación que cambió de escala

hs

ARNm del gen x en f(t)

Hibridación in situ

Embrión de pezdesarrollo muscular(miosina)

Localización de transcriptos de HP1a durante el desarrollo temprano de Xenopus, por hibridación in situ

Análisis simultaneo de la expresión de los genes por microarreglos

Se basa en la hibridación de cadenas complementarias de ADNFragmentos de ADN, los genes,están fijos a un soporteLa sonda es la población de los ARNm presentes en cierto tejido celular

microchip

ARNm de células normalesen distintos grado de diferenciación

ARNm de células del mismo tejido de pacientes

Permite identificar genes involucrados en determinadas patologías

Proteoma: proteínas celulares analizadas

por electroforesis en 2D

www.expasy.org/ch2d/ publi/kidney.html

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

(USA, n. 1944, PN 1993)

Single Cycle

Secuenciación

Genómica

(Fred Sanger, n. 1918, PN 1958 y 1980)

Robot molecular fabricado con ADN

Nanobiotecnología

La célula sintética creada por el Instituto Venter, esconde un secreto:Los creadores han incluido sus nombres en el ADN de la célula

CRAIG VENTER codificado:TTAACTAGCTAATGTCGTGCAATTGGAGTAGAGAACACAGAACGATTAACTAGCTAA

VENTERINSTITVTE:TTAACTAGCTAAGTAGAAAACACCGAACGAATTAATTCTACGATTACCGTGACTGAG TTAACTAGCTAA

HAMSMITH: TTAACTAGCTAACATGCAATGTCGATGATTACCCACTTAACTAGCTAA

CINDIANDCLYDE: TTAACTAGCTAATGCATAAACGACATCGCTAATGACTGTCTTTATGATGAATTAACTA GCTAATGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGT CGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATG

GLASSANDCLYDE:TTAACTAGCTAAGGTCTAGCTAGTAGCGCGAATGACTGCCTATACGATGAG TTAACTAGCTAA

Gene drive is the practice of "stimulating biased inheritance of particular genes to alter entire populations."

Kac, Historia Natural del Enigma, “Edunia”, 2009

Ars longa vita brevis

Agradezco a: BePé, SB-FC, EI

Nota: todas las imágenes contenidas en este documento son de dominio público y libremente accesibles vía Internet. El presente material refleja el trabajo de preparación de las clases correspondientes por parte de los docentes responsables, no tiene fines de lucro y sí docentes, sin pretender sustituir a la bibliografía recomendada.

Interferencia de ARN

TAF: TATA binding Associated FactorsAlgunos TAFs tienen actividad acetilasa de histonas