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Dr. Claudio Martínez DebatVersión Original: Dra Mónica Marín
2o19Sección Bioquímica
Módulo III:Vías de la información genética
Regulación de la expresión génica:Generalidades
ProcariotasOperones lac y trp
Eucariotas
• La estructura de la cromatina, • el inicio de la transcripción, • el splicing alternativo• vida media, y “disponibilidad” del ARNm• Inicio de la traducción• Modificaciones postraduccionales• Vida media de proteínas
Diferenciación celular y desarrollo
Mutantes homeóticos enDrosophila melanogaster
OP LacOP Trp
CAP o CRP
Bacterias: mecanismos moleculares
Adaptación y optimización del crecimiento y multiplicación
En función de las condiciones ambientales– Disponibilidad de nutrientes– Condiciones fisicoquímicas– Agentes tóxicos : antibióticos, radiación
uv, infección por bacteriófagos, etc.
σ70
σ32
Interacciones ADN-proteína
Otros aács.: D, K, …
Motivos de unión al DNA
Represor Lac y trp CRP
Receptor de Glucocorticoides
Estrategias de regulación transcripcional en procariotas
● ADN, la naturaleza del promotor● Grado de superenrollamiento del ADN● Organización en Operones, Regulones● Actividad de activadores y represores de la
transcripción● Alteración de la ARN pol
– sustitución de la subunidad σ● Regulación en el tiempo:
– Antiterminadores (atenuación; fago λ)– Transcripción en cascada (sustitución de σ )
● La respuesta a condiciones de estrés– La respuesta estricta (ppGpp)– Respuesta frente al aumento de presión osmótica
- Operón lactosa- Operón triptofano
Regulación de la expresión génica en procariotas
Operón
● Un promotor: controla la expresión de varios genes funcionalmente relacionados
● ARN policistrónico ● Genes estructurales y genes
reguladores
Operón Lactosa
Operón Triptofano
Operón LactosaFunción: permite la utilización de la lactosa
Lactosa → Glucosa + Galactosa
Enzima: β-galactosidasa
Lactosa
E. coli
Estudio del crecimiento en distintos medios de cultivo ± lactosa
(± glucosa)
(Jacob y Monod, 1961)
Síntesis de β-galactosidasa: inducible por lactosa
en ausencia de glucosa
+ lactosa
- lactosa
β gal (enzima)
β gal (ARNm)
tiempo (min)
Act. Enz
Modelo del “Operón lactosa” Jacob y Monod, 1961
En realidad hay 3 sitios “operador” en el Operon lac,de secuencia palindrómica.
En realidad hay 3 sitios “operador” en el Operon lac,de secuencia palindrómica.
CAP – proteina activadoraRNAP – RNA polimerasa
Unión del inductor
Unión al ADN
Estructura del Represor (monómero)
7 repeticiones de leucina
Cooperatividad de los operadores:El represor lac (tetrámero) puede unir 2 secuencias de operador.
LacI Tetramero(2 dimeros unidos abajo)
DNA
Represor lac (tetrámero)
unido a 2 sitios Operador
distantes en la secuencia
de ADN lineal
(Gal(β 1 6)Glc)
Inductores del Operón Lactosa
Alolactosa
Lactosa
IPTGIsopropil tiogalactósido
(Sintético)
Regulación en el operón lactosa
● ARNm policistrónico● inducible por lactosa / alolactosa● regulación negativa :
– represor que se une al operador● regulación positiva :
– CRP-cAMP que se une próximo al promotor
– cAMP depende de la concentración de glucosa
T = 0:Medio de cultivo con Glucosa + lactosa
ATP cAMP + PPi
Adenilato ciclasa cataliza la formación de cAMP
Stop del gen i
CRP-cAMP
ARNpol
operador
inicio gen z
(promotor)
-80
-50
-10
-35
+10
+40
CAP (catabolite activator protein) = CRP (cAMP receptor protein)
● CAP (dímero) activador si está unido a cAMP
● CAP-cAMP estimula la transcripción● CAP-cAMP (dímero) se une a una
secuencia palindrómica (~20 bp)
Secuencia ADN consenso para la unión de CAP (dímero)
2 subunidades de 22 kDa
AANTGTGANNTNNNTCANATTNNTTNACACTNNANNNAGTNTAANNEn diferentes localizaciones respecto al inicio de la transcripción y con diferente orientación!
CAP-cAMP curva el ADN
Hipótesis : CAP-cAMP (dímero) interactua con el CTD de la subunidad α de la ARNp
CTD - carboxy-terminal domainNTD - amino-terminal domain
Curvatura puede favorecer la interacción de la ARNp con elementos distantes
Modelo : complejo ADN, Represor, CAP-AMPc
● Operón● inducible● constitutivo● fenotipo, genotipo● operador● represor, activador● inductor● genes estructurales, genes reguladores● regulación positiva, regulación negativa● promotor
Conceptos básicos :
Regulación de la biosíntesis de Trp
Mapa del operón trp
Promotor Operador Lider Atenuador
Trp: interviene en la regulación de su biosíntesis a distintos niveles:
● 1) inhibidor de la enzima codificada por el gen trpE
retroinhibición
2) Trp: en control negativo como co-represor
3) Trp participa en la atenuación
Codones para Trp
La ubicación del ribosoma determina la formación de las horquillas en el
ARNm
Terminador transcripcional
● El Trp regula su biosíntesis a 3 niveles; uno de ellos es la atenuación
● Es un mecanismo frecuente de regulación de biosíntesis de aa.
• Se basa en el acoplamiento transcripción-traducción. (exclusivo de procariotas)
● En el inicio del ARNm hay varios codones para el aa producto de la biosíntesis.
● La ausencia del aa implica ausencia del aa-ARNt y por lo tanto una pausa en la traducción.
● La pausa del ribosoma sobre el ARNm, impide la formación de la horquilla de terminación de la transcripción. La ARNpol continua la síntesis de todo el ARNm policistrónico.
Atenuación, en otros operones biosintéticos, especialmente de aminoácidos:
operón his: síntesis de histidina
operón phe: síntesis de fenilalanina;
operón leu: síntesis de leucina;
operón thr: síntesis de treonina;
operón ilv: síntesis de isoleucina y de valina.
Algunos de estos (como el His) sólo poseen atenuación como mecanismo de control, mientras que otros tienen además regulación por represión.
Otros mecanismos de regulación● Respuesta al shock térmico y otras
formas de estrés celular : genes HS (Sustitución de subunidad σ70 de la ARNpol)
● anti terminadores en el fago lambda● ppGpp inhibe la síntesis de la maquinaria traduccional cuando faltan aa.● Otros…
Sustitución de la subunidad σ70 en la ARN pol
σ determina el reconocimiento de los promotoresAlternativos:
σ32 : respuesta al shock térmico σΕ: lo mismo, a mayor temperatura σ54: falta de amonio. Induce la expresión de genes
que permiten la utilización de fuentes alternativas de nitrógeno.
σ28 : genes “flagelares”, en respuesta a cambios del ambiente
σF : quimiotoaxis, genes flagelares. σS : stress, esporulación
σ70
σ32 (choque térmico, stress)
Factores de especificidad: σ
Regulación en trans por sARNSσS
“0 stress”
“tres esstress”
Stress oxidativo
Regulación en cis por sARNS
TPP, tiamina PPi, vit. B1
Identificación y cuantificación de variaciones del nivel de ARNm específicosen respuesta a determinada situación
Mutagénesis y cultivo en medio selectivo
Estudio comparativo del nivel de ARNmNorthern blot, PCR cuantitativo, Real time PCR, microarrays, etc
Microarrays
www.ou.edu/.../oubcf/docs/growth_trans.shtml
Identificación de proteínas/ ARNs reguladoras (activadores, represores)
Métodos para estudiar mecanismos de regulación:Identificación de :
sitios en el ADN regiones de l a proteína / regulador co-reguladores
Estudios dinámicos y funcionales
Regulación en Eucariotas
• La estructura de la cromatina, • el inicio de la transcripción, • el splicing alternativo• vida media, y “disponibilidad” del ARNm• Inicio de la traducción• Modificaciones postraduccionales• Vida media de proteínas
• Los ARNm son monocistrónicos• Predomina la regulación positiva, por
activadores• La estructura de la cromatina, • el inicio de la transcripción, • el splicing alternativo• la vida media, y la disponibilidad del
ARNm• plegamiento
bacterias
levadura
Regiones reguladoras en el genoma de bacterias, levaduras y humano
humano
Diferenciación celular y desarrollo
Acetilación de histonas : modificación de la accesibilidad al ADN
Remodelación de la cromatina por activadores
Acetilación de histonasRemodelado de nucleosomas
Las hormonas afectan la expresión de ciertos genes
Los receptores de hormonas esteroidean son factores transcripcionales
Receptores Tipo IMonoméricosCitoplasmáticosEjs.: estrógenos,Progesterona,Cortisol
Receptores Tipo IIDiméricosNuclearesEj.: Hormona Tiroidea
Motivos “dedos de Zn”
Motivo“hélice-vuelta-hélice”de unión al ADN
Proteínas de unión al ADN
Represores Traduccionales
Síntesis y maduración de los miRNA
Regulación de la expresión génica en eucariotas
Información posicional: genes con homeobox
ExpresionEctópica
De eyelessMurino
En Drosophila
http://www.genome.gov/encode/
Ventajas clave del ARN (como regulador):
Especificidad de secuencia (“digital”) Codificación compacta y minimización del ruido en redes regulatorias complejas
Reconfiguración flexible (mutaciones puntuales) Digital analógico .:. ARN:ARN o ADN:ARN Proteínas (ARN como adaptador)
Regulación mediada por familias de RNAs no codificantes
● tRNAs, RNA ribosomales
● Long non coding, lncRNAs ● microRNAs, ● siRNAs, ● snRNAs, ● exRNAs, ● piRNAs,
Definición revisada del flujo de la Información Génica en Eucariotas. Formación de Redes Complejas de Interacciones Estructurales, Funcionales y Regulatorias
ADN
ARN
Proteína
La transcripción NO codificante es x lo – 4x la codificante! Concepto de gen .. Modelo lineal Modular …
Pueden ser clasificados según su tamaño: largos (>200Nts) o cortos, Sentido (S) o Antisentido (AS)Codificantes o no codificantesPor su modo de acción, etc
Ejs de funciones de ncARNs largos Remodelamiento cromatínico Cambios epigenéticos por reclutamiento de complejos remodeladores de la cromatina a loci genómicos específicos
HOTAIR: Hox transcript AS RNA--| 40 kb de HOXD en trans
Locus HOXC
Xist/RepA: inactivación de cromosoma X(imprinting)
Locus Xist RepAPRC2 es inactivado en el otro X por Tsix (AS de Xist)
Modelo alternativo: Xist-Tsix siRNA ( inactivación de cromosoma X)H3
PRE
Mecanismos epigenéticos de regulación de la expresión génica
• Metilación del DNA (mC)Elevada metilación se asocia con silenciamiento génico. La dieta y
factores ambientales pueden afectar el patrón de metilación• Modificación de histonasAcetilación, fosforilación, metilación, etc afectan la expresión de genes• RNA no codificantesEj MicroRNA de interferencia que regulan la traducción
Qué es un Gen?
Aproximaciones actuales para el estudio de la expresión génica
● Múltiples proyectos “Genoma”● Construcción de bancos de datos con
las secuencias génicas● Bancos de las
secuencias”expresadas”, de los ARNm● Estudio de la expresión de genes, de
distintos organismos, en distintas condiciones, normales y patológicas.
Hibridación de ácidos nucleicos : aproximación que cambió de escala
hs
ARNm del gen x en f(t)
Hibridación in situ
Embrión de pezdesarrollo muscular(miosina)
Localización de transcriptos de HP1a durante el desarrollo temprano de Xenopus, por hibridación in situ
Análisis simultaneo de la expresión de los genes por microarreglos
Se basa en la hibridación de cadenas complementarias de ADNFragmentos de ADN, los genes,están fijos a un soporteLa sonda es la población de los ARNm presentes en cierto tejido celular
microchip
ARNm de células normalesen distintos grado de diferenciación
ARNm de células del mismo tejido de pacientes
Permite identificar genes involucrados en determinadas patologías
Proteoma: proteínas celulares analizadas
por electroforesis en 2D
www.expasy.org/ch2d/ publi/kidney.html
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
(USA, n. 1944, PN 1993)
Single Cycle
Secuenciación
Genómica
(Fred Sanger, n. 1918, PN 1958 y 1980)
Robot molecular fabricado con ADN
Nanobiotecnología
La célula sintética creada por el Instituto Venter, esconde un secreto:Los creadores han incluido sus nombres en el ADN de la célula
CRAIG VENTER codificado:TTAACTAGCTAATGTCGTGCAATTGGAGTAGAGAACACAGAACGATTAACTAGCTAA
VENTERINSTITVTE:TTAACTAGCTAAGTAGAAAACACCGAACGAATTAATTCTACGATTACCGTGACTGAG TTAACTAGCTAA
HAMSMITH: TTAACTAGCTAACATGCAATGTCGATGATTACCCACTTAACTAGCTAA
CINDIANDCLYDE: TTAACTAGCTAATGCATAAACGACATCGCTAATGACTGTCTTTATGATGAATTAACTA GCTAATGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGT CGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATG
GLASSANDCLYDE:TTAACTAGCTAAGGTCTAGCTAGTAGCGCGAATGACTGCCTATACGATGAG TTAACTAGCTAA
Gene drive is the practice of "stimulating biased inheritance of particular genes to alter entire populations."
Kac, Historia Natural del Enigma, “Edunia”, 2009
Ars longa vita brevis
Agradezco a: BePé, SB-FC, EI
Nota: todas las imágenes contenidas en este documento son de dominio público y libremente accesibles vía Internet. El presente material refleja el trabajo de preparación de las clases correspondientes por parte de los docentes responsables, no tiene fines de lucro y sí docentes, sin pretender sustituir a la bibliografía recomendada.
Interferencia de ARN
TAF: TATA binding Associated FactorsAlgunos TAFs tienen actividad acetilasa de histonas