hormonas esteroideas libres · chiu sk y col. clin biochem. 2003;36:211–4). •qlia immulite i ó...
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HORMONAS ESTEROIDEAS LIBRES
Bioq. Cecilia Andrea Fenili
Laboratorio Maipú.
2017
HORMONAS ESTEROIDEAS EN CIRCULACION
•Derivadas del
ciclopentano perhidrofenantreno
•Naturaleza lipídica.
•Parcialmente insolubles en
medios acuosos
•Interaccionan con proteínas de
transporte
ALBUMINA
Alta capacidad y baja afinidad Transporte de ac grasos, vitaminas,
hormonas, fármacos y sus metabolitos,
complejos no covalentes
CBG (Corticoid binding protein)
•Baja capacidad y alta afinidad •Mayor afinidad por glucocorticoides
SHBG (Sex hormone binding globulin) GLAE (Globulina ligadora de Andróg y Estróg)
• Baja capacidad y alta afinidad • 5 veces mayor afinidad por To que por E2.
Proteinas transportadoras de Esteroides
Aumentan en embarazo y con ACO o TRH (aum de Estrógs)
Sitruk-Ware R, Nath A. Rev Endocr Metab Disord. 2011; 12:63–75.
Esteroide
% libre % unido a
CBG
% unido a
ALBUMINA
% unido a
SHBG
T1/2 en circ
(min)
Cortisol 5 90 5 0.1 100
Aldosterona 42 21 37 0.1 10
P4 <2.0 18 80 0.6 5
To 2.0 0.1 30 68 10
E2 2.0 0 62 36 20
TRANSPORTE DE ESTEROIDES EN CIRCULACION
Dimorfismo sexual
AUMENTO DE SHBG DISMINUCIÓN DE SHBG
Terapia estrogénica ACO THR Embarazo Cirrosis Hipogonadismo Drogas Antiepilépticas Hipertiroidismo
Terapia Androgénica Obesidad Insulina Prolactina Hipotiroidismo Deficiencia endógena Drogas antitiroideas Acromegalia Síndrome de Cushing Glucocorticoides exógenos Progestágenos
Guay. Laboratory tests in androgen deficiency. Fertil Steril 2002.
MODIFICACIONES EN LA SHBG
GLUCOCORTICOIDES: CORTISOL LIBRE
RITMO CIRCADIANO DE CORTISOL TOTAL Y LIBRE
Cortisol Total Cortisol libre
MEDICION DE CORTISOL LIBRE
•CORTISOL SALIVAL (SAF)
•CORTISOL LIBRE URINARIO (CLU)
•LC-MS (no en aplic clínica)
Medición de Cortisol libre:
SAF
SAF
• Hay equilibrio entre el Cortisol libre en plasma y en saliva. •Su concentración es independente de la tasa de producción salival.
J Clin EndocrinolMetab 94: 3647–3655, 2009
UTILIDADES DE SAF 23 HS. Un SAF elevado (23 hs)
• Diagnóstico de S. Cushing endógeno: > 90% de S y E.
• Control de pacientes en remisión y/o recurrencia post cx hipof por E. Cushing.
• Durante una prueba de estímulo con ACTH en pacientes con prot plasmáticas:
• altas (aum de estrógenos) • bajas (enfermedad crítica).
J Clin EndocrinolMetab 94: 3647–3655, 2009
ACOS Y CORTICOIDES
Physiol. Res. 57 (Suppl. 1): S193-S199, 2008
Comparación de cortisol plasmático vs SAF en pacientes con Sme Cushing
Comparación de cortisol plasmático vs SAF en pacientes en tratamiento con estrógenos
Comparación de cortisol plasmático vs SAF post Test de supresión con DXM
Manetti y col, Eur J Endocr, 2013.
S Y E DE SAF DE 23 HS EN EL DIAGNÓSTICO DE S. DE CUSHING
Varían:
• el número de casos y controles,
• los criterios diagnósticos,
• los tipos de controles,
• las metodologías de ensayo,
• los métodos utilizados para generar puntos de corte,
• las técnicas de muestreo de saliva.
Sin embargo:
• se encontraron S y E similares para S. Cushing.
JCEM, 2009, 94(10):3647–3655
EFICIENCIA DIAGNÓSTICA DE MÉTODOS PARA MEDIR CORTISOL
Test para Diagnóstico de S de Cushing
SAF tiene una eficiencia diagnóstica
superior que el CLU de 24 hs y se debería utilizar (bien
estandarizada) como
la prueba bioquímica primaria para el diagnóstico de S.
Cushing.
Elias PC y col JCEM, 2014; 99(6):2045-51.
Endocrine Journal 2010, 57 (4), 331-337
SAF Y CUSHING CÍCLICO
Fácil muestreo frecuente
para la detección de
Cushing cíclico o intermitente.
Meinardi JR y col. 2007 Eur J Endocrinol 157:245–254.
SAF 8 HS • Ritmo circadiano
• útil para el diagnóstico de la ISR?
Limitaciones
• Amplio rango de VR.
• No es útil para el diagnóstico diferencial de ISR 1° y 2°.
• La S y la E para ISR 1° es menor de 35%.
Restituto P y col. 2008; Clin Biochem 41:688–692
SAF: UTILIDAD EN LA DETECCIÓN DE ISR
POST ACTH1-24 (1 gr)
Marcus-Perlman Y y col;2006. Clin Endocrinol Oxf. 64:215–218
SAF PRUEBA DE ACTH
Cortisol sérico Cortisol salival
control control
ISR ISR
hiperE2
hiperE2
SAF Y MONITOREO DE REEMPLAZO CON
GLUCOCORTICOIDES
• Controlar a los pacientes con ISR tratados con cortisol exógeno (hidrocortisona).
• No aporta significativamente a la evaluación de la terapia de reemplazo con glucocorticoides.
Maguire AM y col. 2007; Eur J Endocrinol 156: 471–476.
SAF: UTILIDAD DE SAF EN PEDIATRÍA
El muestreo de saliva es particularmente útil en los niños
con sospecha de S. de Cushing
en los que la toma de muestra
de sangre y de orina
puede ser un desafío.
MEDICIÓN DE SAF
HORMONAS EN SALIVA
• Refleja la hormona libre.
• Muestreo no traumático para el paciente.
• Se ha reportado gran estabilidad de los esteroides en muestras de saliva.
Dificultades en la estandarización de la
técnica de recolección de las muestras.
Matriz variable de la muestra de saliva.
Posible contaminación con sangre periférica.
Sensibilidad de los métodos para medir las hormonas (adaptaciones)
Dificultades para establecer los rangos de referencia.
Posible contaminación por administración de por ej corticoides orales exógenos.
Lewis J. Clin Biochem Rev. 2006;27(3):139–146.
Ventajas Desventajas
CONDICIONES PRE-ANALÍTICAS PARA LA RECOLECCIÓN DE SALIVA
• No realizar la recolección si tiene heridas bucales sangrantes (encías,
etc.): cualquier contaminación con sangre invalida la medición.
• No utilizar limón para estimular la salivación. Vialard-Miguel J y col. Lemon juice alters cortisol assays in saliva. Clin Endocrinol. 2005;63:478–9.
• No realizar actividad física de esfuerzo 12 hs previas, en especial respetando un reposo de 2 hs antes de la recolección de la muestra.
CONDICIONES PRE-ANALÍTICAS PARA LA RECOLECCIÓN DE SALIVA
• No ingerir alimentos (sólidos ó líquidos) en las 3 hs previas a la recolección de la muestra.
• No ingerir alcohol (interfiere en el IE), te, café ó mate en las 8 hs previas (aumentan la actividad de la alfa-amilasa).
• Enjuagarse la boca con agua (buche) sin cepillar, luego de la última ingesta de alimentos.
MEDICACIÓN Y SAF
La Hidrocortisona
no puede ser distinguida
de cortisol endógeno
Cruza
en los inmunoensayos,
La Dexametasona
puede ser distinguida
de cortisol endógeno
No cruza
con los inmunoensayos.
MÉTODOS PARA MEDIR SAF
• RIA MODIFICADO (Contreras y col)
• EQLIA (Vogeser M. Chem Lab Med. 2006; 44(12):1441-5 y
Chiu SK y col. Clin Biochem. 2003;36:211–4).
• QLIA Immulite I ó 1000 modificado (Astarita y col)
EQLIA vs método patrón
POSTANALÍTICA: SAF Y VR
Clin Chem Lab Med 2006; 44(12):1441-1445
• Informar si recibe medicación para disminuir los niveles de colesterol y/o triglicéridos (lípidos) del tipo de las “Estatinas”. (inhiben la 11-beta dehidrogenasa: disminuye conversión a Cortisona, por lo que se observan SAF elevados).
• Informar administración de corticoides (3-6 meses previos).
• Hiposalivación: descripta en Sjögren, antidepresivos, etc.
ETAPA POSTANALÍTICA DE SAF
MEDICIÓN DE CLU
CORTISOL LIBRE URINARIO (CLU)
Recolección de orina de 24 hs
•Los Pacientes deberán recibir instrucciones precisas para la recolección de orina de 24 hs.
•Descartar la 1° orina de la mañana (7 AM) y comenzar a juntar todo el volumen de las micciones siguientes hasta el dia siguiente a las 7.00 AM inclusive.
•Remitir todo el volumen al Laboratorio.
CLU Cortisol libre:
• cortisol no ligado a las proteínas plasmáticas: se filtra en el glomérulo y luego se reabsorbe en el túbulo colector. Alrededor del 3% del cortisol filtrado se elimina por orina.
• cortisol no conjugado al ácido sulfúrico o hialurónico.
Por lo tanto, el cortisol libre urinario no está conjugado
y su nivel en la orina refleja
el nivel de cortisol bioactivo libre en el plasma.
CLU 24 hs
• Refleja la concentración de Cortisol libre (biológicamente activo) integrada de 24 hs.
• Requiere función renal normal.
• Puede ser normal en Cushing cíclico.
• Puede ser normal si el SC es leve.
• Hay que medirlo en 2 muestras de diferentes recolecciones.
Vilar L y col. Pitfalls in the diagnosis of Cushing's syndrome.
Arq Bras Endocrinol Metabol. 2007 Nov;51(8):1207-16.
CLU y Depresión
• Aumenta la excreción urinaria de cortisol libre.
CLU MÈTODOS
• Métodos directos: RIA
• Métodos extractivos (diclorometano): RIA, EQLIA, QLIA.
ESTEROIDES SEXUALES
E2
TESTOSTERONA Y PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS
Simon JA. Fert Steril. 2002;77:S77-S82.
Demers LM. In: Redmond, G, ed. Androgenic Disorders. Raven Press, New York, NY; 1995:21-34.
~30% unida
a albumina
~0.5-2% libre Testosterona libre
TO LIBRE: MÉTODOS
• RIA ANALOGO
• RIA CON EXTRACCiON PREVIA
• CALCULOS BASADOS EN LA LEY DE ACCION DE MASAS
No aplicables en clínica de rutina:
• EQUILIBRIO DE DIALISIS
• ULTRAFILTRACION
• El intervalo de referencia de To libre RIA análogo es 5 veces menor que el del Eq. de diálisis.
• No está claro qué es lo que mide????.
• Correlaciona con To total, por lo que ofrece la misma información y no corrige las diferencias por la concentración de SHBG plasmática.
Stephen J Winters y col. The analog free testosterone assay: are the results in men clinically useful?
Clinical Chemistry 44:10 2178–2182 (1998).
MEDICIÓN DE TO LIBRE POR RIA ANÁLOGO: CRÍTICAS (1998)
TO LIBRE POR RIA ANÁLOGO (FRITZ Y COL. 2008)
Los resultados de To libre RIA análogo correlacionan con los de To Total,
Este método
“NO MIDE la To dializable” o sea que
“NO MIDE To libre”
Fritz KS, McKean AJS, Nelson JC, Wilcox RB. Analog-based free testosterone test results linked to total testosterone concentrations, not free
testosterone concentrations. Clin Chem 2008;54:512– 6.
BioT = [FT] + {(kat x [alb] x [FT]) / (1 + (kat x [FT]))}
FT = {-b + (b2 + 4a[T])} / 2a
a = kat + kt + {kat x kt x ([SHBG] + [alb] – [T])}
b = 1 + (kt x [SHBG]) + (kat x [alb]) – ((kat + kt) x [T])
kat : constante de afinidad de la unión de To a Albúmina
Kt : constante de afinidad de la unión de To a SHBG
Vermeulen, Sodergard, Emadi-Konjin
Vermeulen et al. J Clin Endo & Metab 1999;84(10):3666-72.
Sodergard et al. J Steroid Biochem 1982;16:801-10.
Emadi-Konjin et al. Clin Biochem 2003;36:591-6.
Morris et al. Eur J Endocrinol 2004;151:241-9.
CÁLCULO DE TO LIBRE Y TO BIO
ESTIMACION DE TO LIBRE Y TO BIODISPONIBLE
CÁLCULO DE TOL Y TO BIO
To ACCESS DPC DSL EQLIA IMMULITE
SHBG EQLIA EQLIA EQLIA EQLIA EQLIA
Padilla P. Y col. Estimación por calculo de testosterona biodisponible: Variables a considerar. CUBRA 2005.
TO LIBRE CALCULADA: ES NECESARIO MEDIR LA ALBÚMINA?
En la rutina clínica no sería necesario estimar la Albúmina de cada paciente en mujeres hiperandrogénicas cuando se encuentra en rangos fisiológicos de 40-50 g/L.
Andreas Mueller. The Role of Albumin in the Calculation of Free and Bioavailable Testosterone in Women with
Hyperandrogenemia. In vivo 20: 403-408 (2006).
To libre calculada Albúmina medida nmol/L
To lib
re c
alc
ula
da A
lbúm
ina fija
nm
ol/
L
TO BIO CALCULADA CON DIFERENTES MÉTODOS PARA TO Y SHBG Y DISTINTAS
KA (2005) To Bio
To
SHBG
To Bio
Immulite
Immulite
To Bio
DSL
Immulite
To Bio
Elecsys
Immulite
To Bio
DPC
Immulite
To Bio
Access
Immulite
Muestras MN HN MN HN MN HN MN HN MN HN
RRe Verme
(ka= 1.0)
<
0.462 1.462
4.404 0.0297
0.4107 1.0159
4.1898 <
0.2357
1.0912
3.9103 <
0.2356
1.2270
3.8881 <
0.2477
1.1477
3.4942
RRe Sheeva
(ka=1.0) 0.038
0.405
1.079
3.535
0.0153
0.3043
0.7124
3.3699 <
0.1724
0.8112
3.0885 <
0.1713
0.9095
3.0852 <
0.1787
0.8650
2.7435
Rre Sheeva
(ka=1.6) 0.028
0.283
0.732
2.922
0.0037
0.2171
0.4309
2.7817
<
0.1212
0.5642
2.4746
<
0.1209
0.6320
2.4899
<
0.1242
0.6207
2.1717
To Bio
To
SHBG
To Bio
Immulite
Elecsys
To Bio
DSL
Elecsys
To Bio
Elecsys
Elecsys
To Bio
DPC
Elecsys
To Bio
Access
Elecsys
Muestras MN HN MN HN MN HN MN HN MN HN
RRe Verme
(ka= 1.0)
<
0.4513
1.0253
4.5107
0.0183
0.4085
0.9585
4.1332
<
0.2270
1.0507
3.8304
<
0.2297
1.1787
3.8168
<
0.2453
1.1144
3.4491
RRe Sheeva
(ka=1.0)
0.0375
0.4050
0.7382
3.5981
0.0080
0.3016
0.6612
3.3154
<
0.1679
0.7719
3.0149
<
0.1697
0.8636
3.0183
<
0.1765
0.8343
2.6982
Rre Sheeva
(ka=1.6)
0.0275
0.2850
0.4759
2.9362
0.0325
0.2600
0.3905
2.7231
<
0.1168
0.5311
2.4034
0.0100
0.1600
0.5908
2.4254
<
0.1228
0.5964
2.1241
Saavedra M y col. Estimación de testosterona biodisponible aplicación de diferentes métodos de calculo. Congreso SAEM 2005.
Vermeulen (JCEM 84,3666-72,1999) Södergard ( Steroid Biochem 13, 801-10,1992).
PACIENTES EN TRATAMIENTO CON TO
• Realizar el monitoreo dosando ToBio y ToL,
• Obtener las muestras de acuerdo con la farmacocinética del producto empleado.
• Gel o parche: no realizar la extracción de la muestra inmediatamente después de la aplicación ni del mismo brazo en que fue aplicado por última vez.
TO SALIVAL
• Su exactitud es cuestionada.
• La salivación pasiva es el método de elección para la colección de la muestra.
• To-sal no es directamente comparable a la ToL de suero debido a la unión de To a proteínas de la saliva, lo que afecta sustancialmente la To-sal baja en las mujeres, pero no la To-sal más alta en hombres adultos sanos.
Fiers T y col. Steroids. 2014;86:5-9.
VARIACIONES EN ESTRADIOL LIBRE Y BIODISPONIBLE CON LA EDAD
BMI
E2 libre
E2 biodisponible
DHEA SALIVAL
A4 Y 17ΑLFA-OH-P4 SALIVALES MATUTINOS PARA MONITOREO
EN NIÑOS Y PÚBERES CON HSC CLÁSICA
El tratamiento de la HSC clásica
debida a déficit de 21-hydroxilasa
puede ser
monitoreado por
A4 y 17α-OH-P4 salivales.
Monique J.M. de Groot y col. Clin Chem Lab Med; 2014
TRANSPORTADORES DE VIT D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22528806
• Es la globulina Gc
• También une a los ácidos grasos y los monómeros de actina, además de prevenir su polimerización.
• Rol en: mantenimiento de los niveles totales de la vitamina D regulación de las cantidades de libre (no unida) de vitamina D
disponibles para tejidos y células específicas.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22528806
DBP
VITAMINA D LIBRE
Debería reflejar mejor la actividad biológica de la Vitamina D
que la medición de la
25OH vitamina D total
J Steroid Biochem Mol Biol. 2014;144PA: 132–137.
DETERMINACION DE VIT D LIBRE
No se puede calcular la Vit D como el 0,04% de
la vit D Total.
Porque la
concentración de
DBP varía
Porque existen
polimorfismos de DBP
La medición de directa de Vit D Libre o a través
de la medición de DBP
podría aportar mejor información
que la Vit D Total.
Obesidad, Embarazo, ACO,TRH,
Enf Renal, Enf Hepática,
Proteinuria, UTI
Que afectan su estructura y su
afinidad por Vit D.
Varían con la raza.
DETERMINACION DE VIT D LIBRE
Ultracentrifugación
No para clínica
Cálculos
Se necesitan 3 mediciones de DBP
Es costosa
Ensayos no validados totalmente
Idealmente se debería realizar la genotipificación de DBP
• Métodos de medición directa de Vit D Libre???
DETERMINACION DE VIT D LIBRE DIRECTO
DBP Y VIT D BIODISPONIBLE
Controles Pac crítico Embarazadas Controles Pac crítico Embarazadas Controles Pac crítico Embarazadas
25OHViT D Total DBP Vit D biodisponible calculada
VIT D BIODISPONIBLE Y EMBARAZO
1er Ttrimestre 2do Ttrimestre 1er Ttrimestre 2do Ttrimestre
1er Ttrimestre 2do Ttrimestre
25OH Vit D Total DBP Vit D biodisponible
calculada
CONCLUSIONES
• Medición de esteroides en saliva: refleja las concentraciones de hormona libre y no se ve afectado por las concentraciones de proteínas de transporte.
• Se ha reportado gran estabilidad de los esteroides en muestras de saliva.
• SAF y CLU: para incrementar la sensibilidad diagnóstica es necesario repetir el muestreo y su medición en más de una ocasión.
• Al igual que para el CLU, el muestreo es esencial para obtener resultados confiables (importancia de la claridad de las instrucciones al paciente).
• Vit D libre: incierto futuro de su aplicación. Sólo para embarazo, enf crítica, hipoproteinemias????. Se requiere desarrollo de kits adecuados.
Dra. Cecilia Andrea Fenili
ceciliafenili@diagnosticomaipu.com.ar
Muchas gracias por su atención.
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