germán bou microbiología complejo hospitalario ... · como su morfología ... perfiles de...

Germán Bou

Microbiología

Complejo Hospitalario Universitario La Coruña

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1900 1950 1975 2000 2010

Culture-based Methods

Nucleic acid amplification technologies Serological

technologies

Proteomic-based Methods

¿¿¿¿???????

Los métodos tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las características “observables” de las bacterias como su morfología, desarrollo, propiedades bioquímicas y metabólicas cuando estas crecen en cultivos

Φαίνειν “Mostrar” “Tipo”

“Conjunto de rasgos de un organismo”

Métodos Fenotípicos

Time from onset of septic shock to effective antibiotic initiation (hrs)

Inadequate initial therapy is associated with higher mortality in severe infections

• Métodos Fenotípicos

• Métodos Moleculares

• Métodos basados en Proteómica

• Métodos Fenotípicos

• Métodos Moleculares

• Métodos basados en Proteómica

» Pruebas iniciales: Morfología en tinción de Gram, crecimiento en función de la atmósfera de incubación, crecimiento en función de específicos medios de cultivo.

» Determinación del género. Pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad

Métodos Fenotípicos

» Por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie. El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar con un alto grado de precisión la mayoría de las cepas clínicamente significativas

Métodos Fenotípicos

Métodos Fenotípicos

Métodos Fenotípicos

Métodos Fenotípicos

PRUEBAS NEGATIVAS

PRUEBAS POSITIVAS

Métodos Fenotípicos

Métodos Fenotípicos

Métodos Fenotípicos

Métodos Fenotípicos

Métodos Fenotípicos

DNA Genes

mRNA (transcripto)

Proteínas

Metabolitos

Genoma

Transcriptoma

Proteoma

Metaboloma

FENOTIPO

Splicing alternativo

Interacciones proteína-proteína

Modificaciones Post-traducción

EXP

RESIO

N TEM

PO

RA

L

Métodos fenotípicos: Problemas » La identificación más probable y no definitiva, debido a la ausencia de

concordancia entre las características morfológicas y/o fenotípicas del aislamiento en cuestión y las correspondientes a la(s) cepa(s) de la especie tipo

» No todas las cepas de una misma especie muestran una característica específica

» Una misma cepa puede generar diferentes resultados en ensayos repetidos

» Las limitaciones en la base de datos de bacterias correspondiente

»MUY LENTOSSSSSSS

• Métodos Fenotípicos

• Métodos Moleculares

• Métodos basados en Proteómica

Métodos Moleculares

Con el objetivo de identificar el agente etiológico responsable del proceso infeccioso, para conocer las implicaciones patogénicas/patológicas, evolución clínica y aplicar una terapia antimicrobiana efectiva, un pilar fundamental en la práctica de la microbiología clínica lo constituye la asignación de especie a un aislamiento microbiano

Métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos

Secuenciación Espectroscopía basada en Electrospray ionización TOF

PLEX-ID (antiguo T5000)

Detección Molecular

Diagnóstico molecular no es sinónimo de rapidez

Rep-PCR diversilab Horas

DNA sequencing Horas-Días

454 Sequencing Días

Molecular detection

Day 4 Day 3 Day 2 Day 1

readjustment

Gram Species Blood Culture

2-3 days

Resistance

culture

Gram, Species, Resistance (VRE & MRSA & BLEE )

6 h

PCR PCR

readjustment

readjustment

+ culture

readjustment

readjustment

Reference Sample nº

BC+/SF+ BC+/SF- BC-/SF+

JCM. 2009. 47:2405 784 73 (61%) 27 (23%) 18 (15%)

JCM. 2005. 57: 601 103 20 (19%) 1 (1%) 14 (13%)

BMC Infect. Dis. 2009. 9: 126

101 14 (13%) 9 (9%) 14 (13%)

CMI. 2009. 15: 544 359 58 (10%) 16 (3%) 77 (14%)

Shock. 2010.34:27 144 30 (21%) 13 (9%) 10 (7%)

Molecular Diagnosis of Sepsis

Septifast MagicPlex Vyoo/ Looxster

Filmarray Verigene

Procedure RT-PCR (blood)

RT-PCR (blood)

Multiplex PCR+microarray

(blood)

RT-PCR (positive

BC)

Microarray+ signal

amplification (positive BC)

Microorganisms (N)

25 91 41 24 3 pannels (30)

Resistance markers

VanA/B mecA

VanA/B mecA

VanA/B, mecA, CTX-M-15, SHV

VanA/B mecA, KPC

VanA/B, mecA,+ 5

carbapenemases

Complexity Yes Yes Yes No No

Integrated system No No No Yes Yes

Turnaround time (h)

6 4-5 7 1 2.5

Verigene

PNA (Peptide Nucleic Acid) Probes

• Métodos Fenotípicos

• Métodos Moleculares

• Métodos basados en Proteómica

Maldi-TOF Bruker VITEK-MS BioMerieux

MALDI BIOTYPER

La identificación microbiana del siglo XXI

El diagnóstico rápido conduce a la detección u orientación del agente etiológico, ayudando al correcto tratamiento, mejorando el pronóstico del paciente, reduciendo la estancia hospitalaria y es la base para el establecimiento de medidas preventivas y coste-efectivas.

LA IMPORTANCIA DE UNA RESPUESTA RÁPIDA

4 a 72 HORAS

● Basados en propiedades morfológicas, fisiológicas y bioquímicas (tinciones, cultivos, pruebas bioquímicas, pruebas serológicas)

● Miniaturización y automatización en placas de microdilución ● Técnicas de biología molecular

MÉTODOS CONVENCIONALES DE IDENTIFICACIÓN Y SENSIBILIDAD

Bacterias

► Grampositivos

► Gramnegativos

► Anaerobios

► Exigentes

► Micobacterias

Levaduras

Hongos filamentosos

• Sin pruebas preliminares ni conocimiento presuntivo del microorganismo

• Misma base de datos y mismo procedimento para la identificación de distintos grupos de microorganismos:

IDENTIFICACIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI -TOF

RESULTADOS EN MINUTOS

Reproducibilidad

Medida de proteínas abundantes (ribosomales )

Espectrometría de masas. Técnica analítica que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos, separándolos en función de su relación masa/carga (m/z).

En el espectrómetro de masas se produce la separación de las especies iónicas de la muestra, en función de su masa.

El espectro de masas de cada compuesto se denomina “huella química” y es una representación gráfica de los fragmentos obtenidos, por orden creciente de masa frente a su abundancia relativa.

Dado que la mayoría de los iones formados poseen una sola carga, la relación “m/z” es equivalente a “m”. masa/carga

inte

nsi

dad

BASE DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Fuente de ionización. Es el elemento del espectrómetro que ioniza el material que va ser analizado.

Ionización. Proceso físico o químico mediante el cual se producen iones (átomo o molécula cargada eléctricamente debido al exceso o falta de electrones)

Detector. Los iones que llegan al detector producen una señal eléctrica que es procesada, ampliada y enviada a un ordenador. El registro obtenido es el Espectro de masas.

Analizador de masa. Utiliza un campo eléctrico o magnético para acelerar los iones y separarlos en función de su relación masa/carga (m/z).

ESPECTRÓMETRO DE MASAS - COMPONENTES

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight

Un ácido orgánico (denominado Matriz) colabora en el proceso al “amortiguar” la energía que recibe la muestra y facilitar la cesión de iones a la muestra.

La muestra es sometida un “bombardeo” láser que provoca su Desorción (paso de fase sólida a fase gaseosa).

Técnica basada en la Ionización de biomoléculas que son separadas en función de su masa formando un perfil específico.

Láser + Matriz: Energía para este fenómeno con poco calentamiento de la muestra: proteínas intactas pasan a fase gaseosa sin casi descomposición.

MALDI-TOF

MALDI-TOF

En el detector se genera el perfil o huella química

específico de esa muestra.

La muestra ionizada y vaporizada crea una densa nube de gas entre dos electrodos. El campo eléctrico formado se emplea para acelerar la muestra hasta el detector.

Perfiles de diferentes especies de Bacillus

-6000

-4000

-2000

0

2000

4000

6000

a.i.

B. globigii

B. licheniformis

B. subtilis

B. thuringiensis

Selección de la colonia

Transferencia a la tarjeta

Comparación del perfil con la base de datos

Especie identificada

Microorganismo desconocido

Generación del perfil o huella molecular

FLUJO DE TRABAJO MALDI Biotyper

1

2

3

4

Base datos microorganismos

Resultado identificación

Comparación de Perfil

Espectro principal

PROCESO DE COMPARACIÓN AUTOMÁTICO

● Resultado en menos de 30 minutos.

● MALDI Sepsityper: protocolo en 1 único microtubo

● A partir de 1 ml de hemocultivo

MALDI SEPSITYPER

Terapia empírica dirigida en pacientes críticos

Vlek, A. et al. PLoS ONE 2012 7(3)

IDENTIFICACIÓN DESDE HEMOCULTIVO

COMBINACIÓN CON ANTIBIOGRAMA DIRECTO

Incorporación de una estrategia de identificación temprana en hemocultivos.

● Identificación rápida permite una terapia apropiada de forma temprana ● Reducción en el desarrollo de resistencias ● Disminución efectos secundarios

Mejor pronóstico del paciente Reducción tiempo estancia hospitalaria

Coste total de hospitalización por paciente se redujo, de

media, en 19.547 $ (introducción de MALDI

Biotyper).

Perez, K et al. Arch Pathol Lab Med 2012

IMPACTO DE LA IDENTIFICACIÓN TEMPRANA

Identificación de MICOBACTERIAS desde ► Medio sólido ► Médio líquido ► Medio líquido en sistemas automáticos (MGIT)

Ventajas frente a técnicas de biología molecular (PCR) ► Rápidez (30 min vs 90-120 min) ► Coste-efectivo

MICOBACTERIAS

Gran mejora frente a métodos tradicionales

HONGOS FILAMENTOSOS

Ensayo funcional detección actividad antimicrobiana

Microorganismo portador enzima degrada antibiótico

Modificación sufrida por antibiótico detectada en MALDI Biotyper

NO SOLO IDENTIFICACIÓN

Microorganismo portador enzima degrada antibiótico

Modificación sufrida por antibiótico detectada en MALDI Biotyper

Ensayo funcional detección actividad antimicrobiana

NO SOLO IDENTIFICACIÓN

Proteomic detection

Oviaño M et al. Unpublished

Diversos estudios demuestran que MALDI-TOF es una herramienta relevante para la detección de resistencia a antibióticos y abre nuevos caminos en el entorno clínico

MALDI-TOF con aplicaciones para:

(1) detección de modificación de antibióticos por enzimas (2) detección de mecanismos de resistencia a través de estudios proteómicos de bacterias multiresistentes (3) análisis de la modificación de sitios diana, como la metilación ribosomal (4) estudio de mecanismos de expulsión de antibióticos por la cuantificación de los mismos.

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry for Detection of Antibiotic Resistance Mechanisms: from Research to Routine Diagnosis - Hrabák, J. et al Clin. Microbiol. Rev. January 2013 vol. 26 no. 1 103-114

NO SOLO IDENTIFICACIÓN

Maldi MSP_sm

100

9080

A...

A...

A...

A...

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A...

A...

A...

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Aspergillus niger D_16_256_7_3 LLH

Aspergillus niger e7158 LLH

Aspergillus niger 2008_146035 MUZ

Aspergillus niger DSM 737 DSM

Aspergillus niger 01 MPA_1261 MPA

Aspergillus niger DSM 22593 DSM

Aspergillus niger M10 RLH

Aspergillus niger M14 RLH

Aspergillus niger Asp_Nr_2 UGB

Aspergillus niger M16 RLH

Aspergillus niger DSM 11167 DSM

Aspergillus niger DSM 12634 DSM

Aspergillus ochraceus DSM 63304 DSM

Aspergillus ochraceus DSM 2499 DSM

Aspergillus ochraceus F48 LLH

Aspergillus ochraceus DSM 824 DSM

Aspergillus candidus_BB MPA 1330 MPA

Aspergillus candidus_BB MPA 1339 MPA

Aspergillus candidus_BB F45 LLH

Aspergillus fumigatus 2008_136063 MUZ

Aspergillus fumigatus 2008_136033 MUZ

Aspergillus fumigatus M02 RLH

Aspergillus fumigatus F42 LLH

Aspergillus fumigatus ea1457 LLH

Aspergillus fumigatus DSM 15966 DSM

Aspergillus fumigatus D_16_256_4_6 LLH

Aspergillus fumigatus MPA 1342 MPA

Aspergillus fumigatus D_16_256_7_4 LLH

Aspergillus fumigatus e7499 LLH

Aspergillus fumigatus M03 RLH

Aspergillus fumigatus DSM 21023 DSM

Aspergillus clavatus_DD F44 LLH

Aspergillus flavus_CC1 M08 RLH

Aspergillus flavus_CC1 M09 RLH

Aspergillus flavus_CC1 M07 RLH

Aspergillus flavus_CC1 M19 RLH

Aspergillus flavus_CC1 MPA 1327 MPA

Aspergillus flavus_CC1 2008_146044 MUZ

Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1863 DSM

Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1147 DSM

Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1862 DSM

Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1861 DSM

Aspergillus flavus_CC1 DSM 62065 DSM

Aspergillus glaucus_DD 2009_305262 MUZ

Acremonium strictum_DD DSM 15965 DSM

Arthrinium phaeospermum_DD MPA_1268 MPA

Alternaria alternata DSM 62006 DSM

Alternaria alternata DSM 12633 DSM

Alternaria alternata DSM 62010 DSM

Alternaria alternata DSM 1102 DSM

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Posibilidad de realizar estudios epidemiológicos que facilitan el control de infecciones y el correcto manejo de las mismas.

Análisis de relaciones taxonómicas mediante dendogramas de sencilla generación.

La mayoría de proteínas estudiadas son proteínas ribosomales, lo que garantiza una capacidad de discriminación inter e intra-especie comparable a secuenciación DNA.

EPIDEMIOLOGÍA

Número de artículos

PUBLICACIONES IDENTIFICACIÓN POR MALDI- TOF MS

INCORPORACIÓN MALDI-TOF EN RUTINA DE IDENTIFICACIÓN

INCORPORACIÓN DE MALDI Biotyper

● Resultados muy rápidos; disminución del tiempo de respuesta entre 24-72 horas

● Resultados comparables con técnicas de secuenciación, que añaden valor clínico a la respuesta del laboratorio (UCI, hematología, oncología, pacientes crónicos, fibrosis quística, microorganismos emergentes)

● Reorganización de flujos y protocolos de trabajo. Eliminación de pruebas preliminares, menos repeticiones y subcultivos, sustitución de técnicas convencionales y de biología molecular

● Fácil implementación en el laboratorio. No precisa personal con experiencia previa en espectrometría de masas. Sin requerimiento especiales de instalación

● Gestión del antibiograma de forma más eficiente. Antibiograma dirigido en función de la identificación obtenida

MALDI Biotyper. IMPACTO EN EL LABORATORIO

● No modifica la Cartera de Servicios

● Resultado “inmediato”. Disponible dentro de la jornada laboral

● La sencillez de la técnica permite su realización en formato “24/7“

● Reducción gasto farmaceútico (tratamientos empíricos dirigidos, desescalado, correcta cobertura)

● En estudio de sepsis, permite identificar desde el hemocultivo positivo y preparar simultáneamente el antibiograma directo

● Reducción días de estancia

● Manejo infección nosocomial y de resistencias

● Optimización de stocks y gestión de residuos

MALDI Biotyper. IMPACTO EN LA GESTIÓN HOSPITALARIA

REDUCCIÓN DEL TIEMPO DE RESPUESTA EN LA IDENTIFICACIÓN MICROBIANA: IMPLANTACIÓN DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF EN EL SERVICIO

DE MICROBIOLOGÍA

COMPLEJO HOSPITALARIO UNIVERSITARIO A CORUÑA

“… drástico acortamiento de los tiempos diagnósticos de respuesta […] y con un importante ahorro económico en el hospital por el ahorro de terapias antibióticas empíricas.”

“… el gasto diario de antibióticos de amplio espectro que se administran empíricamente a la espera de un resultado microbiológico definitivo se sitúa en muchos casos entre 60 – 115 euros/día/paciente.”

“El coste del tratamiento dirigido una vez conocido el agente infeccioso causal podría reducirse en algunos casos a 3 – 5 euros/paciente/día.”

CONCLUSIONES

● Diseño ergonómico. Equipo de sobremesa que no precisa adecuación en el área de instalación

● Tecnología WhisperMode ™: Funcionamiento silencioso en la zona de trabajo

● Tecnología FlashDetector ™. Excelente sensibilidad comparable a los grandes equipos usados en investigación

● Tecnología “Full Spectrum Resolution”. Evita el empleo de tubos de vuelo innecesariamente largos

● SmartSpectra™ Acquisition: Mayor rápidez de análisis. Mayor vida útil de la fuente del láser. Menor número de “disparos” por muestra.

● Fuente Auto-Limpiable. Prolonga la vida media del láser y alarga las intervenciones preventivas.

● Rápida inserción de la tarjeta

MALDI Biotyper. Sistema compacto con un excelente rendimiento

Bruker - Microflex LT

Shimadzu - Axima

0.0

0.5

1.0

1.5

4 x10

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4 x10

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0.75

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1.25

4 x10

3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z

Microflex LT

Ultraflex II

Autoflex II

Aspergillus flavus

MALDI Biotyper. Sistema compacto con un excelente rendimiento

Resultados independientes del tamaño del instrumento

● Acelera de forma significativa la identificación de microorganismos en los laboratorios de rutina. ● Mejora la calidad de los resultados de identificación.

● Reduce la carga de trabajo y la utilización de consumibles.

● Las nuevas aplicaciones irán mejorando su utilidad en el laboratorio de Microbiología.

MALDI Biotyper

Others…

o Non-invasive test o Handheld portable devices o Inmediate results o Detection of selective breath

volatile organic compounds

Others…

VIDEO

Mutters et al. Annals of Laboratory Medicine. 2014; 34: 111-117

» Métodos fenotípicos siguen siendo válidos aunque adolecen de lentitud

» Métodos moleculares y los nuevos sistemas basados en proteómica pueden

ayudar a una perfecta identificación de los microorganismos

» La mayoría de los laboratorios siguen usando los métodos fenotípicos. De manera creciente y progresiva los laboratorios de microbiología van incorporando esta nueva tecnología, lo cuál supone una oportunidad para el diagnóstico microbiológico

» Hasta que no esté perfectamente establecida y consolidada es necesaria una comunicación entre los servicios clínicos y el laboratorio de microbiología para clarificar el significado clínico de los aislamientos para evitar cualquier tipo de confusión