fagos en la industria láctea un problema siempre vigente · presencia de fagos en el ambiente...
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Fagos en la industria lFagos en la industria láácteacteaUn problema siempre vigenteUn problema siempre vigente
MarMaríía Luja Lujáán n CapraCapra
INTI LINTI LáácteoscteosRafaela, 11 de junio de 2015Rafaela, 11 de junio de 2015
Daniela Daniela GuglielmottiGuglielmotti
La La bioconversibioconversióónn
de sustratos en compuestos de mayor valor de sustratos en compuestos de mayor valor agregado es el proceso bagregado es el proceso báásico de una amplia variedad de sico de una amplia variedad de
industrias biotecnolindustrias biotecnolóógicasgicas
BacteriofagosIndustria fermentativa
Las Las bacteriasbacterias
representan el pilar fundamental de los procesosrepresentan el pilar fundamental de los procesos
La mayorLa mayoríía de las a de las industrias fermentativasindustrias fermentativas
experimentan experimentan contaminaciones fcontaminaciones fáágicasgicas
Graves consecuenciasGraves consecuencias
de estas infecciones para todos los de estas infecciones para todos los sectores industrialessectores industriales
(retrasos o freno en las fermentaciones, impacto en la (retrasos o freno en las fermentaciones, impacto en la
calidad del producto, elevados costos y tiempo para identificar calidad del producto, elevados costos y tiempo para identificar origen e implementar origen e implementar medidas correctivas)medidas correctivas)
Cualquier poblaciCualquier poblacióón bacteriana en crecimiento activo es n bacteriana en crecimiento activo es susceptible a susceptible a infecciones finfecciones fáágicasgicas
Infecciones fágicas en la industria fermentativa
((EmondEmond
& & MoineauMoineau, 2007), 2007)
Los grandes volLos grandes volúúmenes de menes de leche crudaleche cruda
procesados diariamente procesados diariamente constituyen la constituyen la vvíía principal de ingreso de fagos a las plantasa principal de ingreso de fagos a las plantas
La elevada frecuencia de La elevada frecuencia de mutacimutacióónn
es origen de creciente es origen de creciente diversidaddiversidad
Entre el Entre el 0,1 y el 10% de los 0,1 y el 10% de los batchsbatchs
estestáán comprometidos por las n comprometidos por las infeccionesinfecciones
Fagos en la industria lácteaIngreso y persistencia
PRÁCTICAMENTE INEVITABLE
PRESENCIA DE FAGOS EN EL AMBIENTE INDUSTRIAL
MicrografMicrografíías electras electróónicas de la inicas de la infeccinfeccióónn
de un de un cultivocultivo
de S. thermophilus. El de S. thermophilus. El cultivocultivo
se se observaobserva
antes (A) y antes (A) y despudespuééss
(D) de la (D) de la infecciinfeccióónn. . AdsorciAdsorcióónn
de de loslos
virionesviriones
a la a la superficiesuperficie
celularcelular
bacterianabacteriana
antes (B) y antes (B) y despudespuééss
(C) de la (C) de la inyecciinyeccióónn
del AND del AND ffáágicogico
en el en el citoplasmacitoplasma
celularcelular..
BacteriofagosBacteriofagosInfecciInfeccióón y lisis celularn y lisis celular
CCéélulas de lulas de LactobacillusLactobacillus
spsp. . infectadas por un fago. infectadas por un fago.
90 min
después de la infección
Lisis celular
Sensibilidad a fagos en las tecnologSensibilidad a fagos en las tecnologíías de as de leches fermentadas y quesos leches fermentadas y quesos
QUESOSQUESOS LECHES FERMENTADASLECHES FERMENTADAS
Mat. prima/Trat. térmico Leche cruda/SuaveLeche cruda/Suave‐‐Moderado Moderado
(63(63°°CC, 72, 72°°CC))Leche cruda/EnLeche cruda/Enéérgico rgico (90(90°°CC))
Proceso MMúúltiples etapas que involucran ltiples etapas que involucran
operarios y utensilios variosoperarios y utensilios variosAutomatizado y Automatizado y
relativamente asrelativamente aséépticoptico
Suero SinSinééresis, drenaje, circulaciresis, drenaje, circulacióón, n,
aerosolesaerosolesSin separaciSin separacióónn
Vías de ingreso fágico Leche crudaLeche crudaAmbiente Ambiente Cultivos iniciadoresCultivos iniciadores
Ambiente (ruptura de Ambiente (ruptura de
barreras fbarreras fíísicas)sicas)Cultivos iniciadoresCultivos iniciadores
Frecuencia de infecciones Elevada Elevada Baja Baja
Diversidad fágica ElevadaElevada BajaBaja
Cultivos iniciadores Acidificantes/Acidificantes/multicepamulticepa Acidificantes/Acidificantes/multicepamulticepa
ADITIVOADITIVO
propprop. . probiprobióóticatica
cepacepa--especespecííficafica
FERMENTOFERMENTO FAGOSFAGOS
Alta Alta vulnerabilidad a vulnerabilidad a
fagosfagos
LECHES FERMENTADAS PROBIÓTICAS
Mat. prima/Trat. térmico Medio a base de leche/Moderado
Proceso AutomatizadoEstricto control microbiológico
Suero Sin separación
Vías de ingreso fágico Ambiente (ruptura de barreras físicas)Cultivos iniciadores
Frecuencia de infecciones Elevada
Diversidad fágica Elevada
Cultivos iniciadores Probiótico/monocepa
Aumento y diversificaciAumento y diversificacióón en el uson en el usoCEPA CEPA
PROBIPROBIÓÓTICATICA
Sensibilidad a fagos en las tecnologSensibilidad a fagos en las tecnologíías de as de leches fermentadas y quesos leches fermentadas y quesos
fermentaciones fermentaciones muy largasmuy largas
LisogeniaLisogenia
aireaire
ingredientes, materia prima, salmueras (queseringredientes, materia prima, salmueras (queseríías) as) producto en diferentes puntos de la lproducto en diferentes puntos de la líínea de produccinea de produccióónn
equipamiento y superficies (pisos, paredes, picaportes, equipamiento y superficies (pisos, paredes, picaportes, mesas, implementos de limpieza, camesas, implementos de limpieza, caññereríías, etc.)as, etc.)
efluentes efluentes
QuQuéé/d/dóónde muestrear? (nde muestrear? (ubicuidadubicuidad))
ConservaciConservacióón de la muestran de la muestra
CuCuáándo muestrear?ndo muestrear?Monitoreo o anMonitoreo o anáálisis de rutina lisis de rutina FermentaciFermentacióón anormal n anormal
DetecciDeteccióón de fagos n de fagos MUESTREOMUESTREO
INSTRUMENTALESINSTRUMENTALES
MOLECULARESMOLECULARES
MICROBIOLMICROBIOLÓÓGICASGICAS
DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍASAS
Permiten reducir tiempos de anPermiten reducir tiempos de anáálisis y aumentar el nlisis y aumentar el núúmero de mero de muestras analizadas en menor tiempo. muestras analizadas en menor tiempo.
Seguimiento de Impedancia o Conductancia:Seguimiento de Impedancia o Conductancia:
detecta detecta diferencias en estos pardiferencias en estos paráámetros cuando el cultivo metros cuando el cultivo desarrolla en leche (comparacidesarrolla en leche (comparacióón con control libre de n con control libre de
muestra).muestra).
InmunoensayosInmunoensayos: : reacciones con anticuerpos especreacciones con anticuerpos especííficos ficos de los diferentes grupos morfolde los diferentes grupos morfolóógicos de fagos. gicos de fagos.
MicroscopMicroscopííaa
electrelectróónica:nica:
clasificaciclasificacióón en diferentes n en diferentes grupos morfolgrupos morfolóógicos.gicos.
DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍAS INSTRUMENTALESAS INSTRUMENTALES
MicroscopMicroscopííaa
electrelectróónicanica
Permite diferenciar grupos morfológicos.
VENTAJASVENTAJAS
LD: 107
UFP/ml.
Equipamiento y personal
Numerosas etapas de purificación y concentración.
No discrimina partículas activas/inactivas
DESVENTAJASDESVENTAJAS
28,8 nm
92,8 nm
MicrografMicrografíías electras electróónicas nicas de fagosde fagos
de de S. thermophilusS. thermophilus. .
Permiten reducir tiempos de anPermiten reducir tiempos de anáálisis y aumentar el nlisis y aumentar el núúmero de mero de muestras analizadas en menor tiempo. muestras analizadas en menor tiempo.
Sondas especSondas especííficas:ficas:
dirigidas a determinar la naturaleza dirigidas a determinar la naturaleza de especies fde especies fáágicas (gicas (LactococcusLactococcus) ) ((MoineauMoineau
et al., 1992)et al., 1992)..
PCR (PCR (PolymerasePolymerase
ChainChain
ReactionReaction):):
amplificaciamplificacióón de n de secuencias conservadas en el genoma secuencias conservadas en el genoma ffáágicogico..
PCR tradicional: detecta, identificaPCR tradicional: detecta, identifica
PCR cuantitativa: detecta, identifica, cuantificaPCR cuantitativa: detecta, identifica, cuantifica
DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍAS MOLECULARESAS MOLECULARES
TipificaciTipificacióón de fagos por PCR y secuenciacin de fagos por PCR y secuenciacióón del n del amplicamplicóónn
((VR2VR2): ): disediseñño racional de estrategias de rotacio racional de estrategias de rotacióón n
de cepas de de cepas de StSt. thermophilus . thermophilus y y LcLc. . lactislactis
multiplexmultiplex::
deteccideteccióón simultn simultáánea de varias especies de nea de varias especies de fago en la misma reaccifago en la misma reaccióón (fermento n (fermento multicepamulticepa))
PCRPCR
PCRPCR
tradicional: tradicional: DetecciDeteccióón e identificacin e identificacióón de fagos en n de fagos en muestras lmuestras láácteas (extraccicteas (extraccióón de ADN n de ADN ffáágicogico
o deteccio deteccióón n
directa) por directa) por amplificaciamplificacióón de secuencias conservadas en el n de secuencias conservadas en el genoma genoma ffáágicogico
muestras mix
de PCR ciclos de PCR gel
de agarosa
Técnica cualitativa
Límite de detección 103
‐
105
ufp/ml
PCRPCR
La presencia de fagos es ubicua en las plantas industriales. La de ADN fágico, más aún.
tiempo de análisis reducido
análisis de un gran número de muestras
detección e identificación (cuantificación) de grupos/especies de fagos
VENTAJASVENTAJAS
requiere conocimiento de la secuencia nucleotídica
de los genes de los fagos a determinar
no informa infectividad
(sólo detecta ADN fágico)
detecta ADN fágico
de una especie determinada, pero no se sabe de la especificidad sobre las cepas que en particular se usan en una dada planta
posee menos sensibilidad que las técnicas microbiológicas estándar
DESVENTAJASDESVENTAJAS
Se basan en la inhibiciSe basan en la inhibicióón de las bacterias componentes del n de las bacterias componentes del starterstarter. .
TestTest
de Actividad:de Actividad:
detecta diferencias en la produccidetecta diferencias en la produccióón n de acidez (comparacide acidez (comparacióón con control libre de muestra) n con control libre de muestra) (FIL(FIL--
IDF, 1980)IDF, 1980)..
TestTest
de Turbidez:de Turbidez:
clarificaciclarificacióón (lisis) del cultivo en n (lisis) del cultivo en presencia de la muestra presencia de la muestra (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991)..
Spot Spot TestTest::
detecta zonas de lisis en el cultivo detecta zonas de lisis en el cultivo bacteriano (medio agarizado) bacteriano (medio agarizado) (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991). .
Doble capa agarizada:Doble capa agarizada:
permite enumerar las placas de permite enumerar las placas de lisis formadas lisis formadas (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991)..
C MTC Mɸ
DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍAS MICROBIOLAS MICROBIOLÓÓGICASGICAS
DetecciDeteccióón de fagos por metodologn de fagos por metodologíía a dependientes de cultivodependientes de cultivo
PROCESAMIENTO DE MUESTRASPROCESAMIENTO DE MUESTRAS(IDF, (IDF, BullBull. 263, 1991). 263, 1991)
Muestra
(suero, leche fermentada)
Centrifugación o filtración
Ajuste de pH
(4,5-4,7)
Filtración por membrana estéril (diám. poro 0,45 μm)
Tratamiento térmico (90°C/15 min)
Muestra para análisis de inhibidores químicos
Muestra para análisis de bacteriofagos
CinCinééticas de acidificaciticas de acidificacióón en leche n en leche por parte de por parte de S. thermophilusS. thermophilus,,
en presencia de fagos.en presencia de fagos.
5
5.5
6
6.5
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo (min)
pH
control m.o.i.=1.25.10-3
m.o.i.=1.25.10-4 m.o.i.=1.25.10-5
S. thermophilusS. thermophilus
StSt
12.4 + fago 02112.4 + fago 021--44
DESVENTAJASDESVENTAJAS
En general, poco sensible, para cultivos multicepa.
VENTAJASVENTAJAS
Método sencillo.
TestTest
de Actividadde Actividad
ClarificaciClarificacióón (lisis) del cultivo en n (lisis) del cultivo en presencia de la muestra presencia de la muestra (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991)
C MTC Mɸ
TestTest
de Turbidezde Turbidez
Método sencillo.
Sensible (enriquecimiento en fagos con sucesivos subcultivos: amplificación).
Específico (aislamiento previo
de clones).
VENTAJASVENTAJAS
Tiempo de procesamiento prolongado (dependiente de cultivo).
DESVENTAJASDESVENTAJAS
Muestra
tal cualMuestra
calentadaInterpretación de
resultados
+ + Inhibición por ATB
+ ‐ Inhibición por fagos
‐ ‐ Sin inhibición
+ presencia de lisis‐
ausencia de lisis requiere confirmacirequiere confirmacióón: placas de lisisn: placas de lisis
Método sencillo.
Sensible (LD bajo).
Específica (aislamiento previo de clones).
VENTAJASVENTAJAS
Tiempo de procesamiento prolongado (dependiente de cultivo).
No detecta fagos que no producen placas de lisis visibles.
DESVENTAJASDESVENTAJAS
DetecciDeteccióón y enumeracin y enumeracióón n de de bacteriofagosbacteriofagos
Spot Spot TestTest
MMéétodo de todo de lala
DobleDoble
Capa Capa AgarizadaAgarizada
Spot Spot TestTest
y Doble capa y Doble capa agarizadaagarizada
FormaciFormacióón de placas de lisis y de zonas de inhibicin de placas de lisis y de zonas de inhibicióónn
DetecciDeteccióón de fagos n de fagos COMPARACICOMPARACIÓÓN DE METODOLOGN DE METODOLOGÍÍAS AS
*
Sí
permite conocer la especificidad de cepa (dependientes de cultivo).
Tradicionales Instrumentales y Moleculares
Tiempo de ensayo Elevado Reducido
Sensibilidad analítica ~10 ufp/ml 102
‐
107
ufp/ml
Identificación fágica
(especie, grupo
morfológico)No permite* Permite
InfectividadDetermina sólo fagos
infectivosNo discrimina fagos
infectivos/fagos no infectivos
Complejidad del
laboratorioMicrobiología general Laboratorios equipados y
especializados
Capacitación del personal
técnicoPersonal con elevado
entrenamiento y criterioPersonal con elevado
entrenamiento y criterio
Costo económico Bajo/Moderado Elevado
(C(Capraapra
et al. 2009, et al. 2009, MercantiMercanti
et al. 2011)et al. 2011)LactobacillusLactobacillus
((BinettiBinetti
& & ReinheimerReinheimer
2000) 2000)
StreptococcusStreptococcus thermophilusthermophilus
EvoluciEvolucióón fn fáágica en la industria lgica en la industria láácteacteaResistencia tResistencia téérmicarmica
(Su(Suáárez rez andand
ReinheimerReinheimer
2002, 2002, MMüüllerller--MerbachMerbach
et al. 2005, et al. 2005, BuzrulBuzrul
et al. 2007, et al. 2007, AtamerAtamer
et et al. 2009)al. 2009)
LactococcusLactococcus
lactislactis
((AtamerAtamer
et al. 2011)et al. 2011)LeuconostocLeuconostoc
TECNOLÓGICAS
Resistencia tResistencia téérmica de rmica de bacteriofagosbacteriofagosImplicancias en la industria lImplicancias en la industria láácteactea
ANALÍTICAS
FagosFagos
vehiculizadosvehiculizados
en la en la leche leche crudacruda
(10(10--101044
ufpufp/ml),/ml),FagosFagos
que que resisten los resisten los tratamientos ttratamientos téérmicosrmicos,,
ContaminaciContaminacióón n del ambiente del ambiente (planta, laboratorios)(planta, laboratorios)
y de productos.y de productos.
INFECCIONES DURANTE LOS PROCESOS DE ELABORACIÓN
Muestras Muestras conteniendo elevados conteniendo elevados niveles de niveles de fagosfagos,,
Mayor Mayor frecuenciafrecuencia
de aislamiento de aislamiento de de fagos fagos termorresistentestermorresistentes,,
InconvenientesInconvenientes
durante los durante los ananáálisis lisis de laboratorio. de laboratorio.
ACTUALIZACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS
Resistencia tResistencia téérmica de rmica de bacteriofagosbacteriofagosImplicancias analImplicancias analííticasticas
Procesamiento de muestras Procesamiento de muestras sospechadas de contener sospechadas de contener
bacteriofagosbacteriofagos
(IDF, (IDF, BullBull. 263, 1991). 263, 1991)Muestra
(suero, leche fermentada)
Centrifugación o filtración
Ajuste de pH
(4,5-4,7)
Filtración por membrana estéril (diám. poro 0,45 μm)
Tratamiento térmico (90°C/15 min)
Muestra para análisis de inhibidores químicos
Muestra para análisis de bacteriofagos
Fagos termorresistentes
Muestra
tal cual
Muestra
calentada
Interpretación de
resultados
+ + Inhibición por ATB
+ ‐ Inhibición por fagos
‐ ‐ Sin inhibición
FAGOS
+ presencia de lisis‐
ausencia de lisis
+
‐
‐
Aumento y diversificaciAumento y diversificacióón de n de poblaciones fpoblaciones fáágicas que resisten los gicas que resisten los
tratamientos ttratamientos téérmicosrmicos
BacteriofagosBacteriofagos
termorresistentestermorresistentesActualizaciActualizacióón de las metodologn de las metodologíías analas analííticas ticas
tradicionalestradicionales
JJ--1 (1965)1 (1965)
MLCMLC--A3R (2005)A3R (2005)
CCLL
2 (2006)2 (2006)
LactobacillusLactobacillus
caseicasei
031031--D (1995)D (1995)
CGLCGL--3 (2009)3 (2009)
CGLCGL--4 (2009)4 (2009)
WPCWPC--1 (2010)1 (2010)
StreptococcusStreptococcus thermophilusthermophilus
P008 (1971)P008 (1971)
P680 (2005)P680 (2005)
P1532 (2005)P1532 (2005)
LactococcusLactococcus
lactislactis
Prof. Prof. HorstHorst
NeveNeve
Prof. Prof. ZeynepZeynep
AtamerAtamer
((CapraCapra et al. 2013)et al. 2013)
InactivaciInactivacióónn
ttéérmica de fagos de rmica de fagos de StreptococcusStreptococcus
thermophilusthermophilus
y y LactobacillusLactobacillus
caseicasei
en tubos de vidrio.en tubos de vidrio.
Fagos con elevada Fagos con elevada resistencia tresistencia téérmicarmica
9090°°CC, leche, leche
9090°°CC, leche, leche
Propuesta de aplicaciPropuesta de aplicacióón de n de tratamiento ttratamiento téérmico mrmico máás s
severo 90severo 90ººCC
––
45 45 minmin
La lLa líínea de puntos vertical senea de puntos vertical seññala la ala la condicicondicióón de incubacin de incubacióón (90n (90ººCC--15 15 minmin) propuesta ) propuesta en la metodologen la metodologíía tradicional para la deteccia tradicional para la deteccióón de n de fagos (IDF, fagos (IDF, BullBull. 263, 1991).. 263, 1991).
InactivaciInactivacióónn
ttéérmica de fagos de rmica de fagos de LactococcusLactococcus
lactislactis
en en tubos de vidrio ( tubos de vidrio ( ))
y de acero inoxidable ( ). y de acero inoxidable ( ).
PPéérdidas moderadasrdidas moderadas
de actividad ade actividad aúún n frente a frente a tratamientos ttratamientos téérmicos severosrmicos severos
(de hasta 100(de hasta 100ººCC) por per) por perííodos de odos de tiempo tiempo
prolongadosprolongados
(hasta 3 h).(hasta 3 h).
(Roca et al. 2010)(Roca et al. 2010)
(Roca(Roca et al. 2011)et al. 2011)
aminoglicaminoglicóósidossidos
++++++R a QR a Q
EvaluaciEvaluacióón de la n de la termorresistenciatermorresistenciade inhibidores qude inhibidores quíímicos (ATB)micos (ATB)
macrmacróólidoslidos
ββ--lactlactáámicosmicos
quinolonasquinolonas
tetraciclinastetraciclinas
((ZorraquinoZorraquino et al. 2008, 2009, 2011et al. 2008, 2009, 2011))
Propuesta de aplicaciPropuesta de aplicacióón de n de tratamiento ttratamiento téérmico mrmico máás s
severo 90severo 90ººCC
––
45 45 minmin
factiblefactible
Resistencia tResistencia téérmica de rmica de bacteriofagosbacteriofagosImplicanciasImplicancias
BALANCE EVOLUTIVO
FagosFagos
BacteriasBacterias
Control Control ffáágicogico
y no y no erradicacierradicacióónn
Notable plasticidad y Notable plasticidad y flexibilidad flexibilidad gengenóómicamica
Elevada frecuencia de Elevada frecuencia de mutacimutacióónn
RRáápida adaptacipida adaptacióónn
ColonizaciColonizacióón de n de ambientes industrialesambientes industriales
EVOLUCIÓN
BACTERIOFAGOSBACTERIOFAGOS
ADAPTACIADAPTACIÓÓNN
MarMaríía Luja Lujáán n CapraCapra
Daniela Daniela GuglielmottiGuglielmotti
VivianaViviana
SuSuáárezrez
Diego Diego MercantiMercantiMariMariáángelesngeles
BriggilerBriggiler
MarcMarcóó
Silvina Silvina PujatoPujato
Jorge Jorge ReinheimerReinheimerAndrea Andrea QuiberoniQuiberoni
GRUPO DE TRABAJOGRUPO DE TRABAJO
Prof. Prof. HansHans--WolfgangWolfgang
AckermannAckermann
Prof. Prof. SylvainSylvain
MoineauMoineau
Prof. Prof. HorstHorst
NeveNeveProf. Prof. ZeynepZeynep
AtamerAtamer
……muchasmuchas
graciasgracias
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