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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD I)E CIENCIAS QUíMICAS
DEPARTAMENTODE QUíMICA ORGANICA
lmuuIu¡¡unuuuau* 5309552798*
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
DERIVADOS DE 2,5-DICETOPIPERIDINASY 3-OXOINDOLIZIDINAS COMO UNAAPROXIMACION A LA OBIENCION
DE PEPTIDOMIMETICOS
TESIS DOCTORAL
MARIA JOSE DOMINGUEZ PEREZ
DIRECTOR: Dra. ROSARIO GONZALEZ MTJNIZ
A mis pad2res
El Trabajo que se describeen estaMemoria ha sido
realizado en el Instituto de Química Médica del Consejo
Superiorde InvestigacionesCientíficasbajo la dirección dela Dra. ~ Rosario GonzálezMufliz, a quien quiero
expresar mi más sincero agradecimientopor su granayuda, dedicacióny asesoramiento.
Deseo expresar mi gratitud, de manera muy
especial, a la Dra. M~ Teresa García López por lasfacilidadesdadas,como Directora del Instituto de Química
Médica, para la realización de este Trabajo, así como, y
principalmente,por su constanteayuda e interés en el
desarrollo del mismo, como Jefe del Equipo de
Investigación.Agradezcoal Dr. Benito Alcaide Alañón el haber
aceptadoserponentede estaTesis.
Mi reconocimientotambiénal Dr. Joaquíndel Río
Zambran.apor la realización de los ensayosbiológicos.Agradezcoal Dr Ibón Alkorta Osoro la realización
de los estudiosde modelizaciónmolecular.
Igualmente, deseoagradecera la Dra. ~ Luisa
Jimeno Herranz su asesoramientoen los estudiosde
análisis conformacionalmedianteRMN.
Agradezco también al Dr. B. Lundt, Jefe del
Departamento del Sistema Nervioso Central de la
compañíadanesaNovo-NordiskAIS, su interésen nuestro
tema de trabajo y a los Dres. NL. Johansen,PL Th0gersen
‘c P. Suzdaky al Sr. K. Madsen,su colaboracióndirecta en
el mismo.
Agradezcoal Dr. Federico Gómez de las Heras,
Director del Instituto de QuímicaMédica cuandocomencé
este Trabajo, las facilidades dadas para iniciar surealización.
Quiero dar las gracias también al personalespecializadodel C.N.Q.O. por la realización de los
microanálisisy los espectrosde Masasy, especiaSiente,a
Dita. ~ Dolores CasadoLópezy a Dita. MercedesPlazaRamírezpor su ayudacon los espectrosde RMN.
Igualmente, agradezcoa Dña. Asunción Lorenzo
Vián su colaboración con el HPLC y a D. FranciscoCaballero Pérez, su ayuda en la transcripción del
manuscrito.A la Dra. Rosario Herranz Herranz y a mis
compañerosde laboratorio, Ana, Isabel, Juan, Marisol,M~ Luisa, Mercedesy Natalia, gracias por vuestroapoyoy
por todos los buenosmomentosque hemoscompartidoa lo
largo de estosaños.
D4DICE
Págs.
1. INTRODUCCION . . 15
1.1. APROXIMACIONES HACIA LA BÚSQUEDA DE PEPTIDOMIMÉTICOS.... 19
1.1.1. Búsquedaal azarde nuevoscompuestoscabezade serie 19
1.1.2. Diseño racional de peptidomiméticos 21
1.2. RESTRICCIONESCONFORMACIONALES EN PÉFEIDOS BIOACTIVOS.
UTILIZACIÓN DE LACTAMAS 27
1.3. ANTECEDENTES INMEDIATOS, OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 29
2. RESULTADOSY DISCUSION 352 1 2,5 DICETOPIPERIDINASCOMO ANÁLOGOS CÍCLICOS DE PSEUDOPÉP-
TIDOS CETOMETILÉNICOS 37
2.1.1. 3-Metoxicarbonil-2,5-dicetopiperidinas6-sustituidas 38
2.1.2. 2.5-Dicetopiperidinas 3,3,6-trisustituidas 43
2.1.3. Pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos 52
2.2. DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINAS COMO ANALOGOS CONFOR-
MACIONALMENTE RESTRINGIDOS DE DIPÉPTIDOS 54
2.2.1. Formación del esqueleto de 8-amino-3-oxoindo]izidina-2-carboxi-
lato 55
2.2.2. Alquilacién de derivados de 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxi.
lato SS2.2.3. Enantioselectividaden la formación de derivados de S-amino-3-oxo-
indolizidina.2-carboxi]ato 61
2.2.4. Formación de derivadosde Sa-bidroxi- y Sa-alcoxi-8-amino-3-oxoin-dolizidina-2-carboxilato2-sustituidos 70
2.2.5. Modelización molecular de derivadosde S-amino-3-oxoindolizidina-
2-carboxilato. Análisis confornvacionalmediante dinámica molecu-
lar 752.3. ANÁLOGOS CONFORMACIONALMENTE RESTRINGIDOSDE COLECIS-
TOQUININA Y NEUROTENSINA 89
2.3.1. Análogos conformacionalmenterestringidos de CCK 89
2.3.1.1. Análogosde CCÑ derivadosde 2,5-dicetopiperidinas 922.3.1.2. Análogos de CCÑ portadoresdel esqueletode 3-oxoindolizi-
dina 97
2.3.2. Análogos conformacionalmenterestringidos de NT 107
Págs.
3. PARTE EXPERIMENTAL 117
3.1. SÍNTESIS DE CLOROMETILCETONAS DERIVADAS DE AMINOÁCIDOS. 12332. SÍNTESIS DE 4-CETODIESTERESDERIVADOS DE AMINOÁCIDOS 125
3.3. OBTENCIÓN DE 4-CETODIÉSTERES 2-SUSTITUIDOS 127
3.4. SíNTESIS DE 2,5-DICETOPIPERIDINAS3.4.1. Síntesisde 3-mnetoxicarbonil-2,5-dicetopiperidinas6-sustituidas 130
.3.4.2. Síntesis de 6-aralquil-3-metoxicarbonil-2,5-dicetopiperidinas3.3-di-
sustituidas 136
3.4.3. Síntesis de pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos 143
3.5. SÍNTESIS DE 3-OXOINDOLIZIDINAS 1441
3.5.1. Síntesis de 8-(terc-butoxicarboniflamino-2-metoxicarbonil-3-oxoin-
dolizidinas 146
3.5.2. Preparaciónde S-(terc-butoxicarbonil)amino-3-oxoindolizidina 147
3.5.3. Síntesis de 8-(terc-butoxicarboniliamino-2-rnetoxicarbonil-S-oxoin-
dolizidinas 2,2-disustituidas 151
3,5.3.1. Preparaciónde derivados 2-bencil, 2-etoxiearbonilrnetil y
2-tere-butoxicarbonilmetil sustituidos 151
3,5.3.2. Obtenciónde derivados2-(indol-3-il)metil sustituidos 154
3.5.3.3. Preparación de 8-(eerc-butoxicarbonil)amino-2-carboxi-3-
oxoindolizidinas 2,2-disustituidas 159
3.5.4. Preparación de derivados de MTPA 1&4
3,5.4.1. Reaccionesde derivatizacióncon el ácido (R)-(±)-cx-metoxi-
os-<trifluorornetil)fenilacético í64
3.5.4.2. Reaccionesde derivatizacióncon el cloruro de (S) (4> o (R>(—)-a-metoxi-a-(trifluorometil)feni]acetilo 1%
3.5.5. Obtención de derivados de Sa-hidroxi- y Sa-a]coxi-S-amino-3-oxoin-dolizidina-2-carboxiíato 2-sustituidos 16,9
3.5.5.1. Reaccionesde hidrogenación del 2-bencil-4-cetodiésterderi-vado de Boc-Orn<Z)-OH
3.5.5.2. Reaccionesde reducción de 8a-hidroxi- y 8a-alcoxi-3-oxoin-
dolizidinas 175
3.5.5.3. Obtenciónde AWBa~bexahidroindo1izinas 1773.6. PREPARACIÓN DE ANALOGOS DE COLECISTOQUININA DERIVADOS
DE 2,5-DICETOPIPERIDINAS 181
3.6.1, Acoplamiento peptídico de derivados de 2,5-dicetopiperidinas conH-Phe-NH2 181
3.6.2. Eliminación del grupo protector terc-butilo 1823.7. PREPA1?.ACIÓNDE LNÁLOGOS DE COLECISTOQUININA DERIVADOS
DE 3-OXOINDOLIZIDINAS 1&3
3.7.1. Acoplamiento peptídico de derivados de 3-oxoindolizidina 2-bencil
sustituidoscon Boc-L-Trp-OH 6 Boc-D-Trp-OH 186
3.7.2. Transformaciónde ésteresmetílicos en amida~ 188
3.7.3. Acoplamientopeptídico de derivadosde 3-oxoindolizidina 2-/erc-buto-xicarbonilmetil sustituidoscon H-Phe-N112 191
Págs.
3.7.4. Acoplamientopeptídico de derivadosde 3-oxoindolizidina 2-carboxi-
ruetil sustituidos con Boc-L-Trp-OH 192
3.7.5. Eliminación del grupo protector terc-butoxicarbonilo 1%
3.8. SÍNTESIS DE ANÁLOGOS DE NEUROTENSINA PORTADORES DE ES-
QUELETOS DE 3-OXOINDOLIZIDINAS 199
3.9. MÉTODOS BIOLÓGICOS .
3.9.1. Ensayosde unión a los receptoresde CCK.. . . .
3.9,2. Ensayosde liberación de amilasa3.93. Inhibición de las contraccionesinducidaspor CCK~ ó CCK4 en el íleon
de cobaya:Preparaciónde músculolongitudinal- plexo mientérico...
3.9.4. Ensayos de unión a los receptores de NT
4. CONCLUSIONES 2&5
5. BU3LJOGBAFÍA . 211
NOTA SOBRE NOMENCLATURA
A lo largo de esta Memoria se han utilizado la nomenclatura y
simbolismo de aminoácidosrecomendadospor la Comisión de Nomenclatura
de Bioquímica (JCBN) de la IUPAC-IUB (“Nomenclature and Symbolísm for
Aminoacidsand Peptides’%Pure & Áppl. Chern., 1984, 56, 595).
Los aminoácidosse nombran medianteel sistema de símbolos de tres
letrasy pertenecena la sedenatural L, salvo que seindique lo contrario. Las
sustituciones sobre el grupo u-NH2 se indican anteponiendoel símbolo
aceptadopara el sustituyente al símbolo del aminoácido,mientras que las
sustitucionessobrelos gruposfuncionalesde las cadenaslateralesse indican
entreparéntesis,inmediatamentedespuésdel símbolo del aminoácido.
En cuanto a los péptidos,el residuoque tiene el grupo amino libre, o no
adiado por otro aminoácido, se denominaN-terminal y el que tiene el grupo
carboxilo libre se denomina C-terminal. Tanto para nombrarlos como para
representarlosgráficamentese comienzapor el residuo N-terminal, seguido
de los aminoácidosinternosen orden,parafinalizar con el residuoC-terminal.
Para las sustituciones del enlace peptídico por agrupamientos
bioisósteros se utiliza la terminología aceptada para pseudopéptidos,
consistenteen la introducción de la letra griega W entre los símbolos de los
aminoácidoscuyo enlacepeptídicose ha modificado,seguidadel agrupamiento
que sustituyeal enlacepeptídicoentrecorchetes.
ABREVMTURAS UTILIZADAS
Boc terc-butoxicarbonilo
BOP : hexafluorofosfatode benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio
DCC : N,N’-diciclohexilcarbodiimida
J)CU : N,N’-diciclohexilurea
DIEA : diisopropiletilamina
DMAP : N,N-dimetilaminopiridina
TiME : 1,2-dimetoxietano
HOSu: N-hidroxisuccinimida
In 3-indoliloMTPA ácido a-metoxi-cx-(trifluorometil)fenilacético
NMM N-meti]morfolina
TEA: trietilarnina
TEA : ácido trifluoroacético
TFAE : i-(9-antril)-2,2,2-trifluoroetanol
THF : tetrahidrofurano
Z: benciloxicarboni]o
1. INTRODUCCIÓN
El descubrimiento y caracterización,así como el estudio de las
propiedadesy funcionesbiológicas,de los péptidosbloactivos, han tenido undesarrolloexponencialen los últimos 40 años.Estedesarrolloes resultadodelos avancessurgidos tanto en la químicaorgánicade péptidos (síntesisen fase
sólida), la biología molecular (producción de hormonas por ingenieríagenética, clonaje de receptores),como en las técnicasdisponiblespara losestudiosestructurales,más químico-físicos(RMN, métodos informáticos) ypara la caracterizaciónfarmacológica (ensayos de unión al receptor,radioinmunoensayos).La participaciónde los péptidos en la mayoríade losprocesosbioquímicos,donde actúancomo hormonasy/o neurotransmisores,hace que la modulación con agonistaso antagonistasde los receptorespeptídicosasociadosa la superficie celular, o la inhibición de las enzimasimplicadas en su biosíntesisy¡o degradación,puedan tener importantesimplicaciones terapéuticas (Figura 1). De hecho, péptidos o análogospeptídicos,entre los que destacacomo ejemplo clásico la Insulina, son ya de
uso clínico generalizado.Entre ellos, los análogos sintéticos del FactorLiberadorde la HormonaLuteinízante(LH-IRH), Busereliny Goserelin,y de laSomatostatina,Octeotride, se han comercializadopara el tratamiento deciertos tumores, mientras que el Acetato de Desmopresina,un agonistaselectivo de Vasopresina,se utiliza actualmenteen el tratamiento de la
diabetesinsípida ‘-a.Desafortunadamente,el interésde los péptidoscomo fuentedirecta de
nuevos fármacos está limitado por una serie de propiedadesadversas,inherentesa la propia estructurapeptídica,como son:
a) Bajaestabilidadmetabólicao, lo quees lo mismo, rápidadegradaciónpor peptidasastanto en el tracto gastrointestinalcomo en la sangre,
que origina efectosbiológicos de cortaduración.
¿Vi Pobrebiodisponibilidadoral, debidaal alto pesomolecularde estoscompuestoso a la falta de sistemasespecíficosde transporteo a unaconjunciónde ambosfactores.
—17—-
Figura 1. Principalesgruposdepéptidosbioactivose interés
terapéuticode los mismos
Interésterapéutico
1. NEUROPÉPTIDOS
PéptidosoploidesSustanciaP (SP)Neurotensina (NT)Neuroquininas (NR)Hormonasdel hipotálamo
Tirotropina (TRWSomatostatina(ST)
FactorLiberadorde l.aHormona Luteinizante (LH-RH)
Hormonas de la Hipófisis1-lormonadel Crecimiento(Somatotropina)Oxitocina (OT)Vasopresina
AnalgésicoHipotensor, antiinflamatorioHipotensorHipotensor,antidepresivo
DesórdenestiroidalesDiabetes,úlcerasgástricas,cáncerde próstata
Fertilidad, contracepción,cáncerdepróstata
Enanismo, osteoporos3sContraccionesuterinasDiabetesinsípida
2. PÉPTIDOS GASTROINTESTINALES
InsulinaGlucagónGastrinaColecistoquinina (CCK.~
DiabetesHipoglicemia, fallo cardíacoSecreción HCIPancreatitis, anorexia,ansiedad
3. PÉPTIDOS DE IMPORTANCIA INMUNOLÓGICA
CiclosporinasMuramilpéptidos
Inmunosupresor(Transplantes)Inmunoestimulante
4. PÉPTIDOSDEL SISTEMA RENINA-ANGIOTENSiNA
Inhibidores de ECAInhibidores de Reuma
AntihipertensorAntihipertensor
5. VACUNAS
Péptidossintéticos Gripe, SIDA
6. PÉPTIDOSNATRIURÉTICOS ATRIALES
ANE Diurético, antihipertensor
7. OTROS
SaborizantesPéptidosantibióticosPéptidos-Leucotrienos
Edulcorante (AspartameAntibióticoAntialérgico, antiinflamatorio
Péptido
—18
c) Rápidaexcrecióna travésdel hígadoy del riñón.
d) Alta flexibilidad conformacional,queconlíevala posibilidad de unión
a diversosreceptoresy, por lo tanto, una baja especificidadde accion.
Uno de los mayoresretos actualesde la Química Médica es encontrar
vías racionalespara la transformación sistemática de la información con-
tenidaen un ligando peptidiconatural en moléculasno peptídicasde bajo peso
molecular,capacesde interaccionarcon receptoresespecíficospara eseligan-
do y de mimetizar o bloquearla accióndel péptidoendógenoconsiderado4<7. Es
de esperar que estos compuestosno peptídicos, denominadospeptido-
miméticos, poseanpropiedadesfarmacodinámicasmejoradascon respectoa
las de los péptidosnaturalesy, por lo tanto, puedenconsiderarsea priori un
objetivo mejor en el procesode desarrollode nuevosfármacos.Por otra parte,
la aparición de reaccionesinmunológicas tras la aplicación de fármacos
peptídicoses otro factor que apoya,cadavez más, la necesidadde profundizar
en la investigaciónconducenteal desarrollode peptidomiméticos8~
1.1. APROXIMACIONESHACIA LA BÚSQUEDADE PEPTH)OMIMIETICOS
La obtención de peptidomiméticos puede abordarse desde dos
perspectivasbien diferenciadas,la búsquedaal azar,más o menosdirigida, de
nuevoscompuestoscabezade seriey el diseñoracional 9.
1.1.1. BÚSQUEDAAL AZAR DE NUEVOSCOMPUESTOSCABEZA DE SERIE
Estaestrategiaconsisteen el ensayogeneralizadode compuestostanto de
origen natural como sintético, sobreun amplio abanico de receptorespeptídi-
cos, con el fin de identificar estructurascabezade serie. Posteriormente,a
partir de aquel compuestoque haya mostrado una afinidad interesante,
aunquegeneralmentemoderada,por un determinadoreceptor, se aplican los
principios de variacionesestructuralesclásicos de la Química Médica hasta
lograrel desarrollode un agenteterapéuticocon propiedadesadecuadas1042•
El primer gran éxito en este campo surgió a raíz de la moderada
capacidadpara actuar como antagonistade Colecistoquinina(CCK) mostrada
por la Asperlicina (1) 13.Tras una serie de modificaciones en el anillo de
1,4-benzodiazepina,característicaestructuralclave para la actividad de este
producto natural, se desarrollaronlos compuestosMK-329 (Devazepide,2),
— 19—
antagonistaselectivo de los receptoresperiféricos de CCK (CCKA) y activo por
vía oral 14, así como el análogoL-365,260 (3), que resultó ser un antagonista
selectivo de los receptores centrales (CCKB) de este neuropéptido15
Concretamente,el Devazepide está siendo objeto de estudios clínicos en
humanos para explorar su potencial aplicación en la pancreatitis y en el
síndromede irritación intestinal. Por otra parte, los antagonistasde CCKB
puedenser de utilidad para el tratamiento de disfuncionesalimentarias y
ciertosdesórdenesasociadoscon la ansiedad.
O
NH HOH H /\ /NN N
N\ H O HN N
O — HN o
H
1 2
H HN N CY
O
3
Entre otros ejemplos de peptidomiméticosdesarrolladospor estavía se
puedendestacarel compuesto4, antagonistade AngiotensinaII y, por tanto,
con aplicación en el control de la hipertensión16, los antagonistas de
SustanciaP 5 y 6, con interés para el tratamiento de la inflamación y el
dolor 17,18 y el antagonistade Oxitocina (01) 7, que permitirá la evaluaciónde
la utilidad clínica de los antagonistasde 01 en la prevención del parto
prematuro19•
Es de destacarque,aunquealgunosde los antagonistasde neuropéptidos
comentados anteriormente están en fase clínica avanzada, esta vía de
aproximaciónno ha conducidotodavíaa la obtenciónde peptidomiméticoscon
capacidadpara actuar como agonistas.Sin embargo,y como aspectopositivo,
O
—20—
los peptidomiméticossurgidosde esta primera vía pueden contribuir a una
mejor comprensiónde los grupos farmacóforosimplicados en las uniones
péptido/receptor y, por lo tanto, deberánser consideradosa la hora de
emprender el diseño racional de un peptidomimético a partir del corres-
pondientepéptidobioactivo.
clN
N OH
4
CH3O
NROH
6 7
1.1.2. DISEÑO RACIONAL DE PEPTIDOMIMÉTICOS
La preparación de peptidomiméticos a través de diseño racional,
utilizando un péptido de interés o sus análogoscomo punto de partida para
realizar modificaciones estructurales posteriores, es la segunda vía
desarrolladapara accedera estetipo de compuestos2022•
Teniendoen cuentaqueen las interaccionespéptido/receptorsolamente
un reducidonúmerode aminoácidosdel péptido bioactivo sonresponsablesdel
procesode activaciónlinhibición de dicho receptor, parecerazonablesuponer
que moléculaspequeñaspuedanasumir susfunciones.Sin embargo,el diseño
5
O ~
OtS
O
O
21 —
de estasmoléculases un procesolaborioso,ya que requiereel conocimientoprevio de los elementosquímicosy espacialesdel farmacóforode interés.Por lo
tanto, el diseñode un peptidomiméticodebe contemplarlos siguientespuntosfundamentales:
1. Identificaciónde los gruposimportantespara la unión al receptor.2. Definición de la disposicióntridimensionalde dichosgrupos.
3. Unión de los grupos necesariospara la interacciónen estructurasrígidas, no peptídicas,que cumplan los requisitostridimensionalespreviamenteespecificados.
A partir de un péptidobiológicamenteactivo, y comose indica de maneraesquemáticaen la figura 2, la primera etapaa llevar a cabo es la determi-nación del fragmentomínimo necesariopara la actividadbiológica. Una vezconocido este fragmento, la sustitución de cada uno de sus aminoácidosconstituyentespor alanina da idea de la importancia que tienen para laactividad el tipo y la funcionalidadde las cadenaslateralesde cadaresiduo.Posteriormente,las sustitucionesde los distintos aminoácidospor sus aná-
logos de configuraciónD aportaninformaciónacercade la disposiciónespacialpreferidapor las diferentescadenaslaterales.La D-sustitución.junto con laintroducción de aminoácidosmodificados, generalmenteanálogosconforma-
cionalmenterestringidos,y el estudio de los derivadospeptídicosresultantesson de crucial interésparallegar a definir una seriede parámetrosconforma-cionaleslocales,así como para establecerla presenciade estructurassecun-darias concretas23• De una manera paralela, la sustitución del enlace
peptídico por grupos bioisósteroso estructuralmenterelacionados,tales comoCH2NH, COCI-12,NHCO, permite determinarla participaciónde los enlaces
CONH del esqueletoenlas interaccionesconel receptor,bien por formacióndeenlacestipo puentede hidrógenoo bien por ser responsablesde la adopcióndeuna disposiciónespacial adecuadade las cadenaslateralescríticas 24 Lapreparaciónde análogosconformacionalmenterestringidos,tanto por mediode diferentestipos de ciclaciones21,23 como por introducciónde miméticosde
estructurassecundariaspeptídicas25,26, constituyeuna etapaavanzadahaciael desarrollode peptidomiméticos,ya quepermitecomprobarsi los parámetrosconformacionalespreviamentedefinidos se ajustana la topografíadel receptoren estudio.Paraello, se han de realizarlos análisisconformacionalesy fisico-químicostanto de los compuestosque muestrenactividadsignificativacomo de
—22-—
PÉPTIDO BIOLÓGICAMENTE ACTiVO
Eliminación continuao% discontinunderesiduos
Fragmentomínimo activo
Ji SustitucionesporAla
Importancia de las cadenaslaterales
‘a Sustitucionespor D-aminoácidosy aminoácidosmodificados
Definición de parámetrosconformacionaleslocales(Determinacióndc la presenciadeestructurassecundarias)
‘It SustitutosdelenlacepeptídicocicíacionesMiméticosdela estructurasecundariapeptídica
Análogosconfonnacionalmenterestringidos -IAnálisis conformacionalEstudiosfísico-químicos
Hipótesisde la conformaciónbioactiva
Diseñode nuevoscompuestosquemimeticenlos elementostridimensionalescríticos
¡Figura 2. Aproximacioneshacia el diseñoracional depeptidomiméticos.
Actividadbiológica
‘a‘It
1
—23—
aquéllosque resulteninactivos. Una vez llegadosa estepunto, se define unahipótesispara la conformaciónbioactiva del péptido, a partir de la cual sepuede abordar la preparaciónde moléculaspequeñas,no peptídicas, quecumplanlos requisitospreestablecidos,tanto en cuantoa grupos funciona]es
necesarios para la actividad como, y principalmente, en cuanto a su
disposiciónespacial.La falta de estudiosde relacionesestructura-actividaddetalladospara
muchos péptidos bioactivos, junto con la dificultad de extrapolar las
conformacionesen estado sólido y/o en disolución con las de unión a undeterminadoreceptor,ralentizanla obtenciónde peptidomiméticossiguiendoesta estrategia. Sin embargo, los ejemplos de compuestosno peptídicosdesarrolladospor estavía en los últimos añosapoyanla validez de la misma.La primeraaplicacióncon éxito de estaestrategiase encuentraen el campodelos inhibidores de la Enzima Convertidorade Angiotensina(ECA). Así. loscompuestosCaptopril (10) y Enalapril (11) surgieron,por diseñoracional, a
partir del moderadopoderde inhibición sobrela ECA mostradopor el Teprótido(8) y el dipéptido9 y del conocimientode la presenciade un átomode Zn en e]centro activo de dicha enzima27,28 Posteriormente,estudiosde modelizaciónmolecular, basadosen las coordenadasde R-X y en datos de RMN del
Captopril, permitieron el diseño de una nueva generaciónde inhibidoresconformacionalmenterestringidos,entrelos que destacael Cilazapril (12) 29,30Los compuestos10, 11 y 12 se encuentranactualmentecomercializadospara eltratamientode la hipertensiónarterial.
H-pGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Ile-Pro-Pro-OH H-Ala-Pro-OH
8 9
Ph
CH,
N NHOCOH ~ COH
10 11
Más recientementes~, la utilización de la 3-desoxi-~3-D-glucosacomo
molde para el anclaje de las cadenaslateralesesencialesdel análogo de
Ph
H
12
—24—
15
Somatostatina(ST) 15, ha conducidoa los derivados13 y 14, que se unenalreceptorde la ST con afinidadesde rango micromolar,mostrandopropiedadesmixtas agonistalantagonista.El compuesto13 seunetambiéna los receptoresg-adrenérgicosy al receptorde la SustanciaP, todosellos receptoresacoplados
a proteínasG, lo quepone de manifiestounagran similitud estructuralen loscentros de unión de esta familia de receptores.Por su parte, el benciloxiderivado14 actúacomoun antagonistapotentede la SP 31•
Ph Ph
y /NHo oN
O N 1-1 0
Ph
NH2 OH NH2
R=H,OBn 13,14
Basándoseen la rigidez y en las múltiples posibilidadesde anclajeque
ofrecen los esqueletosde tipo esteróidico, el grupo de Hirschmann hapreparadoel compuesto16, como mimético del péptidoH-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-
Pro-OH (17), un agonistadel receptor del Fibrinógeno, responsablede lainiciación de la agregaciónplaquetaria.Desafortunadamente,el antagonista
16 presentauna afinidad demasiadobaja para ser consideradocomo uncandidatode utilidad terapéutica32•
1-1 HN NR N NR42 42
NH NH
HN
H-Gly — NH
U
HO-Pro-Ser —N
£0211 CO2H
17
o
16
—25—
El derivado de piperidina 18, peptidomimético antagonista de SP, fue
diseñadoa partir de estudioscombinadosde RMN y de mecánicamolecular dela SP y análogos activos, y admitiendo la hipótesis de que el fragmento-Phe-Phe-es el responsableprincipal de la unión al receptor de la SP (19) ~3.
Ph
18
H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln—N
¡Ph
H U PhN
00 Gly-Leu-Met-NH2
19
El derivado de ciclohexano143,5-cis-trisustituido20 se diseñó comomimético de la HormonaLiberadorade Tirotropina (TRH, pGlu-His-Pro-NH2,
21), un péptido hipotalámicoqueparecerelacionarsecon ciertosdesórdenesde
la memoria, como son los asociadoscon la enfermedadde Alzheimer. Elcompuesto20 presentauna actividad similar a la TRH en diversosmodelos
animales,siendoactivo por vía oral. Sin embargo,este peptidomiméticonocompite con la TRH tritiada en su unión al receptor,por lo que se estáestudiandoel mecanismode accióna travésdel cual estederivadoes capazdemimetizarlos efectosdel péptidoendógeno3’~.
=4
NH
oN
=4
N ~ CONH2OH
CONHQ
20 21
Ph
=4
O,
-3Ph
—26—
1.2. RESTRICCIONES CONFORMACIONAJ.ES EN PÉPTIDOSBLOACTIVOS.UTILIZACIÓN DE LACTAMAS
La determinaciónde relacionesestructuratridimensional-actividaden
péptidosbioactivos,enormementedificultadapor la flexibilidad inherentea lasestructuraspeptídicas,constituyeuna etapafundamentalen el diseñoracional
de peptidomiméticos.Dado el amplio desconocimientode los receptorespeptídicosy la dificultad de establecercuál o cuálesde los muchosconfórmerospresentesen disolución se ajusta(n)a la geometríadel receptor,paraabordar
este problema se aplica una aproximación sintética que consiste en laintroducción de restriccionesconformacionales.Así, es de esperarque unanálogo conformacionalmenterestringido adopte,en disolución, conforma-
ciones preferentes,que permitan una extrapolaciónmás fidedigna de la(s)conformación(es)bioactiva(s).Atendiendoal grado de rigidez que se incorpora
al péptido, las restriccionesconformacionalespueden agruparseen tresapartados:
1. Restriccioneslocales: Incorporaciónde sustitutosdel enlacepeptídico
como N-alquil derivados, retroanálogos,dobles enlaces trans y
restriccionesde la movilidad de las cadenaslaterales,como tt-alquil,
dehidroy ciclopropil aminoácidos.2. Restriccionesregionales:Introducción de miméticos de la estructura
secundariapeptídica,hélices cx, láminas¡3, giros inversos ¡3 y ‘y.
3. Restriccionesglobales:Ciclaciones.
Los dos primeros tipos de modificacionesson muy útiles para dar unavisión generalde la importanciade la conformaciónde residuosespecíficosyde la participación o no de estructurassecundarias,respectivamente,en la
unión al receptor. Por otra parte, los compuestosobtenidos medianteciclacionesN-C-terminal, cadenalateral-gruposN- y/o C-terminales o porunión de los grupos funcionales de distintas cadenaslaterales,facilitan elestudio de la conformación global del péptido y la extrapolaciónde estaconformación con la de unión al receptor. Además, la introducción derestricciones conformacionalesproporciona en muchos casos ligandos
selectivospara un determinadosubtipo de receptore incrementade manerageneralla resistenciafrente a la proteólisisenzimática5,2í~
La incorporaciónde lactamasen péptidosbioactivos como vía para lapreparaciónde análogosconformacionalmenterestringidos fue iniciada por
—27—
Freidinger a principios de la décadade los 80 ~ Estas lactamas,concebidas
en principio para fijar el enlace peptídico en su forma trans, han marcadolapauta de una línea de investigación de creciente actualidad que engloba a los
miméticos de la estructura secundariapeptídica, también denominadosmiméticos de la conformación peptídica25,26 En los últimos años se han
descritoun grannúmerode ciclos pequeños,principalmentede tipo lactámico,cuya incorporaciónen péptidosde interésbiológico ha dado lugar a análogosconformacionalmenterestringidos que, en mayor o menor medida, han
contribuido al esclarecimientode las interaccionespéptido-receptor25,26 Lasestructurasmásrepresentativasde estoscompuestosse recogenen la figura 3.
11
NH2N
O
CO2H
Ii
C02H
NR2
H2N
R
O
COQH
R
22 n=1,2
( ~n
N
HO
CO2H
11
25 n~1,2
O
NH2N
O COQH
27
H2N N
CQH
26 n=1,2
ON o CO2H11
28
Figura 3. Lactamasde utilidad para la introducción de restriccionesconformacionalesen péptidos.
La introduccióndey- y 8-lactamasde tipo 22 ha dado lugar a la obtención
de agonistaso antagonistasde diferentespéptidosbioactivos~ asícomoainteresantes inhibidores enzimáticos40~ La lactama monocíclica 23 fuediseñadacomo mimético de giros ¡3 por Olson y colaboradores41, habiéndose
HN
23 24
—28----
demostrado,tanto por RMN como por modelizaciónmolecular,que es un buenmimético de este tipo de estructurasecundariapeptídica.Por otra parte, lalactama de siete miembros 24, ideadapara restringir conformacionalmentegiros -y, se ha utilizado para estudiar la contribución de estos giros en la
conformación bioactiva de antagonistasdel receptor del Fibrinógeno y deinhibidoresde la proteasadel HIV-1 42,43, Los derivadosde espirolactama25son capacesde forzar conformacionesde giro ¡3 tras su incorporación en
diferentes sistemaspeptídicos44-46, De manerasimilar, la introducción delBTD (Bicyclic Turned Dipeptide, 26, n = 2) en péptidos de interés biológicoinduce a éstosa adoptarconformacionesde giro 3 ‘~7”~9. Los buenosresultados
obtenidos con el BTD han conducido a un desarrollo espectacularen la
búsqueda de lactamas bicíclicas, estructuralmenterelacionadas,como
miméticosde giros ¡3 [26 (n = 1), 27, 28 y otras]50-56
1.3. ANTECEDENTESINMEDIATOS, OBJETIVOSY PLAN DE TRABAJO
Teniendo en cuenta el interés general despertadopor los análogospeptídicos conformacionalmentorestringidos, y en particular por las
estructuraslactámicasreferidasen el apartadoanterior, se plantearoncomoobjetivossintéticosprincipalespara estetrabajo la obtenciónde los derivadosde2,5-dicetopiperidina 30 y 3-oxoindolizidina 81, indicados en el esquema
siguiente, como representantesde lactamas monocíclicas y bicíclicas,respectivamente.
Ou’
COQHHN
A O
30H2N CO2R
O
29 E CO2H
It2
NR9
31RutaA: It’, Ii
2 = cadenaslateralesde aminoácidos
RutaB: It1 = (CI-12)3NH9;R
2 = cadenaslateralesde aminoácidos
—29—
Las 2,5-dicetopiperidinas 30 podrían ser incorporadas posteriormente a
péptidos de mayor tamaño para conducir a análogosconformacionalmente
restringidos en el pseudodipéptidoN-terminal, o bien dar paso a lospseudodipéptidos cetometílénicos correspondientestras una simpledescarboxilación.En amboscasos, la presenciadel anillo monolactámicovendríaa contrarrestarel aumentode flexibilidad conformacionalresultantede sustituir el enlacepeptidico -CONH- por el isósterocetometilénico-COCH2-,
sustitución generalmenteutilizada para proporcionar resistenciafrente apeptidasas24,
La elección de las 3-oxoindolizidinas 31 fue resultado de variasconsideraciones.En primer lugar, la presenciade grupos NH2 y CO2H las
hacía susceptiblesde incorporacióna cadenaspeptídicastanto en la posiciónC-terminal como en la N-terminal. En segundolugar, dentro del interésgeneradopor las lactamasbicíclicas como posiblesmiméticos de estructuras
secundariaspeptídícas, las 3-oxoindolizidinas 31 están particularmenterelacionadascon aquéllascuyo mimetísmoestá demostrado.Tal es el caso delBTD (26) como mimético de giros ¡3, indicadoen el apartadoanterior4749.
Desdeel punto de vista de viabilidad sintética,la experienciarecientedenuestroslaboratorios en la preparaciónde los 4-cetodiésteresderivadosdcaminoácidos29 5762,productosa utilizar comomaterialde partidacomúnque
debería dar accesoa las 2,5-dicetopiperidinas30 y 3-oxoindolizidinas31,constituyó un factor importanteen la selecciónde ambostipos de lactamas
comoobjetivosde estetrabajo.Así, el esqueletode 2,5-dicetopiperidina3-carboxísustituidodeberlaresultarde la 8-lactamizaciónde los aminodiésteres29 ó de
derivadossencillos de éstos (Ruta A). Por su parte, el esqueletode 3-oxo-indolizidina 2-carboxi sustituido debería formarse mediante aminaciónreductivadel cetodiésterderivadode ornitina 29 [R
1 = (CH2)gNH2], seguidade
acilación intramolecular de la piperidina resultante (Ruta 13). Una rutaparalela,basadaen la conocidacapacidadde los derivadosde Orn y Mg paraexperimentarciclacionesintramoleculares36,63, había sido puestaa puntoennuestros laboratorios para la preparación de S-amino-3-oxoindolizidinas2-aralquil sustituidas, carentes del resto carboxilo, a partir de pseudo-dipéptidos cetometilénicosderivadosde ornitina 64 Esta experienciapropia,unida a la referentea la obtenciónde los compuestos29, constituyen los
antecedentessintéticosmásinmediatosdel trabajode estaMemona.Por último, para empezara explorar la utilidad en el campo de los
peptidomiméticosde los sistemaslactámicos30 y 31, se definió tambiéncomo
—30—
objetivo de este trabajo la introducciónde los mismos en péptidos de interésbiológico, así como la posterior evaluación biológica de los análogosconformacionalmenterestringidosobtenidos.Para este fin se eligieron losneuropéptidosColecistoquininay Neurotensina,y más concretamente,susfragmentosmínimos activosCCK4 (H-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)y NT8j3 (H-Arg-
Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH). Además del interés particular que tienen estos
péptidosen la búsquedade nuevosfármacos,como se detallaráen el capítulocorrespondiente,la elección estuvo basadaen sendascolaboracionesquenuestro grupo mantiene con el Departamentode Farmacología de laUniversidad de Navarra y la CompañíaNovo-Nordisk, interesadosen los
estudiosde CCK y NT. respectivamente.Como se concretaráen el capítulo2.3de esta Memoria, para el diseño de los análogos conformacionalmenterestringidosde estosneuropéptidossehantenido en cuentalos estudiosprevios
de relacionesestructura-actividaddescritosen la bibliografYa paraIta CCK y laNT, así comolos estudiosde sus análisisconformacionalesrespectivos.
Paraabordarlos objetivosanteriormenteexpuestos,se ha seguidoel plande trabajo que seresumea continuación:
— Derivados de 2,5-dicetopiperidinascomo análogos cíclicos de
pseudopéptidoscetometilénicos.Puestaa punto de métodosde aplicacióngeneralpara la obtención
del esqueletofundamentalde 2,5-dicetopiperidinay su extensióna lasíntesisde pseudodipéptidoscetometilénicos.Estudiode las propie-dadesconformacionalesde estaslactamasmonocíclicaspor RMN.
— Derivados de 3-oxoindolizidinas como análogos conformacional-menterestringidosde dipéptidos.
Síntesisde derivadosde 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilatoyestudio de la enantioselectividaddel procesode formación del anillode 3-oxoindolizidina. Análisis de la capacidadde esta estructurapara inducir conformacionesde giro ¡3.
— Análogosconformacionalmenterestringidosde Colecistoquinina.Síntesisy actividadbiológica de derivadosde 2,5-dicetopiperidinasy
3-oxoindolizidinasanálogosde CCIQ.— Análogosconformacionalmenterestringidosde Neurotensina.
Síntesisde análogosde NTgj3 que incorporan3-oxoindolizidinasen
sustitucióndel dipéptidocentralPro’0-Tyr11. Ensayosde unión a los
receptorescentralesde la Neurotensina.
—31—
Se pretende, finalmente, que los resultadosde actividad biológicaobtenidospara los diferentesanálogosconformacionalmenterestringidosdeCCK4 y NTg.jg sirvanparaestablecerrelacionesestructura-actividad,asícomo
paracontribuir a perfilar los requisitosestructuralesde los receptoresde CCI(y NT, tanto en lo que se refiere a cadenaslateralesimprescindiblespara la
actividadcomo a su disposicióntridimensionalconcreta.Los antecedentes,objetivos y vías de aproximacióna estosúltimos se
recogende forma esquemáticaen la figura 4.
—32—
U)
E-,zoorí~
U)
oE-’
oz0oCf)o5o
~-E~~~~1z-Qoo
dkueeeCiCi
‘eueuee49-
9-
ooQ
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2~
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Che)
13e>
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4
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0
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~
c~
oo
2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2.1. 2,5-DICETOPLPERIDINAS COMO ANÁLOGOS CÍCLICOSDE PSEUDOPEPTIIDOS CETOMETILENICOS
Como se ha comentadoen la introducción, la sustitución del enlaceamida por el agrupamientobioisósterocetometilenoconlíeva la pérdida derigidez del esqueletopeptídico.Con el fin de contrarrestaresteefecto, se dirigióla atenciónhacia los correspondientespseudopéptidoscetometilénicoscíclicoscomo análogosconformacionalmenterestringidos.Llevadospor esteinterés,se diseñaron los derivados de 2,5-dicetopiperidina-3-carboxiíato33 comointermedios comunes,bien para dar accesoa los pseudodipéptidoscíclicosciclo[XaaT[COCH2IYaa] (34: Yaa = Gly; 35: Yaa!=Gly) o bien a los análogos
3-carboxi 3-sustituidos30, susceptiblesde ser incorporadosen los pseudo-péptidosde mayor tamaño36 (Esquema1).
O Oit It
1
ZHN CO2Me HN HNÑ$
CO4Nk CO2Me
32 33 34
O
It’
£HN 0211
U2
O30
Onl
CO-Xaa-OHUN
0 y O = cadenaslateralesde aminoácidos OXaa= aminoácido, péptido 36
Esquema1
O
fiN
35
—37—
Los 4-cetodiésteres32, a utilizar como productos de partida para la
preparaciónde los intermedios clave 33, estabangarantizados,dada laexperiencia previa de nuestro laboratorio en su síntesis a partir dehalometilcetonasderivadasde aminoácidosy malonatode dimetilo 57,58~
2.1.1. 3-METOXICARBONIL-2,5-DICETOPIPERIDINAS6-SUSTITUIDAS
Para estudiar el método más adecuadopara la obtención de estos
compuestosmediante lactamizaciónde los correspondientesderivadosde5-amino-4-cetodiésteres,se seleccionaronaquéllosprocedentesde fenilalanina
y triptófano, ya que la presenciade anillos aromáticosdeberíafacilitar laasignaciónpor RMN del nuevo centro asimétrico creado en posición 3 delanillo de 2,5-dicetopiperidina.Comométodo conocido6570, y en principio másdirecto, se ensayóen primer lugar la calefaccióna reflujo de MeOH de los
aminodiésteres39 y 40, procedentesde la N-desprotecciónde 37 y 38(Esquema2). Sin embargo,esteprocedimientocondujo, en nuestrocaso, a losderivados de pirazina 41 y 42, respectivamente,junto con productos de
descomposición.
Rl
ZUN CO2Me HVPd-C CO2MeMeORO CO2Me O CO2Me
37,88 39,40
AjMCO~~
It1 N CO
2MeMeO2C + productosde
CO2MeN R
1 descomposiciónMeO
2C
41,42
37, 39, 41: R’ = CH2PhaS,40,42:fi’ = CH2In
Esquema2
La estructurade estosderivadosfue establecidaa partir de sus datosanalíticosy espectroscópicos,incluyendoMasas, ‘H RMN y
13C RMN. En el
espectrode masasde 41 se observael pico base a rn’e 548, correspondienteal
—38—
ion molecular, junto con las fragmentacionescaracterísticasde este tipo deestructuras71,72~Los espectrosde 1H RMN de los compuestos41 y 42 muestranuna notablesimplicidad,observándose,en amboscasos,la desapariciónde losprotones a-CH y a-NH del aminoácido de partida, junto con undesapantallamientoconsiderabLedel grupo ¡3—CH
2 de los correspondientes
aminoácidos.Este desplazamientoestáde acuerdocon el esperadopara ungrupo metileno flanqueadopor dos anillos aromáticos.Dada la simetríadeestasmoléculas,las resonanciasdebidasa los grupos2- y 5-CH2y al CH delrestode malonato,aparecencomo únicosdobletey triplete, respectivamente,si
bien ligeramentedesapantalladosen comparacióncon dichosprotonesen el‘y-cetodiésterde partida.Finalmente,en los espectrosde ‘
3C RMN de41 y 42 seobservandos señalesde carbonocuaternarioa 150,25y 147,91ppm y 150,20y147,54ppm, respectivamente,atribuiblesa los carbonos2 (5) y 3 (6), o viceversa,del anillo de pirazina‘7~t’~’~~
La obtención de estos derivadosde pirazina puede explicarsepor laautocondensaciónde dos moléculasde la (x-aminocetonacorrespondientepara
dar lugar a las dihidropirazinas43 y 44, que, posteriormente,se aromatizan,transformándoseen los derivadosde pirazina 41 y 42, respectivamente
(Esquema3). Esteprocesoconstituyeuno de los métodos descritospara lapreparaciónde pirazinas2,5-disustituidas72,7577
R1 ,NH2 CO2Me
MeO2C-4-
MeO2C H2N’ ~‘ CO2Me
39,40 39,40
1II’ N CQMe It’ N CO2Me¡ —.- 1
MeO2C [o] MeO2CtDO2Me
CO2Me~ It1MeO>C Me02C
43,44 41,42
139,41,43:R =CH2Ph
40, 42, 44: R’ = CH2Ln
Esquema3
39—
Para intentar obviar este inconveniente, debido a la reactividad de lasa-aminocetonas,se recurrió a la utilización de condicionesde reacciónmás
suaves.Para ello se llevó a cabo la hidrogenacióncatalítica de los 4-cefo-diésteresZ-protegidos,esperandoque la lactamizacióntuviera lugar en elpropiomedio de reacción(Esquema4). En estascondiciones,los compuestos37y 38 condujeron en una sola etapa a los respectivos derivados de 2,5-diceto-
piperidina 45 y 46, aunque senecesitarontiempos de reacción bastante largos y
los rendimientosobtenidosfueron moderados.En cuantoa la estereoquímicadel nuevo centro asimétrico en el carbono C-3 del anillo de 2,5-diceto-piperidina, se encontró una estereoselectividadcasi total en el caso del
derivadode Phe, mientrasque en el de Trp se llegó a una mezclade los dosdiastereoisdmerosposiblesen proporción5:2. En amboscasosse aisló tambiénunapequeñacantidaddel derivadode pirazinacorrespondiente41 ó 42.
It1
71W CO2Me
O CO2Me
37,88 HOSo
DCC
1t/Pd-C Método 2 ZH=4 CO9MeMeOR 112/Pd-C O CO2Su
AcOEt 47,48
O ~1 O Métodos
+HN ‘CO2Me CO2Me
O O
45a,46a 46b
137,45,47:R =CH2Ph38,46,48:R’ = CHoIn
Esquema4
La configuraciónabsolutaen C-3 de estosderivados3,6-disustituidosse
estableciómedianteel estudiocomparativode susespectrosde1H RMN. En el
espectro registrado en DMSO-d6 de la parejade diastereoisómeros46 se
observa que el protón H-3 del isómero mayoritario se encuentra
—40—
considerablementedesplazadohacia campo más alto respectoal mismo protón
del isómerominoritario. Esteapantallamíentoesdebidoa la corrientede anil]odel indol en posición 6, lo queindica que en el isómeromayoritario el protón
H-3 y el anillo aromáticoestánen disposición relativa cís ~ Teniendo encuentaque la configuraciónabsolutaen C-6 esS paraambosisómeros,ya queen la síntesisse partió de L-Trp, al isómero mayoritario le correspondelaestructura46a, de configuraciónabsolutaS en C-3, mientrasque al isómerominoritario 46b se le asignóla configuración(SR,6S).En el casodel derivadode
Phe 45, al obtenersecasi exclusivamenteun isómero, la asignaciónde laconfiguración en C-3 se efectuó por comparaciónde su espectrode 1~ RMNcon el de los correspondientesderivadosde Trp 46ab.
Una vez sintetizadosy caracterizadosestos derivados dc 2,5-diceto-piperidina, se decidiómodificar el método empleado,en un intento de mejorarlos rendimientos,así como de reducir los tiempos de reacción.Este tercer
método,tambiénindicadoen el esquema4, consisteen utilizar como productosde partida los aminodiésteresmixtos 47 y 48, en los queuna de las funcionescarboxilato ha sido previamenteactivada en forma de éster N-hidroxi-
succinimídico~ De estemodo, la hidrogenaciónen presenciade Pd-C deestos compuestoscondujo a las dicetopiperidinasbuscadas45 y 46, conrendimientosy estereoselectividadessimilaresa los obtenidossiguiendo elmétodo 2. Como se esperaba,la presenciade los ésteresactivadosredujo eltiempo de reacción, pero no se observó ninguna mejora apreciableen elrendimiento, posiblementecomo consecuenciade la gran reactividady, portanto, inestabilidad,de los ésteresN-hidroxisuccinimídicos.
Con objeto de estudiarla influenciade la estereoquímicadel aminoácidode partida en eí proceso de lactamización, así como de extender elprocedimientoanterior a la obtenciónde los análogoscetometilénicoscíclicos
procedentesde aminoácidosde la serieo, serealizó la síntesisde las 2,5-diceto-piperidinas 53 y 54 derivadasde Z-D-Phe y Z-D-Trp (Esquema 5). Lahidrogenaciónen presenciade Pd-C de los cetodiésteres51 y 52, preparadossiguiendoel mismométododescritoparasus enantiómeros37 y 38, condujoaresultadosanálogosalos obtenidosen el casode los derivadosde L-Phey L-Trp,tanto en lo que se refiere a rendimientoscomo a la estereoselectividaddelproceso.La asignaciónde la configuraciónabsolutade los compuestos53ay54ab, enantiómerosde 45a y 4Gab, respectivamente,se llevó a cabo porcomparaciónde sus espectrosde 1H RMN entresí, tal y como se ha indicadopara los derivadosde la serie L. Al efectuaresta comparaciónse observóuna
—41-—-
total coincidenciade los espectrosde los compuestos45a-58a,46a-54ay 46h-54b,lo queratifica que setrata de tresparejasde compuestosenantiórneros.
O 1VBnOCOCI/NMM O
TI-IF R”~..OH
2) CH2N2 ZHNZHN 3) 11C144eOH
49,50
I 1) NaXjIDME2)NaHC(CO2Me»
o CO2Me
It’,’.. CO0Me
ZHN
H~Ípd-c
1 MeOH(Método2)
o ou
1 N CO2Me
e—
+ + MeO2C CQMeUN CO2Me UN > It’
£O2Me MeO2C
53a, 54a 54b 41,42
1,41,49,51,53:R= CH2Ph42, 50, 52, 54: = CH2In
Esquema5
En la tabla 1 se resumenlos resultadosobtenidosen la síntesisde losderivadosde 2,5-dicetopiperidina3,6-disustituidos,utilizando los métodos2 y 3.De los datosde la tablasededucequeambosmétodosconducena las 2,5-diceto-piperidinasobjeto de estecapítulo con rendimientosmoderados.El tiempo dereacción se reduce en un 50% cuando se utilizan los ésteresmonohidroxi-succinimídicos(método 3), no observándose,en ningún caso, mejorasen losrendimientoscuandolos tiempos de reacción se prolongan.En cuantoa laproporción de diastereoisómeros,hay que señalarque para los derivadosde
Phe se obtuvo casi exclusivamenteel isómero con disposición¿rans de los
—42—
sustituyentesen posiciones3 y 6, conindependenciadel método.En el casodelos derivadosde Trp, se observaronproporcionesvariables,si bien el isómero3,6-transfue siempremayoritario.
‘fabla 1. Resultadosobtenidosen la síntesisde los compuestos
45a, 4Bab, 53a y 54ab,utilizando los métodos2y 3
Proporción deaTiempo de reacción Rendimiento diastereoisómeros1)
Compuesto Método (días) (%) a/b
45a 2 6 42 s 10:13 3 60 >10:1
46ab 2 6 42 5:2
3 3 40 3:2
58a 2 6 30 >10:1
54ab 2 6 34 6:5
a Calculadoa part:r de los correspondientescetodiésteres37,38,51y 52.
b Estimadapor 111 RMN.
2.1.2. 2,5-DICETOPIPERIDINAS3,3,6-TRISUSTITUIDAS
Una vez puestaa punto la síntesisde las 3-metoxicarbonil-2,5-diceto-
piperidinas 6-sustituidasde fórmula general 33, el pasosiguientepara lapreparación de los pseudopéptidoscetometilénicoscíclicos propuestoslo
constituyó la introducciónde la cadenalateral del aminoácidoC-terminal o deun precursorde la misma en la posición 3 del anillo de 2,5-dicetopiperidina.
Para ello, se planteó en primer lugar estudiarla alquilación directa de losderivados45ay 4Bab, eligiéndosetresagentesalquilantesdiferentescapacesdesuministrarlas cadenaslateralesde tres aminoácidosde distinta naturaleza,como son la fenilalanina, la alaninay el ácido aspártico.Así, la alquilaciónde45a y 46abcon bromurode bencilo y bromoacetatode etilo en DME, utilizandocomo basemetóxidosódico(métodoA), condujoa los derivadosS5ab,56ab,57ab
y 58ab, respectivamente(Esquema6). Un tratamientosimilar con yoduro demetilo como agentealquilante llevó a la obtencióndel derivadocorrespondiente3-metil sustituido6Oabcon bajo rendimiento,mientrasque el análogo59abno
43—
pudo obtenersepor este método. Los productos59aby BOab se prepararon
finalmente por alquilación de las dicetopiperidinas 45a y 46ab con yoduro de
metilo, en condicionesde transferenciade fase, duranteseis días, utilizando
NaOH como base e hidrogenosulfato de tetrabutilamonio como catalizador
(método B) 81,82 En estascondicionesse recuperóentre un 25 y un 30% de
producto de partida inalterado. Sin embargo,la prolongación excesivade los
tiempos de reacciónhastadesaparicióndel productode partida, lleva consigo
la saponificación de los ésteres metílicos, lo que dificulta la etapa de
aislamientoy purificación de los productosobtenidos.
oo CO~kIe
CO2Me UN
ZHN CO2MeO
37,38 45a,46ab
NaMeO 2MétodoA~ R-XDME
MétodoE
Oo CO2Me H2/Pd-C
2
It’ McOH .,,, UNZUN It
2 CO2Me MétodoC Rcogvre 112
O
61-66 55b-60b
55ab,61:R’ =CH2Pb,R2 =CH
2Ph56ab,62: R’ = CH2In, E
2 = CH2Ph
1 257ab,63: R = CH2PE,R = CH2CO2Et
58ab,64: R’ = CH2In,E2 = CH
2CO2Et
59ab,65: E’ =CH2Ph,Ii2 =CH
3
6Oab, 66: Ii’ = CH2In, E2 = CH
3
Esquema6
Los derivadosde 2,5-dicetopiperidina3,3,6-trisustituidos55ab,5Bab, 58ab,
59aby BOab se obtuvieron como mezclasde dos diastereoisómerosen proporción2:1, mientrasque el compuesto57ab se obtuvo tambiéncomo mezclade dos
diastereoisómeros,pero en proporción3:1, segúnse deducede los espectrosde1H RMN. La separación cromatográfica de los dos diastereoisómeros
O
55a-60a
—44 —
solamentefue posibleen el casode 56ab. La configuraciónabsolutaen C-3 de
todos estosderivados3,3-disustituidosse establecióuna vez más a partir de los
datosde 1H IRMN de cadaparejadediastereoísómeros.En los espectrosdeS5ab
y 5Bab se observa que el protón H-6 de los isómeros minoritarios aparece
apantallado con respecto al mismo protón de sus correspondientes
diastereoisómerosmayoritarios. Este efecto indica que, en los isómeros
minoritarios,el protónH-6 se encuentraen disposicióncts respectoal anillo
aromáticoen posición3. Teniendoen cuentaque en todos estoscompuestosla
configuraciónabsolutaen C-6 es8, la de los isómerosminoritarios55b y 5Gb se
asignócomo (3R,6S),mientrasque la de los mayoritarios55ay 56a lo fue como
(3S,68).De manerasimilar, en los espectrosde los compuestos59ab y BOab,se
observaque el singletecorrespondienteal grupo metilo en posición 3 aparece
ligeramente apantalladoen el isómero mayoritario comparado con el
minoritario. Este hecho puede explicarse,nuevamente,por el efecto de la
corriente de anillo del resto aromáticoen posición 6, lo que indica que en el
isómeromayoritarioel sustituyenteen 6 y el grupometilo en3 estándispuestos
del mismo lado del anillo de 2,5-dicetopiperidina~ Siguiendoel mismo
razonamiento,en el casode los análogos3-(etoxicarbonil)metilsustituidos57ab
y 58ab, el apantallamientoobservadoparalas resonanciasdel grupo 3-CH2 en
el isómero mayoritario permitió la asignaciónde la configuración de estos
compuestos.
El estudio de los espectrosde13C RMN de todos estos derivados de
2,5-dicetopiperidinaha revelado la existencia de diferencias significativas
entre los distintos diastereolsómeros.Así, en los isómerosmayoritarios, los
carbonosendocíclicosC-4 y C-6, así comolos CH2 ó CH3 pertenecientesa las
cadenaslaterales,aparecena campoligeramentemásalto que en los isómeros
minoritarios, mientras que el carbono C-5 aparecedesapantalladoen losisómeros mayoritarios respectoa los minoritarios. El hecho de que estas
diferenciasseanprácticamenteconstantesa lo largo de la serie de compuestos
aquídescritosabreJa posibilidad de queestosresultadosde ‘~C iRMN puedan
ser utilizados como criterios para la asignaciónde la configuración en otros
derivados similares.
Dado que los rendimientosde la alquilación de las 3-metoxicarbonil-
2,5-dicetopiperidinas 6-sustituidas no resultaron todo lo buenos que se
esperaba,y teniendo en cuenta que la alquilación de 4-cetodiésterestrans-
curre, en general, con buenosrendimientos~ se consideróconvenienteensayarla secuenciainversade reacciones. De estemodo, la reacciónde los
—45—
4-cetodiésteres37 y 38 conbromurodebencilo,bromoacetatode etilo y yodurodemetilo, en presenciade metóxido sódico, dio lugar a los derivadosde malonatodisustituidos61-66 ~7, respectivamente. La hidrogenacióncatalíticade estosderivados condujo a las 2,5-dícetopiperídinas55-60, que se obtuvieronnuevamentecomo mezclas de dos díastereoisómeros,en proporcionesidénticasa las encontradascuandose siguieronlos métodosA y 13. pero conrendimientosconsiderablementemejores.
Los resultadoscomparativosobtenidosen la síntesisde los derivadosde
2,5-dicetopiperidina3,3,6-trisustituidos,por los tres procedimientosensayados,serecogenen la tabla 2.
Tabla2. Resultadosobtenidosen la síntesisde los compuestos
55-60,utilizando los métodosA, ¡3 y C
Compuesto Método
Proporción de
Rendimientoglobal a diastercoisémerosb(04) alb
55ab 00
3457
2:12:1
SSab 00
551
2:12:1
57ab 00
3241
3:13:1
SSab 00
2360
2:12:1
5Oab 23C
1964
2:12:1
SOab 223C
117
54
2:12:1
2:1
ba Calculadoapartir de los cetodiésteres87 y SS. Estimadapor111 RMN.
Estos resultados indican que el método C conduce a rendimientos
globalesmejoresque los métodosA y B, constituyendoasí el métodode elección
para la síntesis de este tipo de derivadosheterocíclicos.Por otra parte, la
proporción de diastereoisómerosfue muy similar en todos los casos,con
independenciadel método utilizado. Así, cuando se aplicaron los métodos
—46—
A o B, ni la naturalezadel agentealquilante(R2) ni la estereoquímicaen C-3 de
la 2,5-dicetopiperidinade partida afectaron,en general, a la estereoselec-
tividad de la alquilación. De manerasimilar, cuandose aplicó el método C, nila naturalezadel aminoácido de partida (R’) ni la del sustituyente(R2)influyeron en la estereoselectividadde la ciclación.En todos los casosse obtuvo
como diastercoisómeromayoritario el derivadode 2,5-dicetopiperidina3,3,6-tri-sustituido en el que los sustituyentes alquilicos en posiciones 3 y 6 se
encuentranen disposiciónrelativa cts.
Se conoce a través de la bibliografía 78,83,85-89 que las 2,5-diceto-
piperazinasprocedentesde dipéptidos en los que uno de los aminoácidoses
aromático, adoptanpreferentementeuna conformaciónen la que la cadena
lateral aromáticase pliega sobreel anillo de dicetopiperazina.La preferenciapor esta conformaciónplegada viene apoyadapor una serie de estudios de
RMN 78.83,85 R-X 86.87 cálculos termodinámicos85,88 y de OM 89 En los casos
en los que, además, el segundo aminoácido posee una cadena lateral
voluminosa, las interferenciasestéricasentre las cadenaslateralesde los dos
aminoácidos condicionan también la adopción de una conformación
determinada, llegándose a una situación de compromiso en la que se
maximiza la interacción estabilizante entre el anillo aromático y el de
2,5-dicetopiperazina,a la vez que se evita la interferencia estéricaentre las
cadenaslaterales86.87
Teniendo en cuenta que para la asignaciónde la configuraciónen C-3 delas 2,5-dicetopiperidinasaquí descritas se ha consideradola existencia de
conformacionesplegadas,y con el fin de establecerclaramentesi estetipo de
compuestospresentao no un comportamientoconformacionalparalelo al de
las 2,5-dicetopiperazinas,sedecidió llevar a caboun estudiodetalladoa partir
de sus espectrosde ‘H RMN. Estos estudiosconformacionalesse realizaronendos disolventes distintos, DMSO-d
6 y CDCI3, ya que se habían observado
diferencias notablesen los espectrossegúnque el disolvente utilizado fuera
uno u otro.
Considerandola existenciade un equilibrio conformacional,debido a la
rotación libre alrededordel enlaceC6-C7 ~,entrelos tres confórmerosA, 13 y O
indicados (Tabla 3), se pueden calcular las poblacionesrelativasde los tres
Nota sobre nomenclatura:El grupo £112 unido a la posición 6 del anillo de 2,5-diceto-piperidina se ha numeradocomo (2-7 para simplificar la notación.
—47-----
estadosrotacionales si se conocenlas constantesde acoplamientocorrespon-
dientesa cadauno. Como no es posible determinarexperimentalmenteestas
constantesde acoplamientopara cadarotámero, ya que los valores que se
obtienen a partir de los espectrosde 1H RMN correspondenal promedio de
todos los confórmeros que contribuyen al equilibrio, éstas se calcularon
utilizando la ecuaciónde Karplus parametrizadaparatres sustituyentes90,91,
Las fraccionesmolares de los rotámerosn4, n~ y nc se obtuvieron por
resolucióndel siguientesistema de ecuaciones:
nA +nB+nc—- 1
60 180 30C~(G,Y)cxp nA ~6,? + ~23 + U~ h.7
300 60 180~(6,7’)cxp = náJ6-, + nB ~6.7’ + nc ‘~67
Los subíndicesA, B y O indican el confórmeroy los superíndiceslos
ángulos de torsión interprotónicos. Los valores de las constantes deacoplamientocalculadosa partir de la ecuaciónde Karplus se indican a
continuación:
60 300 60 180 180 300
= 3,39;3A 2,65; J
23 = 3,62; J3 = 11,8; J~ = 11,8; J~ = 2,87.
Puestoque no es posibleasignarindividualmentelas resonanciasde losprotones11-7 y H-7, los porcentajesde los rotámerosA, 13 y O se calcularonpara las dos posibles soluciones1 y II (Tabla 3). De los datosobtenidosen este
estudio se deduceque el equilibrio conformacionaldependeclaramentedel
disolvente. Así, la cadena6-aralquilica adopta preferentementela confor-
mación plegadaA en DMSO-d6, mientrasque las conformacionesB o C son las
preferidas en CDCI3. Estos resultadosestánde acuerdocon las diferencias
observadasentre los espectrosde 111 RMN de los derivadosde 2,5—dicetopi-
peridina estudiados,segúnqueesténregistradosen CDCI3 ó en DMSO-d6.Así,
parala pareja de diastereoisómeros4Bab, el apantallamientoobservadoparael
protón H-3 en el isómeromayoritario 46a esmucho más acusadoen DMSO-d6
que en CDCl3, lo que refleja una mayor abundanciade la conformación
plegadaen el primerode los disolventes.En estaconformación,el protón 11-3 y
el anillo aromáticodel sustituyenteen posición 6 estánmás próximos en el
espacio,por lo quela influenciade la corrientede anillo esmayor
—48—
Tabla 3. Porcentajescalculadosde losrotánierosA, 11, y (2
NH— NH—
paralas2,5-dicetopiperidinas45,4Gab,SSab-OOab
iso’ >11—
z~H7300CO117
(213
Compuesto Disolvente %Ai %~i %C¡ %A11 %23n ~Cíf
51 20 29
17 262 73
50 18 32 50 3018 7 75 23 74
11 228 80
13 252 86
18 22
5 83
44 14 42
7 8 85
59 24 175 8 87
60 11 29
52 16 32
52 16 32
8 9 83
47 21 32
67 1818 79
63 2014 84
60 1818 82
46 40 14
14 85
57 1511 87
61
1
282
25 14
53 29 18
55 26 19
15 82 3
47 30 23
153
172
22o
1-17.60~
Ar 1-17
A
Ar
45a
46a46a
4Gb
4Gb
DMSO-d6
DM50 -a6COCl~
DMSO-dgCDC13
5725
56 26 22
53 2330 70
24o
203
6712
6212
6012
55a55a
55b55b56a
56a
5Gb
57a
58a58a
59a
59b
OOaOlla
60b
DMSO-d6CDC)g
DMSO-d6CD Cl~
DMSO-d6CDCI3
DM50-dg
CDCIg
DM50CDCI3
DMSO-d6
DM50-
DMSO-dE
CDC)3
DMSO-d6
—49—
Del mismo modo, se explica que, en el compuesto BOab, el
apantallamientoejercido por el anillo aromáticosobreel grupo 3-metilo en el
isómero BOa, en el que dicho grupo metilo estáen disposicióncts respectoal
anillo, sea también bastante mayor en DMSO-d6 que en CDC]3. Por el
contrario,en los derivados3-bencil sustituidos55aby 5Bab,el apantallamiento
observadopara el protón H-6 en los isómerosminoritarios 55b y 56b esmásacusadoen CDCI3 que en DMSO-d6. Esto pareceindicar que,en los compuestos
55ab y 5Bab, la contribución de una conformaciónplegadadel grupobenciloenposición 3 es más importante en CDC]3 que en DMSO-d6, mientras que la
cadenaaromáticaen 6 adoptapreferentementeestetipo de conformaciónenDMSO-d6.
En cuanto a las posibles conformacionesdel anillo de dicetopiperidina
(Figura 5), en DMSO-d6, la adopciónde una de las formas de bote torcido
liv o 5/ pareceser consistentecon el plegamientode la cadenaaromáticaen
posición 6 sobreel anillo de dicetopiperidinay con los valoresobservadosdelas
constantesde acoplamientoCH-NP? (Figura 6, Tabla4) 83,84,92 Cuando el
disolvente es CDCl3, se podría pensar igualmente en las conformaciones
11V o 5/, pero sin descartarlas formas bote II o III 84,86,87
11’ 0
11’ N
11 N té 1-11-1 ~ U
.7 1-3
1 III III
ORl R
1-1
O o
5=1-3 5=0
nr
Figura 5. Conformacionesdelanillo de2,5-dicetopiperidinay constantesdeacoplamientoOH-NH para los confórmerosII, III, 15/y V.
Rl
5=0
—50——
H
O o
11N4~H
Iv
R2, R3 = H, CO2Me,CH2Ph,CH2CO2Et,CH~
Figura 6. PosiblesconformacionesenDMSO-d6paralos derivadosde
2,5-dicetopiperidinarelacionadosen la tabla4.
Tabla4. Constantesde acoplamientoCH-NH y conformacionesposiblesen DMSO-d6
de los derivadosde 2,5-dicetopiperidina
Compuesto J1,6 (Hz) Conformación
45a 2,0 IV
46a 2,0 IV
4Gb 0 y
55a O V
55b 2,4 IV
56a O V
5Gb 2,6 IV
58a O V
59a O V
59b 1,2 IV
60a O V
60b 1,9 IV
—51---—
O o
y
2.1.3. PSEUDODIPÉPTIDOSCETOMETILÉNICOSCÍCLICOS
Siguiendoel esquemageneralde síntesispropuestoen el apartado2.1, laobtenciónde pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicosciclo[XaaM-’LCOCH2]Cxly](34) y ciclo[XaaW¡ICOCH2]Yaa] (35), requiere la eliminacióndel grupo3-metoxi-carbonilo de los derivadosde 2,5-dicetopiperidina3,6-di y 3,3,6-trisustituidos,
respectivamente.Esta eliminación, que implicó saponificacióndel éstermeti$lico seguidade descarboxilación,sellevó a cabo únicamentea partir de loscompuestos4Gaby 55ab,elegidoscomorespectivosejemplosrepresentativosdederivadosque deberíanconducir a pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos en
los que el aminoácidoC-terminal es Gly y otro aminoácidodiferente de éste
(Esquema7). De estamanera,la saponificaciónde los compuestos46aby SSab
condujo a los correspondientesácidos carboxílicos G7ab y 6Sab, cuyadescarboxilación por calefacción a reflujo de dioxano dio lugar aciclo[Trp’P1iCOCH~]Gly] 69 y ciclo[PheW[COCH2]-ambo-Phe] 7Oab, respectiva-mente,obteniéndoseeste último como una mezclade dosdíastereoisómerosen
proporción 2:1.
O O O
1) NaOIUIeOH dioxaoofiN 2)HGI fiN A
CO2Me co2uO O
46ab, 55ab 67ab, 68ab 69, 7Oab
67ab,69: R’ = CH2In, R2 = H
GSab,70:R1=R2 =CH2Ph
Esquema7
La asignación de la configuración absoluta de la pareja de diastercoisó-
meros 7Oab se realizó a partir de los espectrosde1H RMN, basándose
nuevamenteen los efectosde apantallamientode los anillos aromáticosde las
cadenaslateralessobre los protonesdel anillo de 2,5-dicetopiperidina.Así, enel espectrode 1H RMN en DMSO-d
6del compuesto7Oabseobservaque en el
isómero minoritario 70b, tanto el protón H-3 como el H-6 se encuentranapantalladoscon respectoa esosmismos protonesen el isómeromayoritario.Esto indica disposicionescts entre los protonesH-3 y H-6 y las cadenas6- y
—52—
3-aralquilicas, respectivamente.Por lo tanto, la configuración absolutadeldiastereoisómeromayoritario 70a se asignó como (3R,6S) y la de 70bcomo(3S,6S).
El hecho de que la descarboxilación de BSab para dar lugar a 7Oab
transcurrade forma estereoselectiva66,93 podríaexplicarsesuponiendoque la
descarboxilaciónse producea través de la formación del enol intermedio 71
(Esquema8). Segúnestemecanismopropuesto,la protonacióndel carbono0-3
tiene lugar preferentementepor la carainferior del anillo, menos impedida,
dandolugar mayoritariamenteal isómero70a 94.
o 1Ph Ph Ph Ph~
r I{Ny~2’68ab 71
o o
Ph Ph+
HN Ph HN
O o
lOa 70b
Esquema8
O1-1
—53—
2.2. DERiVADOS DE 8-OXOINUOLIZIDINAS COMO ANÁLOGOSCONFORMACIONALMENTE RESTRINGIDOS DE DIPÉPTIDOS
Como se indicó en el apartado1.3, el esquemasintético quenos deberíapermitir la obtenciónde las 8-amino-3-oxoindolizidina—2-carboxilato2—susti-tuidas objeto de este trabajo, se basóen el procedimientoque, previamente,había conducido con facilidad a 8-amino-3-oxoindolizidinas2-aralquil susti-tuidas a partir de pseudodipéptidoscetometilénicosderivadosde ornitinaconvenientementeprotegidos(Boc-Orn(Z)W!ICOCH2]Yaa,Yaa = Phe, Trp) 64~
En esteprecedente,el procedimiento,consistenteen unasimple hidrogenacióncatalítica, condujo directamentea las 3-oxoindolizidinasentoncesbuscadasatravés de un procesoque implica, en un solo paso,la hidrogenolisisdel grupoZ, aminación reductivay y-lactamización.A la vista de estosresultados,sepropusieron las dos rutas sintéticas alternativas indicadas en el esquema
general9, en las que la elaboracióndel biciclo lactámico,bien en una primera
etapa(ruta A), o bien en una segunda(ruta B), constituyeel pasofundamental.
CO e
l3ocHN
73NHZ RutaA
11
BodHN CO2Me CO2Meo BodUN
CQMe
72 NHZ
RutaE
CQMeBodHN
o RCO2Me
74
iR = cadenaslaterales dediferentes aminoácidos
Esquema9
o
——54—
Así, mediante la ruta A, la aplicación del citado procedimiento a]
cetodiésterderivadode ornitina 72 deberíaconduciral esqueletode 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilato73 comointermedio comúnpara la introducción
posteriorde las cadenaslateralesde los diferentesaminoácidos(R), incluidascomo sustituyentesen las 3-oxoindolizidinas2,2-disustituidas75. Alternativa-mente,siguiendola ruta B, la introducciónprevia de las cadenaslateralesde
aminoácidos(R) en el cetodiéster72 y la subsiguienteformación del biciclo
lactámico deberían dar lugar a las 3-oxoindolizidinas buscadas75. La
desprotecciónselectiva de los grupos NP?2 6 CO2H de los compuestos75
conduciríaa los derivadosde 3-oxoindolizidina aptospara ser incorporadosacadenaspeptídicasde mayor tamano.
2.2.1. FORMACIÓN DEL ESQUELETODE 8-AMINO-3-OXOINIJOLIZIDINA-
2-CARBOXILATO
Siguiendo la ruta A del esquemageneral 9, se llevó a cabo la
hidrogenacióncatalítica del 4-cetodiésterderivadode Orn 72, paradar lugar en
un solo paso de reacción, y de acuerdocon lo esperadosegún el ya citado
antecedente64, a la 3-oxoindolizidina73 (Esquema10). Estecompuestomostró
un espectrode ‘H RMN complejo, en el que, al menos,se podía observar la
presenciaesperadade dos diastercoisómerosmayoritarios en proporción 1:1
debidosa ]a creación de] centroasimétricoen el carbono0-2. La separacióncromatográficade estamezclade 3-oxoindolizidinasisómeras73 no se intentó,dada la conocida tendenciaa racemizarsede los derivados de malonatos
monosustituidos,que impide su resolución95,96
Con el fin de determinarla estereoselectividadde la aminaciónreductiva
y de asignar la estereoquímicaen 0-Sa, se procedió a eliminar el grupo
2-metoxicarbonilo. Así, la descarboxilacióndel ácido 76, procedentede la
hidrólisis del éster 73, condujo a una mezclade los derivadosde 8-amino-3-
oxoindolizidina 78a y 78b en proporción 12:1, determinada por HPLC.
Resultadossimilares se obtuvierontanto en la formaciónde los compuestos76
a partir del cetodiácido 77 como en la descarboxilaciónsubsiguiente. La
asignaciónde la estereoquímicade los diastereoisómeros78a y 78b se llevó a
cabo a partir de sus espectrosde1H RMN. Así, en el espectrodel isómero
mayoritario 78a, se observauna constantede acoplamiento~88a de 9,8 Hz, lo
que indica una disposicióntrans-diaxialde los protonesH-8 y H-8a, mientras
56—
queparael isómerominoritario 78b el valor de la ~S,8aesde 2,9 Hz, indicando
unadisposicióncts paralos mencionadosprotones.
NHZO
112¡Pd-C(2O2Me
McOH
BocHN CO2Meo BocHNCO2Me
72 ‘73
I I) NaOHIMeOI-I ji> NaOHI1~1eOH
2) HO) 2) Hcl
NHZO
H2IPd-C
MeOH 2
BocHN 211o 00211 BocHN
77 76
I dioxano/A
o O
+
flodUN BocHN
78b
78a/78b=12:1
Esquema10
Estos resultadosindican que la aminación reductiva implicada en la
elaboracióndel esqueletode oxoindolizidina transcurre con un alto grado de
estereoselectividad,conduciendomuy mayoritariamentea una disposicióntrans de los sustituyentesen 8 y Sa. En cuantoa configuracionesabsolutas,ala esperade poderdeterminarsi hay racemizaciónalgunadel resto de L-Orn
durantela formación de la oxoindolizidina, se asignaronde forma tentativacomo (SS,8aR)y (8S,8aS)paralos compuestos78ay 78b, respectivamente.Por
78a
—56—-
tanto, el compuesto73 y su análogo76 estaríanconstituidospor unamezcladedos parejasde diastereolsómerosen 0-2 de configuraciones(2RS,SS,8aR)y(2RS,8S,8aS).
O
N
CO2R
BocHN
73ab:R = CH37Gab: R = H
O
N
CO2R
BocHN
73cd: R = CH~7Gcd: R = H
Con el fin principal de disponerde unaseriede derivadosde 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilato con distintas configuraciones en sus centros
quiralespara ser insertadosposteriormenteen cadenaspeptídicas,se decidió
preparar los compuestos81, análogosde 73, siguiendo el mismo procedi-
miento, pero utilizando D-Orn como producto de partida (Esquema11). La
preparación del 4-cetodiésterderivado de Boc-D-Orn(Z) 80 se llevó a cabo
siguiendoel mismo método descritopara su enantiómero64• La hidrogenación
catalíticade 80 condujoa la obtencióndel derivadode 3-oxoindolizidinaSi como
una mezclade diastercoisómerosen las mismasproporcionesque en el caso de
sus respectivosenantiómeros73.
NHZ NHZ
1) BijOCOCIINMM, TIff
OH 2) CH2N23) HCI’MeOH BocHN Cl
O
4) NaI/THF
5)NaBC(CO2Me»
79
NHZ
BodHN’ CO,2MeO CO2Me
80
I H 2/Pd-c
MeOH
O
N
CO2Me
BocHN
81
Esquemail
BodUN’O
—57—
2.2.2. ALQUILACIÓN DE DERIVADOS
DE 8-AMJNO-3-OXOINDOLIZIDINA-2-CARBOXILATO
Para estudiar la posibilidad de introducción de cadenaslaterales de
diferentesaminoácidosen la posición 2 del anillo de 8-amino-2-metoxicarbonil—
3-oxoindolizidina, se realizó, en primer lugar, un estudiode la alquilación del
compuesto 73 con bromuro de bencilo (Esquema 12). Además de la gran
reactividad de este agente alquilante, la presenciade una cadena lateral
aromática en el anillo de 3-oxoindolizidina podría ser de utilidad para la
asignación de la estereoquímicade los productos finales obtenidos. De este
modo, se sintetizó el compuesto82 como mezcla de tres diastereoisómeros.en
proporciones 11:2:1, que pudieron ser separadospor cromatografía y cuya
estereoquímicase establecióa partir de sus datosde 1H RMN. Los isómeros
obtenidosen mayor proporción presentanuna disposocióntrans entre los
protones H-8 y Hl-Sa, como se deducede los valores de las constantesde
acoplamientoJ8,Sa,de 8,6 y 9,7 Hz, respectivamente.Por otra parte, en el
espectrocorrespondienteal isómerominoritario el valor de la constanteJgs~es
de 3,1 Hz, lo que está de acuerdocon una disposición relativa ds entre los
mencionadosprotones. Asumiendo~ que la configuraciónen 0-8 es S en los
tres casos,la configuración en 0-Sa se asignó como R para los isómeros
mayoritarios y como S para el minoritario. Por otra parte, el protón Hl-Sa del
diastereoisómeromayoritario 82a apareceapantalladocon respectoa ese
mismo protón en el compuesto78a, ambosde configuraciónR en 0-Sa. Esta
diferenciase atribuyó al apantallamientoproducidopor el anillo aromáticodel
sustituyenteen posición 2, por lo que sededucequeel protón H-8a y eí grupo2-
bencilo se disponen en la misma cara del anillo heterocíclico.Como era de
esperar,el protónH-Sa del isómero82b presentóun desplazamientoquímicomuy similar al de esemismo protón en 78a. Finalmente, la configuración
absolutadel isómerominoritario 82c se asignócomo(2S,SS,SaS),teniendoencuentael apantallamientoobservadopara el protónHl-Sa de estecompuestoencomparacióncon el de 78b, que indicabanuevamenteuna disposición relativacts entreel grupo bunciioyel mencionadoprotón.
+ Como ya se ha mencionadoen el capítulo anterior, las asignacionesde configuraciones
absolutas,tanto en las indolizidinas obtenidas a partir de L-Orn como de D-Orn, serealizaron, en principio, de manera tentativa partiendo de una ausencia total deracemizaciónen el C-cx del aminoácido.Este aspectose resolverádefinitivamente tras elestudiode enantioselectividaden el procesode formación de estosbiciclos (Apartado2.2.3.)
——58—
La introducciónde la cadenalateral del Trp en la posición2 del anillo de
3-oxoindolizidina, se llevó a cabo por tratamiento del compuesto 73 con
metíyoduro de gramina, utilizando metóxido sódico como base. En estas
condicionesseobtuvo el compuesto83, tambiénformadopor una mezclade tres
diastereoisómerosen proporciones11:2:1. La asignaciónde la configuraciónen
0-2 y 0-Sa se realizó nuevamentea partir de las constantesde acoplamiento
~8,8a y los valoresde desplazamientoquímico de los protonesH-8a, siguiendoel
mismo razonamientoqueen el casode los derivados82.
O
NCQMe
Bocl-IN
73
IO
N
CO2Me
BocHN
82a,SSa,Ma
1O
N
COQE
BocHN
85w 86a
O
N CO2Me
+
Boel-IN
82b, 83b, Mb
4,O
N cO2H+
‘—II
BocHN
85b, 8Gb
O
N CQMe+
ti
BodUN
82c,83c,Mc
1O
>4 C02H+
ti
BocHN
85c
82a,82b, 82c,85a,85b, 85c: R = Ph
83a,SSb, 83c,SGa,8Gb: U = In
84a,Mb, 84c: R = CO2Et
Esquema12
—59-----
La alquilación de 73 con bromoacetatode etilo, agentealquilante portadorde un precursorde la cadenalateral del Asp, utilizando metóxido sódico como
base,condujo a la obtención de 84 con bajo rendimiento. Sin embargo,una
reacciónsimilar utilizando NaH dio lugar al compuesto84 con un rendimiento
aceptable. El espectro de 1H RMN de 84 indicó la presenciaclara de dos
diastereoisómerosen proporción aproximada5:1, detectándosetambién trazas
de un tercerdiastereoisómero.Como en estecaso no fue posible la separacióncromatográficade los mismos,la asignaciónde la configuraciónse realizó apartir de los datos de 1H RMN de la mezcla. Nuevamente,el isómeromayoritario presenta una constante de acoplamiento ~88a de 8,5 Hz,
concordante con una disposición trans entre los protones H-8 y H-Sa.
Suponiendoqueel ataquedel agentealquilantetiene lugarpreferentementeporla mismacaradel anillo que en los casosanteriores,el compuestomayoritario84a se corresponderíacon el isómero(2S,SS,SaR),mientrasqueel minoritario84b presentaríaconfiguración(2R,8S,SaR).
La desprotecciónparcial de los compuestos82a, 82b,82e, 83ay 83b por
tratamientocon NaOH, condujoa los correspondientesácidoscarboxílicos85a,85b, 85c, SBay 86b, respectivamente(Esquema12), adecuadospara su
introducciónenpéptidosde mayor tamaño,como sedetallaráen el capítulo2.3.La alquilación con bromurode bencilo del correspondientederivado de
3-oxoindolizidina 81, preparadoa partir de D-Orn, dio lugar al compuesto87
(Esquema 13), constituido por una mezcla de tres diastereoisómerosen
idénticasproporcionesa las descritaspara82. Los espectrosde ‘H RMN deestos tres diasteroisómerosson idénticos a los de sus enantiómeros
correspondientes,82a,82b y 82c, respectivamente.Los compuestos87ay 87b fueron saponificadosa los ácidoscarboxílicos
88a y 88b, adecuadospara su introducción posterior en la secuenciadelhexapéptidoC-terminal de la Neurotensina,como se indicaráen el capítulo
correspondiente.De forma general,la alquilación de las 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizi-
dinas transcurrecon rendimientosmoderados,que oscilanentre el 58% y el69%, obteniéndoseen todos los casos con esteroselectividadessimilares,independientementedel agentealquilanteutilizado. Se observatambiénque la
entrada del agentealquilante tiene lugar preferentementepor la misma cara
del anillo de 3-oxoindolizidinaen la quese encuentrael protón H-8a.
——60—
ON
CO2Me
BocHN
O
N CO2Me
Ph
B ocHN
8’7a
81
+ CO2Me
BocHN
Sm
O
N —Ph+
BocHN
87c
4O
N CO2H
— — Ph
88a
BOCHN
SSb
Esquema13
2.2.8. ENANTIOSELECTIVIDAD EN LA FORMACIÓN DE DERIVADOS
DE S-AMINO-3-OXOINDOLIZJDINA-2-CARBOXILATO
Cuando se llevó a cabo el acoplamientode los compuestos82 conBoc-L-Trp, con objeto de prepararanálogosconformacionalmenterestringidosde COK (Capítulo2.3), seobservóque, tanto a partir del compuesto82acomode
82h, se obteníanmezclasde dos diastereoisómeros.Este hechopodíaserdebido,bien a la racemizaciónparcial del L-Trp duranteel procesode acoplamientoobien a que las 3-oxoindolizidinas82ay 82b estabanconstituidaspor mezclasdeenantiómeros.Teniendoen cuentaque los métodos de formación del enlacepeptídico empleadosno producennormalmenteracemización,la segundaexplicaciónparecíamásprobable.Para esclarecerestepunto, se llevó a caboun seguimientode la ruta sintética utilizada para la preparaciónde losderivadosde 3-oxoindolizidina,estudiándoseconcretamentelos 4-cetodiésteresderivados de Orn y las 3-oxoindolizidinas2,2-disustituidas.Los primeros
BocHN
o
Ph
CO2H
—61-——
fueron elegidospara determinarsi durantela etapade obtenciónde los 4-ceto-
diésteresse producíaracemizacióndel derivado de Orn de partida. Por otraparte, la determinación del exceso enantioméricode las 3-oxoindolizidinas
2,2-disustituidasnos daríaideade la enantioselectividadduranteel procesode
generacióndel anillo de 3-oxoindolizidina. En este caso, no se eligieron las
2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidinasintermedias,ya que el hecho de que seobtengan como mezclas de diastereoisómerosinterconvertibles en 0-2dificultaría el estudio.Además,es poco probableque la reacciónde alquilación
en 0-2 afecte a los centrosasimétricos0-8 y 0-Sa,previamentecreados,por loque los resultadosobtenidoscon los derivados2,2-disustituidospuedenserextrapolablesa las 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidinas.Parallevar a caboesteestudiose prepararon,en primerlugar y de formaparalela,los 4-cetodiésteres72 y 80, derivadosde L- y D-Orn, respectivamente.A continuación estos
compuestosfueron hidrogenadosen idénticascondicionesde concentraciónypresiónde H2, y a temperaturasde 12-14 OC para72 y 14-15 CC para80, dando
lugar a las 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidinas73 y 81. Estosderivadosfueron
alquilados posteriormentecon bromuro de bencilo, en las condicionesyaindicadas, para dar lugar a los compuestos82 y 87, respectivamente,procediéndosefinalmente a la separacióncromatográficade los correspon-dientesdiastereoisómeros.
Paradeterminarla purezaenantioméricade los 4-cetodiésteres72 y 80,
asícomo de los derivados82a,82b,87ay 87b, serecurrióal empleode auxiliares
quirales~, para obtener,si fuera el caso,los correspondientesderivadoscomomezclasde diastereoisómeros,detectablespor RMN. Entre los diversostipos de
auxiliares quirales existentesse eligieron, en primer lugar, los agentesquiralesde solvatación97,98, dadala rapidezy simplicidaddel experimentoy laimposibilidad tanto de problemasde resolucióncinéticacomo de racemización
de la muestra.Los espectrosde ‘Hl RMN de los compuestos72, 82a y 82bregistradosen presenciade cantidadescrecientes(de 1 a 4 equivalentes)de(S)-(+)-TFAE y utilizando CDCl3 como disolventeno presentarondesdobla-
miento en ningunade las señales.Aunque el CDCI3 es uno de los disolventes
más adecuadospara estetipo de ensayos,dadasu baja polaridad, se registrótambiénel espectrode ‘Hl RMN del compuesto82bjunto con 3 equivalentesde(S)-(+)-TFAE en benceno-d6,por si la menorpolaridad de este último pudiera
ser un factor decisivo para la eficacia del experimento.Sin embargo,tampocoen estecasose observódesdoblamientode señales.
——62—
72
Los agentesquirales de derivatízación~, de uso muy extendido para
determinar excesosenantioméricos,presentanla ventaja de que para los
diastereoisómerosobtenidosel A~ observadosueleserdel ordende cinco veces
superioral que se observacon los agentesquirales de solvatación.Dentro deestos agentes,se utilizó el ácido a-metoxi-c~-(trifluorometil)feni1acético
(MTPA) 99, que es el de aplicación más amplia para derivatizar aminasprimariasy secundarias,así como aminoácidos100.
La desproteccióndel grupo 5-aminode los 4-cetodiésteres72 y 80 conTFA, seguidade tratamiento con (R)-(+)-MTPA en presenciade BOP 101,
condujoa la obtenciónde los derivados89 y 90, respectivamente(Esquema14).
>4HZ NUZ
O
BocHN CO2Me 1)TFA/C142C!2 MeO2)(R9-(+)-MTPA Ph N A2
11 o (‘O MeCO<2Me
‘289
NHZ NI-IZ
1) ‘ITA! cti2ci2 MeO O
BocH>4 CO2Me 2) (R)-(+)-MTPA Ph N CO#fe
O CQMe CF3 11 CO2Me
80
Esquema14
En la evaluaciónpor }{PLC de los crudosde reacciónseobservóquetantopara 89 como para90 seobtenía un solo pico con idéntico tiempo de retención.Tras una cuidadosapurificación cromatográficase registraronlos espectrosde
1H RMN en CDCl3. Cadauno de ellos muestrala existenciade un único
grupo de señales,con pequeñasdiferenciasde desplazamientosentre uno y
otro. Paradeterminarsi estasdiferenciaserandebidasa pequeñasvariacionesen las condicionesen que se obtuvieronlos espectros,se compararonéstosconel espectrode una mezclapreparadacon los derivados89 y 90 en proporción3:1. En este último se observa el desdoblamientoclaro de las señales
O
O
90
——63—
correspondientesa los protonesH-7 y al OCH3 del MTPA. Por tanto, se puede
concluir que,dentro de los límites de detecciónde la RMN, la formación de los4-cetodiésteresderivados de L- y O-Orn transcurresin racemización.Losvaloresde AS (~sg-~9o)observadosestánde acuerdoconlas prediccionesteóricas
del modelo del MTPA, segúnel cual los derivadosde este tipo adoptan,endisolución, una conformaciónpreferenteen la que el grupo carbonilo de laamidase encuentraeclipsadocon el grupo trifluorometilo y con el hidrógeno
11-5 ~ (Figura 7). Así, los protones11-7 del compuesto90 aparecenapantalladospor la corrientede anillo del grupo fenilo 99, próximo en el espacio(AS = 0,22ppm). Por otra parte,el AS observadopara el grupo a-metoxilo (—0,13 ppm)
indica que, en el isómero90, los protonesde dicho grupo estándesapantalladospor eí grupo carbonilo, ya que ambosgruposestánorientadoshacia el mismolado del planodel MTPA ~.
COcH2cH(cO2cH3)2 (CH<93-NHZMeO Ph Ph
ZHN-(CH2y,
45)
89 90
Figura 7. Conformacionespreferentesen disolución, segúnel modelodel
MTPA, de los cetodiésteresderivatizados89y 90.
Seguidamentese derivatizaroncon (R)-(+)-MTPA los compuestos82ay
87a(Esquema15) y 82by 87b (Esquema16), aplicandoel mismoprocedimientoutilizado paralos 4-cetodiésteres.
El análisisde HPLC de los crudosde reacciónindicó quetanto a partir de82a como de 87a se obtenía la mezcla de diastereoisómeros91a+91b,enproporciones6,3:1 y 1:5,8, respectivamente.Del mismo modo, la derivatizaciónpor separadode 82b y 87b condujoen amboscasosa la obtencióndel compuesto
92ab,en proporciones a/b de 5,4:1 y de 1:3,9,respectivamente.Nuevamente,los valores de AS(a-b) encontradosen los espectrosde
‘Hl RMN de las parejasde diastereoisómeros9lab y 92ab presentanuna granconcordanciacon las prediccionesdel modelo del MTPA (Tabla 5, Figura 8).Así, los valoresde AS negativosparalos protones11-1 y Hl-Sa son consistentes
con el apantallamientode dichosprotonespor la corrientede anillo del grupo
MeO
—64 —
fenilo en los isómeros 91a y 92a, mientras que los valores positivos para losprotones H-7 indican que son éstos los que, en los isámeros 91b y 92b, seencuentrandel mismo lado que el anillo aromático.
oN Ph
CO~Me
BocHN
82a
O
N CO2Me
— PhBodUN
87a
1) TFA/cH2CI22) (R)-(i-)-MTPA
(S)-(+)-MTPA-clo
O
Ph
¼ CO~Me+
(R)-MTPA-HN
91a
O
N CO2Me
— Ph
(R)-MTPA-HN
91b
Esquema15
O
N CO2Me
“—ph
BocHN
82b
O
N Ph
CO2Me
BocliN
87b
1) TFA/cH2cI22) (R)-(+)-MTPA
O
N ¡ CO2Me
—Ph
(R)-MTPA-HN
92a
O
N Pb
CO Me2
+
(R).MTPA-HN
92b
Esquema 16
—65—
Tabla 5. Diferenciasde desplazamientoquímico (ppm) más significativas
de ‘a RMN [(CDg)2C0]delasparejasde diastereoisómeros9laby 92ab
Compuesto 11-1
AS(a-b),ppm
H-7 ¡1-Sa
9lab —0,26 + 0,11 + 0,12 —0,16
92ab —0,29 —0,17 + 0,11 + 0,16 —0,14
Ph
Cofa3
H H Ph
E ~ OCa3
~ O CF3
91a
CO2CH3
11N<t. OCaS11 o
92a
Ph
11CHSO2C o
11N
01130, ~N
11CE3
0 H
91b
92b
Figura 8. Conformacionespreferentesen disolución,segúnel modelo
delMTPA, de los compuestos9lab y 92ab.
La diferenciaen la proporción de díastereoisómerosobtenidaa partir de
82a (6,3:1)y 82b (5,4:1), en los que, por proceder de la mismareacción, el exceso
enantioméricodebe ser idéntico, sugiere la existenciade algún problema de
resolución cinética, debido a las diferentesvelocidadesde reacción de los
O11
—66-—
sustratosenantiómerosfrente al reactivo quiral 9~. Se obtieneun resultado
similar al derivatizarlos compuestos87ay 87b, como ya se ha indicado.Paratratar de evitar esteproblema,seprocediódenuevoala introduccióndel MTPAen los derivadosde 3-oxoindolizidina,utilizando un gran excesode! cloruro delácido de Mosher correspondiente,mucho más reactivo loo. En estascondiciones,los diastereoisómeros9lab se obtuvieronen proporciones5,3:1 y
1:5,3, a partir de 82ay 87a, respectivamente.Sin embargo,una derivatizaciónsimilar de 82ay 87a concloruro de (R)-(—)-MTPA condujoa proporcionesde laparejade diastercoisómeros93abde 7,6:1 y de 1:4,9, respectivamente(Esquema17). Estehechoindica quela utilización de los clorurosde ácido no solucionaelproblemade resolucióncinéticay, por lo tanto, las proporcionesde las mezclasde diastercoisómerosobtenidassedebenconsiderarcomo aproximadas.
O OPh N CO2Me
CO2Me Ph
Boel-IN BocHN
82a 87a
1) TFA’0112C1, 42> (R)-(—$NIWA-c:
O O
N Ph CO2Me+
CQAle — Ph
(S)-MTPA-I-IN (SYMTPA-HN
93a 93b
Esquema17
En cualquiercaso, los resultadosde esteestudiode derivatizaciónconMTPA ponende manifiestoque los derivadosde 3-oxoindolizidinapreparados
están constituidos por mezclasde dos enantiémerosformados durante elprocesode elaboracióndel anillo heterocíclico. Teniendo en cuentaque elcentroasimétricoen 0-Sase forma durantela reacciónde aminaciónreductivaintramolecular,los intermediosde esta reacciónhande ser los determinantesde la formación de las mezclasde enantiómerosobtenidas(Esquema18). Así,si la reacciónde hidrogenación del ‘y-cetodiéster72 transcurriesea travésde la
—67—
ae
ao
ti
448aO
/z
ao
o
+
o> ‘4
a
e
z
zao
4ao
a
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a
o
+
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O
z
ao
o -9
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4’o
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Q
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ao
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O
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2:ao
+
=4ao
o> ‘4
a
e
2:
2:ao
E-
u.-
imina intermedia A 102,103, se obtendríanlas piperidinas D y E que, trasy-lactamización,daríanlugar a los derivadosde 3-oxoindolizidina73aby 73cd
mayoritarios.Por otra parte, a través de un equilibrio imina-enamina,laimina A puedeconvertirseen la imina 0, cuya hidrogenacióngeneraríalas
3-oxoindolizidinas8lab y 8lcd. Dado que las transposicionesimina-enaminaestánfavorecidaspor el calor, para comprobarla validez de estemecanismopropuesto,se llevó a cabo la hidrogenacióndel ‘y-cetodiéster72 a 40 OC. La
derivatizacióndel compuesto82a, preparadopor alquilación de la 2-metoxi-carbonil-3-oxoindolizidina 73 así obtenida, condujo a los derivados9lab(a¡b = 2,1:1)y 98ab(a/b = 2,8:1), siendolasproporcionesa/bmuy superioresalasencontradascuando la hidrogenación de 72 se había llevado a cabo atemperaturamásbaja(Tabla6).
Tabla 6. Excesosenantioméricosdeterminadostras derivatizaciéncon MTPA
de las 3-oxoindolizidinas82a,82b, 87ay 87b
Proporciónalb (% excesoenantiornérico)Prod. de Temp. de Prod. final — __________ ______
partida hidrogen. denvatizado (R)-(+)-MTPA-OH (S)-(+)-MTPA-C~ (R)-&-i-MTPA-CI
u-Orn 12-14 0C 9lab 6,3:1 (73) 5,3:1 (68)
L-Orn 400C 91ab 2,3:1 (39) 2,1:1 (35)
D-Orn 14-15 0C 9iab 1:5,8(71) 1:5,3 (68)
u-Orn 12-140C 92ab 5,4:1 (69)
1)-Orn 14-15<C 92ab 1:3,9(59)
u-Orn 12-140C 93ab 7,6:1 (77)
u-Orn 40<C SSab 2,8:1 (47)
n-Orn 14-15 0C S3ab 1:4,9 (66)
La estereoselectividadobtenidaen 0-Sase puedeexplicar tambiénpormedio de este mecanismo,ya que es de esperarque la hidrogenaciónocurra
preferentementepor la cara superiorde la imina A o por la inferior de laimina 0, para dar lugar al derivadode piperidinacon los dos sustituyentesen
disposición relativa trans diecuatorial (D o F). La pequeñaproporción delisómerominoritario podría procederde la hidrogenaciónde la imina por ellado menosfavorable o bien de la hidrogenaciónde la enamina.Sin embargo,
la gran resistenciaa la reduccióndel doble enlaceenamínicoobservadatanto
—69—
en el derivado de hexahidroindolizina 106, que se describemásadelante,comoen el casode otros sistemasrelacionados104,105,apoyael que la hidrogenación
procedaen todoslos casosvía la imina intermedia.
2.2.4. FORMACIÓN DE DERIVADOS DE Sa-HIDROXI- Y Sa-ALCOXI-8-AMINO-
3-OXOINDOLIZIDINA-2-CARBOXILATO 2-SUSTITUIDOS
De acuerdocon el esquema9 (Apartado2.2) se abordéla ruta sintéticaB,como alternativa a la descrita en el apartado2.2.1 para la síntesisde losderivadosde 8-amino-3-oxoindolizidinas2,2-disustituidasde fórmula general
75. Cabríaesperar,en principio, que por esta segundaruta, la reacción dealquilación para introducir las cadenaslateralesde los aminoácidos,en este
caso, en los derivados malónicos lineales, transcurriera con mayorrendimiento que en el caso de la ruta A, en que se introducían en la
oxoindolizidina previamenteformada. En una segundaetapa, los 4-ceto-
diésteresportadoresde dichas cadenasdeberíanconducir, en las condicionesde hidrogenaciónhabituales,a los derivadosde 3-oxoindolizidina-2-carboxilato2-sustituidos,de manerasimilar a como ocurría en las 3-oxoindolizidinas2-monosustituidasanálogas64
Paraexplorarestasegundaruta, se preparó,con excelenterendimiento,el 4-cetodiéster94 por alquilacióndel compuesto72 con bromurode bencilo. Encontrade lo esperado,la hidrogenacióncatalíticade 94 utilizando MeOH comodisolvente(método A), no dio lugar a las correspondientes3-oxoindolizidinas2,2-disustituidasbuscadassino a una mezclade los derivadosSa-metoxi y
Sa-hidroxi sustituidos95 y 96 (Esquema19), amboscon el grupo 2-carboxflatocomo ácido libre. Efectuandoel seguimientode la hidrogenaciónpor HPLC seobservala formación exclusivadel compuesto95, mientrasqueel derivado96
se obtienepor hidrólisis de 95 durantela manipulaciónde la reacción.En elespectrode ‘H RMN registradoen DMSO-d6 de la mezclade 95 y 96 no seobservanlas señalescorrespondientesa los protonesH-8a, apareciendolos
protonesH-1 simplificados en forma de dobletes. Por otra parte, entre lasseñalesatribuibles al derivadomayoritario 95 se observaun singletea 3,01ppm, queintegrapara tresprotonesy que indica la presenciadel hemiaminalO-metilado. El espectrode ‘
3C RMN muestra señalescaracterísticasdecarbono cuaternario a 90,18 y 85,49 ppm, asignables a los carbonoshemiaminálicos0-Sade95 y 96, respectivamente1061OS~
—70-—
o
oo
o
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O
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2-4
Con el fin de minimizar la fácil hidrólisis del compuesto95 e impedir asísu transformaciónen el derivado Sa-hidroxilado96, se trató la mezclade losdos con CH2N2, lo que dio lugar a la obtenciónde los ésteresmetílicos97 y 98,
que pudieron ser separadospor cromatografía. La asignación de laconfiguración absolutade los dos nuevoscentrosasimétricosgeneradosen elprocesode formacióndel anillo de 3-oxoindolizidina,0-2 y C-8a, se llevó a cabo
a partir de los compuestos97 y 98 por medio de experimentos de NOEbidimensional (NOESY). El compuesto98 muestraun fuerte intercambiodipolar de magnetización(NOE) entrelos protonesH-1¡3 y 11-5, por una parte,yH-1j3 y 2-CH2, por otra (Figura 9), lo que indica que el protón 11-8 y el grupo
bencilo en posición 2 se encuentrandel mismo lado de la molécula.Del mismomodo, se observaun fuerte NOE entrelos protones11-la y OH, de dondese
deducequeel protónH-8 y el grupo OH debenhallarseen disposiciónrelativatrans. En el caso del derivado 8a-metoxi sustituido 97, se observanfuertesNOEsentrelos protones H-1j3-OCH3,11-113-2-0112y H-8-OCH3,indicandoqueelprotón 11-8 y los grupos OCR3 y 2-bencilo se encuentranen disposícion
relativacia
O OCOQCH3
Ph
BocHN H BocEN H
98
Figura 9. NOEssignificativosobservadospara los compuestos97y 98.
Paraintentar explicar la formación del derivadocarboxílico 95, así como
los resultadosestereoquimicosde la ciclación, se puedenproponerdos posiblesmecanismos(Esquema20). Así, suponiendola formacióninicial del hemiami-nal A, en el que el anillo de piperidinaadoptauna conformacióntipo silla conlos grupos 2-alquilo y 3-amino en disposición relativa trans-diecuatorial,lahidrólisis del éster metílico al correspondienteácido carboxilico podría tenerlugar a través de la lactona D, mediante el desplazamientodel grupo
carboxílato por ataquedel disolvente (MeOH> 109, paradar lugar directamente
97
—72—
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al derivadoSa-metoxisustituido95. Estafisión alquil-O ocurreprobablementea
través de un mecanismo bimolecular BAL2 110-112, ya que se obtieneexclusivamenteel isómeroque procedede la inversióntotal de la configuración
del carbonoU-Sa. La lactama tricíclica D podría formarsea partir del ioniminio 0, procedentea su vez del derivado Sa-hidroxilado98, o de la másimprobable acilación intramolecularde la imina intermedia B 113,114 El
segundo mecanismo propuesto implica la formación de la espirolactonaintermediaE, que podría evolucionarhacia la lactamaD o tranformarse,porataquedel disolvente,en la metoxipiperidinaF, por medio también de unmecanismoBAL2. En este último caso, una rápida y-lactamizaciónde F a
través del éstermetílico exclusivamentedaríalugar al ácido carboxílico95. Elestereocontrolobservadoen 0-2, al obtenerseúnicamenteel isómero de
configuración 2S, podría estardeterminadopor la posibilidadde formación deenlacesde hidrógeno~ en el hemiaminalintermedioA o por la existenciadeun mecanismode tipo concertado,que implicasela formación de la lactamatricíclica D y su hidrólisis por el MeOH o bienla metanolisisde la espirolactonaE y su‘y-lactamizacióna travésdel éstermetílico.
Con el fin de comprobarla participacióndel disolventealcohólico en elcursode la reacción,se llevó a cabo la hidrogenacióndel 2-bencil-4-cetodiéster
94, utilizando EtOR como disolvente(Esquema19, métodoB). Se obtuvo asíelanálogoSa-etoxisustituido99, junto con Ja3-oxoindolizidinaSa-hidroxilada96,procedente,también en este caso, de la hidrólisis del alcoxi derivado. Eltratamientode estamezclacon CH
2N2 dio lugar a los correspondientesésteres
metílicos 100 y 98. La caracterizaciónde los compuestos99 y 100 se efectuóporcorrelaciónde susespectrosde 111 RMN y de 130 RMN conlos de los Sa-metoxiderivados95 y 97, respectivamente.
Una vez puestade manifiestola implicación del alcohol utilizado como
disolvente en esta reacción, se llevaron a cabo dos ensayos más dehidrogenacióndel 4-cetodiéster94 en disolventesno alcohólicos,concretamenteAcOEt y THF (Esquema19, método 0). La aplicación del procedimientohabitual dio lugar, en amboscasos,a un único producto de reacción, que se
identificó como la 8a-hidroxi-3-oxoindolizidina 98. La formación delhemiaminal A con dos enlacesde hidrógenointramolecularespodría explicarla estereoespecificidadobservadaen la formación de este producto. Laobtenciónde este derivado de 3-oxoindolizidinaSa-hidroxi sustituido pareceindicar que, en estecaso, la y-lactamizacióndel hemiaminalA es más rápida
que su hidrogenolisispara formar la correspondientepiperidina, y que la
—74-----
N-acilación intramolecular del hemiaminal impide la subsiguientereducción,
al menosen las condicionesde hidrogenaciónutilizadas.
Para intentar esclarecerla participación del compuesto98 como
intermedio en el procesode obtenciónde los derivados8a-alcoxi sustituidos,se
efectuóun seguimientode las correspondientesdisolucionesde 98 en MeOH yEtOH a lo largo de varios días. En estascondicionesel hidroxi derivado 98resultó completamenteestable,por lo que, de los dos mecanismospropuestos,e] quetranscurrea travésdela espirolactonaparecee] másprobable.
La hidrogenacióncatalíticade 2-bencil-4-cetodiésteresderivadosde Ornconduce,por tanto, de forma totalmenteestereoespecífica,a derivados de8-amino-3-oxoindolizidina2,2-disustituidosportadoresde un grupo hidroxilo oalcoxilo en posiciónSa.dependiendodel disolventeutilizado.
Teniendo en cuenta el alto grado de funcionalización de estoscompuestos,se considerósu posibleutilidad como intermediospara la síntesisde diferentes análogos de indolizidinas. Por una parte, se intentó ladesoxigenaciónradicálicadel derivado98 con hidruro de tributilestaño,previaesterificacióndel grupoOH conel reactivoadecuado116 (Esquema21).
O dR/DMA?, O OCH3CN 6 THF CO2Me N CO2Me
-~ ‘—Ph —Ph011
BocHN BociziN BocHN
Bu>5nH
oCO.~Me
II:: CSOPH,COCO2Me Ph + Bu3Sn
BocHN
82b, 82c
Esquema21
Con ello se pretendíaaccederpreferentementea los derivados82b u 82c,
isómeros que se habían obtenido de forma minoritaria al efectuar laalquilación directa del anillo de 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidina. Sin
embargo,el tratamientode 98 con cloruro de feniloxitiocarbonilo en presencia
98
75—
de DMAP no condujo a la obtencióndel producto de esterificacióndeseado,probablementedebidoa problemasde impedimentoestérico.Sin embargo,la
utilización de cloruro de metoxalilo117, menosvoluminoso, tampocodio lugaral resultadoesperado,recuperándoseel productode partida inalterado.Estehechopareceindicar que el grupo OH del hemiaminalno es lo suficientementereactivofrentea los agentesde acilaciónempleados.
Por otra parte, y ante el fracasode estos intentos, se procedió a la
utilización de métodos más drásticos de reducción. Los ensayos dehidrogenacióndel compuesto98, utilizando comocatalizadoresPd(OH»y PtO2,
resultarontambiéninfructuosos.Finalmente,la calefacióna reflujo de THF de98 en presenciade 3 equivalentesde NaBHi, (Esquema22) condujo, tras
purificación cromatográfica,a la obtenciónde dos productosde reducción,101y 102, que fueron caracterizadosa partir de sus datos analíticos y
espectroscópicos.En ambos casos se observala transformacióndel éstermetiico en el correspondientealcohol. Además,el espectrode ‘
3C RMN de 101mantiene el carbonocuaternariodel grupo hemiaminal 0-Sa (85,67 ppm).mientras que en el espectrode 130 RMN del producto minoritario 102 seobserva la desaparición de las señales correspondientesal carbonohemiaminálicoy al carbonocarbonílico 0-3, lo queindica que ha tenidolugarla reducciónde ambosgrupos.En el espectrode 111 RMN de 102,el valor de laconstantede acoplamiento~8,8a es de 10,0 Hz, indicando una disposición
relativatransentrelos protonesH-8 y Hl-Sa.
Comovía alternativapara la preparacióndel compuesto102, se ensayóla reducción del derivado de 3-oxoindolizidina 82b con NaJ3H
4 y LiAlH4
(Esquema22). Sin embargo,en estascondiciones,los compuestos82a y 82bcondujerona los derivados103 y 104, respectivamente,en los que únicamentese redujo el grupometoxicarbonilo.De manerasimilar, el tratamientodel Sa-etoxi derivado 100 con LiAlH4 a reflujo de THF dio lugar exclusivamentea la
obtencióndel productode reduccióndel éstermetílico 105.Los derivados8a-hidroxi y 8a-alcoxi sustituidosanteriormentedescritos,
pierdenfácilmente una molécula de H20 ó alcohol en presenciade medios
ácidos.Así, el tratamientodel compuesto98 con cantidadescatalíticasde TEA(Esquema23) condujoa la obtencióndel derivadoenamínico106. El espectrode‘H RMN de este producto muestra la desaparición de las señalescorrespondientesa los protones11-8 y H-Sa, mientrasque en el espectrode130 RMN seobservauna señalde carbonocuaternarioa 109,03ppm, atribuible
a los carbonos0-8 y 0-Sa11S~ Todos los intentos de hidrogenacióndel doble
—76—-
enlace enamínico, a diferentes presiones y temperaturasy con distintos
catalizadores,resultaroninfructuosos.El tratamientocon NaBH3CNen medio
ácido 119 tampococondujoal correspondientecompuestosaturado.
oN OH
PhOH
BocHN
101
OH
+
BocHN
102
NaBH4 6LiAIH4
CO2Me TIff, A
O
N Ph
“—011
BocHN
103
NaBII1 6
LIAIIbPh TElE, A
Eo cHN
OH
Ph
¶04
LIAIH4
TElE, A
BocHN
OH
Ph
105
Esquema22
O
N CO2Me
01-1BocHN
98
O
El’ N CO2MQCH2CI2 Ph
BoefiN
106
Esquema23
OCO2Me
BocHN
Ph
NaBH4
lEE, A
98
Bo cHN
82a
BocHN
82b
O
“—Ph
BocHNOEt
100
—77-—
2.2.5, MODELIZACIÓN MOLECULAR DE DERIVADOS DE S-AMINO-3-OXOINDO-LIZIDINA-2-CARBOXILATO. ANÁLISIS CONFORMACIONAL MEDIANTE
DINÁMICA MOLECULAR
Puestoquelas 3-oxoindolízidinasaquídescritassepuedenrelacionarconotras lactamasbicíclicas capacesde mimetizar giros 13 4756, se consideródeinterés efectuarel análisis conformacionalde estosderivadoscon el fin de
conocer su capacidad para inducir conformaciones plegadas y, másconcretamente,conformacionesde giro 13.
Estructuralmentelos giros 13 puedendefinirse comopseudociclosde diez
eslabones,estabilizadospor un puentede hidrógenointramolecularentre elgrupo carbonilo del primer residuo y el NR del cuarto, y para los que ladistanciactC1-cC4es=7 A (Figura 10) 120,121 Por otra parte,el tipo específico
de giro 13 se clasifica de acuerdoconlos ángulosdetorsión b y ‘-Y de los residuos2 y 3 delesqueletopeptídico.
R2 ~,
UN’
11’ H>4uCj
fiN-tcrniinal
0
jiC-termiral
dac1-rC4=7A
Tipo ‘½ ‘Vg
—60 —30 —90 0
60 30 90 0
—60 120 80 0
60 —120 —80 0
—60 —30 —60 —so
iii- 60 60 30
Figura 10. Estructurageneralde los giros ¡3 y principalestipos.
—78—
H3C
Parallevar a cabo el estudioconformacionalse eligieron como modelossencilloslos derivadosde 3-oxoindolizidinaA, B y C, en los que los grupos
N-acetiloy N-metilcarboxamidaconstituyenuna simplificación usual de losresiduos1 y 4 de los giros 13. Por otraparte, la estereoquímicade los diferentes
centrosasimétricosse correspondecon la de aquellosisómerosquese obtienentras alquilación en C-2 del esqueletobásico de 2-metoxicarbonil-3-oxo-indolizidina.
O o oN H N H
oHN H HYL. HN PIN~ HN Fi HN~ CH3
CTSH3C
A B C
Las estructuras iniciales de los compuestosmodelos A, B y C, seconstruyeron utilizando distancias y ángulos estándar incluidos en elprogramaInsightll 122• Estasgeometrías,una vez optimizadascon el campo
de fuerza de segundageneracióncvff9l 123, se utilizaron como punto inicialpara el minucioso análisisconformacionalllevado a cabo con cadauna de lasmoléculas.
La metodologíautilizada para el análisis conformacionalha usadolas
técnicasde dinámicamoleculara alta temperaturay posteriorminimización.El uso de la dinámicamolecularestábasadoen la ideade queel aumentode laenergíade la molécula,por asignacióna cadaátomo de velocidadesal azar,
puedeser llevado a cabo de tal forma que le permita superarlas barrerasenergéticasexistentesentre los diferentesmínimos, siguiendolas leyes deNewton. La posterior minimización de las estructurasobtenidaspor estemétodoproporcionaunaidea de los diferentesmínimos accesiblesparadichamolécula.
La efectividadde estametodologíaparaexplorar el espacioconforma-cional en función de la temperaturautilizada en la dinámicamolecularhasido estudiadapor Kollman 124, aplicándola al éter 18-corona-6.En estetrabajo se llega a la conclusiónde que cuando las simulacionesse llevan acaboentre 700 y 800 1< se encuentraun númeromayorde conformacionesdemínima energíaque a temperaturasmás altas o más bajas. Con e] fin de
—79—
comprobarsi éstees un principio generalpara todo tipo de compuestoso si
solamentees aplicableal compuestoestudiadopor Kollman, se realizarontresdinámicasmolecularesa 750 K para cada uno de los compuestosantesmencionados. La primera dinámica utilizó como estructura inicial la
comentadaanteriormente, la segunda,aquélla de mínima energíade laprimera dinámicay la tercera,la estructurade menor energíano encontradaen la primera dinámica.Asimismo, se efectuarontres dinámicaspara cadacompuestoa 1500 K utilizando las mismasestructurasinicialesquea 750 K.
Las condicionesexactasen que se ha realizadoesteestudiosuponenunprimer paso de calentamientoprogresivo, en el que se fue elevando latemperaturade las moléculas5 K cada0,15 Ps (10 K para las dinámicasa1500 K) hastallegar a la temperaturadeseada.Esteprocesofue seguidode
20 Ps de estabilizacióncon el fin de que la energíacinética se distribuyerauniformementeen la molécula. Por ultimo, se llevaron a cabo 75 Ps desimulación, durante los que se almacenaron300 estructurasa intervalosregularesde tiempo. Cadauna de estasestructurasse optimizó aplicandoel
campode fuerzacvIIiYl durante500 ciclos del métodode minimizaciónSteepestDecent, con el fin de eliminar las interaccionesmás importantesen lasmoléculasy, posteriormente,durante los ciclos necesariosdel método deminimizaciónConjugateGradientshastaque el gradientealcanzaseun valormenor de 0,001.Los mínimos así obtenidosse compararonentre sí con el fin
de eliminar aquéllosque se encontrabanrepetidos.Los mínimos encontradosen cada una de las dinámicasefectuadasa
750 K y a 1500 K se encuentranrecogidosen la tabla 7. El número total demínimos obtenidos,considerandoconjuntamentelas dinámicasa 750 K y a
1500 K, fue de 93 para el compuestoA, 76 paraB y 88 paraC. Dado el elevadonúmero de mínimos, y aunque todos ellos fueron estudiados,para lapresentación de los resultados se consideraronúnicamente los veintemínimosde menorenergía,tal y como serecogeen las tablas8-10.
En primer lugar, se observaque en estructurascon pocos grados delibertad, como las estudiadasen este caso, la probabilidadde encontrarelmínimo absoluto es mayor que la de encontrarotros mínimos.Así, en todaslas dinámicasse ha llegado al mínimo absoluto, cualquiera que fuese laestructurade partida. En cuantoa la distribuciónde mínimos,se observaqueen las dinámicas a 750 K, la mayoría de las conformacionesobtenidascorrespondena aquéllasde másbaja energía,mientrasque otros confórmerossólo aparecencuandose utilizan temperaturasmásaltas(1500K). Ademas,se
—80—
compruebaque las dinámicasa 1500 K proporcionan,independientementede
la estructurade partida, un númeromayor de confórmerosde baja energía
quelas dinámicasa 750 K, en contrade lo expuestopor Kollman parael éter1S-corona-6124 La mayor desventajade la utilización de temperaturaselevadases la facilidad con que se producela isomerizaciónde los enlaces
peptídicosa disposicionescis, poco habitualesexperimentalmente.Estaisomerizaciónno seobservacuandola dinámicase efectúaa 750 1<.
Tabla 7. Mínimos encontradosen las diferentesdinámicasmoleculares
llevadasa cabocon lasestructurasA, E y C
Temperatura Estructura
Número de mínimos
1’. Dinámica 2’. Dinámica 3’. Dinámica
750K A 20 15(22) 24(27)E 15 21 (22) 13 (22)C 14 15(16) 13(17)
1500K A 49 62(72) 72(92>8 51 49(65) 55(75)C 65 34(74) 62(87)
Los númerosentreparéntesisindicanel númerototal de mínimosteniendoen cuentalasdinámicasantenores.
Como ya se ha indicado, para cualquier tipo de giro 13 la distancia
czCí-aC4 debe ser inferior o igual a 7 A y, por lo tanto, éste es un primer
parámetroa tener en cuentapara determinar la presenciade este tipo degiros. Así, de los veinte mínimos de bajaenergíaobtenidospara la estructuraA, únicamentelos confórmerosA4, AS y Ah presentaronvaloresde dctC1-uC4inferiores a 7 A (Tabla 8), lo que indica una tendenciamoderadade este
derivado a adoptar conformaciones plegadas. En el caso de la 3-oxoindolizidina B, se observa la formación prácticamenteexclusiva deconformacionesextendidas,ya que en el único confórmerocon distanciactC1-
ctC4 inferior a 7 Á, BiS, uno de los enlacesamidaestáen disposicióncis (Tabla9). En todos los confórmerosencontradospara las estructurasA y B, el anillode piperidina adoptauna conformaciónde tipo silla con disposición trans-
diecuatorialde los sustituyentesen posiciones8 y 8a.
— si —
Tabla 8. Confórrnerosde mínima energíaobtenidosparala estructuraA en funcidn de la
dinámicallevadaa caboy distancia ctCí-c104paracadauno de ellos
EnergíaConf. (Kcal/inol)
doCí-aC4(A)
Dinámicas(750 K)Total750K
Dinámicas(1500K)Total1500K1 2 3 1 2 3
x x x x x x x
Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx x
Lx Y Lx Lx Lx Lx Lx Y
Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx Lx Y Lx
Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Y Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx
Lx Lx
Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx
Y Lx Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Y Y Lx Lx Lx Lx Y
Lx Lx Lx Lx
Lx Lx
Lx Lx
Lx Lx Lx
Lx
Lx
Lx Lx Lx Lx
Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
Por otra parte, la obtención de doce confórmeros,
absoluto,con daC1-cxC4dentrodel valor establecido(Tabla
incluido el mínimo
10), esindicativo de
la gran preferenciade la estructuraC por adoptarconformacionesplegadas.
Tambiénen estecaso, el anillo de piperidina de la 3-oxoindolizidina adopta
conformacionestipo silla. Sin embargo,los sustituyentesen posiciones8 y Sa
adoptanexclusivamentedisposicionesaxial y ecuatorial, respectivamente.La
visualización de los doce mínimos de conformación plegadaindicó que los
confórmerosCl, C2, ClO y C17 presentanun puentede hidrógeno entre el
Al
A2
ASA4
AS
A6
A7A8
A9
AlO
Ah
A12
A13
A14
A15
A16
Al?
A18
A19
A20
--29,28
—27,91
—27,89
—27,80
—27,72
—27,33
—27,31
—27,25
—26,68
—26,39
—25,85
—23,86
—23,13
—23,07
—23.06
—22,98
—22,91
—22,87
—22,83
—22,72
8,10
‘7,44
9,85
6,04
6,92
9,49
9,26
8,54
10,04
8,99
6,06
9,63
9,37
8,98
7,82
8,96
7,26
8,26
8,91
9,94
Lx Lx
Lx
Lx
Lx
Lx
Lx
—82—
S-NH y el grupo carbonilo de la posición 2, es decir, entre el NR
correspondienteal segundoresiduoy el CO del tercero, incompatible con lasconformacionesde tipo giro 13. Por otra parte,en los confórmerosCS, C13 y
CiS, uno de los dos enlacesamida estáen forma cts, manteniendoen los dos
primeros casosel puentede hidrógenoanteriormenteseñalado.Finalmente,
los mínimos C5, C9, C12, C16 y C20 son los queposeena priori disposicionesespacialesde los sustituyentesen posiciones2 y 5 próximas a las esperadas
para las conformacionesde tipo giro 13.
Tabla9. Confórmerosde mínima energíaobtenidosparala estructuraE en función de la
dinámicallevada a caboy distancia~C1-aC4 para cadauno de ellos
Conf.
Energía(KcalImol)
daCl-uC4
(A>
Dinámicas (750 K)Total
750K
Dinámicas(1500 K)Total
1500K1 2 3 1 2 3
81 —28,55 9,10 x Lx Lx x x Lx Lx Lx
82 —28,31 8,74 X Lx Lx Lx Lx Lx X
83 —27,88 9,61 x x Lx x Lx Lx Lx X
84 —27,75 8,55 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx X
85 —27,49 9,77 x x x Lx
86 —27,43 7,97 x x Lx Lx Lx Lx
B7 —27.30 9,35 x x x Lx Lx Lx Lx
88 27,oo 9,07 Lx x x Lx Lx Lx Lx
B9 —26,88 9,49 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
BlO —26,36 9,57 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
811 —24,36 9.24 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
812 —24,21 8,80 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx
BiS —23,87 9,71 Lx X Lx Lx Lx Lx Lx Lx
814 —23,09 7,62 Lx Lx Lx Lx
815 —23,05 6,02 Lx Lx Y Lx
816 —23,03 8,15 x x x x x x x
817 —22,99 896 x Lx x Lx
818 —22,81 7,47 Lx Lx Lx Lx
819 —22,77 7,22 Lx x Lx
820 —22,61 9,09 x x x
—83—
Tabla 10. Confórmerosde mínima energíaobtenidosparala estructuraC en función de la
dinámica llevadaa caboy distanciaaCí-cxC4para cadauno de eííos
Energía
Conf (Kcal/mol)
dcíCí-cxC4
(Á)
Dinámicas(750 K>
1 2 3
Dinámicas(1500 1<)Total750K 1 2 3
X Lx Lx Lx Y Lx Y X
Lx Lx Lx Y X Lx Lx Lx
Y Lx Y Y Lx Lx Lx Lx
Y Lx Lx Lx Y Lx Y Lx
Y Y
Lx Lx Y Y Lx
Y Lx Lx Lx Lx
Y
Lx Lx
Lx Lx
Y
Lx Lx Y
Lx Y Lx
Y Y Y
Y Y
Lx Y Y Y Lx
Y Lx Lx Lx Y
Lx Y Y Y
Y
Y
Y
Lx
Lx
Lx Y
Y Y Lx Lx Lx Lx Y Y
Lx Y Y Lx
Lx
Lx Lx
Y
Y X Lx Lx
Lx Lx
Y Y Y Lx
Y Y
En la figura 11 se muestran de forma gráfica las dos clases de
conformacionesplegadasobtenidasparael derivadode 3-oxoindolizidina C, elconfórmeroCl, como representantede las estructurascon un puente dehidrógenoentrelos gruposS-NH y 2-CO, y el mínimo C5, comoejemplode las
conformacionesque poseenun puentede hidrógenoentreel grupo carbonilodel primerresiduoy el NH del cuartoresiduo,característicode los giros 13.
Tott<l
1500K
Cl
C2
Ca
C4
C5
C6
C7
C8
C9
Cío
Cli
CI.2
C13C14
Cis
C16
C17
C18
C19
C20
—35,98
—33,54
—33,08
—32,88
—32,02
—32,01
—31,99
—31,97
—30,72
—30,66
—30,43
—30,36
—30,12
—29,78
—29,48
—29,47
—29,28
—29,14
—29,05
—28,75
4,98
4,32
7,83
8,57
4,81
7,94
8,66
6,26
4,05
5,56
9,66
3,77
6,12
9,36
7,38
3,65
6,72
5,74
10,10
4,66
—84—
Cl C5
Figura 11. Conformacionesplegadasdel derivadode 3-oxoindolizidinaC:
Cl (8-NH--2-CO~y C5 (giro ¡3 tipo It.
Los mínimos encontradospara las tres estructuras estudiadassecompararon con diferentestipos de giros 13, construidosa partir del derivado
dipeptídicoAc-Ala-Ala-NHCH3, utilizando ángulosestándar120,121 Para ello
se efectuóla superposiciónde los diez átomosquedefinenel esqueletopeptídicocon sus análogos en los derivados de 3-oxoindolizidina, señaladosen trazo
grueso.
CH:3 N— CH3Fi
FiN H1» o FiN4
H:3C
En la tabla 11 se recogen los valores de rms (root mean square)
encontradosen estassuperposicionespara los confórmerosplegadosde losderivadosA, B y C. Los mínimoscon conformacionesextendidas,no reflejadosen la tabla,presentanen todoslos casosvaloresde rms muy superiores,como
era de esperar.A la vista de los datosde la tabla se puedededucir que losvaloresmásbajosde rms para los confórmerosA4, A5 y Ah se obtienenporsuperposicióncon los giros 13 idealesde tipos 1 y III, tal y como se puede
FiN
YO
Hg
—85—
apreciaren la figura 12. Para los mínimos de conformaciónp]egadade laestructuraC, los mejoresvaloresde rms se obtienencon los giros 13 de tipos 1’
y II, con preferenciapor esteúltimo. Así, la superposicióndel confórmeroC5con estos giros 13 (Figura 13) muestrauna mejor correlación, tanto de los
átomosdel esqueletopeptídicocomo de la cadenalateral del tercerresiduo,enel casodel giro 13 detipo II queen el de tipo It
Tabla 11. Valoresde rms obtenidospor superposiciónde los confórmerosplegados
de los derivadosde 3-oxoindolizidinaA, B y O con diferentestipos de giros I~
rms (A)
Confórmero
A4
AS
Ah
815
Cl
dcxCí-cÉC4(A)
6,04
6,92
6,06
6,02
4,98
02 4,32
05 481
C8 6 26
1
0,66
0,82
0,53
0,87
0,87
1,15
0,82
0.96
1•
1,11
1,40
1,20
1,13
0,91
0,69
0,52
1,18
II
0,84
1,06
0,82
0,90
0,72
0,82
0,48
0,99
117 III III’
0,72
0,99
0,70
0,87
0,85
0,96
0,57
1,06
0,64
0,73
0,47
0,84
0,99
1,31
0,97
0,97
1,21
1,43
1,29
1,16
1,02
0,81
0,71
1,23
1,20 0,88
1,33
1,14
1,12
0,98
1,54
0,75
0,83
093
1.03
0.82
1,31 0,82
1.03 0,65
Ce 4,05
CíO
012
013
5,56
377
6 12
016
017
3,65
1,04
1,23
0,94
1,05
0,77
1,49
1,23
0,88
018
6,72
0,69
0,72
0,66
0,91
0,85
0,92
0,79
0,45
0,80
0,86
0,56
0,82
0,60
1,13
0,87
0,51020
5,74
0,85
0,95
0,76
0,91
0,78
1,21
0,97
0,604,66
—86—
a
Figura 12. Superposicióndel confórmeroAh Cinea continua)congiros /3 idealesde tipo 1 (a) y III (b).
a
Figura 13. Superposicióndel confórmeroC5 (líneacontinua)
congiros ¡3 idealesde tipo II (a) y 1’ (b).
En resumen,los derivadosde 3-oxoindolizidina A y B, con disposición
trans entre los sustituyentes en posiciones 8 y Sa, presentan capacidadmoderaday nula, respectivamente,para inducir conformacionesde tipo
b
-N
b
—87—
giro 13. Únicamenteun pequeñoporcentajede confórmerosde la estructuraA
se asemejaa los giros 13 idealesde tipos 1 y III. Por el contrario, el isómero8,Sa-cis, C, mostró una gran tendencia a adoptar dos clases de
conformacionesplegadas.Una primera claseoriginada por la formación deun puentede hidrógenointramolecularentrelos grupos 8-NH y 2-CO, y unasegunda constituida por la adopción de conformaciones de giro 13.especialmentede tipo II. Por tanto,estosresultadosindican queel esqueletode(2S,SS,8aS)-8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilatose puedeconsiderarcomoun nuevomimético de esteúltimo tipo de giros 13.
—88-—
2.3. ANALOGOS CONFORMACIONALMENTE RESTRLNGIIX)SDE COLECISTOQUININA Y NEUROTENSINA
Una vez puestasa punto las vías sintéticasque permitenel accesoa los
esqueletosfundamentalesde 2,5-dicetopiperidinay 3-oxoindolizidina,se explorósu aplicacióna la preparaciónde análogosconformacionalmenterestringidosdepéptidos de interés biológico. La colaboraciónque nuestro grupo de trabajomantienecon el Departamentode Farmacologíade la Facultadde Medicinade la
Universidadde Navarray con la empresadanesaNovo Nordisk A/S, interesadosen el estudiode Colecistoouinina(CCK) y Neurotensina(NT), respectivamente,decantaronnuestraelecciónhacia estosneuropéptidos.Por otra parte, el hechode que los fragmentosmínimosactivosparaestospéptidosesténconstituidosporun númeroreducidode residuosde aminoácidos,podría facilitar, en principio, lapreparaciónde los correspondientesanálogosrestringidos.
2.3.1. ANÁLOGOS CONTORMACIONALMENTE RESTRINGIDOSDE CCK
La CCK es una hormona peptídica ampliamente distribuida en el tracto
gastrointestinal y en el sistema nervioso central 125 A nivel periférico, la CCKestimula la contracción de la vesícula biliar, la secreción pancreáticay la
motilidad gastrointestinal.En el sistemanervioso central, dondeactúa comoneuromoduladory/o neurotransmisor,la CCK induce hipotermia,analgesiayestimula la liberación de las hormonasde la pituitaria, entre otros efectos.Porotra parte, Ja colocalización de la CCK en el cerebro con Dopamina (DA),
Serotonina(5-HT), Encefalinas,GABA y aminoácidosexcitatorios,pareceindicarque esteneuropéptidopodríaestarinvolucradoen la modulaciónde las acciones
de estos neurotransmisores126-130~ Se ha demostradotambiénque tanto laadministracióncentral como periféricade CCK producesaciedad,sin que, por elmomento,estéclaro el mecanismoa travésdel cual ejerceesteefecto.
La CCK se ha aislado en varias formas moleculares,denominadas
CCK5g, CCK39, CCK33, CCK8 y CCÑ, provenientesdel procesamientode unprecursorcomún. La CCK33, CCK8 y CCIQ sonlas formas predominantesa nivel
periférico, mientrasque en el cerebrose encuentraprincipalmenteel octapéptidoC-terminal,CCK8 125~
H-Asp-Tyr(SO3EI)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
CCK8
89—
Las actividades biológicas de la CCK estánmediadaspor dos tiposdiferentes de receptores, los receptores centrales CCKB, ampliamentedistribuidos en el cerebroy los receptoresperiféricos CCKA, distribuidos en los
órganosperiféricos, aunquetambién estánpresentesen algunasregionesdel
cerebro 131~ Sin embargo,la participaciónconcretade uno u otro tipo de receptor
en las respuestas farmacológicas inducidas por la CCK mencionadasanteriormente, todavía no ha sido completamenteelucidadao es materia de
controversia.Teniendoen cuentael rangode actividadesbiológicas de la CCK, la
disponibilidad de agonistas y antagonistaspotentes, altamente selectivos,
metabólicamenteestablesy con propiedadesfarmacocinéticasadecuadas,podría
teneruna clara aplicación parael desarro]lode nuevosfármacos132•
La aplicación de la estrategia general de diseño racional depeptidomiméticos,comentadaen la introducción, y en la que se han utilizado
comopuntosde partida la CCK7, fragmentomínimo activo a nivel periférico, y la
CCÑ, H-Trp-Met-Asp-Phe-NH2,estructuramínima necesariapara la activación
de los receptoresCCKB, ha dado lugar a la preparaciónde agonistasy
antagonistaspotentesy selectivos, aunque la mayoríaconservangran parte delcarácter peptídico inicial 132443 Por otra parte, la optimización, mediante
estudios de relacionesestructura-actividad,de compuestossurgidosa través del
muestreo al azar ha conducido a antagonistas de gran interés, como losderivadosbenzodiazepínicos2 y 3 ya comentados14,15•
Dentro de los agonistas basadosen la estructurade la CCÑ cabedestacarel compuesto A-71623 (107), agonista selectivo de los receptoresCCKA con
propiedadesanoréxicas similares a las inducidas por la CCK8 144,145 y los
derivados conformacionalmenterestringidos 108, agonistas selectivosde losreceptoresCCKB 146~
H ON~k
Boc-Trp Asp-(N-Me)Phe-NH2o
N Asp-Phe.-NH2
Fi ~ FiN OHN4N Fi o
O x = ii-Fr, n-Bu, ‘Bu
107 108
—90—
Por otra parte, los derivados 109, 110 y 111 constituyen ejemplosrepresentativosde antagonistasselectivos de los receptores CCKB 147152,
desarrolladostomandocomo modelo la secuenciapeptídicade la CCIQ, mientras
que el análogo tripeptídico 112 muestra propiedadesantagonistasa nivelperiférico~5g.
o
~ Ml
CH2 FiNu o
109
oL
A’ Leu-Asp-NH2
1 NH
olCl
111
Asp-Phe-NH2N
OBoc-Trp
110
H OBoc-Tr< 2¼
o
N OH
112
Tomandocomo antecedenteslos estudiosconocidossobre la importancia
de las cadenaslaterales de los aminoácidosque integran la secuenciade la
CCK4 132, los estudios conformacionalesque indican la existencia deconformacionesplegadaspara el tetrapéptidoC-terminalde la CCK 154,155y losejemplosanteriormenteexpuestos,sehandiseñadola seriede análogosde CCÑ
56, 113, 114 y 115, que incorporananillos de 2,5-dicetopiperidinay 3-oxoindolizi-dina adecuadamentesustituidos.
En los derivados56 y 114 seha reemplazadoel fragmentoMet-Asp por losesqueletosheterocíclicosseñalados,mientras que en los análogos 113 y 115únicamentese ha eliminado el residuo de Met, menos importante para laactividad, manteniendola cadenalateral ácida del Asp, cuya contribucióna la
actividadde la CCK esmásacusada.
—91—
Teniendoen cuentaque la presenciay disposiciónespacialrelativa de lascadenaslateralesaromáticasde los residuosde Trp y Phejueganun papel muyimportante en el reconocimiento de los receptoresde CCK, en todos loscompuestosdiseñadosse han incorporadodichas cadenaslaterales.Además,laintroducciónde restriccionesconformacionalesa distintos niveles podría ser deutilidad para intentar establecerlos requisitostridimensionalesde las cadenaslateralespresentesen estosderivados.
Boc-TÉp-HN’
o
O
Ph
COR
o
Fi o
113
B oc-Trp-HN
114 R=OCH3,NFI2
o
C02Fi
Phe-N112
CO?
Phe-NH2
115
2.3.1.1. Análogosde CCK4 derivadosde 2,5-dicetopiperidinas
La síntesisde los compuestos56a y 56b, en los que el anillo de 2,5-diceto-
piperidina reemplaza al fragmento dipeptídico Met-Asp y que incorporan
restriccionesconformacionalestanto de la cadenalateral del Trp como de la Phe,está descrita en el capítulo 2.1.2. Estos compuestos fueron ensayados
farmacológicamenteen forma de éstermetflico, ya que los intentos de obtenerlasamidas correspondientes,por tratamiento con NH3/MeOH, dieron lugar amezclascomplejasde reacción.
In
O
Ph
CO2Me
IpPh
FiNCO2Me
o
561,
Fi
56
CO2Me
HN
o
56a
92—
Para abordar la preparación de los derivados 113 se llevó a cabo,
inicialmente, la secuenciade reaccionesindicadas en el esquema 24. La
formacióndel enlacepeptidico,por el métododel ésteractivo N-hidroxisuccinimí-dico 156, entreel derivadocarboxílico ll6ab, obtenido previamentepor hidrólisisselectivadel éstermetílico de 5Sab, y H-Phe-NH2, condujoal compuestoll7ab.
Estederivado se obtuvo como unamezclade dos diastereoisómerosen proporción
2:1, similar a la del productodepartida 5Sab.En el espectrode ‘H RMN de ll7abse observaque el protón 1-1-6 del isómeromayoritarioaparececonsiderablementeapantallado con respecto al mismo protón del isómero minoritario(Ab = 1,57 ppm). Esta diferencia de desplazamientoquímico indica que, en el
isómeromayoritario, el protón H-6 y el anillo aromáticodel residuo de Phe seencuentranen disposición relativacts y que, por tanto, la configuraciónabsoluta
de esteisómeroes(3R.6S).La saponificacióndel compuestoll7ab, no condujo al derivado ll3ab
esperado,sino que dio lugar a una mezclacompleja de reacción,probablementedebido a la epimerización de alguno de los centros quirales durante eltratamientoprolongadocon NaOH.
o o
In CO2EI 1)NaOH/MeOl-1 lo CO2Et
UN 2)HCI UNCO2Me C02Fi
o o
SSab ll6abalb =2:1
1) HO5uiDCC
j2) H-Pbc-NH2
O o
CO~EtIn C02FiHN FiN
Phe-NH2 Phe-NFi2o o o o
ll3ab 11 7ab
a/li 2:1
Esquema24
Paraevitar esteinconveniente,se preparóel derivadode 2,5-dicetopiperi-
dina ll9ab (Esquema25), en e] que la cadenalateral del Asp estáprotegidaen
—93——
forma de éster terc-butílico, lo que permite realizar la desprotecciónfinal enmedio ácido. A partir de ll9ab, y siguiendouna secuenciade reaccionessimilar ala indicadaparala obtencióndc ll7ab, sesintetizó el derivadotripeptídicol2lab,constituido por una mezcla de dos diastereoisómerosen proporción 3:1, que
fueron separadospor cromatografía.La asignaciónde la configuraciónabsolutade los derivados121ay 121b como (3R.6S)y (SS,6S),respectivamente,se efectuósiguiendoel mismorazonamientoque paralos análogosetil sustituidosll7ab.
o CQMe
o CO2Me NaO\IcJBrCH2CO2tBu lo CO
2tBu
In CO2Me ZUN CO2MO
ZHN 11838
H2/Pd-CI MeOH
O O
In VNaOU/MeOH lo CO~Bu
FiN 2)HCI FiNC02Fi C 02M e
O O
l2Oab ll9abafh = 2:1
I 1) HO5uflCC
2) H-Phc-NH2
O O
In In CO2~Bu+
UNPhe-NFi2
o o
121a 121b
jTFA/CHSCI2 {TFA/cH2C]2
O O
In CO» In~.AJ,fl
FiN ¼>~~~PbNH UN Phe-NH2
O O o O
liSa 113b
Esquema25
FiNCO2tBU
O o
—94—
Finalmente, la eliminación del grupoterc-butilo por tratamiento con TFA
dio lugar a los análogosde CCÑ buscados113a y 113b, en los que la restricción
conformacionalse centraen las cadenaslateralesdel Trp y del Asp.La capacidadde unión a los receptoresCCKA y CCKB de los derivadosque
incorporan2,5-dicetopiperidinas56a,5Gb, 113ay 113b, fue evaluadaen homoge-neizadosde páncreasy cortezacerebralde rata,utilizando [3H]-propionil-CCKg
como marcador157 (Tabla 12). A efectoscomparativos,en la tabla se incluyentambiénlos datos correspondientesa la CCKg, Boc-CCIQ y a los antagonistas
centrales3 y 109.
Tabla 12.Afinidadespor los receptoresCCKÁ y CCKB
de los derivadosde 2,5-dicetopiperidinas
O
1In R
UN
Oo
1C50a CM)
Páncreas CerebroCompuesto Config. C-3 (CCKA) (CCKB)
56a Ph OMe S 6,7 >10
56b Ph OMe E 88,0 > 10
liSa CO2H L-Pbe-NH2 R >100 > 10
llSb C0211 L-Phe-NH2 S 50,0 > 10
CCKs 0,0006 0,006B
Boc-CCÑ 1,8 0,025
3 0,8 0,05
109 1,7 0,01
aEl valor de 1C50 representa la concentración capaz de produciruna inhibición del 50% de la unión específicadMa [
3H]-propionil-CCK8 a los receptores de CCK. Los valoresindicadoscorresponden a la mediade los
obtenidos entresexperimentos separados.b valores publicados en la referencia 151.
—95——
Los valores reflejados en la tabla indican que los análogosde CCK4
derivadosde 2,5-dicetopiperidinaspresentanentresí distinta afinidad por losreceptoresperiféricos,que puedecalificarse desdemoderadaa nula, careciendode afinidad hacia los receptoresCCKB a concentracionesinferiores a IO~ M. Elcompuestomás efectivo frente a los receptoresCCKA, 56a, mostró afinidadmicromolar, del mismo orden que la Boc-CCIQ. Si se comparanlos resultados
obtenidoscon los diastereoisómeros56ay 5Gb, se deduceque la disposiciónvisentrelas cadenaslateralesaromáticasen posiciones3 y 6 del anillo de 2,5-diceto-piperidina, favorecela unión a los receptoresCCKA. Observaciónsimilar resulta
de compararlos datosobtenidosparala parejade diastereoisómeros113ay lISb,en los que las cadenaslateralesde Trp y Phese encuentranen disposicionestrans y cis, respectivamente.En estos últimos derivados, la presenciade la
cadenalateral del Asp no contribuyea mejorar los valores de afinidad,posible-mente debido a una disposiciónespacialinadecuada,tanto de la mencionadacadenalateralcomo del grupo fenilo del residuode Phe.
Por otra parte, ninguno de los compuestosde esta serie fue capaz deinhibir la liberación de amilasa de los acinos pancreáticosinducida por laCCKs 158, un ensayofuncional que da idea de la capacidadde los derivados
evaluadosparaactuarcomo antagonistasperiféricos.Finalmente, las 2,5-dicetopiperidinassintetizadas se ensayaron en
preparacionesde músculo longitudinal-plexoruientérico de íleon de cobaya130
En estetipo de ensayola CCK8 produceun efectocontráctil por estimulacióndelos receptoresCCKA, mientrasque la CCK4 contrae el íleon a través de la
activación de los receptoresCCKB. Estascontraccionespuedenser inhibidaspor
antagonistasselectivosparauno u otro tipo de receptory, por lo tanto, el ensayosepuedeutilizar para evaluarla capacidadantagonistaperiférica o central de uncompuestodado. Los porcentajesde inhibición obtenidosparalos compuestosSOa,56b, 113a y 113b, en la contracción del íleon inducida por CCK8 ó CCK~ se recogen
en la tabla 13.
Del análisisde estosdatoshay quedestacarqueno existe unacorrelaciónclara entrelos ensayosde unión al receptory los de inhibición de la contracción
del íleon. Estehecho podríaatribuirsea posiblesdiferenciasentrelos receptoresde distintas especies,ratay cobaya.Además,en el casode los receptoresCCKB,
no existe unaevidenciamolecularconcluyentede la identidadde estosreceptoresen la periferia y en el cerebro. En cualquier caso,ninguno de los derivados
ensayadospresentaactividadantagonistasignificativa.
—96
Tabla 13. Inhibición de la contraccióninducidapor la CCK
en plexo mientéricode cobaya
Compuesto
(10-aM)
% de inhibición
CCKs (10~M) CCK4 (í0-~ M)
56a 186 + 5,7 278 + 7,4
56b +165 + 8,0 a ~ + 66~
liSa 210 + 7,5 ±320 + 19,98
113b 114 + 7,5 -*556 + 223a
3 851±2,7 100
109 604± 4,8 797 + 14,0
a El signo + indica potenciación en vezde inhibición.
2.3.1.2. Análogosde CCKg portadores del esqueletode3-oxoindolizidina
Parala preparaciónde las seriesde análogosde CCK4 representadospor
las fórmulas generales114 y 115 se eligieron como productosde partida los de-rivados de 3-oxoindolizidina 2,2-disustituidos75 (Esquema26). La disponibilidad
O
114
OR N
CONHQ ~2zt CO2Me
BocUN
75 R = CH2Ph,CH2CO2Et
1?O
N R
Phe-NH2O
115 R = CH2CO2IHI
Esquema26
Boc-Trp-HN
1? = CH2Ph
Boc-Trp-HN
—97—
de diferentesisómerosen el carbonoasimétrico0-2, junto con la posibilidad de
acoplar un resto de Trp de configuración L o D con el grupo NWS, permitiría la
obtención de derivadoscon diferentes disposiciones espacialesde las cadenas
aromáticas del Trp y de la Phe. Con ello se pretende profundizar en elconocimiento de los requisitos tridimensionalesde estas cadenaslateralesaromáticasnecesariosparala unión a los receptoresCCKA y/o CCKB y paralasactividadesbiológicasmediadaspor dichosreceptores.
Segúnseindica en los esquemas27 y 28, la obtenciónde los derivados122,123, 126y 127 sellevó a cabopor tratamientoconTEA delas 3-oxoindollizidinas82a
y 82b y posteriorformacióndel enlacepeptídicoconBoc-L-Trp ó Boc-D-Trp. Debidoa la falta de enantioespecificidadcon que se forman las 3-oxoindolizidinasdepartida, estos triptofil derivadosse obtienencomo mezclasde dos diastercoisó-merosen las proporcionesindicadasen la tabla 14.
Tabla 14. Proporciónde diastereoisómerosen los derivados
de 3-oxoundolizidinade fórmula general
O
N Ph
E
Boc-Xaa-HN
Compuesto Xaa E
Configuración2,8,8aProporción de
diastereoisómerosa/b aa b
122ab L-Trp CO2Me RSE SRS 10:1
124ab L-Trp CONH2 SSE RES 10:1
l2Sab D-Trp CO2Me RSE SRS 10:1
l2Sab fl-Trp CONH2 SS!? RRS 10:1
l2Gab L-Trp CO2Me SSE RES 4:1
128ab L-Trp CONH2 RSE SRS 4:1
127ab D-Trp CO2Me SSE RRS 3:1
129ab L-Trp CONH2 ESE SRS 3:1
Determinadapor HPLC.
—98—
z~
03
uo
.0z
-4—
.,Izoo
++
0-4Zoo
o
zz4-4
0-4Zao
o
z
2:
oo
oo3
o
o
z
+oo
o
z
2:oo
o
oo
o8)
a
2:
2:oo
+
oCo1—o
,
—cl
oo
o
2:
e”1~
2:o
z
o
z
0e
os
ooo
en
to
~Ic
O)
o3
o
oz
+O
)
oo
o
2:
2:04oo
ose,,
2:ooo
oo
0
.02:
e.)o
oo
o.0
ZObe,”—
2:oeso
++
cl4
;2:8
)o
2:.~
ose”
eso
2:~
8)
oos
z2
:~
oe)o
en
o6o
o
.0
6~e-)o
+
89
oE
os2:
2:~
e.)o
clC
o
—o
—cl
4;
O)
oo
o
2:
e)o
+.0e,”
5Co
oO—C
l
O)cl
83
o
2:
2:ze)o
6o
o
.0e-a.;’
~hz—e.)o+
8)
o
2:1
ose-e
”2
:~
oe)
o
eCo
Como era de esperar,los espectrosde ‘H RMN de los isómeros122a,122b,126a y 126b son idénticos a los de sus enantiómeros 123b, 123a, 127b y 127a,
respectivamente. El tratamiento de los compuestos 122, 123, 126 y 127 conNH3/MeOH condujo a las amidas 124, 125, 128 y 129 correspondientes,constituidas también por mezclasde dos diastereoisómerosen proporcionesidénticas a las de los ésteresde partida.
Las diferenciasen las proporcionesde diastereoisómerosobservadaspara
estos derivadospodrían ser debidasa la utilización de diferentespartidasde las
3-oxoindolizidinas82ay 82b, o a un problemade resolucióncinéticadurantelacondensacióncon Trp, o bien a una combinaciónde ambosfactores.
Con objeto de estudiarla influenciadel grupoprotectorBoc en la actividadde estosderivados,se procedióa la N-desprotecciónde los compuestosl2Sab y129ab (Esquema29). Se obtuvieron así las mezclas de diastereoisórnerosdesprotegidos l3Oab y l3lab, que pudieron ser separadospor HPLC
semipreparativo.
O
N CONH2
‘—Pb
O
CONFiO
~efl y—Ph
Bac-L-’Prp-HN 1 28a+
TEA/O112012
O
N Ph‘4
CONH2
H-L-Trp-IIN lSOa+
O
N —Ph
CONFi,,
Boc-L-Trp-FiN Fi-L-Trp-HN
OCONII
N 2
‘—ph
O
N CONH2
~—Ph
Boc-o-Trp-HN+
H-n-Trp-HN+
N Ph
O ONH2
N Ph
CONI12
Boc-b-Trp-HN
Esquema29
1 28b ‘Sol>
129a
o
TFAICH2CI2 iSla
O
1 29b Fi-o-T¡-p-FiN lSlb
—101—
Lógicamente, los espectros de ‘H RMN de 130a y 131b, por una parte, y
130b y 131a, por otra, son coincidentes,mientras que los valores del poder ópticorotatorioson idénticosy de signo contrarioparacadapareja.
Para la preparaciónde los análogosde CCI¾115 se intentó en primer
lugar la saponificaciónselectivadel éstermetílico del diésterS4ab mediantetratamientocon un equivalentede NaOH. Sin embargo,estetratamientocondujoa unamezclaconstituidapor el producto dc partiday los derivadoscarboxílicosprocedentesde la monosaponificacióntanto del éstermetílico como del etílico.Paraevitar estafalta de selectividadse llevó a cabola saponificaciónen el diésteranálogo132ab, obtenidopor alquilación del correspondientederivado 2-mono-sustituido73, enel queel restode acetatode etilo de 84abseha sustituidopor el deacetatode terc-butilo (Esquema30). La reacciónde acoplamientopeptídico delácido carboxílico 133ab con H-Phe-NH2 condujo a una mezcla6,6:1 de los
diastereoisómeros134a y 134b, que pudieron ser separadospor cromatografía.
Cadauno de estosderivados,segúnse apreciaen el espectrode1H RMN, está
impurificado con una pequeñacantidad del diastercoisómeroprovenientede la
mezclaenantioméricade la 3-oxoindolizidina de partida.
o O
N CO2tBU N CO2tBu1) NaOHJMcOH
CO2Me 2)HCI -.,.,~ CO»
BoeFiN BocFiN
132ab 133abaib = 5:1
I 1) HO5u/DCC2> H-Phc-N1112
0 00
N CO2tBu N Pbe-NFi
2+
~Phe-NH2 ‘— CQ’BuO
BocFiN BocFiN
1 54a 1 34b
Esquem.a30
102—
Finalmente, los análogos de CCK liSa y 115b se obtuvieron por
tratamiento de 134a y 134b con TEA, seguido de acoplamiento con el éster
N-hidroxisuccinimídico de Boc-L-Trp (Esquema31). El tratamiento con TFA del
derivado115acondujoal correspondienteanálogodesprotegido135.
O
N CO2tBu
CPhe.NH2
OBodUN
134a
I ~
00
N Phe-NH2
‘4— C(>21Bu
BocHN1 34b
T i) TEX’CH2C]2
2) Poc-Trp-OSu
O
N co»
~—Pbe-NH2
oE oc-Trp-I-IN
115a
00
N -Phe-NFi2
“—C02H
Hoc-Trp-HN
115b
T TFAICH2CJ•2
o
N co»
»-~Phe-NH2o
Fi-hp-UN135
Esquem.a31
La asignaciónde la configuraciónabsolutade estos análogosde CCK se
realizópor medio de experimentosde NOE bidimensional (ROESY).El compuesto
liSa muestra fuertes NOEs entre los protones U-Sa y H-la, U-la y 2-CH2, y H-8 y
H-lfl, lo que indica que el protón U-Sa y el resto de Asp en posición 2 se
encuentranen disposición relativacis. Por el contrario, para el isómero115b los
protonesdel grupo 2-CH2 muestranNOE conel protónH-1~, al igual que el H-8,indicando que el protónH-8 y el sustituyentealquilico de la posición2 se disponen
del mismo lado del anillo de 3-oxoindolizidina(Figura 14).
— 103—
o 00C02Fi Phe-NFi2
Phe-NH2 co»
Boc-Trp-HN Fi Fi~ Boc-Trp-HN Fi
115a 1 lSb
Figura 14. NOEsmássignificativosobservados
para los compuestosll5ay 115b.
Los valoresde afinidadpor los receptoresCCKA y CCKp de los derivados
de 3-oxoindolizidinasintetizadosserecogenen la tabla 15, junto con los obtenidospara los compuestosde referencia.
Dentro de los análogosconformacionalmenterestringidosde COK1 en los
que se sustituye el fragmento dipeptídico Met-Asp por un resto de 3-oxoindoli-
zidina, los derivadosen los queel grupo2-bencilo y el residuode Trp se sitúandelmismo lado del anillo de 3-oxoindolizidinapresentanmayoresafinidadespor losreceptoresOCKB quepor los periféricos.Si secomparanlos compuestos123 y 125
se observaquela sustitucióndel éster metílico por amida conduceal aumentodeun orden de magnitud en la capacidadde unión a los receptoresCCKB. Se
produceun resultadosimilar con la sustitución de L-Trp por D-Trp, como sededuce de la comparaciónde los valores de afinidad obtenidos para loscompuestos124y 125. Por el contrario,cuandoel grupo 2-benciloy el residuodeTrp se encuentranen lados contrariosde la molécula,se observaselectividadpor
los receptoresCORA, obteniéndoseafinidadesde rangomicromolar. En estecaso,
la introducción de Boc-L-Trp en la posición 8 del anillo de 3-oxoindolizidina
condujoa mejoresresultados(126) que la incorporaciónde Trp de configuracióno
(127). Nuevamente se obtienen mejores afinidades para los carboxamido
derivados(ver compuestos126 y 128). En estaserie de compuestosla eliminación
del grupo Boc dio lugar a la pérdidade afinidad, indicando la importanciadelgrupo hidrofóbicoen la posiciónN~ del Trp, de maneraanálogaa la descritaparaotros derivadosde COK4 147450
Por otra parte,la introducción de la cadenalateral del Asp en la posición2
del anillo de 3-oxoindolizidina condujo a compuestosinefectivos para ambosreceptores.
Fi~
—104—
Tabla 15. Afinidadespor losreceptoresCCKA ~ CCKB
de los derivadosde 3-oxoindolizidina
R-Trp-HN
O
Configuracióna ICso (pM) b
Compuesto Fi Trp 2,8,8a
Proporción
alb
C
CCKA
C
CCKB
l2Sab Boc Ph OCH~ D ESR 10:1 > 10 4,3(SE5)
124ab Boc Ph NR2 L SSE 10:1 >10 3,9(RES)
125ab Boc Ph NR2 SSE 10:1 > 10 0,7(RES)
l2Gab Boc Ph OCFig L SSR 4:1 9,2 > 10
(RES)
127ab Boc Ph OCHg u SSE 3:1 >10 >10(RES)
l2Sab Boc Ph NR2 L RSE 4:1 3,9 > 10
(SE5)
130a H Ph NR2 L RSE — >100 >100
130b Fi Ph NR2 L SRS — >100 >100
liSa Boc CO2IvI L-Phe•-NH2 L SSE — >10 >10
1 15b Boc CO2H L-Phe-NH2 L RSR — > 10 > 10
135 H CO2H L-Fhe-NH2 L SSE — > 10 > 10
CCK8 0,0006 0,006
Boc-CCÑ c 1,8 0,025
3 0,8 0,05
109 1,7 001
a Las configuracionesindicadasentre paréntesis corresponden a las de] diastereolsómero minoritario presente
enla mezcla.b El valor de 1C50representala concentración capaz de producir una inhibición del 50% de la unión específica
de la [3Fi1-propiooil-CCK~a los receptores de CCI{. Los valores indicados corresponden a la media de los
obtenidosen tres experimentos separados.c \Talores publicados en la referencia 151.
— 105 —
112
En el ensayode liberaciónde amilasade los acinospancreáticosinducidapor COK8, el derivadol2Sab inhibió, a una concentracióni0~ M, la liberaciónde
esta enzimaen un 70%. Por lo tanto, el compuesto128 actúa como antagonista
periférico.
La capacidadantagonistade los derivadosde 3-oxoindolizidinaquehabían
mostrado afinidades a concentracionesinferiores a 10~ M fue evaluadaen el
ensayode músculolongitudinal-plexomientéricodeíleon de cobaya(Tabla 16). En
esteensayo,los compuestos126aby l2Sab inhibieron la contraccióndel íleon
mediada por los receptores periféricos en porcentajes del 70 y 88%,
respectivamente,en consonanciacon sus afinidadespor dichos receptores.Este
resultadoestáde acuerdocon el obtenidopara 128 en el ensayode liberación de
amilasa comentadoanteriormente.Se confirma así que estos derivadosson
antagonistasperiféricos,aunquecon actividadmoderada.
Los D-triptofil-3-oxoindolizidina derivados123 y 125 no inhibieron signifi-cativamentelas contraccionesdel íleon inducidas por la COK4, aunquesus
afinidadespor los receptorescentralessonaceptables.
Tabla 16. Inhibición de la contraccióninducida por la CCK
en plexo mientéricode cobaya
Compuesto(10~ M>
% de inhibición
CCK8 (108 Nt CCK1 (10v Nt
l2Sab 25,3 + 42 193 + 0,5
124ab 52,6 ± 7,3 --i-441 + 22,0
125ab 2,9 ± 7,4 -4-08± 4,2 a
l2Sab 70,0 ~- 60 261 + 2,3
l2Sab 88,2 + 32 +170 * ~ a
lSOa 27,2 ± 7,3 16 + 11,9
lSOb ±5,6+ ~ a ±167+ 10,8 a
3 85,1~27 100
109 60,4 + 48 797 + 14,0
a El signo-4 indica potenciación en lugar de inhibición.
— 106 —
La capacidadantagonistaperiférica del compuesto124, capaz de inhibiren un 52% las contraccionesdel íleon inducidas por CCK8, no tiene una
explicaciónclara, ya que su afinidad por los receptoresCCKA es muy baja.
Finalmente, la disminución de la potenciaantagonistade los derivados
130ay 130b, análogosde 128ab,en los queseha eliminado el grupoprotectorBoc,
estáde acuerdocon la pérdidade afinidad mostradapor estoscompuestos.
Teniendo en cuenta que los derivados 123-128 están constituidos por
mezclas de diastercoisómeroses difícil establecer relaciones estructura
tridimensional-actividadbiológica, especialmenteen el caso de los tres últimos
compuestosdonde la proporción de isómeroses más pareciday la contribución
del isómero minoritario podría ser más importante. En cualquier caso, el
compuesto128, un antagonistamoderadode los receptoresCCKA, y el derivado
125, con afinidad 1O~ M por los receptorescentrales,podrían constituir la base
para la preparaciónde nuevosanálogosmáspotentesy selectivos,Asimismo en
aquellos compuestosde mayor interés, quedapendiente la resolución de las
parejasde diastereoisómeros,que seda de gran ayudapara llegar a establecer
cúal o cuálesde las muchasdisposicionesespacialesde las cadenasaromáticas
favorecenla interaccióncon los diferentestipos de receptores.
2.3.2. ANÁLOGOS CONFORMACIONALMENTE RESTRINGIDOSDE NT
La Neurotensina(NT), H-Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-
Ile-Leu-OH, es un tridecapéptidocon un extensoperfil farmacológicoque incluye
accionestanto en el sistemanervioso periférico como en el central 159,160 La
administración periférica de NT induce hipotensión, incrennentala permeabi-
lidad vasculary estimula la contracciónintestinal. A nivel del sistemanervioso
central la NT ejerce potentesaccionesde hipotermia y analgesia.Además, este
neuropéptidoactúa como moduladorde la transmisióndopaminérgicay podría
tener importantes implicaciones en la etiología de la esquizofreniay de la
enfermedadde Parkinson.
Los estudios de relacionesestructura-actividadbiológica han permitido
establecer los requisitos estructurales necesarios para la interacción
NT-receptor(es)16 1-165, habiéndosedeterminadoque el hexapéptidoC-terminal de
la NT, NT&18 (H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH), es el fragmentomínimo capazde
unirsea los receptoresde NT y de expresarla totalidad de las accionesbiológicas
de esteneuropéptido164• Sin embargo,la existenciao no de diferentessubtiposde
— 107—
receptores no está todavía bien establecida166• Este hecho se debe,principalmente, a la falta de antagonistasespecíficosy de análogos de NTmetabólicamenteestables,que constituyenlas herramientasnecesariaspara la
caracterizacióntanto de los receptorescorno de las implicaciones fisiológicasespecíficasde dicho neuropéptido.
Teniendo en cuenta que la prolina es uno de los residuos que másfrecuentementeentrana formar partede los giros ~3120, y quela sustituciónde la
Pro10 en la NT por D-Pro o por Gly coníleva una disminución acusadade laactividad164, diversosautoreshan postuladoque la importanciade esteresiduoestá directamenterelacionadacon la adopciónde conformacionesde tipo giro
inverso 167,168~ Sin embargo,los análisisconformacionalesllevadosa cabocon laNT y susfragmentosactivosno hancontribuidoa esclarecerestepunto, ya que,
mientras en disolución se puede descartarla existencia de estructurassecundariasconcretas169,170 algunosestudiosde cálculos de energíaindican lapresenciade un giro 3 de tipo 1 constituido por el fragmento Arg-Pro-Tyr-
Ile 167,171
Con objeto de intentar aportar nuevosdatos acercade la conformación
bioactiva de esteneuropéptido,y dentro del marcode colaboraciónque nuestrogrupo de trabajo mantienecon la compañíaNovo-Nordisk XIS, se consideródeinterés la preparación de una serie de análogos conformacionalmenterestringidosde NT
613 de fórmula general186. En estosderivados,el dipéptído
Pro’0-Tyr11sesustituyópor esqueletosde 3-oxoindolizidina2-hendísustituidacon
diferentesestereoquímicas,capacesde inducir restriccionesconformacionalesdeíndole diversa.Por facilidad sintética,se reemplazóla cadenalateral de la Tyr
por Phe,dado que estasustituciónno modifica sustancialmentela actividadde laNTg.
13.
oPh
fle-Leu-OH
H-Arg-Arg-HN
Como derivadosde 3-oxoindolizidinade partidapara la preparaciónde losanálogosde NT8.j3 136, se utilizaron los compuestos85a,85b, 85c, 88a y 88b,
previamentepreparados(Apartado 2.2.2).
136
—108—
o OoN Ph N N CO2H
co2n ‘—Ph ‘—Ph
BocHN l3ocHN BocHN
85a 85b 85c
(IRSR) (ISSR) (ISSS)
o oN CO2H N Ph
‘—Ph CO2H
BocHN BocHN
88a 88b
= 8-amino-2-bencil-3-oxoindolizidina-2-carhoxilato.Las tres letras siguientesa la letra 1 indican la conflguraciónde C-2, C-8 y C-8a, respectivamente.
A partir de estos derivadosde 2-bencil-3-oxoindolizídina-2-carboxilato,elDr. Nils L. Jobansen(Novo-Nordisk) abordó la síntesis de los derivadosbexapeptídicosconformacionalmenterestringidos [IRSRlQí 11 NT8j3 (136a),FISSR
101’JNT&ís(lSBb), [ISSS’0’111NT&13(136c), [ISRS
1Q”]NT813 (136d)e
[IRRS1O’111NT
313 (136e), utilizando la metodologíade péptidos en fase sólida y
siguiendo la estrategiaBoe/BzI. En concreto, se utilizó una resma PAM[4-(bidroximetil)fenilacetamidometil resma] como soporte sólido, las cadenaslaterales de los residuos de Arg se protegieronen forma de tosilato y los
acoplamientos de los diferentes Boc-aminoácidosse realizaron con loscorrespondientesésteresde N-hidroxibenzotriazol,previamenteformados.Parala introducciónde los derivadosde 3-oxoindolizidinasse empleóBOP como agente
de condensación.Finalmente,la separaciónde los péptidos de la resma y laeliminación de los gruposprotectoresde las cadenaslaterales,por tratamiento
con HF, condujo, tras purificación por RP-HPLC, a los derivados136a-lSBebuscados.
Teniendo en cuentaque cada una de las 3-oxoindolizidinasde partidaestabacompuestapor una mezclade enantiómeros,todos los crudosde reacción
obtenidos mostraron la existencia de dos derivados hexapeptidicosdiastereoisómeros(Tabla 17).
— 109 —
Tabla 17. Proporciónde diastereoisórnerosobtenidosen la síntesis
de los análogosrestringidos de NT513
Producto
de partida
Proporción
de enantiómerosa
producto
final
Proporción
de diastereoisómerosb
85a±SSa 6:1 136a + 136d 9:1
85b+ SSb 6:1 136b+ 136e 2,5:1
85a +SSa 1:5 136a +136d 1:3,2
85b+SSb 1:5 136b+136e 1:8,7
a Medidapor HPLC apartir de los correspondientesanálogosderivatizadoscon MTPA (Apartado2.2.3).
b Medidapor 1-IPLC en los crudosde reacc~on.
Las diferenciasen las proporcionesde diastereoisómerosde los análogos
peptídicos finales cuando los productos de partida presentan excesosenantioméricos idénticos, indican nuevamentela existenciade problemasde
resolucióncinética, tal y como sehabíapuestode manifiestoen las reaccionesde
derivatizaciónde las indolizidinas con MTPA. A partir de estosresultadosse
puede concluir que las indolizidinas 85a (IRSR) y 88b (IRRS), ambas deconfiguración R en C-2, reaccionanmás rápidamenteque sus respectivosenantiómerosSSa(ISRS)y 85b (ISSR). Esta diferenciapodría atribuirse a unempaquetamientomayor entreel grupo2-benciloy la cadenalateralde la Ile en el
caso de las 2S-indolizidinasque dificulte la reacción de estos derivadoscon elfragmentodipeptídicoH-Ile-Leu-Resina.
El derivado hexapeptídico correspondiente a la indolizidina deconfiguración (2R,SR,8aR),enantiómerade 85c, no pudo ser aisladoya que, por
unaparte,al ser85eel isómerominoritario setrabajabacon pequeñascantidadesy, por otra, existía un pequeñoproblemade contaminacióndel compuesto 85ccon
el derivado 85a, debido a la dificultad de separacióncromatográficade susrespectivoscompuestosprecursores82c y 82a.
Los derivados 136a-136e fueron caracterizadosmediante sus datos
analíticosy espectroscópicos,como se detallaráen el capítulo correspondientede
la parte experimental.
Los resultadosde afinidad por los receptorescentralesde NT 172 de los
análogosconformacionalmenterestringidosincluidos en estecapítulo se recogen
— 110—
en la tabla 18. A efectos comparativos, se incluyen también los datoscorrespondientesa la NT813y susanálogos[Pbe
1flNTsj3 y [A1a
11]NTs.i3.
Tabla18. Aflnidad por los receptoresdc NT de los análogos136a-136e
aCompuesto IC5o ( nM)
136a H-Arg-Arg-IRSR-Ile-Leu-O11 267 ±79
136b H-Arg-Arg-ISSR-fle-Leu-OH 279 ±129
136c HArg-Arg-ISSS-Ile-Leu-OH ~1O0OO
136d H-Arg-Arg-ISRS-11&-Leu-OH 200 ±62
136e H-Arg-Arg-JRRS.Ile-Leu-OH 342 ±127
[Ala”}NTs~s WArg~Arg-Pro-A1a-Ile-Leu-OH 223 ±70
[Phe11]NT~j~ l1-Arg-Arg-Pro-Phe-Ile-Leu-Ol-l 39 ±19
NTg1~ H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 10 ± 7
a Los valoresde 1C50indican la concentraciónala cual se produceun 50% de inhibición dela unión específica
de [3H]-NT a homogeneizadosde cortezade cerebrode rata. Estosvalorescorrespondena la media de al
menostresexperimentosrealizadospor separado.
Como se deducede los datosde la tabla,los compuestos136a-136by 136d-136e, en los que el dipéptido Pro-Tyrha sido reemplazadopor derivadosde 3-oxo-
indolizidinas de configuración(SS,SaR)y (8R,8aS),respectivamente,resultaron
equipotentesentre sí y aproximadamenteun orden de magnitud menos afines
por los receptoresde NT que el fragmento mínimo activo NT313 y su análogo
[Phe11]NT
843. Sin embargo, el derivado 136c, con disposición cis entre los
sustituyentesen posiciones8 y Sa del anillo de indolizidina, fue inactivo a una
concentraciónde iO~ M. Estos resultadosparecenindicar que, mientras la
estereoquímicaen C-2 no tiene influencia en la unión a los receptoresde NT, la
disposición 8,8a-transjuegaun papel importanteen dichaunión. Por lo tanto, las
restriccionesconformacionalesinducidaspor las 3-oxoindolizidinas 8 ,8a-transen
los análogos de NT813 se ajustan mejor a los requisitos topográficos de los
receptoresque las inducidaspor el derivado8,8a-cis.La disminuciónen un orden
de magnitud de la afinidad de los análogosconformacionalmenterestringidos
136a,136b, 136d y 136e,con respectoa la NT8j3 y [Phe”iNTsig, podríadebersea
que las cadenaslaterales de los diferentesaminoácidosde estos derivadosno
puedanadoptaren su conjunto las disposicionesespacialesmás favorablespara
— 111 —
la interaccióncon los receptoresde NT. rj9eniendoen cuentaque los valores deJCso obtenidospara estos análogosson similares al del derivado [Ala”]NTsa
3,
otra posible explicación, en términos conformacionales,a la disminución de
afinidad podría particularizarse en una disposición espacial inadecuadadelgrupo 2-bencilo, que impediría su interacción con la cavidad hidrofóbicacorrespondienteal residuode Tyr
11 en el mencionadoreceptor.Para intentar profundizar en el conocimientode las relacionesestructura
tridimensional-afinidadpor los receptoresde NT de estos análogosconforma-
cionalmente restringidos de NT8j¿, se realizó un estudio de modelización
moleculardel derivado dipeptídico Ac-Pro-Tyr-NHCHg, como modelo sencillode
NT5.j3, y de las 2-bencil-3-oxoindolizidinasA. B y O.
- 01-1EN
ENCH3 WC
Ac-Pro-Tyr-NHCH3
O O
1~1NNEN CH3 EN+ 0
8 e
Siguiendola metodologíaexpuestaen el apartado2.2.5, se llevaron a cabo
tres dinámicasmolecularesa 1500 K para el derivadodipeptídico Ac-Pro-Tyr-NHCH3 y dos para los compuestosA, B y C. En todos los casos,ci valor de la
constantede rotación del enlacepeptídicose aumentóartificialmente durantelas
dinámicaspara evitar la formación de los correspondientesisómeroscis. El total
de mínimos encontradosfue de 135 para el dipéptido y 74. 78 y 82 para los
derivadosrestringidosA, B, y O, respectivamente.
Hg
A
“0r1~1N% CH1
EN%0
o O
—112—
En la tabla 19 se recogenlas energíasrelativas, las distancias dctC1-ctC4y
los valores de rms obtenidospor superposicióncon diferentestipos de giros 3 para
los veinte confórmerosde menor energíade] derivado Ac-Pro-Tyr-NHCH3.
Tabla 19. Comparaciónde los veinte confórmerosde mínima energíadel derivadodipeptidico
Ac-Pro-Tyr-NECH3 con diferentestipos de giros 3
rms (Á)E relativa
Conf. (Kcal/mo))
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1.2
13
14
15
16
17
18
19
20
0,00
0,17
0,95
1,02
tOS
1,24
1,28
1,31
1.43
1,43
1,49
1,56
1,61
1,66
1,67
1,74
1,75
1,78
1,79
1,82
daC1-aC4(A)
5,98
8,95
8,92
6,65
4,56
4,54
6,33
9,06
8,64
7,53
7,82
5,91
5,16
6,13
5,02
8,53
6,98
8,81
9,03
6,92
31 31 [3-II [311’ 3111 [3111’
0,33
1,62
1,58
0,64
0,66
0,70
1,16
1,47
1,30
0,84
1,92
0,30
0,70
0,46
0,33
1,27
1,32
1,93
1,67
0,89
125
1,99
2,01
1,08
1,14
1,17
1,07
1,71
1,83
1,36
1,50
1,18
1,27
1,27
0,95
1,60
1,23
2,00
1,98
1,13
0,85
1,89
1,8.5
0,76
0,92
0,96
1,12
1,59
1,58
1,07
1,68
0,78
1,02
0,86
0,58
1,42
1,29
2,00
1,93
0,94
0,73
1,84
1,80
0,79
0,80
0,84
1,06
1,59
1,53
1,06
1,69
0,67
0,90
0,78
0,51
1,42
1,23
2,01
1,88
0,93
0,17
1,42
1,38
0,61
0,70
0,74
1,21
1,33
1,08
0,70
1,85
0,21
0,67
0,37
0,51
1,14
1,34
1,79
1,47
0,90
1,34
1,81
1,84
1,14
1,23
1,26
1,05
1,65
1,80
1,38
1,31
1,28
1.35
1,34
1,07
1,57
1., 18
1,87
1,79
1,15
La obtención
incluido el mínimo
de 11 confórmeroscon
absoluto,indica la gran
distanciactC1-uC4 inferior a 7 A,
tendenciadel derivado dipeptídicoAc-Pro-Tyr-NHCH3 a adoptar conformacionesplegadas de tipo giro 13,obteniéndoselos mejoresvaloresde rms por superposiciónde estosconfórmeros
— 113—
con giros ¡3 ideales de tipos 1 y III (Figura 15). Además, la mayoría de los
confórmeros con distancia aCj-cxC4superior a 7 Á presentanun puente de
hidrógenointramolecularentreel grupo carbonilodel acetilo y el NH del residuode Tyr, característicode los giros ‘y inversos120~ Por lo tanto, si se realiza una
extrapolación de estos resultadosa la NT, cabe esperarque los fragmentospeptídicosArg-Pro-Tyr-Ile y Arg-Pro-Tyr presentencapacidadespara adoptar
conformacionesde giro ¡3 (1 o III) y giro y, respectivamente,similares a las
mostradaspor el péptido modelo.
Figura 15. Superposicióndel mínimoabsolutodel derivado Ac-Pro-Tyr-NHCH3(línea continua)congiros /3 idealesde tipos 1 (a) y 111 (b).
Por otra parte, el análisis conformacionalefectuadopara las 2-bencil-3-
oxoindolizidinas A, B y C (Tabla 20) condujo a resultadosmuy similares a los
obtenidos previamente para sus correspondientesderivados desbencilados
(Apartado 2.2.5). Así, se puedeobservarque, mientras la indolizidina A presenta
una tendenciamoderadaa adoptarconformacionesplegadas,las conformaciones
extendidas son predominantesen el caso de la estructura B. Sin embargo,
aunquelos valores de rms de las formas plegadasde A parecenindicar una
correlaciónpreferentecon los giros ¡3 de tipos 1 y liii, en la superposiciónde los
confórmerosA20 y A9 con estostipos degiro 13 seobservaque las disposicionesde
los respectivos enlaces peptídicos, especialmenteel C-terminal, son muy
diferentes (Figura 16). Por lo tanto, no sepuedeconsiderarque estederivado de
2-bencil-3-oxoindolizidinaactúe corno mimético de giros ¡3.
ba
—114—
Tabla20. Confórmerosde las estructurasA, B y C quepresentandaC1-aC4inferior a 7 Áy comparacióncon los diferentestipos de giros ¡3
E relativa
Conf a (Kcal/mol>
A4
AO
Ah
A18
A19
MO
1,48
2,16
‘2,66
3,43
3,47
3,59
B20
Cl
C2
Cg
CCCts
C9
C 13
C14
C16
GiS
C20
3,26
0,00
1,02
1,43
1,84
1,89
2,29
2,81
3,26
4,41
4,93
5,06
rius (A)d
aCj-aC4 <Aí
6,82
6,4-4
6,57
6,44
6,12
5,18
6,83
4,78
3,91
4,66
4,31
4,39
4,20
4,20
3,97
5,31
4,82
6,92
0,81
0,74
0,76
0,88
0,84
0,63
1,40
1,37
1,38
1,31
1,30
1,08
1,06
1,01
1,03
1,04
1,01
0,75
0,98
0,93
0,94
0,92
0,88
0,65
0,71
0,66
0,68
0,79
0,76
0,68
1,12 Ét79 0,75 0,86 1,15 0,74
116
1,15
1,16
1,17
0,81
0,79
1,17
0,82
1,26
0,81
1,12
0,69
0,70
0,68
0,68
0,94
0,99
0,68
0,97
0,68
0,52
0,86
0,78
0,79
0,78
0,81
0,69
0,71
0,81
0,70
0,85
0,48
0,90
0,89
0,90
0,88
0,96
0,82
0,84
0,96
0,84
0,95
0,57
0,92
1,29
1,32
1,29
~1,33
(1,96
0,94
1,34
0,98
1,37
0,96
1,15
a Únicamentese hanconsideradolos veinteconfórmerosde mínimaenergía.
Finalmente, la 3-oxoindolizidina 8,Sa-cis C adopta preferantemente
conformacionesplegadasque se caracterizanpor poseerun puente de hidrógeno
intraniolecular entre los grupos 8-NH y 2-CO (confórmeros01-03. 05, 06, 09,
013, 014, 016 y 020). Además,en estecaso,el conférmeroCiS secorrespondecon
una conformación de tipo giro 13 (II, 1) idéntica a la del mínimo 05 del
correspondientederivado no sustituido en 0-2 (Apartado2.2.5).
[3111
1,44
1,443
1,43
1,37
1,37
1,20
0,78
0,84
0,78
0,79
1,08
1,14
0,80
1,12
0,72
0,71
0,87
115—
Figura 16. a: Superposicióndel confórmeroA20(línea continua)con un giro /3
ideal de tipo L b: Superposicióndel confórineroA9 (línea continua)
con un giro fi ideal de tipo hL
Si, como en el caso de Ac-Pro-Tyr-NHCHI3, el comportamiento
conformacionalde los análogosrestringidosde NT8~13 136a-136cfuera similar al
determinadocon los modelos sencillos A, 13 y C, respectivamente,la falta de
afinidad del derivado 136c indicaría que las conformacionesplegadasde laestructura C (SNH—>2C0 y giro 13 II) son incompatibles con la conformación
bioactiva de la NT. Por otra parte, la carencia de estructuras secundarias
definidaspara los derivados de 3-oxoindolizidinasA y B no permite establecer
una relación clara entre la moderadaafinidad de los análogosrestringidosdeNT815 iSBa y 13Gb y la conformaciónpreferentede la NT en suunión al receptor.
Para llegar a esclarecerla participación o no de conformacionesde tipo
giro ¡3 (1 o III) y/o y en la conformaciónbioactiva de la NT sería necesanala
preparación de análogos conformacionalmenterestringidos que incorporen
miméticospara estostipos concretosde giros inversos.
a b
—116—
3. PARTE EXPERIMENTAL
Los análisis elementalesse efectuaronen el laboratorio de microanálisis
del C.N.Q.O. con un analizadorHeareus CHN-O-RAPID y se hallan en el
rango de ±0,4 respectoa los valores teóricos calculadospara las fórmulas
moleculares.
Los puntos de fusión se determinaronen un aparato Reichert-Jung
Kofler y no estáncorregidos.
Los espectrosde masasse registraron en un espectrómetroVacuum
GeneratorsVG 12-250.
Los espectrosde PD-MS se registraron en un instrumento Bio-lon 20
(Applied Biosystems).
Los poderes rotatorios se determinaron en un polarímetro Perkin
Elmer 141.
Los espectrosmonodimensionalesde ‘H RMN se registraron en un
espectrómetroVarian EM-390 (90 MHz), en un Varian Gernini 200 (200 MHz),
en un Varian XL-300 (300 MHz), en un Brucker AMX2-400 (400 MHz) o en un
Varian Unity 500 (500 MHz), utilizando TMS comoreferenciainterna en el caso
de los espectrosregistradosen CDCI3, DMSO-d6 y (CDahCO,y DDS para los
registradosen D20. Los experimentosde NOESY se registraronen el Varian
XL-300, utilizando 1,5 s de tiempo de relajación y 600 ms de tiempo de mezcla.
Para los experimentosde ROESY, registradosen el Varian Unity 500, se
utilizaron 1 s de tiempode relajacióny 150 nis de tiempode mezcla.
Los espectrosde13C RMN se registraron en el Varian Gemini 200
(50 MHz), en el Varian XIL-300 (75 MHz) o en un espectrómetroBrucker AM-200
(50 MHz).
Las cromatografías analíticas en capa fina se realizaron encromatofoliosde 0,2 mm de espesor,con gel de sílice tipo 60, Merck F
254. Los
compuestosse detectaroncon luz UY de 254 nm, mediantepulverización con
disolución de ácido sulfúrico en etanol (3:7), con disolución de ninhidrina en
etanolal 2% y calentandoo con yodo.
Las separacionescromatográficasen columna sellevaron a cabo con ge]
de síliceMerck tipo 60 (230-400mesh).
Las cromatografíaspreparativasse realizaron en placas de 2 mm de
espesorcon gel de sílice 11F254 Merck o mediante cromatografía circular
centrífuga en capa fina (CCTLC) en cromatotrón,en placasde 1 ó 2 mm deespesorcon gel de sílice Merck tipo 60 PF-254con CaSO4.
Los HPLC analíticos se llevaron a cabo sobre un aparato Waters y
utilizando las siguientescolumnasde fasereversa:
— Columna núm. 1: LichrosorbCís (4 x 250 nnn. 5 ¡im).
— Columna núm. 2: UltrasphereC18 (4,6 x 250 mm, 5 ~ím).
— Columna núm. 3: NovapakC18 (3,9x 150 mm, 4 um).
— Columna núm. 4: ~ BondapakC18 (3,9x 300 mm, 10 gnt.
Los sistemasde eluyentes utilizadosseindican a continuación:
— Eluyente A: CH3CN/H20 (0,05%TFA).
— EluyenteB: CH3CN¡TEAP (TEAIP = tampónEtgN/HgPO4,pH 6,5).
— Eluyente C: CH3CN/H20.
En todos los casosel flujo fue de 1 mL/mm y la detecciónde picos se
realizópor LIV a 214 nm
Para el HPLC preparativo se utilizó una columna ~í Bondapak Cís
(7,8 x 300 mm, 10 gm) y el sistemade eluyentesA, el flujo fue de 3 mL/mm y la
detección,igual queparael HPLC analítico, seefectuóporUY a 214 nm.
Los análisis de aminoácidosse realizaronpor hidrólisis de los péptidos
en HCl 6 N a 1100C durante22 h, seguidode derivatizaciónconisotiocianatode
fenilo y análisis por HPLC.
PRODUCTOS COMERCIALES
Ácido trifluoroacético FLUKA
ALDRICH
Bromoacetatode terc-butilo ALDRICH
Bromoacetatodeetilo ALDRICH
Bromuro de bencilo
Cloroformiato de isobutilo ALDRICH
DCC
Gramina
Hidrogenosulfatode tetrabutilamonio
N-hidroxisuccinimida
LiAIH4
Malonatode dimetilo
MERCK
FLUKA
ALDRICH
ALDRICH
N-meti1monolina ALDRICH
(R)-ú-)-MTPA ALDRICH(R)-(-)-MTPA-Cl ALDRICH
(S)-(-i-)-MTPA-CI ALDRICHNaBH4 FLUKA
NaH ALDRICH
PANREAC
(S)-(±)-TFAE
Trietilamina SCHARLAUYoduro de metilo QUIMICEN
Los aminoácidosy susderivadoscuyasíntesisno se describeprocedende
BOP
FLUKA
FLUKA
SIGMA
NalPd-C FLUKA
FLURA
la casacomercial BACHEM AG.
3.1. SINTESIS DE CLOROMETILCETONAS DERIVADAS DEAMINOÁCIDOS
Procedimientogeneral:
A una disolución del derivadode aminoácidocorrespondiente(8 mmoles)
en THF (20 xnL), enfriadaa —20 oc, se le añadenNMM (1,2 niL, 11 mmoles)y
cloroformiatode isobutilo(1,5 mL, 11 inmoles).Despuésde 30 mm de agitacióna la temperaturaindicada, se adiciona CH2N2, generadosobreéter etílico a
partir de N-metil-N-nitrosourea(3 g), y se deja que la reacción transcurraaO
0C durante30 mm. A continuación,se añadepoco a poco y agitando unadisoluciónsaturadade HCI en MeOH hastaquecesael desprendimientode N
2.
Trasneutralizarel excesode HCí con TEA, seelimina el disolventey el residuoresultantese lava con H20 y con disoluciónsaturadade NaCí, sucesivamente,y seextraeconAcOEt. El extractoorgánicosesecasobreNa2SO4y seevaporael
disolventea sequedad.El residuose purifica por cromatografíaen columnadegel de sílice,utilizando el sistemade eluyentesqueseindica en cadacaso,
Z-D-Phe-cH2Cl(4%
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:78%.
Sólidoblanco.PAl: 89-90 oc (AcOEt-hexano).
1H RMIN (90 MHz, CDC13): a 7,4-7,0[m, 10 H, C6H5 y Ph(Z)], 5,2 (m, 1 H, a-NH),
5,0 lIs, 2 H, CH2 (Z)], 4,7 (m, 1 H, cx-Phe),4,0 (d, 2 H, CH2-Cl), 3,1 (m, 2 H, 13-Phe).
Calculado(Cí8Hí8C]N03) 65,16 5,47 4,22 10,69
Encontrado 64,92 5,58 4,17 10,55
Z-D-Trp-CH2CI (5Q)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:72%.
Sólido blanco.PS.: 134-136 oc (AcOEt-hexano).
— 123 —
1H RMN (90 MHz, CDCl3): 6 8,1 (s, 1 H, NHi), 7,8-6,8[m, 10 H, In y Ph (Z)], 5,4
(m, 1 H, cz-NH), 5,0 Jis, 2 H, CH2 (Zfl, 4,8 (m, 1 H, a-Trp),4,0 (m, 2 H. CH2-Cl),3,2 (d, 2 H, 13-Trp).
Análisis elemental(%) C H N Cl
Calculado(C20H19C1N203) 64.78 5,16 7,55 9,56Encontrado 64,57 5,22 7,30 9,38
Boc-D-Orn(Z)-CH2CZ (79)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:82%.Sólido blanco.P.f.: 80-82
0C (AcOEt-hexano).
HPLC: tR = 13,60mm; eluyenteA (50:50);columnanúm. 1.
1H RMN (300 MHz, CDCl3): 67,36-7,31[m, 5 H, Ph(Z)1, 5,14 (d, 1H, cz-NH), 5,09
Ls, 2 H. CH2 (Z)], 4,89 (ni. 1 H, a-NH), 4,51 (m. 1 H, a-Orn),4,25 (s, 2 H, CH2-Cl).3,22 (m, 2 H, a-Orn), 1,86 (m, 1 H, 13-Orn), 1.56(m, 3 H, 13- y y-Orn), 1,43 jis, 9 H,CH3 (Bocfl.
Análisis elemental(%) C H N Cl
Calculado(C19H27C1N205) 57,21 6,82 7,02 8,89Encontrado 57,23 6,62 7,05 9,08
— 124 —
3.2. SÍNTESIS DE 4-CETODIÉSTERES DERiVADOS DE AI’IIINOÁCU)OS
Procedimientogeneral:
A una disolución de la clorometilcetonacorrespondiente(7 mmoles) enDME (10 mL) se le añadeNal (7 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante15 mm. La suspensiónobtenidase adicionasobreunadisolución de lasal monosódicadel ma]onato de dimetilo (7,7 mmoles) en DME (10 mL)
recientementepreparadaa partir de malonato de dirnetilo y NaMeO. Tras
agitar a temperatura ambiente durante 1 h, se elimina el disolvente y el
residuo resultantese extrae con AcOEt y se lava con H20 y con disolución
saturadade NaCí, sucesivamente.La fase orgánicase secasobreNa2SO4y se
evaporaa sequedad.El residuo obtenido se purifica por cromatografíaencolumnade gel de sílice, utilizando como eluyenteel sistemaque se especifica
en cadacaso.
(5R)-5-(Bendiloxicarbonil)amino-&fenil-2-metoxicarbonll-4-osrhexanoatodemetilo (51)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:88%. Sirupe.
1J¡ RMIN (90 MHz, CDCl3): 6 7,4-7,0Em, 10 II, C6Hs y Ph (Z)], 5,2 (m, 1 H, 5-NH),
5,0 Es, 2 H, CH2 (Z)], 4,5 (m, 1 H, H-5), 3,8 (t, 1 H, H-2), 3,7 (s, 6 II, CO2CH3),3,0
(ni, 4 H, H-3 y H-6).
~ Análisis elemental(Wc,> _ C H N
Calculado(C~H25NO7) 64,63 5,90 3,28
Encontrado 64,38 5,92 3,15
(5R)-5-(Rendfloxicarbonil)amino-64¿ndol-3’-il)-2-metaricarbonil-4-arohetcanoatodemetilo(52)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:90%. Sirupe.
— 125 —
1H RMN (90 MHz, CDCI3): 5 8,2 (s, 1 H, NRO, 7,6-6,9[ni, 10 H, In y Ph (Z)], 5,4
(m, 1 H, 5-NH), 5,0 Es, 2 H, CH2 (Z)], 4,7 Cm, 1 H, H-5), 3,8 (t, 1 H. H-2). 3,7 (s,
6 14, CO2CH3),2,6 (ni, 4 H. H-3y H-6).
Análisis elemental(%,> C H N
Calculado(C25H26N207) 64,37 5,62 6,00
Encontrado 64,02 5,79 5,75
(51V-8-(BencilaricarbonWwnino-5-(tere-butaricarbonil)amino-2-ntetox¿carbonil-4-oxooctanoatodemetilo (80)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:88%.
Sólidoblanco.PS.: 98-990C (AcOEt-bexano).
HPLC: tR = 13,28mm; eluyenteA (50:50);columnanúm. 1.
‘H R.IVIiN (300MHz, CDCl3): 5 7,36-7,30[m, 5 H, Ph 2)], 5,13 (d, 1 H, 5-NH), 5,09
Es, 2 H, CH2 (Z)1, 4,93 Cm, 1 H, 8-NH), 4,34 (ni, 1 11, H-5), 3,91 (t, 1 H, H-2), 3,73 (s,
6 H, CO2CH3), 3,23 Cm, 2 H, H-8), 3,17 (dd, 1 H, H-3, J = 18,3 y 7,8), 3,05 (dd, 1 H,
H-3, J = 18,3 y 6,6), 1,92 (ni, 1 H, 11-6), 1,55 (ni, 3 11, 11-6 y 11-7), 1,43 Ls, 9 11,
CH3 (BocXl.
Análisis elemental(%) C __ _ _ H N
Calculado(C24H34N209) 56,16 7,28 5,95
Encontrado 56,37 7,08 5,68
— 126 —
3.3. OBTENCIóN DE 4-CETODIESTERES 2-SUSTITUIDOS
Procedimientogeneral:
A una disolucióndel 4-cetodiéstercorrespondiente(3 mmoles)en DME oTHF (20 mM se le añadenNaMeO, recientementepreparado(3,3 mmoles) y,
despuésde 10 mm de agitación,el agentealquilante apropiado,bromuro de
bencilo, bromoacetatode etilo, yoduro de metilo o bromoacetatode terc-butilo
(9 mmoles).Tras dejar que la reacción transcurraa temperaturaambientedurantetoda la noche,se elimina el disolventey, a continuación,se extraecon
AcOEt y selava con H20 y con disoluciónsaturadade NaCí, sucesivamente.El
extracto orgánico se secasobreNa2SO4 y se evaporaa presión reducida. El
residuo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,
utilizando el sistemade eluyentesquese especificaen cadacaso.
Los productosobtenidospor estemétodose describena continuación,consus correspondientesdatosanalíticosy espectroscópicos.
(5S)-2-Bencil-5-(bendilaricarbonil)amino-&fenil-2-metoxicarbonW
*axohexanoatodemetilo (61)
Fluyente:AcOEt-hexano(1:4). Rendimiento:85%. Sirupe.
‘H RMN (90 MHz, CDCl3): ~ 7,3-6,8Em, 15 14, C6H5 y Ph (Z)], 5,2 (d, 1 H, 5-NH),
5,0 Ls, 2 14, CH2 (Z)], 4,5 (ni, 1 14, H-5), 3,6 (s, 6 14, CO2CH3), 3,3 (s, 2 14, 2-CH2),
2,9 (m, 4 H, 14-3 y 14-6).
Análisis elemental(%) C 14 N
Calculado(C30H31N07) 69,62 6,04 2,71
Encontrado 69,71 5,95 2,56
(5S)-2-Bendil-5-(bendiloxicarbonil)amino-64indol.3’-il)-2-metoxicarbonil-4-oxohexanoatodemetilo (62)
Fluyente: AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:82%.Sirupe.
— 127 —
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6Á¿ 10,87 (s, 1 H, NS), 7,88 (d, 1 H, 5-NH, J= 8,1),
7,53-6,87[ni, 15 H, In, C6145y Ph (Z)], 5,04 lId, 1 11, CH2 (Z), J = 12,9], 4,98 lid, 1 14.
CH2 (Z)], 4,31 (ni, 1 U, 14-5), 3,61 (s, 6 14, CO2CH3),3,22 (s, 2 H, 2-CH2), 3,10 (m,
214,11-3y 14-6), 2,98(d, 1 14, 14-3,J= 19,2),2,89(dd,1 14, 14-6,J = 14,7 y 9,3).
Análisis elemental(%) C 14 N
Calculado(C32H32N207) 69,05 5,79 5,03
Encontrado 68,89 5,77 5,22
(68)-64Bendiloakarbonil)amino-7-fenil-3,3-dirnetaricarbonil-
5-oxoheptanoatodeetilo (63)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:82%. Sirupe,
1H R1VIiN (90 MHz, CDCl3): 8 7,3-7,0[ni, 10 14, C6115y Ph (Z)], 5,2 (d, 1 14, 6-NH),
5,0 Es, 2 14, CH2 (Z)], 4,5 (ni, 1 H, H-6), 4,0 lIc, 2 14, CH2 (Et)jJ, 3,6 (s, 6 14, C02C143),
3,3 (s, 2 14, 14-2), 3,0 (m, 4 H, 14-4y 14-7), 1,1 lIt, 3 11, CH3 (EtA.
Análisis elemental(%) C 14 N
Calculado(C271431N09) 63,15 6,08 2,73
Encontrado 63,08 6,27 2,81
(GS)-6-(Bendiloxicarbonil)amino-7-(indol-3‘-il)-3,3-dimetoxicarbonil-
5-oxoheptanoatodeetilo (64)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:89%. Espuma.
1H RMN (90 MHz, CDCIs): 6 8,2 (s, 1 14, NHi), 7,6-6,9 [ni, 10 14, In y Ph (Z)], 5,4
(d, 1 14, 6-NII), 5,0 [s, 2 14, CH2 (Z)], 4,6 (m, 1 14, 14-6), 4,0 lIc, 2 14, CH2 (Et)], 3,6 (s,
6 14, CO2CHs), 3,3 (s, 2 14, 14-2), 3,1 (m, 2 14. 14-7), 3,0 (s, 2 14, 14-4), 1,2 [t. 3 H,
CH3 (Et)].
Análisis elemental(%) C Ii N
Calculado(C29H32N209)
Encontrado
63,04
62,97
5,84
5,77
5.074,84
— 128 —
(5S)-5-(Bendiloxiearboniflamino-6-(indol-3‘-il)-2-metil-2-metoxicarbonil-4-oxoheranoatodemetilo (66)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:88%. Espuma.
1H RMIN (300 MHz, DMSO-dÓ: 8 10,86 (s, 1 14, NH~), 7,80 (d, 1 14, 5-NH, J = 7.8),
7,56-6.96Em, 10 14, In y Ph (ZXl, 5,03 [d, 1 H, CH~ (Z), J = 12,7], 4,96 [d, 1 14,
CH2 (Z)], 4,30 (m, 1 14. 14-5), 3,60 (s, 6 14, C02C143),3,23 (d, 1 14, 14-3, J = 18,4),
3,10 (dd, 1 14, 14-6, J = 14,3 y 5,7), 3,08(d, 1 14, 14-3), 2,89(dd, 1 H, 14-6, ¿1 = 14,3y
9,3), 1,31(s, 3 H. 2-CH3).
Análisis elemental(%) C 14 N
Calculado(C26H28N207) 64,99 5,87 5,83
Encontrado 64,87 5.91 5,55
(6S)-6-(Bendilaxicarboniflwnino-7-(indol-3’-il)-3,3-dimetoxiearbonil-5-oxoheptanoatodeterc-butilo (118)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:84%. Espuma.
1H RMN (300MHz, CDCl3): 8 8,10 (s, 1 14, NHi), 7,62-6,99[ni, 10 14, In y Ph (Z)1,
5,36 (d, 1 14, 6-NH, J = 6,9), 5,05 lIs, 2 14, CH2 (Z)], 4,68 (ni, 1 14, 14-6), 3,68(s, 6 H,
C02C143),3,40(s, 214,14-2), 3,33, (dd, 114, 14-7, J = 15,1y 6,0), 3,15 (dd, 1 14, 14-7,J = 15,1 y 5,8), 3,00 (s, 2 14, H-4), 1,39 lIs, 9H, CH3 (CO2tBu)].
Análisis elemental( c,> C 14 N
CaJculado(CaíH3eNaOg) 64,13 6,25 4,82
Encontrado 64,41 6,50 5,04
— 129 —
3.4. SINTESISDE 2,5-DICETOPIPERIDINAS
3.4.1. SÍNTESIS DE 3-METOXICNRI3ONIL-2,5-DICETOPIPERIDINAS6-SUSTITUIDAS
Método1: Calefacciónen MeOHde 4-cetodiésteres
Se disuelve el 4-cetodiéster37 ó 38 (5 mmoles)en MeOH (150 mL) y se
añadeun 10% de Pd-C (10%). La suspensiónasí obtenida se hidrogena a
temperaturaambientey 25 psi de presióndurante1 E. Tras comprobarporcromatografía en capa fina la desproteccióndel grupo amino, se separael
catalizador por filtración y la disolución sc calienta a reflujo durante 4 h. A
continuación, se elimina el disolvente y el residuo obtenido se purifica por
cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando comoeluyenteel sistema
que seindica en cadacaso.Aunque esteprocedimientono permitió la obtención de las 2,5-diceto-
piperidinas buscadas,a continuación se describen los dos derivados depirazinaobtenidos.
3,6-Dibendil-2,5-bisI(21,2-dimetoxicarbonifletil]pirazina(41)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:12%.Sólidoblanco.PS: 133-1340C (EtOH).
1H RMN (300 MHz, CDCla): 8 7,30-7,15(ni, 10 14, CeHs), 4,16 (t, 2 14, 14-2,J = 7,4),4,10 (s, 4 14, 3- y 6-CH
2), 3,67 (s, 1214, CO’2CH3), 3,37(d, 414,2- y 5-CHg,
J — 7 4).
13C RMN (75 MHz, CDCl3): 8 169,76(CO2), 150,25, 147,91(C-2y C-5, C-3 y C-6),
137,89, 128,76, 328,51,126,43(CsHs),52,57(OCR), 49,05(C-20,40,19(3- y 6-CH2),
31,95 (2- y 5-CH2).
EM: 549 (M~ + 1, 25,43),548 (Mt, 100,00),489 (M~ —59, 51,24),457 (M~ — 91,
26,18),430 (M~ — 118, 5,83), 3,66 (M~ — 182, 2,85), 91 (Bn, 93,92), 59 (CO2Me,
13,28).
— 130—
Análisis elemental(%) C H N
Calculado(CsoHa2N2Os) 65,68 5,88 5,11Encontrado 65,34 6,25 5,32
2,5-Bis[(2 ‘,2Sdimetaxicarbonil)etill-3,6-bis[(indol-3’~il)meW]pfrazinn (42)
Eluyente:AcOEt-hexano(lxi). Rendimiento:31%.
Sólidoblanco.PI: 168-1690C (AcOEt-hexano).
1H RlIIiN (300MHz, DMSO-d6):8 10,89(s, 2 H, NBÚ, 7,52-6,92(ni, 10 H, In), 4,16
(s, 414, 3- y 6-CH2),4,06 (t, 214,14-2,J = 7,2), 3,58(s, 12 14, C02C143),3,35(d, 4 14,2- y 5-CH2,J = 7,2).
1~C RMN (75 MHz, DMSO-d6): 6 169,32(CO2), 150,20, 147,54(C-2 y C-5, C-3 y
C-6), 136,18, 126,99, 123,12,121,09, 118,54,118,44, 111,39, 110,64 (In), 52,35
(0C143),48,69 (C-2), 31,48,30,52 (2- y 5-CH2, 3- y 6-CH2).
Análisis elemental(%) C 14 N
Calculado(C34H34N408) 65,17 5,47 8,94
Encontrado 65,33 5,66 8,99
Método2: Hidrogenaciónde 4-cetodiésteres
A una disolución del 4-cetodiéster37, 38, 51 6 52 (5 mmoles) en MeOH
(150mL) se le añadeun 10% de Pd-C (10%) y la suspensiónse bidrogenaa
temperaturaambientey 25 psi de presióndurante6 días.Una vez separadoel
catalizadorpor filtración, se elimina el disolventey el residuo resultantesepurifica por cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando el sistemade
eluyentesqueseespecificaen cadacaso.
Método3: Hidrogenaciónde 4-cetodiésteresnionoactivados
A unadisolucióndel 4-cetodiéster37 ó 38 (5 mmoles)en MeOH (50 nI) sele añadeNaOH 2 N (2,5 mL, 5 inmoles) y se agita a temperaturaambientedurante2 h. A continuación,se elimina el disolventey el residuo obtenidose
—131—
disuelve en 1420 (40 mL) y se acidifica bastaPH 3 con HCl 1 N, extrayendo
seguidamenteel ácido así liberado con AcOEt. El extracto orgánico se secasobreNa2SO4y se evaporaa sequedad.El nuevo residuo se disuelve en THF
(50 mL) y se le añadenHOSu (5 mmoles)y DCC (5 mmoles).Despuésde agitar
a temperaturaambientedurante30 mm, y tras comprobarpor cromatografíaen capafina la formación del ésteractivado, se separapor filtración la DCUformaday se elimina de nuevo el disolvente.El residuoresultantese disuelve
enAcOEt (150 mL) y la disoluciónse hidrogenaen presenciadeun 10% dePd-C(10%) a temperaturaambientey 25 psi de presióndurante3 días.Transcurridoestetiempo, se separael catalizadorpor filtración y el disolventese elimina porevaporación a presión reducida. Finalmente, los productos obtenidos sepurifican por cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando el sistema
de eluyentesindicadoen cadacaso.
A continuaciónse detallanlos productosobtenidospor estosdos últimos
métodos.
(3S)-6-Bendil-3-metoxiearbonil-2,5-dicetopiperidina(45W
Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:42% (a partir del compuesto37,método2); 60% (a partir de37, método3).
Sólido blanco.P.f.: 15 1-152CC (EtOH).
EM: 262 (M~ + 1, 8,69),261 (Mt, 8,95),202 (M~ —59, 28,45),170 (M~ —91, 5,83),91
(Bn, 100,00),59 (CO2Me,5,93).
Análisis elemental(%) C 14 N
Calculado(C14H15N04) 64,36 5,79 5,36
Encontrado 64,10 5,89 5,60
(SS,65)-y (3I~~
2,5-dicetop~pcridbm(48a) y (4Gb)
Eluyente:AcOEt-hexano(2:1). Rendimiento:42% (a partir del cetodiéster38,método 2); 40% (a partir de 38, método 3). Espuma. Proporción de
diastereoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)5:2 (método2) y 3:2 (método3).
—132—
EM: 300(Mt, 3,96), 130(CgHgN, 100,00).
Análisis elemental(%) C FI N 1Calculado(C161116N204) 63,99 5,37 9,33Encontrado 64,15 5,60 9,65
(3W6R)-6-Bendil-3-metoxicarbonil-2,5-dieetopiperidina(53a)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:30% (a partir de 51, método2).Sólido blanco.PI: 15 1-152
0C (EtOH).
Análisis elemental(Wc) C 14 N
Calculado(Cí4HísNO4) 64,36 5,79 5,36
Encontrado 64,06 5,58 5,43
(3W611)- y (3S,6P0-6-(Indol-3-il)ntetil-3-metoxicarbonil-
~5-diceto¡4peridina (Ma) y (Mb)
Eluyente:AcOEt-hexano(2:1). Rendimiento:34% (a partir del cetodiéster52,método 2). Espuma.Proporciónde diastereoisómeros(3R,6R)/(3S,6R)6:5.
Análisis elemental (Wc) C 11 N
Calculado(C16H16N204) 63,99 5,37 9,33Encontrado 63,78 5,46 9,37
Los datosde 111 RMN de los productosobtenidospor estosdos métodosse
encuentrandetalladosen la tabla 21. Asimismo, en la tabla 22 se recogenlos
datosde ‘3C RMN delos derivadospertenecientesa la serie L.
Al aplicar el método2 a la preparaciónde estas2,5-dicetopiperidínas,seaislaron pequeñas cantidadesde los derivados de pirazina descritosanteriormente41 y 42. Así, a partir de los cetodiésteres37 y 51 seobtuvoun 2 yun 3%, respectivamente,del producto 41. Del mismo modo, a partir de loscetodiésteres38 y 52 se obtuvo el derivado 42, siendo los rendimientosrespectivosdel 4 y del 3%.
— 133—
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3.4.2. SÍNTESISDE 6RALQUIL4METOXICARBONIJr
2,5-DICETOPIPERIDINAS3,3-DISUSTITUIDAS
MétodoA
A una disolución del derivado de 2,5-dicetopiperidina 45a ó 46ab
(1,5 mmoles) y NaMeO (1,6 mmoles) en DME (10 mL) se le añadeel agente
alquilantecorrespondiente,bromurode bencilo,bromoacetatode etilo o yoduro
de metilo (4,5 mmoles). Despuésde agitar a temperatura ambiente bajo
atmósferade argón durante6-7 h, seelimina el disolventey el residuoobtenido
se extrae con AcOEt y se lava, primero con 1420 y despuéscon disolución
saturadade NaCí. La fase orgánica se secasobreNa2SO4 y, tras eliminar el
disolventepor evaporacióna presiónreducida,sepurifica el residuoresultante
por cromatografíaen columna de gel de sílice, utilizando como eluyente el
sistemaque se indica en cadacaso.
Método13
A unadisolución del compuesto45aó 46ab(1 mmol) y C1131 (8 mnioles)en CH2Cla(1 mL) sele añade(n-Bu)4N14S04(1 mmol) previamentedisuelto en
NaOH 2 N (1 mL, 2 mmoles).Despuésde 6 días de agitacióna temperaturaambiente,la mezclade reacciónse trata con C142C12(50 mL) y 1120 (5 mL), seseparala fase orgánica,se secasobre Na2SO4y se elimina el disolventepor
evaporación.Finalmente,el residuoobtenido se purifica por cromatografíaencolumnade gel de sílice, utilizando como eluyente el sistemaespecificadoen
cadacaso,
Método C
Una disolucióndel 4-cetodiéster61-66ó 118 (2 mmoles) en MeOH (200 mL)sehidrogenaa temperaturaambiente,en presenciade un 10% de Pd-C (10%),a
30 psi de presión durante 7 días. Transcurrido este tiempo, se separaelcatalizadorpor filtración y se elimina el disolventepor evaporacióna vacío. El
residuo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,utilizando el sistemade eluyentesindicadoen cadacaso.
—136—
Los productosobtenidospor estosmétodos,junto con susdatosanalíticos
y de espectrometríade masas, se detallan a continuación. Los datos de114 RMN y de ‘3C RMN serecogenen las tablas23 y 24, respectivamente.
(3S,6Sky (3R,6S$3,6-Dibendil-3-metaricarbonil-2,5-dicet-opiperidina(55Wy (55b)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:57% (a partir del compuesto45a,
método A); 67% (a partir de 61, método C). Espuma. Proporción dediastercoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)2:1 (métodosA y C).
EM: 352 (M~ + 1, 12,32),351(Mt, 19,55),292(M~ —59, 21,48),260(M~ —91, 25,32),91 (Bn, 100,00), 59 (CO
2Me,6,83).
Análisis elemental(Wc) C 14 N
Calculado(C2iH2iNO4) 71,78 6,02 3,99
Encontrado 71,51 5,85 4,15
(3S,6S)-y (3WOS)-3-Bendil-6-(indol-3’-il)metil-3-metoxicarbonil-
2,5-dicetop~peridbm(56W y (56b)
La cromatografía en columna con AcOEt-hexano (1:1) condujo a la
mezclade los dos diastereoisómeros.Rendimiento: 17% (a partir de 46ab,
método A); 62% (a partir del cetodiéster62, método C). Proporción dediastereoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)2:1 (métodosA y C). La separaciónde los dosdiastereoisómerosse llevó a cabo por cromatografía preparativa encromatotrón,utilizando comoeluyenteC142C12-MeOH(200:1).
Isómero(3S,6S):56a
Espuma.
EM: 390 (Me, 4,30), 130(C91{gN, 100,00).
Análisis_elemental(Wc,> C H NCalculado(C23H22N204) 70,75 5,68 7,17
Encontrado 70,52 5,90 6,89
— 137 —
Isómero(3R,SS):56b
Espuma.
Análisis elemental(Wc) C 14 N
[alculadoC (C231422N204) 70,75 5,68 7,17Encontrado 70,46 5,88 6,95
(31?,6S)-y (3S,6S)-&Bencil.3-(etoxiearbonil)metil-3-nwtoxicarbonil-2,5-dicetopjperidina(57Wy (57b)
Eluyente: AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento: 54% (a partir del producto45a,
método A); 50% (a partir de 63, método C). Sólido blanco. Proporción de
diastereoisómeros(3R,6S)/(3S,6S)3:1 (métodosA y C).
EM: 347 (Me, 16,59),288 (M~ — 59, 63,78),256 (M~ — 91, 29,12),91 (Bn, 100,00),59 (CO2Me, 13.68).
Análisis elemental(%) C _ H NCalculado(C18H21N06) 6224 6,09 4,03
Encontrado 62,01 5,97 4,20
(31?,68)- y (3S,GS)-3-(Etoxicarbonil)metil-6-(indol-3‘-i1)metil-3-metoxiearbonil-
Z5-dicetop~ridina(58a)y (58b)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:55%(a partir del compuesto46ab,
método A); 67% (a partir de 64, método C). Espuma. Proporción de
diastercoisómeros(3R,6S)/(3S,6S)2:1 (métodosA y C).
EM: 386 (Mt, 4,56), 130 (CgH8N, 100,00).
Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalculado(C201422N206) 62,17 5,74 7,25Encontrado 62,08 6,00 7,50
— 13S—
(3$6S)-y (3W6S)-6-Bencil-3-meW-3-metadcarbonhl-2,5-dicetopiperklina(5%)y (59b)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:31% (a partir de 45a, método B);
70% (a partir del compuesto 65, método C). Espuma. Proporción
diastereoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)2:1 (métodosB y O).
EM: 275 (Mt 12,23),260 (M~ — 15, 20,41),216 (M~ — 59, 45,23), 184 (M~ — 91,29,62),91 (Bu, 100,00),59 (CO2Me,7,17).
Análisis elemental ( 6 C 14 N
Calculado(C151417N04) 65,44 6,22 5,09
Encontrado 65,24 6,18 5,13
(SS,65)-y (3W68)-6-<’Indol-3‘-il)metil-3-nwtil-3-metoxi.carbonil-2,5-dicetopiperidina(60Wy (60b)
Eluyente:AcOEt-hexano(2:1). Rendimiento:16% (a partir de 46ab,métodoA);41% (a partir de 4Bab, métodoB); 61% (a partir de 66. método C). Espuma.
Proporciónde diastereoisómeros(3S,6S)/(3R,68)2:1 (métodosA, B y O).
EM: 314 (Mt 3,38),130 (CgHsN,100,00).
Análisis elemental(%~) __ C 14 NCalculado(Cí7HisN2O4) 64,96 5,77 8,91
Encontrado 64,79 6,08 8,88
(311,65)-y(35,6S)-3-(terc4?utoxicarbonil)metil-&(indol-3’-il)metil-3-metoxicarbonil-2,5-dketopiperidina(119a)y (119b)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:79% (a partir de 118, métodoO).
Espuma.Proporciónde diastereoisómeros(3R,6S)/(3S,6S)2:1.
Análisis elemental(Wc) C 14 NCalculado(C221126N206) 63,76 6,32 6,76
Encontrado 63,61 6,60 7,01
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3.4.3. SÍNTESISDE PSEUDODIPÉPTIDOSCETOMETILÉNICOSCÍCLICOS
Ácidos(SS,68)-y (3W6S).6Z(indol-3 ‘-iDmetil-2,5-dicetopiperidina-3.carfr«ilicos (67a)y (67b)
A unadisolución de46ab(0,6 g, 2 mmoles)en MeOH (40 miL) sele añade
NaOH 2 N (1 mL, 2 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante3 h.Tras eliminar el disolvente por evaporacióna presión reducida, el residuoobtenidose disuelveen H20 (20 mL) y seacidifica hastapH 3 con 14011 N. A
continuación,se extraecon AcOEt, se secael extractoorgánicosobreNa2SO4y
se evapora el disolvente a sequedad.El residuo resultantese purifica porcromatografía en columna de gel de sílice, utilizando como eluyenteCH2CI2-MeOH (8:1) conteniendo0,1% de AcOil, para dar lugar al producto
G7ab como un sólido blanco (0,24 g, 42%). Proporción de diastereoisómeros
(3S,68)/(3R,GS)3:1 -
½iRMIN (300MHz, DMSO-d6):
Isómero(38,65):a 10,93 (s, 1 14, NH~), 7,50-6,88(m, 6 14, In y 14-1), 4,07 (m, 1 14, 14-6), 3,20 (dd.
1 14, H-7, J 14,6y 5,0), 3,02 (m, 2 14, 14-3y H-7), 2,61 (dd, 1 14, 14-4, J = 16,4y 7,0),
2,21(dd, 1 14, 14-4,J = 16,4y 5,5).
Isómero(3R,65):
8 10,75 (s, 1 14, NS), 7,50-6,88(ng 6 14, In y 11-1), 4,15 (m, 1 14, 14-6), 3,72 (dd,1 14,14-3,J 110,4 y 5,6), 3,13(m, 1 14, 14-7), 3,02(m, 1 14, 14-7), 2,65(dd, 1 H, 14-4,J = 16,6y 5,6),2,41 (dd, 1 II, 14-4, J = 16,6y 10,4).
130 RMiN (75 MHz, DMSO-d6):
isómero(35.68):8 206,85(C-5), 177,08(00214),170,57(0-2), 135,96, 127,35, 124,56,120,87,118,66,
118,40, 111,36, 108,73(In), 59,97(0-6), 50,79(0-3), 27,59(0-7).Isómero(3R,6S):
a206,85(0-5), 177,02(00214), 171,73(0-2), 135,96,127,27, 124,28, 120,77. 118,93,
118,34, 111,22,108,73,(In), 59,97(0-6), 50,79(C-3), 27,59(0-7).
EM: 242 (M~ —44, 3,64),130 (09145N,100,00).
— 143
Análisis elemental(%) O H N
Calculado(C15H14N204) 62,93 4,93 9,79
Encontrado 62,66 5,15 9,64
cicloflYp ‘4COCHy2JGIy] (69)
Se calienta a reflujo durante 2,5 h una disolución de 67ab (0,2 g,0,7 mmoles) en dioxano (20 mL). Despuésde eliminar el disolvente por
evaporacióna vacío, el residuo obtenido se purifica por cromatografíaencolumna de gel de sílice, utilizando como sistemade elución CHCI3-MeOH
(10:1), paradar lugar al producto69 (0,07 g, 41%) en forma deespuma.
‘H RMiIN (300 MHz, DMSO-d6): 6 10.92 (s, 1 14, NH~), 7.73 (d, 1 14. cx-NH-Trp,J = 2,1), 7,48-6,93(m, 5 14, In), 4,07 (m, 1 14. cí-Trp), 3,19 (dd, 1 14, 3-Trp, J = 15,9
y 5,3), 3,02 (dd, 1 14, f3-Trp, J = 15,9 y 5,1), 2,51 (m, 1 14, cz-Gly), 2,25 (m, 1 14,
000142),2,11 (m, 1 H, 000142),1,78 (m. 1 14. cz-Gly).
13C RJYTiN (75 MHz, DMSO-d6): 6 208,02(COCH2), 170,77(CONH), 135,98, 127,14,
124,55,120,99,118,66,118,50, 111,32,108,83(In), 60,77(ct-Trp), 35,38(000142).28,51,y 28,21 (a-Glyy ~B-Trp).
EM: 242 (Mt 3,50), 130(C9HgN, 100,00).
Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalculado(0141414N202) 6941 5,82 11,56
Encontrado 69,35 5,99 11,50
ciclo[Phe tflCOCHJ~arnbo.Phe](7Oab)
A unadisolucióndel compuesto55ab(0,35 g, 1 mmol) en dioxano(20 mL)se le añadeNaOH 2 N (0,5 mL, 1 mmol) y se agita bajo atmósferade argóndurante3 h. Despuésde eliminar el disolvente por evaporacióna presiónreducida,el residuoresultantese disuelveen 1420 (10 mL) y se acidíficahasta
pH 3 con 1401 1 N. A continuación se extraecon AcOEt, se seca el extractoorgánico sobre Na2SO4 y se evaporacl disolventea sequedad.El crudo de
reacción obtenido se disuelve en dioxano (25 mL) y se calienta a reflujo
144—
durante5 h. Tras eliminar el disolvente, el residuo obtenido se purifica por
cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando AcOEt-hexano(1:2) comoeluyente,paradar lugar al producto7Oabcomoun sólido blanco(0,18 g, 63% apartir de 5Sab).Proporcióndediastereoisómeros(3R,68)/(3S,6S)2:1.
‘H RMN (300 MHz, DMSO-d@):
Isómero (3R,6S):8 7,87 (s, 1 H, KB), 7,25-6,96(m, 10 14, 06145),4,26 (m, 1 14, u-Phe1),2,96-2,80(m,4 14, a-Phe2,[3-Phe1,3-Phe2),2,28 (dd, 1 14, 000142,J = 16,6 y 5,4), 2,10 (m, 1 14,j3-Phe2),1,85(m, 1 14, COCH
2).
Isómero (3S,6S):8 7,92 (4, 1 14, NH, J = 2,0),7,25-6,96(m, 10 14, C6145),4,04 (m, 1 14, cx-Phe
1),3,08(dd, 1 14, 13-Phe’,J = 13,4y 4,9), 2,96-2,80(m, 2 H, I3-Phe’ y 13-Phe2),2,49(m, 1 H,
ct-Phe2),2,41 (dd, 1 14, g-Phe2,J = 14,2 y 9,3), 2,32(m, 1 H, COCI-{2), 1,94 (dd, 1 14,
COCH2,J = 16,2y 4,4).
EM: 293 (Mt 44,97),202(M~ —91, 5,39), 91 (Bn, 100,00).
Análisis elemental(Wc) O 14 N
Calculado(C191419N02) 77,79 6,53 4,77
Encontrado 77,60 6,70 4,53
—145—
Análisis elemental(%) C 14 N
Calculado(015H24N205) 57,68 7,74 8,99Encontrado 57,71 7,63 8,67
3.5. SÑTESIS DE3-OXOINIJOLIZIIDINAS
3.5.1. SÍNTESISDE 8-(terc-BUTOXJCARBONIL)AMJNO-
2-METOXICARBONJL-3-OXOINDOLIZIDJNAS
Procedimientogeneral:
A una disolución del 4-cetodiéster72 u 80 (5 g, 10 mmoles) en MeOH
(200 mL) se le añadeun 10% de Pd-C (10%) y la suspensiónse hidrogenaa
temperaturaambientey 30 psi de presióndurante4 h. Una vez separadoel
catalizadorpor filtración, se elimina el disolventey el residuoresultantese
purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice, utilizando comosistema de eluyentesAcOEt-hexano (1:1), obteniéndoseen cada caso los
productosque se describena continuación.
(211$8StSaR*).y (2RS,8St8aS*).8.(terc.Butoxicarbonll)amino~2-metoxicarbonil-3-oxoindoflzidina(‘73ab)y (‘73c4>
Rendimiento:2,96 g (95%).Espumablanca.
HPLC: tR = 9,95 y 10,46mm; eluyenteA (30:70);columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc) O 14 NCalculado(C15H24N205) 57,68 7,74 8,99Encontrado 57,50 7,38 8,75
(2RS8Rt8aS*).y (211$8Rt8aR*)~8~(terc.Butoxicarboni1)wnino~2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidina(Slab) y (8lcd)
Rendimiento:2,92g (94%).Espumablanca.
Los datosde 111 RMN y 130 RMN de estoscompuestosseindican en las
tablas25 y 26, respectivamente.
—146—
35.2. PREPARACIÓN DE 8-(terc-BUTOXICARBONIL)AMINO-
3-OXOINDOLIZIDINA
Ácidos (2RSSSS8aR*).y (211$8S*,8aS*).8.(terc.butaricarbonil)wnino~3-aroindolizidinar2-carboxí-lieos(‘YOab) y (‘76cd)
Procedimiento1: Hidrólisis del compuesto73
A unadisoluciónde 73 (0,72 g, 2,8 mmoles)en MeOH (lOiniL) sele añadeNaOH 2 N (1,5 miL, 3 mmoles)y se agitaa temperaturaambientedurante1 h.Tras eliminar el disolvente por evaporacióna presión reducida, el residuoobtenidose disuelveen 1420 (10 mL) y se acidifica hastapH 3 con BOl 1 N. A
continuacionse extraecon AcOEt, se secael extractoorgánicosobreNa2SO4y
se evaporael disolventea sequedad,obteniéndoseel producto 76 en forma desólidoblanco(0,61 g, 90%).
Procedimiento2: Hidrogenacióndel 4-cetodiácido77
A una disolución del 4-cetodiéster72 (2,5 g, 5 inmoles)enMeOH (50 mL)
se le añadeNaOH 2 N (5 mL, 10 mmoles) y se agita a temperaturaambiente
durante 2 h. Despuésde eliminar el disolvente por evaporacióna presiónreducida,eí residuoresultantesedisuelveen H20 (30 mL) y se acidifica hasta
pH 3 con HCl 1 N. A continuaciónse extraecon AcOEt, se secael extractoorgánico sobre Na2SO4y se evaporael disolventea sequedad.El crudo de
reacciónobtenido se disuelveen MeOR (100 niL) y la disolución se hidrogenaa
temperaturaambiente,en presenciade un 10% de Pd-C (10%), a 30 psi de
presión durante4 h. Transcurridoestetiempo, se separael catalizadorpor
filtración y se elimina el disolventepor evaporacióna vacío para dar lugar al
producto76 (sólido blanco,1,4 g, 94%).
EM: 299 (M~ + 1, 0,05), 298 (Mt, 0,07), 254 (M~ —44, 1,11), 197 (M~ — 101, 2,35),181 (Mi— 117, 22,03),151 (Mt— 147, 1,02), 137 (Me— 161, 100,00),57 (tBu, 81,61).
Análisis elemental (Wc) 0 14 NCalculado(C14H22N205) 56,36 7,43 9,39Encontrado 56,21 7,79 9,07
— 147—
Los datosde 1H RMN y 130 RMN de estecompuestoseencuentranen las
tablas25 y 26, respectivamente.
(8St8aR*)~y (8St8aS*).&(terc.Butat~icarbonU)amino~3-oxoindoilzidina(78a)y (178b)
Se calienta a reflujo durante 15 h una disolución de 76 (0,43 g. 1,4
mmoles) en dioxano (25 mL). Después de eliminar el disolvente por
evaporacióna vacio, se obtiene el compuesto78, constituidopor una mezclade
dos diastereoisómerosen proporción 12:1, determinadapor HPLC [Eluyente B
(25:75); columnanúm. 2]. La cromatografíaen columnade gel de silice con e]
sistema de eluyentesCH2CI2-MeOH (40:1) conducea la separaciónde los dos
diastereoisómeros,que se describena continuación.
Isómero(8St8aS*):78b
Rendimiento:20 mg (5,5%). Espuma
HPLC: tR = 10,94mm; eluyenteB (25:75);columnanúm. 2.
Isómero(8St8aR*): 78a
Rendimiento:260 mg (71%). Espuma.
HPLC: tR = 12,39mm; eluyenteB (25:75);columnanúm. 2.
Análisis elemental(Wc,> O 14 N
Calculado(C13H22N203) 61,39 8,72 11,01Encontrado 61,43 8,59 10,75
Los datosde 114 RMN de estoscompuestosestánrecogidosen la tabla 25.
— 143 —
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3.5.3. SÍNTESISDE S-(terc-BUTOXICARBONIL)AMINO-2-METOXICARHONJL-
3-OXO1NDOLIZJDJNAS 2,2-DISUSTITUIDAS
3.5.8.1. Preparacióndederivados2-bencil,,2-etoxicarbonilinetil
y2-terc-butoxicatbonilmetil sustituidos
Procedimientogeneral:
A una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina 73 u 81 (1,56 g,
5 mmoles) y NaMeO o NaH (8,5 mmoles)en DME o THF (40 mL) sele añadeel
agentealquilantecorrespondiente,bromurode bencilo,bromoacetatode etilo obromoacetatode terc-butilo (8,5 mmoles). Despuésde agitar a temperatura
ambientedurante2 h, se elimina el disolventey el residuoresultantese extraecon AcOEt y se lava con 1420 y con disolución saturada de NaC1,sucesivamente.La fase orgánica se secasobre Na2SO4 y, tras eliminar el
disolvente,sepurifica el residuoobtenidopor cromatografíaen columnade gelde sílice, utilizando como eluyenteel sistemaquese especificaen cadacaso.
Los productos obtenidos por este procedimiento se detallan a
continuación.Los datosde 114 RMN y 150 RMN serecogenen las tablas27 y 28,respectivamente.
Alquilación de 73 con bromurode bencilo
(2St8St8aS*).2.Bencil~8~(terc-butoxicarbonibamino-2-metoxi-carbonll-3-oxoindolizidina(82c)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:4,5%. Sirupe.
HPLC: tR = 17,83 mm; eluyenteA (45:55);columnanúm. 1.
Análisis elemental(%,> 0 14 NCalculado(C22H30N205) 65,65 7,51 6,96Encontrado 65,48 7,71 6,76
— 151—
(2Rt8St8aR*).2.Bendil~8.(terc~butoxicarbonh1)cunino.2.metoxicarbonll.3-oxoindolizidina(82W
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:50%. Espumablanca.
HPLC: t~ = 15,56mm; eluyenteA (45:55);columnanúm. 1.
EM: 402 (Me, 0,54),345 (M~ — 57, 1,57), 285 (M~ — 117, 100,00), 226 (M~ — 176,9,39), 194 (M~ —208,98,70),91 (Bn, 34,14),57 (tBu, 31,93).
Análisis elemental(Wc,> 0 14 N 2
6,96Calculado(CnHsoN2O5) 65,65 7,51Encontrado 65,52 7,70 7,02
(2St8SS8aR*).2.Bendll.8~(terc.butcxricarboniVwnino-.2-.metoxicarboniJ-.3-aroindolizidina(82b)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendmiento:10,3%.Espumablanca.
HPLC: t~ = 16,63mm; eluyenteA (45:55);columnanúm. 1.
Análisis elemental(%) 0
KÑlculadoO (C22H30N205) 65,65Encontrado 65,73
14 N
7,517,38 6,966,98
Alquilación de 81 con bromuro de bencilo
(2Rt8Rt8aR*)~2.Bencil.84terc.butoxicarboniVamino-.2~metoxicarbonit3-ojwindolizidina(87c)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:4,5%. Sirupe.
Análisis elemental (Wc)
0 14 N
Calculado(C22H30N205) 65,65 7,51 6,96Encontrado 65,67 7,65 6,82
— 152 —
(2SS8Rt8aS*).2~Bencil.8.(terc~butoxiearboniOwnino.2-.metoxicarbonh1.
3-oxoindolizidina(87W
Eluyente:AcOEt-bexano(1:2). Rendimiento:55,6%.Espumablanca.
Análisis elemental (%) 0 14 NCalculado(0221430N205) 65,65 7,51 6,96Encontrado 65,38 7,69 6,91
(2RS8Rt8aS*).2.Bendil~8.(terc-.butoxicarbonhl)amino.2~nwtoxicarbonil.3-ornindolizidina (8Th)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:10,0%.Espumablanca.
Análisis elemental(Wc) 0 14 N
Calculado(C22H30N205) 65,65 7,51 6,96Encontrado 65,64 7,63 6,88
Alquilación de 73 con bromoacetatode etilo
(2St8St8aRt)-, (2Rt8SSSaR*)- y (2Rt8St8aS*).8.(terc.ButavicarboniDwnino~
2-(etoxicarbonll)metil-2-metoxicarbonil-3-o.windolizidina(84W, (Mb) y (84c)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Se obtieneunamezclade tres diastereoisómeros.
Rendimiento: 59%. Sólido blanco. Proporción de diastercoisómeros(2S*,8S*,8aR*)/(2R~~,8S%,8aRt5:1; (2R~<,8S*,8a&),trazas.
HPLC: tR = 10,55mm; eluyenteA (30:70);columnanúm. 3.
EM: 367 (M~ —31, 1,20), 353 (M~ —45, 5,38),281 (M~ — 117, 64,10),222(M~ — 176,
100,00),194(M~ —204, 19,76),150 (M~ —248, 5,61),57 (tBu, 80,79).
Análisis_elemental(%,>
Calculado(C19H80N207)
0 14 N
57,27 7,59 7,03Encontrado 57,21 7,41 6,95
153—
Alquilación de 73 con bromoacetatode terc-butilo
(‘2St8St8aR*$y (2W’,8St8aRt>-8-(terc-Butoxicarbonll,>amino-2-(terc-butoxicarboniflnwtil-2-nwtaricarbonil-3-aroindolizidina(132Wy (132b)
Eluyente: AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento: 70%. Espumablanca. Proporción
de diastercoisómeros(2S*,8St8aRt/(2R*,88*,8aR*)5:1.
Análisis elemental(Wc,> O H NCalculado(C21H34N207) 59,14 8,04 6,57Encontrado 58,97 8,04 6,68
35.32. Obtención de derivados 2-(indol-3’-il)metll sustituidos
A una disolución de 73 (1,56 g, 5 mmoles)en DME (40 mL) se le añaden
NaMeO recientementepreparado(324 mg, 6 mmoles), gramina (871 mg,
5 mmoles)y 0H31 (0,63 mL, 10 mmoles).Tras agitarprimero durante15 mm a
o oo y, después,a temperaturaambientedurante2,5 h, se elimina el disolvente
y el residuo resultantese extraecon AcOEt y se lava, primero con ~ y
despuéscon disolución saturadade NaCí. La fase orgánica se secasobreNa2SO4y se evaporael disolvente a sequedad.El residuo obtenido se purifica
por cromatografía en columna de gel de sílice con el sistema de eluyentes
AcOEt-hexano (1:1), obteniéndoseuna mezclade tres diastereoisómeros.La
cromatografíaen placa preparativa,utilizando como eluyente AcOEt-hexano
(1:2) conducea la separaciónde los mencionadosdiastereoisómeros.
(2St8St8aS*).8.(terc.Butoxicarboni.ikzmino~2~(indol.3t~il)meti1.
2-metoxkarbonll-3-oxoindolizidina(83c)
Rendimiento: 4,3%. Espuma.
HPLC: tR = 19,11 mm; eluyenteA (40:60); columnanúm. 1.
— 154—
Análisis elemental (Wc,> O 14 N1
Calculado(C,24H31N805) 65,29 7,08 9,52Encontrado 65,44 6,95 9,26
(2St8St8aR*)~8.(tere-Bzaaxicarbonil)amino-2-(indol-3‘-¡1)metil-2-metaricarbonil-3-avoindolizidina(SSb)
Rendimiento:8,5%. Espuma.
HPLC: tR = 17,48mm; eluyenteA (40:60);columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc) 0 14 N
Calculado(C24H31N305) 65,29 7,08 9,52Encontrado 65,34 7,19 9,62
(2RtSStSaR*)-8-(terc-Butoxicarbonll)amino-2-(indol-3-iDmetil-2-metoxicarbonll-3-axvindolizidina(8%)
Rendimiento: 45,2%.Espuma.
HPLC: tR = 17,18mm; eluyenteA (40:60);columnanúm.1.
Análisis elemental(Wc) 0 14 NCalculado(C24H31N305) 65,29 7,08 9,52Encontrado 65,13 7,21 9,47
Los datosde 114 RMN y 130 RMN de los tres diastereoisómeros83a,83b y
83c seindican en las tablas27 y 28, respectivamente.
— 155—
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3.&3.3. Preparaciónde8-(terc-butoxicarbonil)andno-2-carboxi-3-oxoindoliñdinas2,2-disusfituidas
Procedimientogeneral:
A unadisolucióndel derivadode 3-oxoindolizidina82a,82b, 82c, 87a,87b,83a,83b ó 132ab(0,3 mmoles)en MeOH (5 miL) sele añadeNaOH 2 N (0,23 mL,
0,45 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante2 días.Tras eliminarel disolventepor evaporacióna presiónreducida,el residuoobtenido sedisuelve
en H20 (10 mL) y se acidifica hastaPH 3 con 1401 1 N. A continuaciónse extrae
con AcOEt, sesecael extractoorgánicosobreNa2SO4y seevaporael disolvente
a sequedad.El residuoresultantesepurifica por cromatografíaen colunma degel de sílice en los casosen quese especifica.
Los productos obtenidos por este procedimiento
continuación.Los datosde 114 RMN serecogenen la tabla 29.
Ácido (2Rt8St8aR*).2~bencil~8~(terc.butoxiearbonil)amino.
3-oxoindolizidino~2-carboxilico(85W
Rendimiento: 98%. Espumablanca.
HPLC: tR = 17,00 mm; eluyenteA (35:65);columnanúm. 1.
Análisis elemental (Wc,> 0 14 NCalculado(C21H2sN2O5) 64,93 7,27 7,21Encontrado 64,94 7,33 7,00
Ácido (2SS8SS8aR*).2-bencil-8-(ten,-butoxicarbonil)amino-.
3-cxoindolizidina-2-carbarílico(85b)
Rendimiento: 96%. Espumablanca.
HPLC: t~ = 19,03 mm; eluyenteA (35:65);columnanúm. 1.
Análisis elemental (%) 0 14 N1Calculado(0211428N205)Encontrado
64,9364,82
7,277,43
7,217,15
se detallan a
— 159—
Ácido(2St8SS8aS*)-2-bendd-8-(terc-bu-toxicarbonil)amino-3-avoindolizidina-2-carboxilico(SSe)
Rendimiento:96%. Espumablanca.
HPLC: tR = 18,30 mm; eluyenteA (35:65);columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc) 0 14 N
Calculado(021H28N205) 64,93 7,27 7,21Encontrado 64,75 6,96 7,45
Ácido (2St8Rt8aS*)~2~bencil.8.(terc~butoxicarboniDamino.3-aniñndolizidin«-2-carbox‘leo (88W
Rendimiento:97%. Espumablanca.
Análisis elemental(Wc) 0 14 N
Calculado(C21H28N205) 64,93 7,27 7,21Encontrado 64,75 7,56 7,08
Ácido (2Rt8RS8aSt>-2-bendil-8-(tere-butoxicarboni?)amino-3-oxoindnlizidñuz-2-carboxdico(88b)
Rendimiento:98%. Espumablanca.
Análisis elemental(Wc,> O 14 NCalculado(C21H28N205) 64,93 7,27 7,21
Encontrado 64,72 7,03 7,38
Acido (2RSBSt8aR*)-8-(tec-butox’icarbonil)amino-2-(indol-3-ll)metll-3-acoindolizidin-a-2-earb<yxílieo(86a)
Purificado por cromatografíaen columna. Eluyente:C142C12-MeOH(10:1).
Rendimiento:84%, Espuma.
— 160 —
HPLC: tR = 15,38mm; eluyenteA (35:65);columnanúm. 1.
Análisis elemental(%) 0 14 N 29,83Calculado(C23H29N505) 64,62 6,84
Encontrado 64,28 6,67 9,50
Ácido (2St8St8aR*).8~(t>erc~butoxicarbonll)wnino~2.(indol.3.il)nletll~3aroindolizidinor2-carboxílieo(861>)
Purificado por cromatografíaen columna.Eluyente:C142C12-MeOH(10:1).
Rendimiento:82%. Espuma.
HPLC: t11 = 16,05mm; eluyenteA (35:65); columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc) 0 14 NCalculado(C231429N305) 64,62 6,84 9,83Encontrado 64,45 6,72 9,95
Ácidos(2St8St8aR*$y (2Rt8St8aR*)~8~(terc-butoxicarbonll)amino-
2-(terc-.butoxicarbonWmetil-3-oxoindolizidina-2-.carboxilicos(13%) y (133b)
Rendimiento: 98%. Espuma blanca. Proporción de diastereoisómeros(28*,88*,SaJt)/(2Rt8S’t8aR’*) 5:1.
Análisis elemental(%,> O 14 NCalculado(C20H32N2O-¡) 58,24 7,82 6,79Encontrado 58,10 8,01 6,90
— 161—
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3.5.4. PREPARACIÓNDE DERIVADOS DE MTPA
3.5.4.1. Reaccionesdederivatízación conelácido(R)-(+)-a-metoxi-u-(Úifluorometil)fenilacéúco
Procedimlento general:
A una disolución del 4-cetodiéster72 u 80 ó del derivado de 3-oxo-indolizidina 82a, 87a, 82bu 87b (0,25 mmoles)en C142C12(4 mL) se le añade
TEA (2 mt) y se agita a temperaturaambientedurante1 lv Tras eliminar eldisolventepor evaporacióna presión reducida,el residuoobtenido se disuelve
en CH2Cl2 (5 mt) y se añadenTEA (0,07 mt, 0,5 mmoles) y, a continuación
BOP (122 mg, 0,28 mmoles). Tras 10 mm de agitación, se añadeel reactivo
quiral, (R)-(±)-MTPA(64,5 mg, 0,28 mmoles).Despuésde agitar durante5 h a
temperatura ambiente, se elimina el disolvente y el residuo resultante se
extraecon AcOEt y selava,primero con H20 y despuéscon disoluciónsaturada
de NaCL. La fase orgánica se secasobreNa2SO4 y se elimina el disolvente.El
residuo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,
utilizando el sistemade eluyentesque seespecificaen cadacaso.
Los productos obtenidos por este procedimiento se describen a
continuación.
(5S,2¶?)-8-(BendiloxicarboniVwnino-2-metoxicarbonil-5-(2’-metcix¡-
2’.trifluorometil)fenilacetamido-4-oxooctanoatodemetilo (89)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:61%. Sirupe.
HPLC: t11 = 11,69 mm; eluyenteA (50:50); columnanúm. 3.
Análisis elemental(%) C 14 NCalculado(C291433F6N209) 57,05 5,45 4,59Encontrado 57,17 5,63 4,32
— 164—
(5E<,2’IR) -8-(Benciloxicarboniflamino-2-metaricarbonil-5-(2-metari-2’-trifluorometil)fenilacetamido4omoctanoatodemetilo (90)
Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:41%. Sirupe.
HPLC: tp = 11,69mm; eluyenteA (50:50);columnanúm. 3.
Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalculado(C29H33F3N209) 57,05 5,45 4,59Encontrado 56,91 5,55 4,47
Los datosde 114 RMN de los compuestos89 y 90 seindicanen la tabla30.
(21R,SS,8a11,2‘11)- y (28,SW8a$2’RF2-BenciU2-metaricarbonW8-(2’-metari-
2’-trifluorometll)fenilacetamido-3-ornindolizidina(91W y (91b)
Eluyente: AcOEt-hexano (1:1). Rendimiento: 62%. Espuma blanca.proporción de diastereoisómerosobtenida en función de la procedenciadelproductode partidaseindica en la tabla 6.
HPLC: ½= 51.75 mm [isómero (2R,8S,8aR,2R)]; 56,61 mm [isómero(2S,SR,8aS,2’R)];eluyenteA (35:65); columnanúm.3.L Análisis elemental (%)Calculado (C271429F3N205)Encontrado C 14 N1
62,5462,48
5,645,71
5,405.39
(2S.8S,8aPs2rPJ~y (2R,SR,SaS,2’P0-2-Rencil-2-metoxicarbonil-842’-metoxi.2’-trifluorometil)fenil-acetamido-3-awindolizidina(92W y (92b)
Eluyente: AcOEt—hexano (1:1). Rendimiento: 61%. Espuma blanca. La
proporciónde diastereoisómerosobtenidase indica en la tabla6.
HPLC: t~ = 22,53 mm [isómero (2S,8.S, SaR,2 ‘R)]; 24,88 mm [isómero
(2R,SR,8aS,2Rj;eluyenteA (40:60); columnanúm. 3.
La
— 165—
[Análisis elemental(Wc) C H NCalculado(C27H29F5N205) 62,54 5,64 5,40Encontrado 62,61 5,89 5,47
Los datos de 114 RMN de los compuestos9lab y 92ab se encuentran
recogidosen la tabla 31.
3.5.4.2. Reaccionesdederivatizaciónconelclorurode (S)-(+)-ó (R)(-)-&metoxi-cz-(tiifluorometil)fenilacetilo
Procedimientogeneral:
Una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina 82a u 87a (3,2 mg,
8 gmoles)en TFA (200 iL) seagita a temperaturaambientedurante2 h. Tras
eliminar el disolvente,el residuoobtenido se disuelve en piridina (0,5 mt). seañadeel reactivo quiral correspondiente(30 gL, 160 imoles) y la disolución seagRa a temperatura ambientedurante 1,5 h. Transcurrido este tiempo, se
adicionaH20 (25 gL) y, a continuación,se evaporael disolvente.La proporción
de diastereoisómerosse determinaen el crudo de reacción, medianteHPLC,
obteniéndoselos resultadosque se especificanen la tabla 6.
En las reaccionescon (R)-(—)-MTPA-Cl se obtienen los compuestos
(2R,8S,8aR,2’S)-y (28,8R,SaS,2’S)-2-bencil-2-metoxicarbonil-8-(2-metoxi-2-tri-
fluorometil)fenilacetamido-3-oxoindolizidina(93a) y (93b), enantiómerosde91b
y 91a, respectivamente.
— 166—
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3.5.5. OBTENCIÓNDE DERIVADOS DE Sa-HIDROXiI- Y 8a-ALCOXI-8-AMINO-3-OXOINIDOLIZIDINA-2-CARBOXILATO 2-SUSTITUIDOS
3.5.5.1. Reaccionesdehidrogenacióndel2-bencil4cetodiéster
derivado deBoc-Orn(Z)-OH
MétodoA: Reacciónen MeOH
A una disolución del compuesto94 (2,3 g, 4 mmoles)en MeOH (140 mL)sele añaden230 mg de Pd-C(10%) y la suspensiónsehidrogenaa temperatura
ambientey 30 psi de presióndurante4 h. Una vez separadoel catalizadorpor
filtración, se elimina el disolvente y el residuo resultante se purifica por
cromatografía en columna de gel de sílice, utilizando como sistema de
eluyentesC142C12-MeOH(50:1), obteniéndoselos productosque se indican a
continuación.
Ácido (2S,8S,8aP0-2-bencil-S-(terc-butoxicarbonll)amino-8a-metoxi-3-oxoindolizidina-2-carboxllico(95)
Rendimiento:1,04 g (63%). Espumablanca.
HPLC: t11 = 9,89 mm; eluyenteA (70:30);columnanúm. 1.
EM: 374 (M~ —44, 0,1), 342 (M~ — 76, 7,85),286 (M~ — 132, 100,00),242 (M~ — 176,
24,26),227 (M~ — 191, 1,79), 195 (M~ —223, 14,31),150 (M~ — 268, 18,60),91 (Bn,
Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C221430N206) 63,14 7,23 6,69
Encontrado 62,89 7,35 6,70
Acido (2S,8S,8aS)-2-ben-cil-8-(terc-butoxicarbonll)amino-<Sa-hidroxi-3-.oxoindolizidina-2-carboxilico(96).
Rendimiento: 0,26 g (16%). Espumablanca.
— 169—
HPLC: tR = 7,48 mm; eluyenteA (70:30); columnanúm. 1.
EM: 342 (M~ —62, 6,07),286 (M~ — 118, 67,32), 242 (M~ — 162, 12,35).227 (M~ —
177, 100,00),195 (M~ — 209,7,04), 150 (M~ — 254, 13,01), 136 (M~ —268, 6,04), 91
(Bn, 28,05),57 (tBu, 64,00).
Análisis elemental (Wc) C 14 N
Calculado(C211428N206) 62,36 6,98 6,93
Encontrado 62,04 7,31 6.85
MétodoB: ReacciónenEtOH
Una disolución del compuesto94 (0,8 g, 1,4 mmoles)en EtOH (50 mL) se
hidrogenaen presenciade un 10% de Pd-C (10%) en las mismas condiciones
descritaspara el métodoA. Tras la aplicación de un procedimientototalmente
análogo,se obtienenlos productosque seindican a continuación.
Ácido (28,8S,8aP0-2-bencil-8-(terc-butoxicarbonil)amino-8a-etavi-
3-arnindolizidána-2-carboxilico(99)
Rendimiento:0,37 g (61%). Espumablanca.
HPLC: t~ = 12,93 mm; eluyenteA (70:30); columnanúm. 1.
Análisis elemental (Wc) C 14 N
Calculado(CnH32N2O6) 63,87 7,46 6,48
Encontrado 63,49 7,61 6,36
También se obtiene un compuestode menor Rf identificado como 96
(116mg, 21%).
MétodoC: Reacciónen disolventesapróticos
Una disolución del 4-cetodiéster94 (lg, 1,7 mmoles) en AcOEt o THF
(60 mL) se hidrogenadurante20 h en las mismascondicionesdescritaspara
—170—
los métodos A y B. Despuésde separarel catalizador por fi]tración y de
eliminar el disolvente,el residuoresultantese purifica por cromatografíaencolumna de gel de sílice con el sistema de eluyentesAcOEt-bexano(1:1),
obteniéndoseel compuestoqueseindica a continuación.
(2S8S,8aS$2.Bendll4(telrrbutaxicwtonil)amino-SadlidrarV2-metoxicarbonil-3-oxoindollzidina(98,)
Rendimiento:0,6 g, 83% (AcOEt); 0,57g, 79% (THF). Espumablanca.
HPLC: tR = 11,56 mm; eluyenteA (70:30);columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc) C 14 N
Calculado(C221430N206) 63,14 7,23 6,69
Encontrado 63,28 7,42 6,54
Los datosde 114 RMN y de13C RMN de los productosobtenidosen estas
reaccionesde hidrogenaciónserecogenen las tablas32 y 33, respectivamente.
(2S,BS,SaP0-2-Bendil-8.(terc-butor¡carbonil)amino-Barmetaxi-2-metoxicarbonil-3-aroindoliz¡dina (97)
A una disolución, enfriada a O o>C, de una mezclade los compuestos95 y
96 en proporción 4:1 (0,9 g, 2,1 mmoles) en THF (20 mL) se le añadeuna
disolución etéreade C142N2 (generadoa partir de 0,5 g de N-metil-N-nitroso-
urea). Después de agitar durante 1 h, se eliminan los disolventes por
evaporacióny el residuo resultantese purifica por cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando AcOEt-hexano(1:2) como eluyente,obteniéndoseel
producto97 como una espumablanca.Rendimiento:0,53 g (56%).
HIPLC: tR = 19,25mm; eluyenteA (70:30);columnanúm. 1.
EM: 433 (M~ + 1, 4,59),432 (Mt, 19,59),400 (M~ —32, 2,52), 376 (M~~ —57, 7,87),
345 (M’ —87, 29,70),317 (M~ — 115, 70,33),149 (M~ —283, 5,05), 91 (Bn, 57,66),57 (tBu, 88,15).
— 171 —
Análisis elemental(%) C H N
Calculado(CnHa2Nj=06) 63,87 7,46 6,48Encontrado 63,70 7,57 6,60
Tambiénseobtieneel compuesto98 (0.13g, 15%).
(2S,8S,8aP0-2-Bendll-84terc-butoxicarbonil)amino-8a~etoxi-2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidina(100)
A una disolución, enfriada a O 0C, de una mezclade los compuestos99 y
96 en proporción3:1 aproximadamente(0,18g, 0,4 inmoles)en THF (5 mL) sele
añadeuna disolución de CH2N2 en éteretílico (generadoa partir de 0,1 g dc
N-metil-N-nitrosourea).Trasagitar durante1 h a la temperaturaindicada,se
eliminan los disolventespor evaporacióny el residuoobtenido se purifica porcromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando AcOEt-hexano(1:3) comoeluyente,paradar lugar al producto 100 en forma de espuma.Rendimiento:0,12 g (64%).
HIPLC: t~ = 27,23 mm; eluyenteA (70:30);columnanúm. 1.
Análisis elemental(%) C II NCalculado(C241434N206) 64,55 7,67 6,27
Encontrado 64,51 7,43 6,12
Tambiénseobtieneel compuesto98 (34 mg, 19%).
En las tablas32 y 33 se detallan los datos de 114 RMN y RMN,
respectivamente,de los productos obtenidos en estas reacciones de
esterificación.
—172—
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3.5.5.2. Reaccionesdereducciónde8a-hidroxi-y 8a-alcoxi-3-oxoindolizidinas
Reducciónde los compuestos82a, 82by 100 conLiAlH4
Procedimientogeneral:
A una disolucióndel correspondientederivadode 3-oxoindolizidina82a,821> ó 100 (0,3 mmoles)en THF (10 mt) se le añadeLiAI}14 (0,9 inmoles)y se
calienta a reflujo durante6 h. Tras neutralizarcon UCí 1 N, se elimina eldisolventepor evaporacióny el residuoresultantese extrae con AcOEt y selava, primero con 1420 y despuéscon disolución saturadade NaCí. El extracto
orgánicosesecasobreNa2SO4y seevaporaa sequedad.
Los productos obtenidos por este procedimiento se detallan acontinuación.Los datosde 114 RMN y
13C RMN seindican en las tablas34 y 35,respectivamente.
(2St8S*,8aR*).2.Bendil.8~(terc~butox¡earbonU)wnino~2-hidroximetil-3-oxoindolizidin.a(103)
Rendimiento:90%. Espumablanca.
HPLC: ¼= 6,12mm; eluyenteC (35:65);columnanúm. 3.
(2Rt8St8aR*)~2.Bendll.8.(terc~butoxicarbonll)amino~2-hidroximetil-3-oxoindolizid¡na(104)
Rendimiento:80%. Espumablanca.
HPLC: tp = 5,51 mm; eluyenteC (35:65);columnanúm. 3.
— 175—
(2R,8S,8aPJ-2-Bendil-8-(terc-butoxicarbonll)amino-8a-eto-xi-2-h¡droxinwtil-3-oxoindolizidina(105)
Rendimiento:77%. Espuma.
HPLC: t11 = 12,49mm; eluyenteC (40:60);colunmanúm. 3.
Reduccióndel compuesto98 con NaBH4
A una disolución del derivado do 3-oxoindolizidina 98 (125 mg,0,3 mmoles) en THF (10 mL) se le añadeNaBH4 (34 mg, 0,9 mmoles)y se.
calientaa reflujo durante6 h. Tras eliminar el disolventepor evaporación,elresiduoobtenidose disuelveenAcOEt y seJava,primerocon 1420 y despuéscon
disolución saturadade NaCí. El extractoorgánico se secasobreNa2SO4y se
evaporael disolvente.El residuo resultantese purifica por cromatografíaencolumnade gel de sílice con el sistemade eluyentesque se especificaen cadacaso,para dar lugar a los productosquese detallana continuación.
(2W8S8aS)-2-Beiwit8-(terc-butoxicarbonil)aniino-Radddravi-2-hidroxinwtil-3-oxo¡ndolizidina (101) o
Eluyente:C112C12-MeOH(50:1). Rendimiento:25 mg (20%). Sirupe.
Análisis elemental(Wc) C 14 N
Calculado(C21H80N205) 64,60 7,74 7,17Encontrado 64,73 7,89 7,02
Los datosde 114 RMN y ‘3C RMN de estecompuestose indican en las
tablas34 y 35, respectivamente.
(211,8S,BaPO-2-Bencil-8-(terc-butoxicarbonil)amino-2-hid,roximetilindolizidina (102)
Eluyente:CH2Cl2-MeOH(20:1). Rendimiento:25 mg (22%). Sirupe.
— 176
1H RMN(300 MHz, CDCl
3): 5 7,27-7,12(m, 5 H, C6H5), 4,46 (s ancho, 1 14, NR), 3,47 (m,1 14, 14-8), 3,39 (d, 1 H, C142-OH,J = 10,5), 3,33 (d, 1 14, C142-OH), 3,13 (d, 1 14,14-3, J = 9,4), 3,02 (m, 1 14, H-Sec), 2,89 (d, 1 14, C142-Ph,J = 13,3), 2,81 (d, 1 14,C142-Ph),2,27 (d, 1 H, H-3), 2,10 (m, 1 14, H-Sax), 2,01(m, 2 14, 14-7 y H-8a), 1,73
(m, 3 14, 14-1 y 14-6), 1,45 (m, 1 14, 14-6), 1,41 [s, 9 14, CH3 (IBoc)], 1,08 (m, 1 14,
H-7).
[300 MHz, (CD3)2C0]: 5 7,32-7,17(m, 5 14, C6145), 5,85 (s ancho, 1 14, NR), 3,50(m, 1 14, 14-8, J = 10,0), 3,33 (d, 1 H, C142-O14,J = 10,3), 3,29 (d, 1 14, CH2-014),3,07 (m, 2 14, 14-3y H-Sec),2,91 (d, 1 14, CH2-Ph,J 13,0),2,83 (d, 1 14, C142-Ph),
2,22 (d, 1 14, 14-3. J = 9,4), 2,08 (m, 1 14, 14-Sa),2,05(m, 1 14, H-Sax).2,04 (m, 1 14,14-7), 1.72(m, 3 14, 14-1 y 14-6), 1,39 (m, 1 H, 14-6), 1,38 [s, 9 14, CH3 (Boc)], 1,26(m,
1 14, 14-7).
1~C RMN (50 MHz, CDClg): 5 155,28[CO (Boc)], 138,40, 130,28,128,15,126,28(C
6145), 79,40 [C (Boc)]. 68,40 (C-8a), 67,21 (C142-OH), 61,70 (C-3), 51,80 (C-8),51,21(C-5), 44,92(C-2). 43,25(C-1), 38,63(CH2-Ph),31,32(C-7), 28,34[CH3 (Boc)1,
23,43(C-6).
Análisis elemental (%) C______ 14 N
Calculado(C211428N203) 70,76 7,92 7,86Encontrado 70,58 7,99 7,81
3.5.5.3. ObtencióndeA~MLhexa1iidroindolizinas
A una disolución del compuesto98 (0,1 g, 0,24 mmoles) en CH2Cl2(10 mL) se le añadeTEA (5,7 pi, 0,05 mmoles) y se agita a temperatura
ambientedurante 3 h. Despuésde eliminar el disolvente por evaporación,el
residuo resultante se purifica por cromatografíaen placa preparativa,utilizando como eluyenteEt2O-AcOEt(40:1), obteniéndoseel producto 106 como
unaespumablanca. Rendimiento:53 mg (55%).
— 177—
(2S)-2-Bencil-8-(terc-butc&xiearbonll)wnino-(106)
1H RMIN (300 MHz, CDCI3): 3 7,30-7,13(m, 5 H, C6H5), 5,25 (s, 1 H, NH), 3,80 (s,
3 H, CO2CH3),3,40 (m, 1 14, H-Sec), 3,27 (d, 1 14, 2-CH2, J = 14,2), 3,11 (d, 1 14,
14-1, J = 17,1), 3,10 (d, 1 14, 2-CH2),2,71 (d, 1 14, H-1), 2,04 (m, 2 14, 14-Sazy
1,75 (m, 2 14, 14-6y 14-7), 1,45 [s, 9 14, CH3 (Boc)], 1,45 (m, 1 14, 14-6).
13C RMN (50 MHz, CDCI3): 5 171,48(C-3), 170,76(CO2CH3), 155,80[CO (Boc)],
135,57,129,97, 128,22,127,07(C6145), 109,03(C-8 y C-Sa),80,05 liC (Boc)], 56,13(C-2), 52,93 (OCH3),39,59y 38,77(C-5 y 2-CH2),30,59(C-1), 28,22 [CH3 (Boc)],
25,96(C-7), 20,42(C-6).
Análisis elemental(Wc) C 14 NCalculado(C22H28N205) 65,98 7,04 7,00Encontrado 66,11 7,29 6,67
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3.6. PREPARACIÓNDE ANALOGOS DE COLECISTOQUININADERIVADOS DE 2,5-DICETOPIPERIDINAS
3&1. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICO DE DERIVADOSDE 2,5-DICETOPIPERIDINASCON H-Phe-M-12
Procedimientogeneral:
A una disolución del compuestoSSab ó ll9ab (1,3 mmoles) en MeOH(15 mL) se le añadeNaOH 2 N (0,65 mL, 1,3 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante3 h. Tras eliminar el disolventepor evaporacióna presiónreducida,el residuo resultantese disuelveen 1420 (15 mL), se acidifica hasta
pH 3 con HCi 1 N y se extrae con AcOEt. El extracto orgánico se secasobreNa2SO4y el disolventese evaporaa sequedad.El crudo de reacciónobtenidose
disuelve en THF (8 mL), la disolución se enfría a O0C y se le añadeHOSu
(173 mg, 1,5 mmoles)y DCC (310 mg, 1,5 inmoles).Trasagitar durante1 h a latemperatura indicada,se adiciona H-Phe-NH
2(215 mg, 1,3 mmoles)en THF(5 mL) y la mezclade reacciónse agila a temperaturaambientedurante3 días.
Transcurridoestetiempo, sefiltra paraeliminar la DCU formaday se evaporael disolventea sequedad.El residuoobtenidosedisuelveenAcOEt y selava conácido cítrico al 10%, NaHCOg al 10% y disolución saturadade NaCí,sucesivamente.El extracto orgánico se seca sobreNa2SO4y se elimina el
disolvente por evaporacióna presión reducida. El residuo se purifica por
cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando como eluyenteCH2CI2-
MeOH (40:1).
Los productos preparadospor este procedimiento se detallan acontinuación.Los datosde 114 RMN y de
13C RMN serecogenen las tablas36 y
37, respectivamente.
(31~68,1‘8)- y (38,68,1‘S)-3-(1‘-Carbamoll-2-feniletll)carbaznoil-
3-(etoxicarboniflmetil-6-(indnl-3‘ Li.Umetil~2,5.dicetopiperidina(117a)y (1lIb)
Rendimiento:275 mg (41%). Sólido amarillo. Proporciónde diastereoisómeros(3R,6S,1S)/(3S,6S.1S)2:1, medidapor HPLC.
— 181—
HPLC: tR = 5,05 mm (isómeromayoritario); 6,40 mm (isómerominoritario);eluyenteA (45:55); columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc) C H NCalculado(C2gHgoN4Os) 64,85 5,83 10,80
Encontrado 64.75 6,02 11,01
(311,68,1‘S)-3-(terc-Butoxicarbonilftnetll-3-(1‘-carbwnoll-2’-fenlletil)earbwnoíl-6-ffndol-3’~4VmetiJ-2,5-dicetopipeHdina(12la)
Purificado por cromatografíapreparativaen cromatotronEluyente:CH2Cl2-MeOH(60:1). Rendimiento:310 mg (44%).
Sólido blanco(amorfo).
Análisis elemental(Wc) C 14 N
Calculado(C30H34N4O6) 65,92 6,27 10,25
Encontrado 66,07 6,43 10,36
(38,68,1‘S)-3-(terc-ButoxicarboniVmetll-3-(1’-carbaznoil-2’-fenlletibcarbanroíl-6~Gndo1~3M.ll)metll~2,5~dicetopipeñdina(121b)
Purificadopor cromatografíapreparativaen cromatotrón.Eluyente:CH2Clz-MeOH(60:1). Rendimiento:95 mg (13%).Sólido blanco(amorfo).
Análisis elemental (Wc,> C H NCalculado(C30H84N406) 65,92 6,27 10,25
Encontrado 65,66 6,63 9,98
3.6.2. ELIMINACIÓN DEL GRUPOPROTECTORterc-BUTILO
A una disolucióndel derivadode 2,5-dicetopiperidina121aó 121b (82 mg,
Ojl5 mmoles) en CHoClo (2 mI) se le añadeTFA (1 mU> y se agita a
— 182—
temperatura ambiente durante 1,5 h. Tras eliminar el disolvente porevaporación a presión reducida, el residuo resultante se purifica porcromatografíapreparativaen cromatotrón,utilizando como eluyente C112C12-
MeOH (15:1).Los productos obtenidos medianteeste procedimiento se detallan a
continuación,junto con susdatosanalíticos.Los datosde1H RMN y ‘3C RMN
seindican en las tablas36 y 37, respectivamente.
Ácido (311,68,1‘8)4(1 ‘-carbamoíl-2‘-/‘eniletil)carbanwíl-6-(indol-3’ ~41)nwtil-2,5-dicetopiperidin-a-3-acético(113W
Rendimiento:65 mg (88 o). Sólido blanco(amorfo)
Análisis elemental1%) C 14 NCalculado(C
261426N406) 63,67 5,34 11,42
Encontrado 63,52 5,61 11,52
Ácido (3S,68,1’S)-3-(1~2,5-dicetopiperidina-3-acético(113b)
Rendimiento:60 mg (82%). Sólido blanco(amorfo)
Análisis elemental(Wc,> C 14 N
Calculado(C26H26N406) 63,67 5,34 11,42Encontrado 63,51 5,69 11,18
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t7. PREPARACIÓN DE ANÁLOGOS DE COLECISTOQUININADERIVADOS DE 3-OXOINDOLIflDINAS
371. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICO DE DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINA
2-BENCIL SUSTITUIDOSCON Boc-L-Trp-OH Ó Boc-O-Trp-OH
Procedimientogeneral:
A unadisoluciónde Boc-L-Trp-OH ó I3oc-D-Trp-O14(228 mg, 0,75mmoles)en THF (4 mL), enfriada a O 0C, se le añadenHIOSu (104 mg, 0,9 mmoles) yDCC (186mg, 0,9 mmoles) y se agita durante 1 h a la temperaturamencionada.Por otra parte,a unadisolucióndel derivado de 3-oxoindolizidina82au 82b (300 mg, 0,75mmoles)enCH
2Cl2 (5 mL) sele añadeTEA (2,5 mL) y se
agita a temperaturaambientedurante 1 lii. Tras eliminar el disolvente, elresiduo obtenido se disuelve en THF (5 mL), se le añadeTEA (0,1 mL, 0,75
mmoles)y, seguidamente,se adicionaesta disolución sobre la que contieneel
éster activo de Trp, preparadainmediatamenteantes.Despuésde agitardurante3 días a temperaturaambiente,la reacciónse procesatal y como se
indica en el procedimientogeneralrecogido en el apartado3.6.1. El residuoresultantese purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice, utilizandocomoeluyenteC142C12-MeOH(50:1).
Los productos obtenidos por este procedimiento se detallan a
continuación,con suscorrespondientesdatosanalíticos.Los datosde1H RMN
serecogenen la tabla38.
(211,8S,8aP0-y (2S,8W8aS)~2~Rendll~8.1N~it(terc.butaricarbonilyL-triptofihlanúno-2-metoxicarbonit3-oxoindolizidina(122a)y (122b)
Rendimiento: 250 mg (57%). Sólido blanco. Proporción de diastereoisórneros
(2R,8S,8aR)/(2S,8R,8aS)10:1, medidaporHPLC.
HPLC: tR = 25,89 mm (isómeromayoritario);30,88 mm (isómerominoritario);eluyenteA (35:65); columnanúm. 3.
Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C
33H40N4O6) 67,33 6,85 9,52
Encontrado 67,52 7,11 9,83 1
— 186—
(211,8S,8aP0-y (28,8E1,8aS).2-Benci1-8-IN<~-(t.erc-butoxicarbonll)-D-triptofdlamino-2-metaricarbonW3-OaxándflhizidifltL(123Wy (123b)
Rendimiento:235 mg (53%). Espumablanca. Proporciónde diastereoisómeros(2R,SS,8aR)/(2S,8R,8aS)10:1, medidapor HPLC. Los tiemposde retenciónde123a y 123b son idénticos
respectivamente.
Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalcu]ado(C331440N406) 67,33 6,85 9,52Encontrado 67,11 6,50 9,52
(2S,88,8aPJ-y (2W8W8aS)-2-Bencil-&1N0.(terc-butaricarbonil)-Ldriptofihlamino-2-metoxicarbOnll-3-aroindolizidina(126Wy (12Gb)
Rendimiento:265 mg (60%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros(2,S,8S,8aR)/(2R.8R.8aS)4:1, medidaporHPLC.
HPLC: tn = 32,30 mm (isómeromayoritario);37,68 mm (isómerominoritario);eluyenteA (40:60);columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc) C 14 NCalculado(C3¿H4oN4O6) 67,33 6,85 9,52
Encontrado 67,58 7,21 9,81
(2S,88,8aR)-y ~D-friptofiflwnino-2-nietoxicarbonil-3-oxoindolizidina (127Wy (127b)
Rendimiento:210 mg (48%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros(2S,8S.8aR)/(2R,8R,BaS)3:1, medidapor HPLC. Los tiemposde retenciónde127a y 127b son idénticos a los de sus enantiómeros 126b y 126a,respectivamente.
Análisis elemental(Wc,> C 14 N
Calculado(C33H40N406) 67,33 6,85 9,52Encontrado 67,21 7,15 9,28
a los de sus enantiómeros 122b y 122a,
— 187—
3.t2. TRANSFORMACIÓNDE ÉSTERESMETÍLICOS EN AMIDAS
Procedimientogeneral:
Una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina 122ab,123ab, 126abó127ab(150 mg, 0,25 mmoles)en MeOH saturadode N143 (50 mL) se agita atemperaturaambientedurante6 días, renovandodiariamenteel N145/MeOH.
Transcurrido este tiempo, se evaporael disolvente a sequedad.El residuo
resultante se purifica por cromatografía preparativa en cromatotrón,
utilizando comoeluyenteC142C12-MeOH(40:1).
Los productos obtenidos por este procedimiento se indican a
continuación,con sus correspondientesdatos analíticos, En la tabla 38 se
encuentranrecogidoslos datosde1H RMN.
(28,BS,SaR>-.y (2W8F48aS).2.Benci1~8.INCt(terc-bzdoxicarboni-l)-L-tripto/ZIPamino-2-carbamoil-3-wxándolizidina(124Wy (1Mb)
Rendimiento: 135 mg (94%). Sólido blanco. Proporción de diastercoisómeros
(2S,8S,8aR)I(2R,8R,8aS)10:1, medidaporHPLC.
HPLC: tR = 14,82 mm (isómeromayoritario); 15,88 mm (isómerominoritario);eluyenteA (35:65); columnanúm. 3.
Análisis elemental(Wc) C 14 N 1Calculado(C
82H59N505) 67,00 6,85 12,21
Encontrado 67,12 7,11 12,28
(28,8S,SaFt)-y ~amino-2-carbamoíl-3-oxoindolizidina(125W y (125b)
Rendimiento:140 mg (98%). Sólido blanco. Proporciónde diastercoisómeros(2S,8S,8aR)/(2R,8R,8aS)10:1, medidapor HPLC. Los tiemposde retenciónde125a y 125b son idénticos a los de sus enantiómeros 124b y 124a,
respectivamente.
— 1•ss —
Análisis elemental (0%) C 14 N
Calculado(C32H39N505) 67,00 6,85 12,21Encontrado 67,36 6,90 12,33
(211,88,SaP0-y (28,8E1,8a$.2.Bendil.&[NcY4tercrbutÚxicarbonW~L~triptofih]~
amino-2-carbanzoil4-ozwindolizidina(128Wy (128b)
Rendimiento:138 mg (96%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros(2R,8S,8aR)/(2S,8R,8aS)4:1, medidapor HPLC.
HPLC: tR = 20,11 mm (isómeromayoritario);23,05mm (isómerominoritario);eluyenteA (40:60);columnanúm. 1.
Análisis elemental(Wc,> C 14 N
Calculado(C32H39N505) 67,00 6,85 12,21Encontrado 66,82 7,14 12,01
(2W8S,8aP0-y (28,8~8aS)-2-Bendil~8~LN<4(terc-butaxicarbonit-D-triptofilkamino-2-carbwnoíl-3-oxoindolizidina(12%) y (129b)
Rendimiento: 140 mg (98%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros
(2R,8S,8aR)/(2S,8R,8aS)3:1, medida por HPLC. Los tiemposde retenciónde129a y 129b son idénticos a los de sus enantiómeros 128b y 128a,respectivamente.
Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C32H39N505) 67,00 6,85 12,21Encontrado 66,76 7,01 12,45
— 189—
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3.7.3. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICO DE DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINA2-terc-BUTOXJCARBONILMETILSUSTITUIDOSCON I4-Phe-NIH2
A una disolución del compuesto133ab (1,57 g, 3,8 inmoles) en THF
(20 mL), enfriada a O 0C, se le añadeHOSu (525 mg, 4,6 inmoles) ~ DCC(940 mg, 4,6 mmoles). La mezcla de reacción se agita durante 1 h a latemperaturamencionaday, a continuación,sele adicionaH-Phe-NH
2(623 mg,
3,8 mmoles) en THF (5 mL) y se agita a temperaturaambientedurante3 días.
Tras un procesadosimilar al indicado en el apartado3.6.1, el residuoobtenido
se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice con el sistemadeeluyentes CH2CJ3-MeOH (40:1), seguidade cromatografíapreparativa en
cromatotrón,utilizando el mismo eluyente,paradar lugar a los productosquese indican a continuación.
(2S*,8St8aRtl‘S)-8-(terc.Butoxicarbonll)amino-2-(terc-butoxicarbonll)metil-2-(1‘-carbanwíl-2’-feniletll)carbanwil-3-oxoindolizidina(134W
Rendimiento:1,4 g (66%). Espumablanca.
~H RMN (300 MHz, CDCI3): 8 7,88 (d, 114, 1’-NH, J = 7,9), 7,32-7,21(m, 5 14,
C6H5), 6,96 (s, 1 14, CONH2), 5,50 (s, 1 14, CONH2),4,73 (m, 1 14, 140.1’), 4,52 (d,
1 14, 8-NH, J = 8,5),4,02 (m, 1 14, H-Sec),3,32 (dd, 1 14, 14-2,J = 14,3 y 5,2), 3,22
(m, 1 14, 14-Sa), 3,03 (dd, 1 14, 14-2’), 3,03 (m, 1 14, 14-8), 2,69 (d, 1 H, 2-CH2,J = 15,2), 2,60 (m, 1 14, H-Sax),2,57 (d, 1 14, 2-CH2), 2,34 (m, 1 14, 14-1), 2,27(dd, 1
14, H-1, J = 14,1 y 7,5), 2,10 (m, 1 14, 14-7), 1,79 (in, 1 14, 14-6), 1,46 (ni, 1 H, 14-6),1,46 lis. 914, CH3 (Boc ó CO2tBu)l, 1,41 lis, 9 14, CH3 (Boc ó CO2tBu)], 1.35 (m,
1 1-1, H-7.
Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C29H42N407) 62,35 7,58 10,03
Encontrado 62,05 7,70 10,21
(2RtSSt8aRt1‘S)-8-(terc-Butoxicarbonil)amino-2-(terc-buto~xjcarbonil)nwtjI-2-(1‘-carbamoll-2’-feniletil)carbanzoíl-3-oxoindolizidina(184b)
Rendimiento:220 mg (10%). Espumablanca.
— 191—
1H RMIN (300 MHz, CDCl3): 5 7,89 (d, 1 14, 1-NH, J = 7,3), 7,32-7,18(in. 5 14,
C6H5), 6,49 (s, 1 14, CONH2),5,40 (s, 1 14, CONH2),4,68 (m, 1 14, 14-1), 4,43 (d,
1 14, 8-NH, <-1 = 7,3), 3,99 (m, 1 14, H-Sec),3,25 (m, 1 14, 14-Sa),3,12 (m, 3 14, 14-8 y
14-20,2,64 (m. 1 14, 14-1), 2,57 (m, 1 14, 14-Saz),2,56(d, 1 14, 2-CH2, J = 15,9), 2,37(d, 1 14, 2- CH2), 2,20 (dd, 1 14, 14-1, J = 14,4 y 7,9), 2,02 (m, 1 14, 14-7), 1,72 (m,
1 14, 14-6), 1,44 (m, 1 14, 11-6), 1,44 Ls, 9 14, CH3 (Boc ó CO2tBu)], 1,39 lis, 9 14, CH3(Boc ó CO2tBu)1,1,29 (in, 1 14, 14-7).
Análisis elemental (Wc) C 14 N1
Calculado(C29H42N407) 62,35 7,58 10,03Encontrado 62,15 7,40 10,10
3.7.4. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICODE DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINA
2-CARBOXIMETIL SUSTITUIDOSCON Boc-L-Trp-OH
A una disolución de Boc-Trp-O14 (107 mg, 0,35 mmoles) en THF (3 mL),
enfriada a O C, se le añade HOSu (48 mg, 0,42 mmoíes) y DCC (87 mg,0,42 inmoles) y se agita durante 1 h a la temperaturamencionada.Por otra
parte,a unadisolución del derivadode 3-oxoindolizidina 134aó 134b (195 mg,0,35 inmoles) en C112C12(3 mi) se le añadeTEA (1,5 mli y se agita a
temperaturaambientedurante 2 h. Despuésde eliminar el disolvente por
evaporacióna vacío, el crudo de reacciónobtenido se disuelve en THF (3 mL),se le añadeTEA (0,05 mL, 0,35 mmoles) y, seguidamente,se adiciona estadisolución sobre la que contiene el éster activo de Trp, preparadainmediatamenteantes. Después de agitar durante 3 días a temperatura
ambientey tras un procesadosimilar al indicado en el apartado3.6.1. elresiduo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,
utilizando comoeluyenteC142C12-MeOH(40:1).
Los productos obtenidos por este procedimiento se detallan a
continuación.Los datosde 114 RMN y ‘3C RMN se encuentranrecogidosen las
tablas39 y 40, respectivamente.
—192—
Ácido (2StBStSaRtl‘S)-8-INC’4terc-butoxiearbonit-.L-triptofihlamino-2-(1 ‘-carbamoíl-2‘-feniletibcarbamoil-3-oxoindolizidina-2-acético(115a)
Rendimiento:135 mg (56%). Sólido blanco(amorfo).
Análisis elemental (Wc,> C 14 N
Calculado(C361444N608) 62,78 6,44 12,20Encontrado 62,40 6,30 11,97
Ácido (2RtSS*,BaRtl‘S).8~1NU4terc.butoxicarboniI)~L-triptofih]amino~2-(1‘-carbamoll-2’-feni1~etll)carbwnoll-3-aroindolizidina-2-acético(115b)
Rendimiento:140 mg (58%). Sólido blanco(amorfo).
L__Análisiselemental (Wc,> CCalculado(C38H44N608) 62,78Encontrado 62,71
14 N
6,446,70
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8.7.5. ELIMINACIÓN DEL GRUPOPROTECTORterc-BUTOXICARBONILO
Una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina I2Sab, 129ab ó 115a
(75 mg, 0,13 mmoles) en CH2CI2 (2 mL) y TEA (1 mL) seagita a temperaturaambientedurante2 h. A continuación,se elimina el disolventepor evaporacióna presiónreduciday el residuo resultantese purifica por HPLC preparativo,utilizando el eluyente que se especifica en cada caso, obteniéndose,trasliofilización, los productos que se describenseguidamenteen forma de
trifluoroacetato.Los datosde 114 RMN de estoscompuestosse encuentranrecogidosen las
tablas39 y41.
Trifluoroacetatode(2R,8S,8aR)-2-bendil-2-carbamoíl-
8-(L-triptofitanñno-3-axoindolizidina(130W
EluyenteA (23:77)-Rendimiento:58 mg (76%).Sólido blanco(liofilizado). [a]~:+51,90 Cc = 0,75,MeOR).
HPLC: tp = 12,85mm; eluyenteA (25:75);columnanúm. 1.
Trifluoroacetato de(28,811,8aS)-2-bencil-2-carbamoi-l-8-<’Ldriptofibamino-3-oxoindolizidina(130W
fluyenteA (23:77).Rendimiento:13 mg (17%).Sólidoblanco(liofilizado). [u]1~:±2,20(c = 0,85, MeOH).
HPLC: tR = 24,36mm; eluyenteA (25:75);columnanúm. 1.
Trifluoroacetatode (2WSS8aB)-2-bendil-2-carbamoi-1-
84D-triptofibamino-3-oirindolizidinn (131W
EluyenteA (21:79).Rendimiento:47 mg (58%).
Sólido blanco(liofilizado). liu119: —3,2~ (c = 0,75, MeOH).
HPLC: El tiempo de retenciónesigual al desu enantiómerolSOb.
— 196—
Trifluoroacetato de(2S,814,8aS)-2-benci.l-2-carbamoíl-8-(D-triptofl»amino-3-cxoindolizidina(131W
EluyenteA (21:79).Rendimiento:17 mg (22%).Sólido blanco(liofilizado). lia]19: —36,6~(c = 0,675,MeOH).
HPLC: El tiempo de retenciónesigual al de su enantiómerolSOa.
Ácido (2St8St8aRtl‘S)-2-(1‘-carbamoil-2’-feniletil)earbamoll-8-(L-triptofd)amino-3-oxoindolizidinor2-acético(135)
En estecasono fue necesariala purificación por HPLC.
Rendimiento:70 mg (93%). Sólido blanco(amorfo)
HPLC: tR = 7,80mm; eluyenteA (30:70);columnanúm. 4.
Los datosde 114 RMN de estecompuestoseindican en la tabla 39.
—197—
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t8. SÍNTESIS DE ANÁLOGOS DE NEUROTENSINAPORTADORES
DE ESQUELETOSDE 3-OXOJNDOLIZIDINA.S
Síntesisen fasesólida:
La síntesisen fase sólida se llevó a caboen un sintetizadorde péptidos
automático ABI 430A. El acoplamientode los diferentes Boc-aminoácídos
(7,5 eq) se realizó con los ésteresde N-hidroxibenzotriazol, previamente
formados, en CH2Cl2JDMF (9:1) durante 20 h a temperaturaambiente.Los
derivadosde 3.-oxoindolizidina 85a-85c,88a y 88b (1,6 eq) se incorporaronal
fragmento H-Ile-Leu-PAM-resina(leq) en las mismas condicionesanteriores,
utilizando BOP como agente de acoplamiento.En todos los casos,el ensayo
cuantitativo con ninhidrina indicó acoplamientossuperioresal 99%. Lasdesproteccionesde los grupos N-Boc se realizaroncon TFA durante 5 mm,
seguidode neutralizaciónde la resmaconDIEAIDMF al 20% durante1 mm.La separaciónde los derivados hexapeptídicosde la resma,con eliminación
simultáneade los gruposprotectoresde las cadenaslaterales,se llevó a cabo
por acidolisis con HF/m-cresol(9:1) durante75 mm a O <0C. Tras precipitación
con étery filtración, los péptidosse extrajeronconAcOH al 1% y se liofilizaron.
La purificación de los crudosde reacción,por RP-HPLC, sellevó a cabo en un
cromatógirafoVarian equipadocon una columna C18 (25 x 250 mm, 7 jm),utilizando como eluyenteCH3CN/(NH4)2504(0,1 M, PH = 2,7) (Gradiente:0,2%
CH3CN/min) y un flujo de 10 mL/mm. Finalmente, los productospuros se
aislaron por liofilización. Siguiendo este procedimiento, se prepararon los
derivados136a-136e,cuyosdatosanalíticosy espectroscópicosse recogenen las
tablas42 y 43.
—199—
Tabla 42. Desplazamientosquímicos(8. ppm) más significativosde 1H RMN
de los derivados136a-136e[400 MHz, 1120/020(9:1)]a
Compuesto
Residuo Protón 136a 13Gb 131k 136d iSGe
Arg8
Arg9
1n dolizidina
Ile12
Leu13
a La asignaciónde cadauno de losprotonesserealizó medianteexperimentoscosyy TOCSY0
a-CH13-CH2y-CH 2S-CH2
a-NHa-CH¡3-CH2y-C ~2¿-CH2
3,891,741,513,04
8,644,061,61
1,51 1,443,08
2,15 1,923,74 2,291,61 1,231,67 1,07
3,202,128,11
3,06 2,85
8,254,051,76
1,34 1,050,790.72
8,224,211,48
1,510,78 0,74
3,961,79
1,50
3,11
8,664,081,66
1,53 1.45
3,11
2,50 1,703,82 2,551.60 1,041,64 1,18
2,25
3,178,10
3,20 289
7,954,081,83
1,39 1,120,87
0,81
8,244251,51
1,510,81 0,75
3,931,781,4<83,09
5,674,30
1,62
1,61 1,513,05
2,17 1,903,83 2,411,48 1,381,54 1,38
3,832,568,42
3,14 2,92
8,584,151,92
1,35 1,100,910,82
8,204,15
1,551,55
0,83 0,79
3,971,81
1,483,08
8,714,131,68
1,55 1,48
3,08
2,30 1,893,80 2,361,65 1,321,70 1.15
3,302,368,21
3,05 2.92
8,4~54,03
1,811,32 1,06
0,830,79
8,314,241,55
1,550/79 0,75
1-1-1H-511-6H-7H-811-Sa8-NE2-CH2
a-NHa-CH¡3-CHy- CH2y-CH g8-CHa
a-NHu-CH¡3-CH2y-CH8-CH3
3,921,781.502,95
8,674061,61
1,50 1,39
3,04
2,47 1,743,76 2,521,57 1,051,61 1,17
2,6-4
3,148,09
3,08 2,89
7,964,02
1,741,29 099
0,770,70
8,264,23
1,471,50
0,78 0,74
— 200—
Tabla 43.Datos analíticosde los análogosde NTg{3 136a-136e
Comp. Rendimiento (91) 0’
136a
13Gb
131k
136d
131k
53(57)
35(49)
9
24(31>
43 (45,
HPLC anal.b
tR (mm)
25,13
26,89
30,33
27,20
23,55
PD-MS
826,9
827,0
826,7
826,7
827,4
Análisis de aminoácidosArg Ile Leu
2,05
1,95
2,02
2,03
1,91
0,97
0,97
1,07
0,95
0,58
1,01
0,94
0,89
0,98
0,96
a
Los valores entre paréntesiscorrespondena?rendimiento global considerandoen cadacasoel segumndodiastereoisérnero.b columna:Vvdac 218 TP54 C18 (4,6 x ‘250 mm, 5 pm). Fluyente: CH3CN/(N114)2S04(0,1 M, pH 2,5): Gradientede 5’¿ a60% de CH8CN en 50 mm. Flujo: 1 mL
1rnin. Detección:17V (214 nm>.
—201—
3.9.MÉTODOSBIOLÓGICOS
3.9.1.ENSAYOSDE UNIÓN A LOS RECEPTORESDE CCK ~
Los experimentosse llevaron a cabo en cortezade cerebroy páncreasderatas macho Sprague-Dawley.La preparaciónde estasmembranasy losensayosde unión a los receptoresse realizaronsegúnel método descritopor
Dauge et al. ~ El radioligando li3H]pCCKs (Amersham) se incubó a
concentracionesfijas de 1 nM en homogeneizadosde cortezacerebral (1 h,25 o>C) y de 0,5 nM en los homogeneizadosde tejido pancreático(2h, 25 0C), en
presenciade concentracionesvariablesdel competidor.Las concentracionesanterioresde radioligandorepresentanaproximadamentela Ej del procesode
fijación.
392. ENSAYOSDE LIBERACIÓN DE AMILASA 158
Paraesteensayoseutilizaron acinospancreáticosde rata. La liberaciónde
amilasa,medidacomo la diferenciaen la actividadde la amilasaliberada en e]
medio extracelularal final de la incubacióncon y sin secretógeno,se expresa
como porcentajede la estimulación máxima obtenida con CCKs (35%±3 del
total de la ainilasa contenida en los acinos) menos la secreción basal de
amilasa sin secretógeno(7%±2 del total de la amilasa contenida en los
acinos). Los compuestosa ensayarse administrarona dosis fijas de íC—~ M
junto con la CCK8.
3.9.3. INHIBICIÓN DE LAS CONTRACCIONESINDUCIDAS
PORCCK8 6 CCÑ EN EL ÍLEON DE COBAYA:PREPARACIÓNDE MÚSCULO LONGITUDINAL-PLEXO MIENTÉRICO 130
Los segmentosdel íleon se sumergenen un baño paratejidos aisladosque
contienetampón Krebs y se conectana un electrodo.Despuésde equilibrar los
tejidos (30 mm, a 0,5 g de fuerzapasiva),se procedea su estimulacióneléctrica
(30 mm, 0,1 Hz, 1 ms, 10-15 V) y se tratan con KCl 67 mM paradeterminarla
contraccióninicial máxima del músculo. Las curvas de respuestacontráctil-
concentración para la CCK8 y Ja CCK4 se obtuvieron por incrementos
— 202
progresivosde la concentracióndel péptido, despuésde un lavadode la dosis
precedente.Para cada tejido sólo se examinó un péptido. Para evaluar losefectosde los distintosproductosen la respuestacontráctil de los péptidos,cada
tejido se equilibré con el producto correspondiente(iO~ M) antesde añadirel
péptido liCCKs (1O~ M), CCIQ (1V M)].
3.9.4.ENSAYOS DE UNIÓN A LOS RECEPTORES DE NT17’2
Los ensayosse llevaron a cabo en homogeneizadosde cortezacerebralde
rata. La preparaciónde las membranasy los ensayosde unión a los receptores
se realizaron según el método descrito por Milis et al. 172 El radioligando
li3H]-NT se incubó a una concentraciónde 5 nM (1 h, 25 0C) en presenciadeconcentracionesvariablesdel competidor.
203—
4. CONCLUSIONES
El trabajo quese recogeen estaMemoria describela síntesisde una
seriede derivadosde 2,5-dicetopiperidinasy 3-oxoindolizidinas,diseñados
para ser aplicadosen el campo de los peptoideso peptidonilméticos.Concretamente,se da cuentade la aplicación de estaslactamasmono ybicíclicas, respectivamente,a la preparaciónde análogosconformacional-mente restringidos de los neuropéptidosColecistoquinina (CCK) y
Neurotensina (NT), así como de los resultados de afinidad de los
compuestossintetizadospor los respectivosreceptoresde CCKy NT.
Los aspectosmás significativos de este trabajo se resumenen las
siguientes conclusiones:
1. Se describen dos rutas sintéticas alternativas para la
preparaciónde 6-bencil- y 6-(indol-3-il)metil-3-metoxicarbonil-
2.5-dicetopiperidinas y sus correspondientesderivados 3,3-
disustituidosqueincorporanen posición 3 las cadenaslaterales
de los aminoácidosPhe,Ma y Asp. Se discutenlas similitudesydiferenciasentre ambasrutas, tanto en cuantoa rendimientocorno en cuantoa estereoselectividad.
2. Se ha llevado a cabo el estudioconformacionalpor 1H RMN de
los derivadosde 2,5-dicetopiperidinaincluidos en el apartado
anterior, encontrándoseque, en DM80, la cadena6-aralquíicaadopta preferentementeuna conformación en la que dicha
cadena se pliega sobre el anillo de 2,5-dicetopiperidina.
Asimismo, estosresultadosparecenindicar que el anillo de 2,5-
dicetopiperidinaadoptaconformacionesde tipo bote torcido.
3. Se ha puesto a punto un procedimientopara la preparaciónde
pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos.
4. Se describela síntesisde derivadosde 8-amino-3-oxoindohzi-dina-2-carboxilatopor hidrogenacióncatalítica de y-cetodiésteres
derivadosde Boc-L-Orn(Z)-014y Boc-n-Orn(Z)-OH.Como dato a
destacaren estasíntesis,indicar que transcurreen un solo paso
—207—
que implica eliminación del grupo protector Z, seguida de
aminación reductiva intramoleculary y-lactamización.Se ha
establecidoque la elaboracióndel esqueletode 3-oxoindolizidinaprocedecon un alto grado de estereoselectivídad,conduciendo
muy mayoritariamentea los isómeros con disposición trans delos sustituyentesen posiciones8 y 8a.
5. Se han sintetizadouna serie de derivadosde 8-amino-2-metoxi-
carbonil-3-oxoindolizidinaportadoresde las cadenaslateralesde
diferentes aminoácidos (Phe, Trp, Asp) en posición 2. La
incorporación de estas cadenas, mediante reacción de
alquilación con el agentealquilante adecuado,transcurrede
forma estereoselectiva.
6. Se ha realizado un estudio de la enantioselectividaden el
proceso de formación de las 3-oxoindolizidinas objeto de este
trabajo, poniéndosede manifiestoque estas lactamasbicíclicasestánconstituidaspor mezclasde dos enantiómerosformados
durante el procesode elaboracióndel anillo heterocíclico.Se ha
demostradoque la enantioselectividadaumentaal disminuir Ja
temperaturade la reacción de hidrogenaciónimplicada en
dicho proceso.
7. Se han preparado de forma estereoespecíficaderivados de
8-amino-3-oxoindolizidina 2,2-disustituidosportadores de un
grupo hidroxilo o alcoxilo en posición Sa, por hidrogenación
catalítica, en diferentesdisolventes,de 2-bencil-4-cetodiésteres
derivadosde Orn.
8. Con el fin de conocerla capacidadde los derivadosde 8-amino-3-
oxoindolizidina-2-carboxilatopara inducir conformacionesdetipo giro j3. se ha llevado a cabo un estudio de modelización
molecular con modelos sencillos, utilizando la técnica dedinámica molecular. Los resultadosde este estudio indicaron
que los derivadosde 3-oxoindolizidina con disposición trans delos sustituyentesen posiciones8 y Sa adoptanpreferentemente
conformacionesextendidas.Por el contrario, el isómero8,8a-cis
mostró una gran tendenciaa adoptarconformacionesplegadas,
bien mediante formación de un puente de hidrógeno intra-
molecularentrelos grupos8-NR y 2-CO, bien conformacionesdetipo giro jB II.
— 208—
9. Se han preparadouna seriede análogosconformacionalmenterestringidosde CCK4, H-Trp-Met-Asp-Phe-N142,en los que el
residuo de Met o el fragmento dipeptídico Met-Asp se han
reemplazadopor esqueletosde 2,5-dicetopiperidinaconveniente-
mente sustituidos.Los resultadosde afinidad por los receptores
de CCK indicaron que, en esta serie de compuestos,la dispo-
sición relativa cts entrelas cadenaslateralescorrespondientesalos aminoácidosTrp y Phe favorecela unión a los receptores
periféricos CCKA, mientrasque la disposicióntrans da lugar a
compuestosmenos efectivos, En el mejor de los casos, las
afinidades encontradasfueron moderadas(~ 106 M). Estos
derivados fueron inefectivos en su unión a los receptores
centralesCCKB. En Los ensayosfuncionalesninguno de los deri-
vadosestudiadospresentóactividadantagonistasignificativa.
10. Se ha llevado a cabo la preparaciónde diferentes análogosde
CCK4 portadoresde esqueletosde 3-oxoindolizidina,encontrán-
doseque los mejoresvalores de afinidad por los receptoresdeCCK se obtuvieron para aquellos derivadosen los que estaslactamas bicíclicas reemplazan al dipéptido Met-Asp.Asimismo, se ha observadoque la disposiciónespacialrelativadel grupo 2-bencilo y el residuo de Trp, así como la
estereoquímicadel restode Trp, afectanal grado de selectividad
por los receptoresCCKA o CCKB. La presenciadel grupo
carboxamida en posición C-terminal de estos derivadosaumentaen un orden de magnitud la afinidad por ambostiposde receptores.Aquellos derivadoscon afinidad aceptablepor losreceptoresCCKA se comportaroncomo antagonistasperiféricos
moderados.
11. Con objeto de intentar aportar nuevos datos acerca de laconformaciónbioactivade la NT, sehansintetizadouna seriedeanálogosconformacionalmenterestringidos de NT813, H-Arg-
Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH, en los que el fragmento dipeptídicoPro-Tyr se ha sustituidopor esqueletosde 3-oxoindolizidina con
diferentesestereoquímicas.A partir de los datos de afinidad de
estosanálogospuedededucirseque, mientras la estereoquímica
en C-2 no tiene influenciaen la unión a los receptoresde NT, ladisposición relativa, cis o trans, de los sustituyentesen
— 209
posiciones 8 y 8a juega un papel importante. Mediante las
diferenciasde afinidad observadaspuedeestablecerseque lasrestriccionesconformacionalesinducidaspor las 3-oxoindolizi-
dinas8,8a-transen los análogosde NTwís seajustanmejor a losrequisitostopográficosde los receptoresde NT que las inducidas
por el derivado8,8a-cis.12. Se ha realizado un estudio de modelización molecular del
derivado dipeptídico Ac-Pro-Tyr-NHCHg y de diferentes
8-acetilamino-2-bencil-3-oxoindolizidina-2-(N-metil)carboxamidoderivados, como modelos sencillos de NTgj3 y sus análogos
restringidos, respectivamente.Este estudiopuso de manifiesto
que el derivado dipeptídico tiene una alta tendenciaa adoptar
conformacionesde giro ¡3, tipos 1 o III, y de giro y-inverso. Por
otra parte, la 8-amino-2-bencil-2-carboxi-3-oxoindolizidinacon
disposición 8,8a-cis, que fue la única que mostró una gran
preferencia por conformacionesplegadas,concretamentedetipos 8N14—*2C0 y giro ¡311, dio lugar a un análogode NT813
inactivo. Estos resultadosindican que estostipos de conforma-
ciones son incompatibles con la conformación bloactiva de la
Neurotensina.
—210—
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