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F. Mocholí

Seminarios ABI, Noviembre 2007

Aspectos a tener en cuenta en el análisis de residuos de plaguicidas en vegetales por

LC/MS/MS

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Tiempos Pasados

Costosa preparación de la muestra para conseguir extractos

muy limpios

Evitar contaminación cromatográfica

Mantener el sistema inerte

Maximizar sensibilidad y obtener la máxima selectividad

Pobre selectividad/sensibilidad en HPLC (tecnología de

columnas, detector UV detector, Derivatizar y detector de

Fluorescencia)

Difícil confirmación (mala selectividad en HPLC)

Se han llevado a cabo diferentes estrategias para conseguir

mejoras

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Tiempos pasados

Smash the vegetable sample (50g)

Homogeneize (20sec)

Filter

SPE/GPC

Evaporate

+60ml EtOAc + 13g Na2SO4

+60ml EtOAc + 13g Na2SO4

Reconstitute with 5ml Cyclohexane

Homogeneize (20sec)

Evaporate

10 fold concentration

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Tiempos pasados

Distintas técnicas para

distintos compuestos (UV,

derivatización para

Fluorescencia, etc.)

Pobre selectividad (longitud

de onda, espectro UV)

Baja sensibilidad

Limitado número de

compuestos

Duración de los

cromatogramas

DAD, 2mg/Kg standard

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LC/MS Ionspray

GC/MS

IonicA

naly

te P

olar

ity

Molecular Weight101 102 103 10104 105

Non-Ionic

GC-LC/MS Polaridad/Peso Molecular

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Evolución de LC/MS

Necesidad de confirmación por MS

Número de analitos en aumento

Gran esfuerzo en interfases (sensibilidad, robustez)

Avances en in tecnología de columnas (resolución, tiempo

de análisis), sistemas de HPLC (inyección, volumen muerto,

presión, etc.)

La ionización en LC/MS solo da 1 ion MS/MS

Elección entre tecnologías (Trap, Triple Quad, etc.)

Número de analitos en aumento

Identificación de desconocidos

Número de analitos en aumento

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Ionización por Electrospray

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Ion Spray (ESI)

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Ion Spray (ESI)

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Ion Spray (ESI)

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Ion Spray (ESI)

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Fuentes de ionización para ESI

Electrospray hasta 1 l/min

Dependiente de la Concentración

Ionspray (Electrospray asistido neumáticamente) Flujos de líquido 5-200 ul/min

Mejor sensibilidad que electrospray en este intervalo de flujos

Dependiente de la Concentración

TurboIonSpray (Ionspray con gas de secado caliente) Flujos de líquido 5-1000 ul/min

Mejor sensibilidad que ionspray en este intervalo de flujos

Dependiente de la Concentración

Fuente Turbo V (TurboIonspray con doble calefactor y dinámica de los gases) Flujos de líquido 5-2000 ul/min

Mejor sensibilidad que turboionspray en este intervalo de flujos

Comportamiento dependiente de la masa en algunos intervalos de flujos

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Problema: Baja tolerancia o intolerancia a sustancias poco volátiles

Solución: Hacer que los iones describan un camino má o menos tortuoso (Balance entre sensibilidad y robustez)

Orthogonal

Pepperpot

Crossflow LCZ aQa

Off axis

Estrategias para mejorar la robustez

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OSA

N2

N2

TurboIonSpray®

Angle

Turbo V source®

Estrategias para mejorar la robustez

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Pares iónicos Evite reactivos que puedan formar pares iónicos fuertes con los iones

deseados y puedan neutralizar los iones en disolución. (Se reduce la

evaporación de los iones)

Efectos competitivos durante la evaporación de los iones Alta concentración de iones de carga similar en la matriz, tampones, etc.

compiten en el proceso de evaporación iónica en las microgotas.

Supresión Iónica Reducción señal Analito

ESI: Mecanismo supresión iónica

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Menos señal a mayor concentración del tampón

Supresión señal iónica

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Comparación matrices Vegetales full scan

LechugaNaranjaUva

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Efecto Matriz

Columna 5 cm

Lechuga 0.010mg/Kg

Uva 0.010 mg/Kg

Columna 15 cm

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Q1 Q2 Q3

SISCIDFULL SCAN

MS/MS

Fuente Ioniz.

Fuente Ioniz.

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¿Qué “Dwell time” debo utilizar?1 transición MRM (1 compuesto)

Como media, se requieren 15 puntos (o al menos 10) para integrar con precisión un pico cromatográfico

30 segundosX

X

X

X

X

X

X

X

X

XX

X

X

X

X(Anchura del pico)/(número de puntos)=30/15 = 2 segundosSe necesita 1 punto cada 2 segundos (2000 ms)

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¿Qué “Dwell time” debo utilizar?2 transiciones MRM (1 compuesto Cuant y Cual)

Si “dwell time” permanece constante; el tiempo para cada compuesto es 2000 ms: 2000 ms

+ 2000 ms-----------

2 compuestos: 4000 ms

30 segundos / 4000 ms = 7.5 puntos sólo!

30 segundos

XXXXXXXXXX

X

X

X

X

X X XX

X

X

X

X

X

X

X X X X X X X X X

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¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente?

“Dwell time” constante

=> El número de puntos para definir el pico cae rápidamente

Time MRM Puntos

2000 1 15

2000 2 7

2000 3 5

Número de puntos por pico constante

=> “Dwell time” debe disnimuir!

Dwell time (ms) MRM Puntos 3DTrap QqQ

2000 1 15 Sí Sí

1000 2 15 Sí Sí

667 3 15 Sí Sí

200 10 15 Sí/No Sí

100 20 15 No Sí

10 200 15 No Sí

Anchura de pico 30 s

En una columna de 2mm id, 3m la anchura de pico es

normalmente 10 s, así que se debe dividir todo por 3

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Anchura de pico 10 s

Para 10 puntos por pico cromatográfico

=> “Dwell time” debe disminuir!

Dwell time (ms)MRM Data points 3DTrap QqQ

1000 1 10 Sí Sí

500 2 10 Sí Sí

333 3 10 Sí Sí

100 10 10 Sí/No Sï

50 20 10 No Sí

10 100 10 No Sí

5 200 10 No Sí

A medida que disminuye el d.i. o el tamaño de partícula de la columna,

la anchura de pico también disminuye, pero para mantener el número de puntos,

debe disminuir el “Dwell time”

¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente?

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Prueba Columnas LC/MS. Analitos

Acephate Demeton-S-methyl sulfoxide Imazalil Omethoate

Acetamiprid Dichlorvos Imidacloprid Oxamyl

Aldicarb Diflubenzuron Indoxacarb Picoxystrobin

Aldicarb Sulfone Dimetomorph Linuron Propoxur

Aldicarb Sulfoxid Diuron Lufenuron Pyraclostrobin

Benfuracarb Ethiofencarb sulfone Methamidophos Spiroxamine

Carbendazim Ethiofencarb sulfoxide Methiocarb Tebufenocide

Carbofuran Fenhexamid Methiocarb sulfone Thiametoxam

Carbofuran 3OH Fludioxonil Methiocarb sulfoxide Thicloprid

Carbosulfan Flufenoxuron Methomyl Trifloxystrobin

Clofentezine Hexaflumuron Monocrotophos

Total analytes, 43

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Columnas Probadas

Atlantis T-3 (Waters), 100 mm, 2.1 mm, 3m

Hypersil Gold (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3m

Hypersil Gold aQ (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3m

QS Strategy 3RP (Interchim), 100 mm, 2.0 mm, 3m

Polaris C18 A (Varian), 100 mm, 2.0 mm, 3m

Ascentis RP-Amide (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 3m

Ascentis Express C18 (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 2.7m

Sinergy Hydro (Phenomenex), 100 mm, 2.0 mm, 2.5m

Cada columna tiene su codigo individual en los datos siguientes

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LC/MS Columns Linearity Test

Número de compuestos con r2>0.996 diferentes concentraciones desde 0.001 a 0.200 mg/Kg,

3 replicas por concentración (18 inyecciones).

37

29

38

30

37

33

37

34

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3 4 5 6 7 8

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Prueba de anchura de pico LC/MS

Anchura de pico (anchura a mitad de altura) en segundos

Leyenda: Muy Ancho

Ancho

Bueno

Estrecho (muy bueno)

Todos los cromatogramas tienen la misma achura (2 min)

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Prueba de anchura de pico en columnas LC/MS

RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8

2.72 Methamidophos 27 37 18 18 16 28 24 20

4.77 Acephate 25 35 15 28 33 30 38 17

5.24 Omethoate 27 38 8 27 28 26 9 9

5.46 Aldicarb Sulfoxid 12 10 6 9 13 9 8 8

5.65 Aldicarb Sulfone 8 8 6 7 10 8 7 8

5.74 Oxamyl 8 7 6 6 9 6 7 6

5.87 Carbendazim 9 10 8 10 12 9 10 9

5.92 Demeton-S-methyl sulfoxide 8 8 7 8 7 7 8 7

6.01 Methomyl 6 6 7 6 8 7 8 6

6.11 Thiametoxam 4 4 4 4 4 4 4 4

6.29 Monocrotophos 7 7 6 7 7 6 6 8

6.61 Ethiofencarb sulfone 7 6 6 7 7 6 6 6

6.72 Imidacloprid 5 5 5 5 5 5 6 5

6.73 Ethiofencarb sulfoxide 7 7 7 9 5 7 6 6

6.94 Methiocarb sulfoxide 6 5 6 6 6 6 6 6

7.16 Carbofuran 3OH 6 6 6 7 6 6 6 7

7.20 Acetamiprid 7 7 7 8 7 7 8 8

7.37 Methiocarb sulfone 6 6 6 7 6 6 6 7

7.65 Thicloprid 7 6 7 7 6 7 7 7

8.13 Aldicarb 6 5 6 6 5 6 6 6

8.73 Dichlorvos 7 6 6 7 6 7 7 7

8.77 Imazalil 6 8 6 8 7 6 9 7

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LC/MS Columns Peak Width Test

RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8

8.85 Propoxur 7 7 7 7 6 7 6 8

8.90 Carbofuran 8 6 7 8 7 8 9 6

9.58 Spiroxamine 8 9 11 11 22 6 20 9

9.95 Diuron 6 7 7 8 6 7 7 9

10.40 Linuron 7 7 6 6 6 5 6 7

10.50 Methiocarb 7 6 5 6 5 5 7 7

10.60 Dimetomorph 22 22 16 18 9 23 23 21

10.60 Fludioxonil 4 3 3 4 3 12 4 5

11.00 Fenhexamid 5 4 5 6 5 6 5 5

11.20 Diflubenzuron 6 5 5 6 8 6 5 5

11.20 Picoxystrobin 7 5 7 6 7 7 6 8

11.30 Tebufenocide 6 5 7 7 6 7 6 7

11.60 Pyraclostrobin 7 6 7 8 6 6 8 7

11.70 Clofentezine 6 6 6 4 10 7 7 8

11.80 Indoxacarb 5 5 4 6 6 5 4 5

11.90 Trifloxystrobin 7 5 7 8 6 8 6 6

12.00 Hexaflumuron 4 4 4 5 4 4 4 4

12.20 Benfuracarb 5 5 5 5 5 5 5 5

12.30 Lufenuron 4 6 3 5 4 4 12 5

12.50 Flufenoxuron 5 5 6 7 7 6 5 5

13.00 Carbosulfan 3 3 4 4 2 5 6 4

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30

Methamidophos 0.100 mg/Kg

1

8765

432

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31

Acephate 0.100 mg/Kg

1

8765

432

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32

Omethoate 0.100 mg/Kg

1

8765

432

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33

Oxamyl 0.100 mg/Kg

1

8765

432

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34

+Hexaflumuron 0.100 mg/Kg

1

8765

432

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35

Trap 3DSensibilidad Full Scan

MS3 (o más)

QqQSensibilidad MRM

Pérdida de Neutros

Barrido de Precursores

Q TRAP

Sensibilidad Full Scan

MS3

Sensibilidad MRM

Pérdida de Neutros

Barrido de Precursores

Tecnologías MS

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Adquisición Dependiente de la Información (IDA)

Barrido en “Multiple Reaction

Monitoring” de cientos de compuestos

(solamente 1 transición por analito...)

Criterio IDA (umbral...)

Adquisición automática de espectros

en modo “Enhanced Product Ion

Scans” en la trampa

Sustracción de Fondo Dinámica y

Exclusión Dinámica

Búsqueda en bibliotecas de espectros

Umbral de señal Exclusión Dinámica

Barrido de MRM

Scans dependientes

Búsqueda de desconocidos

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Library CE=20V

Library CE=35V

Library CE=50V

CE=20VFit 0.956RFit 0.956Purity 0.955

CE=35VFit 0.953RFit 0.955Purity 0.951

CE=50VFit 0.735RFit 0.618Purity 0.607

Metalaxyl 0.009 mg/kg (0.010 mg/kg LMR en alimento infantil)

Metalaxil en uva

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Conclusiones

A través de los últimos años, se han desarrollado nuevas tecnologías en

LC/MS (Interfases ESI, columnas, Triple Quadrupolo, MS/MS, sistemas

más rápidos, Híbridos, etc.) permitiendo:

Una disminución increíble en los límites de detección

Aumento en el número de compuestos en un único análisis

Gran Selectividad

Preparación de la muestra más sencilla

Inequívoca confirmación espectral, full scan MS/MS o

Robustez del método que hace más fácil el trabajo en rutina de un

laboratorio de plaguicidas.

Y la historia continua...

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