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Instituto de Salud Pública de Chile

Cepas: Material de referencia, manejo y aplicaciones en el área de microbiología

Fabiola Rojas C.Microbiología MetrológicaSección Metrología Ambiental y Alimentos

Algo de historia ……

Microbiología

• Ciencia que estudia los MO, su biología, ecología y relaciones.

• Mucho antes que se descubriera el mundo de los MO , el hombre ya intuía laexistencia de «animales» o «miasmas» y sus efectos beneficiosos odevastadores.

• Los antiguos hebreos tomaban medidas profilácticas para evitar la propagaciónde enfermedades que incluían por ejemplo aislamiento, evitar comer ciertosalimentos, costumbres higiénico-religiosas .

Microbiología

• Fue sólo hasta 1676 cuando Leeuwanhoek comerciante que dedicaba parte desu tiempo para pulir lentes, desarrollo un microscopio primitivo con el cual logroobservar y describir unas pequeñas estructuras que llamó animalucos, lo cual enese momento creó un conflicto entre los partidarios de la generación espontáneay los partidarios de el origen de la vida a partir de organismos vivos.

• A fines del siglo XIX tuvo su desarrollo con el avance de conocimientos ydesarrollo de técnicas microscópicas.

Microbiología

• Con el transcurrir del tiempo y con las investigaciones de Redi, Spallauzani,Lavoisier entre otros, hasta llegar a 1861 en donde Louis Pasteur logródemostrar que en el aire había estructuras similares a las encontradas en elmaterial en descomposición.

• La microbiología en la actualidad es una ciencia especializada y exacta que conel tiempo se ha hecho indispensable para la industria y para la calidad denuestra vida.

Historia de la microbiología:

• Era de la Microbiología General y Médica

(1680-1940)

• Era de la Microbiología General y Biología

Molecular (1941-1985)

• Era de la Microbiología Molecular, Genómica yProteómica (1986- )

Relación de la Microbiología con otras ciencias

Microbiología

Biología

Físico química Física

Bioquímica

Ecología

Alimentos Biotecnología

Biología molecular

Genética

Farmacia Medicina

Química Matemáticas

Actualmente

Microbiología:

Los microorganismos han sido los primeros en aparecer en la evolución, y constituyen seguramente la mayor parte de la biomasa de nuestro planeta.

Dentro de los organismos de estudio se encuentran las bacterias, virus,protozoos, hongos microscópicos y también se ha incorporado el estudio delos priones, que no son microorganismos, sino que proteínas que causandiversas patologías y que, por lo tanto, son motivo de estudio.

Actualmente

Globalmente es aceptado que materiales de referencia son necesarios para asegurar la confiabilidad de los resultados

Microbiología:

Actualmente se disponen de herramientas tecnológicas para la investigación y labúsqueda de información que permita integrar las áreas del conocimiento referidas a laidentificación, autenticación, perfil de comportamiento y estudio de los factores internosy externos de los MO.

Disponer de procedimientos para la selección, adquisición, recepción, registro,almacenamiento y utilización de los materiales de referencia, del mismo modo quepara el resto de reactivos y materiales consumibles utilizados en los ensayos ycalibraciones.

Características MO

Agente

(cepa)

Patogenicidad

(genera enfermedad)

Contagiosidad

(capacidad propagación)

Infectividad

(proporción de expuestos)

Virulencia

(cap. de provocar daño

o muerte)

Invasión

(cap. de diseminar )

Aplicaciones

ADN/Genoma

Factores de virulencia

Desarrollo marcadores moleculares

Estudio vía metabólica

Origen y evolución de patógenos

Estudio gen funcional

Genómica Comparativa

Aplicaciones Moleculares

Estudios genotípicos

Secuenciación

Toxinotipado

Ribotipificación

Terminología

MATERIAL DE REFERENCIA:

• Material o substancia, en la cual uno o más valores de sus propiedadesespecificadas son suficientemente estables y homogéneas y estánclaramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración,evaluación de un método de medida o la asignación de valores amateriales.

[Guía ISO 30 Términos y definiciones utilizados en relación con los materiales de referencia

Terminología

MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO:

Caracterizado por un procedimiento metrológicamente válido para una omás propiedades específicas, acompañado de un certificado que proporcionael valor de la propiedad especificada, su incertidumbre asociada, y unadeclaración de trazabilidad metrológica.

[Guía ISO 30 Términos y definiciones utilizados en relación con los materiales de referencia].

La trazabilidad puede estar relacionada

con determinadas referencias de

estándares de medición (generalmente

estándares de medidas nacionales o

internacionales) a través de una cadena

ininterrumpida de comparaciones, con

todas las incertidumbres declaradas, el

productor de materiales de referencia y

sus colaboradores deberán proporcionar

la evidencia documental de la trazabilidad

de estas las mediciones.

Cuando esto no se puede lograr, el

productor material de referencia debe

proporcionar evidencia satisfactoria de la

correlación de los resultados con otros

valores indicados, ya sea por la evaluación

exhaustiva del proceso de medición o por la

correlación con materiales de referencia

certificados nacionales o internacionales

conocidos y aceptados.

Terminología

Cepa: células descienden de un único aislamiento de un cultivo puro, por lo general a partir de una sola colonia, aunque no necesariamente de una sola célula (es decir, no necesariamente un clon).

Autenticación: proceso de comparación de las características de una cepa para la descripción de la especie para determinar o verificar la identidad.

Caracterización: el proceso de someter una cepa a una serie pruebas morfológicas, fisiológicas, moleculares y / otras. La datos derivados se pueden utilizar para describir la cepa y objetivamente compararla con otras cepas.

Cultivo: población de células en un lugar y tiempo establecido.

Terminología

Caracterización

Identificación Fenotípica

Identificación Molecular

Identificación Fenotípica macro-microscópica :

Morfología, fisiología y bioquímica

tamaño, pigmentación, aspecto, comportamiento tinciones, características desarrollo ( O2, temperatura, tiempo), actividad frente AB, etc.

Identificación Molecular:

Análisis 16S rRNA ( PCR)

Secuenciación ADN, (técnicas químicas, enzimáticas, masivas)

whole genome, Hierarchical shotgun sequencing, (ambas por fragmentación aleatoria), next generation sequencing (NGS),

Terminología

Taxonomía (Nomenclatura de clasificación)

- Fenética (fenotipo)

- Numérica (agrupación por semejanza)

- Filogenética ( basado en relaciones evolutivas)

Características utilizadas en Taxonomía

1.- Clásica: Morfología ,Fisiología, Ecología, Análisis genético ( cap. Transferencia)

2.-Moleculares: Secuencia aa, Movilidad electroforética, Hibridación AN , Comparación AN, Secuenciación AN

Principales taxones

Dominio, Reino, Filo o división, Clase, Orden, Familia, Género, Especia, Morfovar, Biovar, Serovar, Fagovar, Patovar (propiedades)

Una nueva organización con nuevas géneros y especies, han dado lugar a una reclasificación taxonómica abarcando la diversidad total a partir de secuenciación genómica.

La imagen muestra una representación artística del nuevo árbol filogenético.

Terminología

Cultivo maestro: es el obtenido directamente del cultivo de colección y sirve para preparar los cultivos de reservas usados internamente.

Cultivo puro: cultivo a partir de un solo organismo.

Cepa control de calidad: una cepa previamente determinada para cumplir el criterio de desempeño de una prueba en particular.

Pasaje: transferencia de organismos a partir de un cultivo viable a un medio fresco con crecimiento del MO. (Subcultivo).

Cultivos en crecimiento activo están sujetos a cambios genéticos, pérdida accidental, contaminación, error humano al transferir y etiquetar, selección de líneas mutantes.

Terminología

Cepas de referencia: Microorganismos obtenido de una colección nacional o internacional reconocida.

Cepa de reserva: Cepas obtenidas a partir del cultivo de una cepa de referencia preparada y conservada por un laboratorio.

Cepas de trabajo: Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo precisen.

Subcultivo

ESQUEMA DE TRABAJOCepa de referencia

Cultivo maestro

Pureza-viabilidad

Pasaje

Cepa reserva

Autenticidad

Caracterización

Cepa de trabajo

Reconstitución

Pasaje

Cepas de Referencia

•Obtención directa a partir de una colección nacional o internacional

Las cepas de referencia pueden incluir:• Cepas positivas robustas con características típicas, • cepas positivas con crecimiento débil, • cepas bioquímicamente no reactivas (Ej.: aquellas que

muestran diferentes reacciones de fermentación o fluorescencia) y

• cepas completamente inhibidas.

Adquisición cepas de referencia:

NOTA: Los proveedores comerciales certificados por ISO 9001 comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en una colección reconocida, generalmente del 3er o 4° repique, las que sólo se pueden utilizar como cepas de trabajo.

Las cepas de referencia pueden obtenerse de organismos de colección como por ejemplo:

CAB International Mycological Institute (CMICC)

American Type Culture Collection (ATCC). (Colección Americana de cultivos tipo)

National Collection of Pathogenic Fungi (NCPF) Colección Nacional de Hongos Patógenos

National Collection of Type Cultures (NCTC) . Colección Nacional de cultivos tipo

Colección española de cultivos tipo (CECT)

National Collection of Food Bacteria (NCFB).Colección Nacional de Bacterias alimentarias

Cepas de Referencia.

Lista de colecciones

World Federation for Culture

Collection - WFCC

Su principal objetivo es la promoción y desarrollo de colecciones de cultivos de microorganismos y líneascelulares.

Las actividades fundamentales siguen siendo la continuidad y apoyo a las colecciones existentes, así comola asistencia y asesoramiento para ayudar a establecer nuevas colecciones. Los miembros de WFCCconstituyen una única red global para la preservación ex situ de la diversidad microbiana que sostiene lavida en la tierra.

WFCC tiene una preocupación constante en todos los aspectos referidos a la actividad de las colecciones decultivos, en particular, a la estimulación de nuevas iniciativas y al mejoramiento de los estándares decalidad de los servicios científicos que se proveen a la comunidad internacional.

La WDCM dispone de una codificación eficiente de las cepas definiendo un acrónimo de lacolección y un número WFCC que le permite dar a cada cultivo de la colección una IdentificaciónGlobal Única (Globally Unique Identifiers – GUID), combinando el acrónimo con su propio númerointerno.

El trabajo pionero de WDCM permite un registro apropiado y un manejo de la documentaciónrelacionada con las cepas.

Las colecciones deberían usar este sistema para ser parte de la red WDCM y estar conectados conla comunidad científica internacional.

World Data Centre for Microorganisms -WDCM

Preservación: para reducir al mínimo los riegos de pérdida de la cepa, la preservación la

realizan en al menos por dos métodos de crio-preservación (liofilización , nitrógeno líquido)

por lo menos en duplicado para ser almacenadas en lugares diferentes ( para no

perder la cepa en catástrofes naturales).

Autenticación: se basa principalmente en una caracterización polifásica (fenotípica y

genotípica) en base a las propiedades del MO. Las pruebas bioquímicas fueron y siguen

siendo fundamentales para autenticar muchas propiedades de los MO.

La caracterización genotípica se basa en secuenciación rADN (SSU 16S). Métodos

altamente específicos y sensibles independiente del estado fisiológico o de

desarrollo del MO.

Identificación: WFCC tienen la responsabilidad de proporcionar recursos con identidades precisas como materiales

de referencia si ofrecen un servicio público y deben hacer todo lo posible para asegurar que los organismos que

suministran son auténticos.

El proceso está diseñado de modo que los organismos experimentan el número mínimo de pasajes posible, para reducir la divergencia genética de la cepa.

Cepas de Referencia

Un proveedor de material de referencia MR y MRC debe brindar información a través de un certificado que acompañe al material. Y además deberá demostrar su competencia en la producción del MR.

Cepas de Referencia

Homogéneo

Estable

Con valores asignados a algunas de sus propiedades

Con incertidumbre asignada a sus valores

• Características de MR

Pureza: Condición de ser libre y exento de toda mezcla

Homogeneidad: Condición de tener composición y estructura uniforme respecto de uno o más de sus caracteres dentro de los límites establecidos.

Estabilidad de cultivos de referencia: Características de un cultivo de mantener, por un período de tiempo establecido, un valor declarado de sus propiedades dentro de los limites especificados.

Trazabilidad de cultivos de referencia: se considera que un cultivo de referencia es trazable si cumple con los requisitos taxonómicos definidos para esa especie microbiana y con aquellas características propias de esa cepa, de forma tal que los resultados de estas evaluaciones puedan ser reproducidos en otros laboratorios.

Qué debe contener un certificado?

Nombre y dirección del organismo de certificación

• Título del documento.

• Condiciones del certificado (provisorio)

• Nombre del material

• Número de muestra (Nº del lote puntual)

• Características del material

• Descripción del material

• Fecha de certificación

• Disponibilidad de otras formas y tamaño del MR

• Fuente del MR

• Proveedor del MR

• Preparador del MR

Qué debe contener un certificado?

� Condiciones de Almacenamiento

� Instrucciones para el uso correcto del MR

� Método de preparación del MR

� Determinación de homogeneidad y estabilidad (descripción de los ensayosrealizados)

� Valores obtenidos para una determinada propiedad y sus límites de confianza

� Valores asignados pueden ser generados por un laboratorios o un grupo delaboratorio

�� Incertidumbre

Colección de cepas

Para su selección:

Es necesario tener en cuenta el propósito al cual será destinado

1. Identificar las especificaciones requeridas con las de los MRC disponiblesen el mercado.

2. Consultar la información disponible: catálogos de fabricantes, bancos dedatos, publicaciones, recomendaciones

3. Asegurar que el MRC seleccionado está certificado para la medida opropiedad de interés y no es un valor meramente indicativo, y que suprocedimiento de certificación tiene un nivel de confianza apropiado y estásuficientemente documentado.

Colección de cepas

Para su selección:

Es necesario tener en cuenta el propósito al cual será destinado

Validación/ verificación métodoQC

Controles ensayos/ análisis (área ambiental, clínica, farmacéutica)Pruebas confirmativas

Evaluación desempeño medios de cultivo Estudio comportamiento a AB

Evaluación de procesos de esterilización.

Colección de cepas

Servicio de colección de cepas

Conservación ex situ del microorganismo

Custodios de los recursos nacionales

Otorgar seguridad , confidencialidad y licencia

Protocolos para una cuidadosa preservación y almacenamiento para mantener cultivos en forma segura y eficaz.

La utilización de un sistema de reserva de semillas para minimizar subcultivo

Caracterización completa de cada cepa para establecer la identidad38

Normas de Referencia

ISO Guía 30 Definiciones ISO Guía 31 Contenido

certificado y etiquetas

ISO Guía 33 Uso MRC

ISO Guía 34 Requerimientos generales para la competencia

de los productores MR

ISO Guía 35 Principios generales para estadística y

certificación

ISO 17025ISO 9000 Gestión y Calidad

Principios de MR

Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados son utilizados para demostrar:

• la exactitud de los resultados, • calibrar equipos, • controlar la calidad del laboratorio, • validar métodos y • permitir la comparación de métodos.

El procedimiento manejo de cepas se fundamenta en:

Principios de MR

En la reactivación de los cultivos de referencia certificados (liofilizados o congelados), a través de la utilización de medios de cultivo específicos,

Incubación a la temperatura y tiempo establecido para cada microorganismo,

Principios de MR

Verificación de la viabilidad, pureza, estabilidad y adicionalmente realizando pruebas para descripción de las características fenotípicas y genotípicas.

Seguido de preservación a través de los diferentes métodos disponibles en el laboratorio.

Cepa de Referencia

Para demostrar la trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de referencia de microorganismos suministrados por una colección nacional o internacional reconocida.

Las cepas de referencia se reconstituirán y someterán a los controles de pureza y ensayos bioquímicos que sean necesarios.

Serán subcultivadas una sola vez para obtener las cepas de reserva, de las que se obtendrán las cepas de trabajo.

Cepas de Reserva

Las cepas de reserva deben conservarse utilizando:• una técnica que mantenga las características deseadas de las cepas de referencia

( sin cambio genético).

Por ejemplo:• liofilización,• ultra congelación (-70ºC),• conservación en nitrógeno líquido, etc.

Cuando se descongelan las cepas de reserva no se deben volver a congelar y reutilizar.

Cepa de trabajo

Las cepas de trabajo, se conservarán en refrigeración durante un período de tiempo que asegure la viabilidad del microorganismo.

Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas y no deben sustituir las cepas de reserva.

Importante

En la práctica para cumplir con el requisito prevenir mutaciones, deterioro oalteración de las características típicas de las cepas de el número de repiques apartir de la cepa de referencia debe ser limitado.

En general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia conforme a lasrecomendaciones de la Pharmacopoeia (USP) las cuales han sido estimadas por Amarican Type CultureCollection (ATCC) y en este contexto ATCC lo hace válido si las cepas son adquiridas directamente aATCC.

Por otro lado, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recomienda hasta tres subcultivos delcultivo de reserva y hasta tres subcultivos del cultivo de trabajo, lo que significa obtener hasta 7 pasajes apartir del cultivo original de la cepa de referencia ATCC.

(Ref. Documento técnico N°6 ATCC)

Pasaje /Subcultivo

Cultivo Viable

Cultivo Fresco

Pasaje

Pasaje Pasaje

Procedimiento por el laboratorio

– Métodos para preservación cepa de reserva :

• Liofilización

Es un proceso de desecación a partir de un estado congelado.

Dentro de los agentes crioprotectores se incluye la leche descremada decalidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% p/v).

El producto liofilizado se puede conservar en refrigeración a temperatura ambiente por años.

Los envases deben estar debidamente identificados con nombre cepa, tipo yN° de colección, N° de repique, fecha de elaboración cepa reserva, fechavencimiento, N° tubo o crioval.

• Congelación a bajas temperaturas

• La congelación es un método de preservación a largo plazo, donde losmicroorganismos son resuspendidos en medios con algún agente crioprotector yson almacenados a temperaturas inferiores a 0°C

• (-20, -40, -70, -80° C ) en congeladores o en tanques de nitrógeno líquido.

Dentro de los agentes crioprotectores se encuentran:

• Glicerol al 20%.• Caldo cerebro corazón (BHI) con glicerol al 20%.• Leche descremada al 20%• Dimetil sulfoxido (DMSO) al 10%.

Puede adicionarse aditivos como el inositol.

• Las temperaturas de congelación deseable a -70°C , -80°C o menores.

A temperaturas de -20°C no es lo ideal pero tal vez es la única forma posible. Es preferible a -40°C.

Los envases pueden ser el uso de crioval o tubo estéril, sistema Cryobank.

Los envases deben estar debidamente identificados con nombre cepa, tipo y N° de colección, N° de repique, fecha de elaboración cepa reserva, fecha vencimiento, N° tubo o crioval.

El producto se puede conservar congelado por años.

Anotar en registro

–Preservación a Temperatura ambiental

Es una forma de mantener el cultivo generalmente para uso diario. Se utilizan tubos de cultivo tapa rosca, rotulados y con medio sólido. El cultivo se ha obtenido por incubación en el tiempo y temperatura apropiados para el microorganismo procesado.

Por un período más largo de almacenamiento, después de incubar añadir una capa de aceite mineral o parafina estéril que cubra el cultivo hasta 1,0 cm por encima de la superficie del agar. Sellar bien los tubos.

Realizar controles periódicos de pureza y viabilidad.

Factores que afectan la viabilidad de la cepa

La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de congelación (para su almacenamiento), está determinada por los siguientes factores:

a) Tipo de cepa: Ejemplo las bacterias Gram positivas resisten mejor las bajas T° que las Gram negativas.

b) Concentración del MO: determinado por las condiciones del cultivo.

El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser expuesto a

bajas temperaturas.

Factores que afectan la viabilidad de la cepa

Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas temperaturas:

• Cultivos demasiados jóvenes o demasiado viejos son menos resistentes al shock térmico.

• Ideal es al final etapa logarítmica principio fase estacionaria (108 ufc/mL, tiene mayor probabilidad de recuperación).

Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia a la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio sólido.

1.- La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del microorganismo de sobrevivir.

2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO también juegan un papel importante .

Recomendaciones

La manipulación y modo de conservación de los cultivos de referencia deben

evitar:

�• �El deterioro de las cepas

• �La contaminación cruzada

• Mutaciones

• Deterioro o alteración de las características típicas de las cepas.

• Su crecimiento característico debe ser documentado sobre cada medio en el

que se utiliza como cepa control.

Problemas asociados selección a MR/MRC

• Dificultad de localizar MRC los disponibles y de comunicarse con fabricantes ydistribuidores.

• Su alto costo, lo que limita su aplicación.

• Escasa información por parte de los fabricantes, lo cual dificulta la evaluación de siun determinado MRC es adecuado a los objetivos.

• El analito requerido no se encuentra certificado en una matriz idéntica o parecidaa la composición del producto o de la muestra.

• Dificultad en disponer de distintos niveles de concentración para evaluar elprocedimiento en todo su rango de aplicación.

• Una incertidumbre inapropiada para evaluar un procedimiento de medida.

• Su trazabilidad.

• Dificultad en su preparación.

GRACIAS

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