curso gen..[1]
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GENÉTICA MOLECULAR
Mgtr. Bettina L. Brusés
AÑO 2012
¿QUE ES LA PCR?
COMPONENTES DE LA PCR
REQUERIMIENTOS DE LA PCR
ADN, Templado, Molde o Target
Cantidad y calidad de la muestra de ADN no
necesita ser alta.
Una sola célula o un lisado celular con una
longitud promedio de unos pocos cientos de pares
de bases son adecuados para una amplificación
exitosa.
Criterio La muestra contenga al menos una
cadena
de ADN intacta que abarque la
región que
se va a amplificar.
Las impurezas estén lo
suficientemente
diluidas como para no inhibir la
reacción
Tipo de Muestra
Fresca
Archivo
Antigua
Componentes de la PCR
Primers, Cebadores o Iniciadores
§ Fragmentos complementarios que se van a unir a una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.
Tamaño: 20- 25 nucleótidos de longitud. Generalmente es entre 18- 30 nt.Temperatura de Fusión: 50- 65º C.Contenido GC: 40- 60%.
Auto- complementariedad
Debe ser evitada para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dímeros de primers
Similaridad: Debe tener el 100% de apareamiento con el molde
DNA Polimerasa
Concentración Recomendada: entre 1 y 2.5
unidades por 100 ul de reacción.
Si la concentración de la enzima es muy alta, se
acumulan productos no específicos, y si es muy baja se
formará una cantidad insuficiente del producto deseado
1983: Se usó ADN polimerasa de la bacteria E.
coli.
Se desactiva a elevadas temperaturas
necesarias
para desnaturalizar la doble cadena de
ADN.
1988: Reemplazo por ADN polimerasa de bacteria
“termófila” Thermus aquaticus (Taq). Actúa entre 75- 80º
C.
Concentración de Magnesio
Afecta
Alineamiento de los primers
Temperatura de disociación de las cadenas de
ADN
Especificidad del producto
Formación de dímeros de primers
Actividad y fidelidad de la enzima
Desoxinucleótidos trifosfatos, dNTP´s
dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
Deben ser usados en concentraciones
equivalentes para minimizar errores de
incorporación de bases.
Buffers y Sales (KCl)
Buffer recomendado para PCR: Tris- HCl
(pH 8.3- 8.8).
KCl: arriba de 50 mM inhibe la actividad de la
enzima Taq polimerasa.
TERMOCICLADOR DE ADN
AMPLIFICACIÓN EXPONENCIAL DE LA PCR
PCR
Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias y
Cáncer Diagnóstico de Infecciones
Aislamiento de Genes
Investigación Forense
Aplicaciones de la PCR
Estudios de Evolución
Estudios de Identidad y Filiación
Ventajas de la PCR
Alta especificidad
Alta sensibilidad
Rapidez en la obtención de los resultados
Amplio rango de muestras biológicas
Se puede estimar la carga parasitaria
(cuantitativo)
La caracterización molecular del amplicón
permite generar información genotípica útil: -
Estudios Clínicos (respuesta a tratamientos,
resistencia a drogas).
-
Epidemiología molecular
Limitaciones de la PCR
Contaminación por arrastre de
amplicón – falsos positivos.
Inhibidores de la muestra-
falsos negativos.
Controles de PCR
Control Positivo de Extracción Muestra que contiene el ADN blanco preparado con los mismos reactivos de extracción y amplificación que muestras problema Control Negativo de Extracción Muestra negativa preparada con los mismos reactivos de extracción y amplificación que muestras problema Control Positivo de PCR Cocktail de reactivos con dilución de ADN en el límite de corte y/o límite de detección del método ( control fuerte y control débil ) Control Negativo de PCR Cocktail de reactivos sin DNA.
SIEMBRA Y CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN CUBA HORIZONTAL
VISUALIZACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR
Siembra del gel
Electroforesis en geles de agarosa
Bromuro de Etidio
VARIANTES DE LA PCR
Se somete el ADN purificado a la amplificación por PCR de
la manera anteriormente descripta en presencia del par de
primers dirigidos contra el kinetoplasto.
Con los productos de amplificación de la primer PCR, se
realiza una segunda reacción de PCR en condiciones de baja
astringencia: elevadas concentraciones de enzima (Taq ADN
polimerasa), baja temperatura de annealing, y solamente un
único primer.
LOW STRINGENCY SINGLE SPECIFIC PRIMER PCR (LSSP-
PCR)
LOW STRINGENCY SINGLE SPECIFIC PRIMER
PCRBajo estas condiciones, el oligonucleótido se hibridiza
con elevada especificidad a su extremo complementario
y con baja especificidad a múltiples sitios dentro del
fragmento generando un patrón electroforético
altamente específico para cada clon del parásito
(Andrade et al., 1999).
Se hace una corrida electroforética en gel de
poliacrilamida al 6% en buffer TBE utilizando la cuba
vertical, y posteriormente se tiñe el mismo con NO3Ag.
100bp
200bp
300bp
MPM C-C+
MPM C-C+
LSSP - PCR
elevada cc de taq, 1 solo primer y baja Tº de annealing
LSSP-PCR
11 12 13 14 Mn IG C- 14 MPM
RT- PCR
RNA Una sola hebra Sensible al calor
Transcripción Reversa antes de la PCR
a partir de una copia de la hebra de RNA
cDNA (DNA complementario) estable al calor resistir PCR
PASOS DE LA RT- PCR
1)Unión del primer a la secuencia de ARN
objetivo.
2)La polimerasa cataliza la extensión del
primer mediante la incorporación de
nucleótidos complementarios.
3)Fin de la transcripción reversa, se obtiene
la hebra de cADN complementario al ARN.
4)PCR
RT- PCR
NESTED PCR
Dos procesos de amplificación sucesivos.
En la segunda PCR se utilizan unos primers contenidos
en la secuencia amplificada en la primera reacción.
El producto de amplificación de la primera PCR es el
molde de la segunda.
Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y
especificidad de la técnica, especialmente en el caso de
muestras de baja calidad o con un pequeño número de
copias de la secuencia a amplificar.
A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a
partir de un templado complejo, apareciendo un
barrido.
Se puede resolver utilizando un segundo par de
primers que hibriden un poco más internamente que
los primeros.
Se obtiene un producto único porque solo el
fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos
de hibridización para el segundo par de primers.
Nested pcr
Ventaja
Brindar alta sensibilidad y especificidad.
La especificidad aumenta porque como es
amplificación de un amplicón obtenido previamente,
los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro
de la molécula y el resultado será una única banda.
Se evitan posibles hibridaciones inespecíficas de
los cebadores.
Desventaja
No permite cuantificar la muestra.
Nested pcr
NESTED PCR
NESTED PCR
PCR MULTIPLEX
Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers
(hasta 8) lo que da una serie de productos. Se
amplifica simultáneamente más de una secuencia.
Se combinan dos o más pares de primers en un
mismo tubo, junto con el resto de los reactivos, para
amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN.
Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel
de agarosa.
Se usa frecuentemente en diagnóstico médico.
Ahorra templado, reactivos, tiempo y gastos.
Requiere una cuidadosa optimización
PCR MULTIPLEX
PCR TIEMPO REAL
La PCR en tiempo real da resultados cuantitativos.
Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la
relativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a
algunos métodos más viejos.
Los productos de amplificación se observan a medida
que transcurren los ciclos de la PCR.
PCR TIEMPO REAL
Está basado en:
• La detección y cuantificación de un reportero
fluorescente, cuya señal aumenta en proporción
directa a la cantidad de producto de PCR en la
reacción.
• El empleo de un termociclador que tiene acoplado un
sistema de detección que es capaz de adquirir y
cuantificar la señal emitida por el reportero al final de
cada ciclo para cada muestra.
Técnicas basadas en fluorocromos: el ADN, que
ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al
fluorocromo (generalmente SYBER Green)
produciendo fluorescencia que es medida por el
termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite
cuantificar sólo una secuencia por reacción. Es mucho
más económica que la que usa sondas específicas.
APLICACIONES DE LA PCR EN TIEMPO REAL
Monitoreo post transplante.
Genotopificación:
- Trisomías
- Microdeleciones
- Haplotipos
- Análisis cuantitativo de micosatélite
- Diagnóstico prenatal de células fetales en sangre
materna
VENTAJAS DE LA Real-time PCR
* No está influenciada por amplificaciones no específicas
* La amplificación es monitoreada en tiempo real
* No se realiza ningún proceso post PCR de los productos ( disminuye los riesgos de contaminación)
* Rápida (30 minutos a 2 hours)
* requirement of 1000-fold less RNA than conventional assays(3 picogram = one genome equivalent)
* detection is capable down to a 2-fold change
* confirmation of specific amplification by melting point analysis
* Más específica, sensible y reproducible
* No es mucho más costosa que la PCR convencional(excepto por los costos del equipamiento)
REAL TIME PCR
MUCHAS GRACIAS!!
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