control de calidad en parasitologÍa -...

Dra. Enedina Jiménez CardosoLaboratorio de Investigación en ParasitologíaHospital Infantil de México Federico Gómez

CONTROL DE CALIDADEN PARASITOLOGÍA

Programa de control de calidad

Toma de muestra5-10g en un recipiente de boca

ancha limpio, seco y libre de detergentes

Toma de muestra5-10g en un recipiente de boca

ancha limpio, seco y libre de detergentes

Calibrar el equipo(centrifuga y microscopio)

Verificar el buen estado de los reactivos y que la muestra no

presente interferencias

Calibrar el equipo(centrifuga y microscopio)

Verificar el buen estado de los reactivos y que la muestra no

presente interferencias

Reporte Post-AnalíticaReporte Post-Analítica

Transporte en Formalina al 5%Transporte en Formalina al 5%PROCEDIMIENTO

Realizar análisis coproparasitos-cópico por concentración: flotación o sedimentación

PROCEDIMIENTORealizar análisis coproparasitos-

cópico por concentración: flotación o sedimentación

Archivar una copia del resultadocon los datos del paciente, de la

muestra, del analista y del laboratorio

Archivar una copia del resultadocon los datos del paciente, de la

muestra, del analista y del laboratorio

Recepción Datos completos del paciente,fecha y hora de la recolecciónfecha de recepción, código de

la muestra

Recepción Datos completos del paciente,fecha y hora de la recolecciónfecha de recepción, código de

la muestra

Identificación de las formas parasi-tarias teñidas con lugol, usando

micrómetro Incluir control positivo,comparar con fotografías y laminillas de colección

Identificación de las formas parasi-tarias teñidas con lugol, usando

micrómetro Incluir control positivo,comparar con fotografías y laminillas de colección

Evaluación de resultadosReportar casos raros para los

estudios epidemiológicos y realizar una colección con tinción

permanente

Evaluación de resultadosReportar casos raros para los

estudios epidemiológicos y realizar una colección con tinción

permanente

Fase Pre-analíticaFase Pre-analítica Fase AnalíticaFase Analítica Fase Post-AnalíticaFase Post-Analítica

Diagnóstico de Parásitos intestinalesDiagnóstico de Parásitos intestinales

Analisis coproparasitoscopicoFase preanalítica

Toma de MuestrasCondiciones

Aceptables.La muestra será la primera de la mañana y remitida al Laboratorio.Si es un Bebé, la muestra se tomará del pañal.Tres días consecutivos.Se enviará en un frasco de boca ancha.

Inaceptables.Contaminadas con orina.Mas de cinco días de emisión.Almacenadas en temperaturas inferiores a 0°C, mayores a 50°C.

MANEJO.

Rotularla con la siguiente información.- Fecha de colección- Nombre y número de identificación del paciente.- Historia clínica con datos de importancia para el

diagnóstico correcto.

Coproparasitoscopico, transporte, ejecuciónFase preanalítica

Fase Analítica

LABORATORIO (a, b, c).

Debe contar con un área de recepción de muestras y otra para desarrollar la

metodología restringido para actividades tales como comer, beber, fumar.

a) MATERIAL. b) CRISTALERIA c) REACTIVOSCentrifuga. Cubreobjetos Formalina 5%

Microscopio óptico. Portaobjetos Lugol-Yoduro 2%

Densímetro Tubos de ensaye Sulfato de Zinc

Balanza granataria. (13x100mm) 33% δ 1.180.

Embudo de plástico.

Malla de alambre galvanizado.

Fase AnalíticaControl de Calidad

a) CALIBRACIÓN DEL MICROSCOPIO.

Controles, fotografías y laminillas de parásitos conocidos.

b) PRECAUCIONES.Uso de guantes, bata y trabajar en un área destinada únicamente al procesamiento de las muestras.Las muestras diarreicas deben analizarse en los treinta minutos siguientes a su emisión.

c) ERRORES.El que los reactivos no estén en condiciones óptimas.(Frascos con fecha de elaboración).Confusión de artefactos con formas parasitarias.Confusión de genero yo especie del parásito observado.Densidad del sulfato de Zinc a una densidad diferente

d) LIMITES DE REPORTE.Estadio del parásito.Género del parásitoEspecie del parásito.

Fase AnalíticaControl de Calidad

Artefactos más comunes en el análisis de concentración por flotación

1. La materia fecal contiene en muchos componentes entre ellos se encuentran:

1.1.- Residuos de alimentos.1.2.- Productos de digestión.1.3.- Células epiteliales, leucocitos, eritrocitos.1.4.- Levaduras y bacterias.

2. Es necesario hacer la diferencia entre los parásitos, de otros elementos presentes en las heces.

2.1.- Material derivado de células humanas.2.2.- Cristales de Charcot-Leyden

Fase AnalíticaControl de Calidad

2.3.- Células epiteliales.2.4.- Macrófagos2.5.- Leucocitos polimorfonucleares2.6.- Eritrocitos

3. Otros elementos.

3.1.- Algas3.2.- Conidias3.3.- Esporas3.4.- Elementos de plantas3.5.- Granos de polen3.6.- Esporas3.7.- Artefactos de tinción3.8.- Espirales vegetales3.9.- Levaduras

Fase AnalíticaControl de Calidad

artefactos

Fase AnalíticaDiagnóstico Presuntivo (1)

Procedimiento

ProtozoariosQuistes/Huevos

HelmintosLarvas

ProtozoariosQuistes/Huevos

HelmintosLarvas

Heces no preservadas

0.85% NaCL Formalina al 5 ó 10% Fijador de Schaudinn´s

Obtención Directa Concentración Tinciones permanentes

ProtozoariosQuistes/Huevos

HelmintosLarvas

ProtozoariosTrofozoitosY Quistes

Motilidad MorfologíaGeneral

MorfologíaPrecisa

Fase AnalíticaDiagnóstico presuntivo (2)

Procedimiento

HecesMuestra líquida

HecesMuestra líquida

5 a 10% deFormalina

Mezclar 3-4 gotas conPVA con la ó 2 gotas

de la muestra

Fijador deSchaudinn´s

Concentrarla Tinciónpermanente

Tincionespermanentes

Huevecillos o larvas de Helmintos

ProtozoariosHelmintos

ProtozoariosHelmintos

MorfologíaGeneral

Morfología precisaProtozoariosy/o Helmintos

Morfología PrecisaProtozoariosy/o Helmintos

• Van Leewenhoek conocido como el padre de la microbiología (1632)

• Realizo la primera observación de Giardia

• Ninguna relación entre el microorganismo y su patología

• En 1859, Vilem Lamblobservo Giardia en muestras de niños con diarrea

• Comensal• Giardia lamblia

Es el agente etiológico parásito más importante que causa diarrea en niños.Lewis, D.J. Dig Dis. 1992;10(2):102-11. Farthing, M. J. Gastoenterol

Clin North Am. 1996;25(3):493-515.

En Asia, Africa y Latinoamerica se reportan 200 millones de personas con Giardiasis sintomática y 500,000 casos nuevos de Giardiasis por año.

WHO (1996) The World Heath Report 1996, WHO.

Afecta un gran múmero de mamíferos entre ellos a los animales domésticos. Por lo que además de la importancia médica y veterinaria este parásito se hace peculiar por sus características genéticas que lo ubican ocmo el eukariote más primitido.

Upcroft, J; Upcroft, P. Bioessays. 1998;20(3):256-63.

G. intestinalis

Colonización

La ingestión de quistes permite pasar a éstos por el estómago y el desenquestamiento se lleva a cabo por al breve exposición con el ácido clorídico pH2, después de 5 a 10 minutos los trofozoítos colonizan la parte alta del intestino delgado.

Adherencia

Los trofozoítos se adhieren a la mucosa intestinal por el disco ventral

suctorio mediante microtúbulos que adheridos a la microbellocidad

intestinal provoca un aplanamiento de ellas y como consecuencia su

disfunción.

• Anaeróbico

• Amitocondrial

• Sensible a

fármacos

• Plásmido o virus

• Gen para toxina

• Dos núcleos

simétricos

• Citoesqueleto

desarrollado

• Cromosomas

múltiples

1. Núcleo2. Cuerpo medio3. Axonema4. flagelos

1. Núcleo2. Axonema3. Pared4. Cuerpos obscuros

• Asintomática•Portador

• Sintomática•Diarrea•Perdida de apetito•Calambres•Nausea•Pérdida de peso y deshidratación•Síndrome de malabsorción

giardiasis

diagnóstico

• El diagnóstico se hace al identificar los quistes y/o trofozoítos en heces.

• aspirado o biopsia duodeno-yeyunal.• El examen simple de una sola muestra de

heces no es suficiente (50-70%).• 3 muestras en un período de una semana

(90-95%).

Parasitosis intestinal por protozoarios

GIARDIASIS

HISTORIA NEGATIVO NO DESCARTARDIAGNÓSTICO

POSITIVO

TROFOZOITOS EN DUODENO

NEGATIVO

POSITIVO

DIAGNÓSTICOCONFIRMADO

NEGATIVO

NEGATIVO

POSITIVO

DIAGNÓSTICOCONFIRMADO

POSITIVOTRATAMIENTO

• DIARREA PERSISTENTE• MALA ABSORCIÓN• FLATULENCIAS

TROFOZOITOS O QUISTES EN MATERIA FECAL

DIAGNÓSTICO

1 200pb

1 2 3 4 Electroforesis en gel de agarosa al 1% en el que se observa: 1.- Marcadores de pesos moleculares.2, 3, 4.- Producto de RCP, fragmento de 1200pb que codifica para la enzima glutamato deshidrogenasa (gdh) de Giardia lamblia.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Análisis de los genes tsp11 y gdh de Giardia intestinalis

tsp11 gdh

Kpn I Xha I Hind III Sph I Apa I BspH I EcoRI Kpn I

Genogrupo Producto ProductoKb Kb

AI 1.80 + + + + 1.20 + + + +

AII 1.80 - - - - 1.20 + + + +

B No 1.20 - - - -Amplifica

transmisión zoonótica

transmisión zoonótica• 10% en perros bien

tratados• 36 a 50% en cachorros• hasta 100% en

criaderos.

En gatos es de 1,4-11% (dificultad para identificar el organismo)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A A2 A3 A4 B G

ASINTOMATICOS

SINTOMATICOS

CULTIVOS

PERROS

Genogrupos de Giardia intestinales y su relación al origen del aislamiento

Árbol filogenético del gen ribosomal 16S, de aislados de Giardia intestinalis humanos y

caninos

Aislado Grupo

1) Ad23 F

2) Ad28 B

3) Ad137 C

4) Ad148 D

5) Ad13 A

6) Bris136 AII

7) Rat G

PM F B E C D AI AII Gpb

2000 -1500 -

1000 -

500 -

Multiplex

MuestrasAssemblage A

AI AII

Cultivon=6

6/6(100%)

0/6

Humanon=12

5/12 (41.66%)

7/12(58.33%)

Perron=20

11/20 (55%)

9/20 (45%)

Totaln=38

22/38 (57.89%)

16/38(42.10%)

Genotipo de Giardia intestinalis en aislados obtenidos de perros y humanos, mediante la restricción del gen de β-

giardina