automatizacion microbiologia

UAP Universidad Alas Peruanas

UNIVERSIDAD ALAS PERUANASUNIVERSIDAD ALAS PERUANASFACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA

SALUDSALUDESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

TECNOLOGÍA MEDICATECNOLOGÍA MEDICAÁREA DE LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA ÁREA DE LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA

PATOLÓGICA.PATOLÓGICA.

Automatización en Microbiología Automatización en Microbiología

Lic. TM Luís Calderón CumpaLic. TM Luís Calderón Cumpa

IMPORTANCIA DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA EN LA PRACTICA

CLINICA

CONTROL DE INFECCIONES INTRAHOSPITALARIAS ESTUDIOS EPIDEMIOLOGICOS VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA EN INSTITUCIONES

HOSPITALARIAS USO EFECTIVO DE TERAPIA ANTIMICROBIANA

CICLO DEL SERVICIO CICLO DEL SERVICIO MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA

MédicosMédicos

EnfermerasEnfermeras

PacientesPacientes

ENTRADASALIDA

CLIENTESCLIENTES MÉDICO

VERIFICADO POR

PACIENTE

TECNOLOGO MEDICO

ENFERMERÍA

AUXILIAR LAB

SECRETARIA

Solicitud de exámenes

Recolección de muestras y transporte

Recepción de muestras y facturación

Recolección de muestras

Proceso de muestras

Reporte y validación de resultados

Impresión de resultados

Entrega de resultados

PROVEEDORESPROVEEDORES

Servicios a tercerosServicios a terceros

Casas comercialesCasas comerciales

EQUIPOS DE MICROBIOLOGIA

FASE POST ANALITICAFASE POST ANALITICA

FASE ANALITICAFASE ANALITICA

¿PORQUE LLEGAR A LA AUTOMATIZACION?

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE INFECCIONES

TINCION DE GRAM.

EL RENDIMIENTO DE LA TINCION DE GRAM PUEDE SER 20% MENOR EN PACIENTES QUE HAN RECIBIDO TERAPIA ANTIMICROBIANA PREVIA.

IDSA GUIDELINES AGOSTO 2004

CLINICAL INFECTIUOS DISEASES 2004; 39:1267-84

MUESTRACLINICA GRAM

SIEMBRA

AISLAMIENTOINTERPRETACION

ANTIBIOGRAMAIDENTIFICACION

AISLAMIENTOINTERPRETACION

Bacterias: como estafilococos, estreptococos, micrococos, neumococos, enterococos, bacilos de !a difteria y bacilos del ántrax.

Bacterias: como gonococos, meningococos, bacilos conformes, shígelas, salmonelas o vibriones del cólera.

COLORACIÓN GRAM

Poly Stainer : automático para la tinción de Gram.

totalmente programableAlmacena diez programas

diferentes, para definir el baño, el tiempo de inmersión y la agitación.

Primer Método utilizado (1966), Estandarizado 0.5 Escala Mc Farland (Turbidez-inoculo)

MIC MIC (Concentración (Concentración

Mínima Mínima Inhibitoria)Inhibitoria)

Concentración Concentración del antibiótico del antibiótico in in vitrovitro por método por método

cuantitativo.cuantitativo. 4 – 5 diluciones 4 – 5 diluciones

por antibióticopor antibiótico 17 – 27 ATB 17 – 27 ATB

/panel/panel

BP (Breakpoint)BP (Breakpoint) SusceptibilidaSusceptibilida

d d in vitroin vitro cualitativa (S, cualitativa (S,

I, ó R)I, ó R) ConcentracióConcentració

n de n de antibiótico antibiótico

equivalente a equivalente a las reglas las reglas

CLSI - CLSI - breakpointsbreakpoints

1-2 diluciones 1-2 diluciones por droga - por droga -

29-33 ATB por 29-33 ATB por panelpanel

ANTIBIOGRAMA

Criterios de Interpretación (R, I, y S)Los escatogramas o scatterplots

Para la interpretación de CIM y disco difusión . •Los aislamientos son analizados con los métodos estándar de difusión por disco y CIM del NCCLS. La CIM y su correspondiente diámetro de zona son delineados para cada aislamiento.

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE RESISTENTE A PENICILINA: EVALUACIÓN

CUANTITATIVO

2,0 g/ml

RR

<0,12 g/ml

SS II

0,12 - 1,0 g/ml

Hansman & Bullen, 1967, en Australia.

Appelbaum et al., 1977; Jacobs et al., 1978; Koornhof et al., 1978, en África del Sur. CIM2,0 mg/ml de penicilina

Resistencia se incrementa a nivel mundial, España, Africa del Sur, Sudeste Asiático y Estados Unidos

ANTIBIÓTICOS EN PANELES

Antibióticos que se liberarán en cuanto estén listos

Amikacina Ampicillina Ampicillina/Sulbactam* Ceftazidima Ceftriaxona Cefuroxima Ciprofloxacina Gatifloxacina Gentamicina Imipenem Levofloxacina Meropenem Moxifloxacina Nitrofurantoina* Norfloxacina Piperacillina/Tazobactam* Piperacillina* Tobramicina Trimetoprim/Sulfametoxazol

Antibióticos de incubación convencional

Amoxicillina/Clavulanato

Aztreonam

Cefazolina

Cefepime

Cefotaxime

Cefotetan

Cefoxitin

Cefalotina

Cloramfenicol

Tetraciclina

Ticarcillina

Ticarcillina/Clavulanato

* Antibióticos de incubación convencional en algunos paneles.

PAPEL DE LA AUTOMATIZACIÓN

Los sistemas automatizados acortan los tiempos porque mejoran la sensibilidad analítica de los métodos

Capaces de detectar el desarrollo bacteriano en una suspensión con y sin antimicrobianos antes que el TM detecte turbidez (fundamento de los sistemas automatizados)

Metodología: - colorimetría – turbidimetria - fluorometria, etc.

METODOS DE HEMOCULTIVOSMETODOS DE HEMOCULTIVOSMETODOS DE HEMOCULTIVOSMETODOS DE HEMOCULTIVOS

M E D IO LIQ U ID O

M E D IO B IFA S IC O S

IN D IC A D O R E S D E G A S

SIM PLES

LIS IS C O N C E N TR A C IO N

LIS IS C E N TR IFU G A C IO N

CONCENTRACION

M ANUALES

RADIOM ETRICOS

IN TE R M ITE N TE S C O N TIN U O S

NO RADIOM ETRICOS

LECTURA DE CO2 PRESION DE GASES

HEMOCULTIVOS

Síntomas de sospecha de bacteremia : Fiebre de origen desconocido (> 38°C) o hipotermia

(<36°C)shock, escalofríosInfecciones severas (meningitis, endocarditis,

neumonia, pielonefritis, Absceso abdominal…).Frecuencia cardíaca aceleradaAlta o baja presión sanguíneaAumento de la frecuencia respiratoria

DDiaia 1 1 al 15 al 15Paso 2 Paso 2

24 – 48 hrs 24 – 48 hrs

Paso 3 Paso 3

24 – 72 hrs.24 – 72 hrs.

MÉTODO TRADICIONAL

Se requiere un máximo de 15 díaspara descartar un negativo

Subcultivo Identificación yantibiograma

SISTEMAS AUTOMATIZADOS

PARA HEMOCULTIVOS

TECNOLOGÍA COLORIMÉTRICA

• Utilización de un sensor liquido tipo plasma.

• Membrana de silicona impregnada al plasma de sensibilidad

• Cambio sensitivo de CO2 diluido

• Generación de color permanente.

Bourbeau PP et al. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary. J Clin Microbiol.

2005;43:2506-2509

IMPORTANCIA DE LA AUTOMATIZACIÓN

TIEMPO DE RECUPERACIÓN

73% en Día 1 20% en Día 2 4% en Día 3 2% en Día 4 1% en Día 5

Estos resultados demuestran que el 97% de los aislamientos clínicamente significativos fueron recuperados en los 3 primeros días de incubación y el 93% dentro de los 2 días de incubación.

COLORIMETRICA Y TURBIDEZ Colorimetrica Colorimetrica

EnzimaticaEnzimatica

FluorescenteFluorescenteFluorescente y Fluorescente y

TurbidezTurbidez

SISTEMAS AUTOMATIZAD

OS

VITEX System

MicroScan WalkAway

Phoenix

Sensitre ARIS

Mini API

MICROSCAN

Presenta base de datos con información que incluye : Lista de 470 especies (Bacterias y

levaduras) lista para controles de calidad con cepas ATCC y lista de antibióticos un

promedio de 79 con dosificación y costoUtiliza un panel, que es una placa de 96

pocillos que contiene en forma deshidratada de 20 a 32 pruebas bioquímicas para la

Identificación (ID) y 17 a 33 antibióticos para MIC o BP

Tipos de paneles

Cromogénicos Convencionales (Gram positivos y Gram negativos.

Principio colorimétrico: Desarrolla colores en la serie bioquímica y turbidez en el antibiogramaCromogénicos rápidos: Permite la identificación en 4 horas, mide la actividad enzimática formadas en el aislamiento primario: Haemophilus y Neisseria, levaduras, anaerobios.Rápidos: fluorométricas de 6 a 8 horas.

EQUIPOS - LINEA MICROSCAN

AutoScan-4

Equipo semiautomatizado para identificación bacteriana y susceptibilidad antimicrobiana

Utiliza metodología colorimétricaEspectrofotómetro modificado con 6 longitudes

de onda y sistema de fibras ópticas para la lectura de los paneles en apenas 5 segundos

WALK AWAY 40/96

Equipo automatizado para identificación bacteriana y susceptibilidad antimicrobiana

Presenta dos metodologías: colorimétrica y fluorométrica

Contiene incubadora, pipeta de reactivos , lectora fotométrica e impresora.

Además lectora de código de barras que identifican al panel en cualquier posición

AutoScan-4

Walk Away

Capacidad de procesar simultáneamente 40 paneles (Walkaway40) o 96 paneles (Walkaway 96)

Los paneles conteniendo pocillos múltiples son inoculados manualmente con un dispositivo especial y luego colocados en la incubadora, el sistema dispensa reactivos y realiza lecturas periódicas

Los equipos vienes acompañados de un completo programa de Gerenciamiento de datos denominados : DMS y LabPro

SISTEMA DE GESTIÓN DE DATOS

Realiza búsquedas multíparamétricasInformes epidemiológicos completosFlexibilidadSupresión de antibióticosFinalización automáticaCopia de seguridad en discoNormas NCCLS

PHOENIX Sistema automatizado de identificación y sensibilidad Comunicación con el equipo por iconos. Capacidad de incubación de 100 paneles Sistema de fácil inoculación Control y calibración interna, no requiere mantenimiento. Lectura : convencional, fluoro génico y cromogénico. Medidas cinéticas de las reacciones: cada 20 min. Funcionamiento autónomo, incluyendo el sistema experto

BDXper. Conexión al sistema Epicenter Conexión al Sistema de Gestión de Laboratorio

PHOENIX: PANTALLA

PHOENIX: INSUMOS

Panel y sellador: bandeja de poliestireno, moldeada sellada y autoinoculante. 136 pozos: 51 ID y 85 en AST.

Caldo Phoenix ID y AST Indicador Azul de Alamar Estación de Inoculación Recipiente para paneles Nefelómetro Crystal Spec o BD

Phoenix Spec. Pipeta 25 ul con micropuntas.

PHOENIX: INSUMOS Identificación: 45 substratos:

convencionales, fluorogénicos y cromogénicos, Carbohidratos, fuentes de carbón o Esculina.

Sin adición de reactivos 5 bases de datos Resultados a 2,3,4, 6 y 12 hrs. Información de valores de

confianza y reacciones de los substratos.

B-Lact en la parte ID para los paneles G+

PHOENIX: INSUMOS Paneles para ID/AST Combo o

solo AST para 1x25: Gram negativos: NMIC/ID Gram positivos PMIC/ID Streptococcus SMIC/ID Panel de formato único:

NID,PID,PMIC,NMIC,SMIC. Temp. almacenamiento de

reactivos: ambiente. Bioseguridad: Cierre hermético Resultados rápidos: 80% de los

resultados de AST completo en < de 10h.

PHOENIX: INOCULACIÓN

Colonias puras, 18-24 hr de incubación.

Hacer escala de McFarland 0.5 o 0.25.

Añadir una gota del indicador azul de Alamar.

PHOENIX: INOCULACIÓN

Transferir 25 ul o 50 ul de inoculo ID al caldo AST.

Servir ambas soluciones en el panel según corresponde ID o AST.

Cierre el panel: hermético.

PHOENIX: INCUBACIÓN

1.- Escanear el código de barras.

2. Teclear o escanear el

numero de muestra.

3. Introducir el panel en el Phoenix.

PHOENIX: CONTROL DE CALIDAD

Lectura de lotes automática

Cepas ATCC variadas

VENTAJAS

Para el PacienteResultados rápidos: Esencial para pacientes

de enfermedades criticas, terapias mas precisas, reducir el tiempo de estadía

Alternativas de antibióticos Reducir combinación de terapiasReducir la Infecciones Intrahospitalarias

DESVENTAJAS

Se debe todavía aislar las bacterias y preparar una suspensión bacteriana para el inóculo.

Puede ser más caro el uso de insumos descartables.

Utiliza baterias de sensiblidad con antimicrobianos fijos, debiendo obligadamente adoptarse algunos de los paneles.

Incapacidad de examinar todos los grupos bacterianos clínicamente importantes.

Sobre los resultados de las pruebas de susceptibilidad se han reportado diversos

problemas, los fabricantes deben incluir sus limitaciones para algunas combinaciones

droga - microorganismo. El control de calidad es dependiente del uso

de cepas ATCC especificadas por el fabricante, además NCCL no provee

estándares al respecto.

IMPORTANCIA DE LA AUTOMATIZACIÓN

CONCLUSIONES

Tratamiento inicial acertadoBeneficios clínicos

Menor morbi-mortalidad Menor tiempo de internación Menor toxicidad Reducción de costos

Beneficios epidemiológicos Disminuir presión de selección de cepas R

VENTAJASVENTAJAS ESPECIFICACIÓNESPECIFICACIÓN

Impacto clínicoImpacto clínico

Rapidez en el resultado de 3 a Rapidez en el resultado de 3 a 10 horas.10 horas.

Inicio o cambio precoz del Inicio o cambio precoz del antimicrobianoantimicrobiano

costos hospitalización y costos hospitalización y análisis de laboratorio ,de usos análisis de laboratorio ,de usos

de antibióticos de antibióticos

Estandarización y control de Estandarización y control de calidadcalidad

de la reproductibilidad intra de la reproductibilidad intra e ínter laboratorio e ínter laboratorio

Disminución de la carga de Disminución de la carga de trabajotrabajo

Requieren menos personal Requieren menos personal

CONDICIONES SOBRE SU UTILIZACION DE LA AUTOMATIZACION EN MICROBIOLOGIA

VENTAJASVENTAJAS ESPECIFICACIÓNESPECIFICACIÓN

Disminución de errores Disminución de errores post analíticospost analíticos

Evita la transcripción Evita la transcripción errónea de resultados por errónea de resultados por el uso de programasel uso de programas

Utilización de sistemas de Utilización de sistemas de expertosexpertos

Permite actualizar Permite actualizar anualmente las guías de anualmente las guías de NCCLS que permite el NCCLS que permite el informe selectivo de los informe selectivo de los antimicrobianos. antimicrobianos. Monitorizar resultados Monitorizar resultados inconsistentesinconsistentes

VENTAJASVENTAJAS ESPECIFICACIÓNESPECIFICACIÓN

Patrones fenotipicos de Patrones fenotipicos de resistenciaresistencia

Permite sospechar la Permite sospechar la presencia de B lactamasas presencia de B lactamasas de espectro extendido y de espectro extendido y cefalosporinascefalosporinas

Facilita las estadísticasFacilita las estadísticas

Almacenar y procesar Almacenar y procesar información para una información para una análisis de tendencias análisis de tendencias anuales de susceptibilidadanuales de susceptibilidad

Facilita el control en el uso Facilita el control en el uso de antimicrobianosde antimicrobianos

Informe de resultados en Informe de resultados en línea con el comité línea con el comité farmacológicofarmacológico

DESVENTAJASDESVENTAJAS ESPECIFICACIONESESPECIFICACIONES

Alto costo (3 veces mayor que los Alto costo (3 veces mayor que los manuales)manuales)

El equipamiento y los insumos El equipamiento y los insumos (Paneles o Tarfetas ) - “Tarifas (Paneles o Tarfetas ) - “Tarifas diferenciadas o “Uso para diferenciadas o “Uso para Hospitalizacion y Criticos ”Hospitalizacion y Criticos ”

Requiere metodo de respaldo Requiere metodo de respaldo

Frente a cualquier falla se Frente a cualquier falla se necesita UN BACK UP o necesita UN BACK UP o Metodologia manual de Metodologia manual de reespaldo.reespaldo.

No existen normas NCCLS para No existen normas NCCLS para sistemas AUTOMATIZADOS, sistemas AUTOMATIZADOS, No aplicables a todas las No aplicables a todas las bacterias. bacterias.

Sin embargo, se deben considerar Sin embargo, se deben considerar los metodos empleados los metodos empleados (PUNTOS DE CORTE O MIC)(PUNTOS DE CORTE O MIC)

DESVENTAJADESVENTAJA ESPECIFICACIONESESPECIFICACIONES

Poca flexibilidad en los Poca flexibilidad en los antimicrobianos antimicrobianos ensayadosensayados

Paneles o tarjetas están Paneles o tarjetas están determinadas por el determinadas por el fabricante. fabricante.

Existen tarjetas especiales Existen tarjetas especiales pero requiere consumo pero requiere consumo mínimomínimo

DESVENTAJADESVENTAJA ESPECIFICACIONESESPECIFICACIONES

Discrepancia con métodos Discrepancia con métodos convencionales de convencionales de referenciareferencia

Problemas:Problemas:

Haemophilus Influenza Haemophilus Influenza Neumococos, Gram (-) no Neumococos, Gram (-) no fermentadores, y fermentadores, y Anaerobios . Anaerobios .

Cefepime y Pseudomonas Cefepime y Pseudomonas

Vancomicina (I) en el caso Vancomicina (I) en el caso de Enterococcus de Enterococcus

Imipenem ,falsa (R) o (S) Imipenem ,falsa (R) o (S) con Pseudomona y con Pseudomona y Acinetobacter baumanii . Acinetobacter baumanii .

DESVENTAJASDESVENTAJAS ESPECIFICACIONESESPECIFICACIONES

Discrepancia con Discrepancia con métodos convencionales métodos convencionales de referenciade referencia

Problemas: Problemas:

B lactamasa en algunos B lactamasa en algunos Gram negativos requieren Gram negativos requieren prolongada incubación prolongada incubación para expresar ( R ) para expresar ( R )

FDA recomienda para FDA recomienda para errores mayores (sistema errores mayores (sistema informe R siendo (S) ,la informe R siendo (S) ,la tasa no > 1.5% ,la tasa no > 1.5% ,la concordancia sea 90% , concordancia sea 90% , fallas de crecimiento =< fallas de crecimiento =< 10%10%