aspectos generales y fundamentos diagnósticos de la brucelosis
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M.V.MSc. Datty Rosales-Zambrano
Mérida, Julio de 2010
ESQUEMA
INTRODUCCION
ANTECEDENTES
ETIOLOGIA:
Taxonomía y relaciones filogenéticas de Brucella sp.
Características estructurales y antigénicas de Brucella sp.
EPIDEMIOLOGÍA
PATOGENIA
MANIFESTACIONES CLINICAS
RESPUESTA INMUNE EN BRUCELOSIS ANIMAL
METODOLOGÍA DE DIAGNÓSTICO:
Examen microscópico
Aislamiento y cultivo bacteriano
Serología
Diagnóstico molecular.
INTRODUCCION
Una las zoonosis bacterianas más importantes a nivel mundial, con
implicaciones de salud pública y económicas en la producción animal
( Godfroid y col, 2005; Smits y Kadri, 2005; Franco y col, 2007).
Brucella sp., es bacteria intracelular facultativa, gram negativa.
Descrita por:
Bruce, 1884. Micrococcus melitensis.
Dr. Bernard Bang. Bacillus abortus,1895. (Nielsen ,2002).
Animales es una patología reproductiva, en ocasiones asintomática
dependiendo de la especie afectada.
Humanos es una enfermedad sistémica, con implicaciones
importantes en la calidad de vida del paciente.
INTRODUCCION
En Venezuela se considera una enfermedad con
importantes implicaciones económicas en ganadería.
Descrita desde principios del siglo XX.
Hoy día debido al auge en la producción lechera con
búfalos de agua en la zona del Sur del Lago de
Maracaibo, es importante detectar la presencia de esta
enfermedad.
Empleando técnicas clásicas y moleculares para el
diagnóstico de Brucella sp.
Marston, 1859.
Bruce, 1884. Micrococcus melitensis.
Dr. Bernard Bang. Bacillus abortus,1895.
Comisión de Fiebre Mediterránea, 1905.
B. suis .Traum. 1914.
B. ovis .1953. Buddles y Boyes.
B. canis. Carmichael (Nicoletti,2002).
Brucelosis en el Mundo
ANTECEDENTES
En Venezuela:
Se reconoce por primera en 1926, entro con
importaciones de ganado lechero (Valera y
col,1995).
Dr. Kubes 1935, reporta en la región zuliana
(Briceño.1974).
M.A.C. en 1941, inicia producción de cepa 19
I.I.V, y establece Programa de Control y
Erradicación.
ETIOLOGÍA: Taxonomía y relaciones
filogenéticas de Brucella sp.
Phylum: Proteobacteria (16S r)*
Clase: Alphaproteobacteria
○ Orden: Rhizobiales
Familia: Brucellaceae
- Género: Brucella
- Especie: melitensis, abortus, suis, ovis,
canis,neotomae,cetaceae, pinnipediae
(NCBI,2009). B. microti
*: Rickettsias, Agrobacterium,Rhizobium.
Cocobacilos, gram negativas, inmóviles, no
esporulados, aeróbicos y carboxifílicos, en
cadenas o pares (Contreras,1992; López y
col,1991 y García,1999).
Intracelular facultativa (Schuring,1999).
Colonias pequeñas, húmedas y brillantes, pueden
se L,R o M.
Requerimientos complejos: CO2, medios ricos,
temp. 37 C°, minimo 5 días incubación.
Afecta animales y hombre (López y col,1991).
ETIOLOGÍA: Taxonomía y relaciones
filogenéticas de Brucella sp.
Las brucelas clásicas, se dividen en biotipos: características BQ y reacción a suero A (abortus) y M (melitensis).
Tienen predilección por un hospedero.
Genoma 3.2 Kpb: Cromosoma I : 2.1 Kpb
Cromosoma II: 1.1 Kpb
Proporción G+C 59%
Carece de plásmidos (Castro,2005).
ETIOLOGÍA: Taxonomía y relaciones
filogenéticas de Brucella sp.
ÁRBOL FILOGENÉTICO DE SEIS ESPECIES
DE BRUCELAS
Michaux-Charachon y col,1997
ESPECIE VIABILIDAD
B. abortus
114 días
TEMPERATURA FUENTE
Agua -4°C 24 horas 18 meses 6 semanas
<4 días
Leche Leche Crema Suero de leche
25-35°C 0°C 4°C
17-24°C
4 semanas Crema 4°C
B. melitensis
15-100 días
48-72 horas 11 semanas
15-24 horas 18 meses
1-8 semanas
142 días
Quesos varios
Queso fresco de cabra
Leche
Queso blanco Mantequilla
Helado
- - -
37°C 4°C
37°C 4°C
- - -
4°C
0°C 30 días
Supervivencia de Brucella en alimentos
ETIOLOGÍA: Características estructurales y
antigénicas de B. abortus.
Membrana externa rica en: FL,
LPS,y proteínas, FDC y lípidos
de ornitina con AG largos (Joklik
y col,1994).
Algo permeable a agentes
hidrófobos.
Similar a las enterobacterias
(López y col,1991).
Tomado de Castro.2005.
ETIOLOGÍA: Características estructurales y
antigénicas de B. abortus.
Lipopolisacárido (LPS-S):
2.5-3% peso seco.
Constituido por:
○ Porción glicolípido (Lípido A), endotoxina.
○ Polisacárido (Núcleo + Cadena O)
CO*: homopolímero de N-formilperosamina (α1-
2 [A]α 1-3[M]).
Difiere de las EB:
No activa vía alterna del complemento
Baja endotoxicidad
Alta resistencia a degradación macrofágica
Capacidad de inducir RI (Lapaque y col,2005).
* Reacción cruzada
ETIOLOGÍA: Características estructurales y
antigénicas de B. abortus.
Proteínas de Membrana Externa (OMP´s):
Grupo 1 (94-88 KDa)
Grupo 2 (36-38 KDa porinas)
Grupo 3 (31-34 y 25-27 KDa) Gupta y col,2007.
Lipoproteínas: bajo PM, omp 10,16 y
19..respuesta proinflamatoria (Giambartolomci y
col,2010).
ETIOLOGÍA: Características estructurales y
antigénicas de B. abortus.
EPIDEMIOLOGIA: Distribución
Mundial.
B. canis es universal y B.ovis donde
la cría es importante.
Países libres: Canadá, Australia,
Nueva Zelanda, Noruega, Suiza,
Suecia, Reino Unido, Bahamas,
Bermuda, Islas Vírgenes, Curazao,
Martinica, Guyana, Trinidad y Tobago
(Seleen y col,2010).
Pérdidas en LA por brucelosis bovina
600 $ anuales.
Tomado de: Pappas,2005
Considerada hoy día una zoonosis re-emergente.
Cada país posee un Programa de Control y
Erradicación de la Brucelosis Animal.
Hoy día la vacuna más ampliamente usada es la B.
abortus RB51, también B. abortus S19 y B. melitensis
Rev1.
En rumiantes 1-9 % novillas nacidas de madres
infectadas son Portadores Latentes (Bishop y col,1994).
Rebaño bufalinos endémicos a B. abortus 20%
seronegativo a pruebas de rutina (Borriello y col,2006)
EPIDEMIOLOGIA
PREVALENCIA EN VENEZUELA DE LA
BRUCELOSIS BOVINA
Valores reportados oscilan entre 0.8 y 1.2% y se ha mantenido estable en el tiempo (González,1999).
Otros autores empleando diferentes técnicas serológicas describen valores de 10.5% con ELISA, 8% con FC y 5% con RB (Rivera y Curiel,1993).
Importante en estados ganaderos destacando: Zulia, Monagas y Apure.
Brucelosis en Venezuela
AÑO # SEROAGLUTINACIONES # POSITIVOS % POSITIVIDAD
# VACUNACIONES
1997 565.297 4.633 0.82
231.604
1998 496.138 3.374 0.68
162.326
1999 464.025 3.135 0.68
206.130
2000 571.195 5.003 0.88
232.640
2001 413.690 3.717 0.90
424.811
2002 412.393 3.447 0.84
142.280
2003 439.463 4.208
0.95 204.982
2004 642.207 7.136
1.11 271.204
2006 2.258.385 34.033
1.51 478.342
BOVINOS SEROPOSITIVOS A BRUCELOSIS
BOVINA EN VENEZUELA AÑOS 1991-2006
61754149 4467 4442
6357 60455072 4172
31355003
3717 3447 4208
7136
34033
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2006
Años
No
.Se
rore
ac
tore
s
PROGRAMA CONTROL Y ERRADICACION (2003)
Vigilancia Epidemiológica
Diagnóstico Sistemático con criterios epidemiológicos, clínicos y de laboratorio.
Identificación, aislamiento, seguimiento y remisión al matadero.
Sacrificio animales positivos.
Medidas de control de movilización.
Caracterizar la enfermedad en cada entidad.
Vacunación antibrucélica obligatoria a sps. Susceptibles.
Elaboración de manuales de procedimientos para Centros de diagnósticos veterinarios.
Producción y abastecimiento oportuno de Antígenos.
Programa de Formación y Acreditación de Veterinarios en general.
Bacteria intracelular facultativa.
Infección crónica persistente
Desarrolla una respuesta inflamatoria granulomatosa
(TL y SRE).
Ubicación en tracto reproductivo (Sxs.,clínicos), y
susceptibilidad por edad.
Patogenicidad de las cepas asociadas a diferencias
estructurales y BQ.
Cepas con preferencia por hospederos pero pueden
darse en distintas especies animales.
PATOGENIA Y PATOLOGIA EN BRUCELOSIS
ANIMAL
Corbel,2006
PATOGENIA Y PATOLOGIA EN BRUCELOSIS
ANIMAL
La difusión de la brucelosis se realiza por
la eliminación de brucelas por vía
vaginal/mamaria luego de abortos o partos de
animales infectados.
La cantidad de brucelas excretadas es variable y
puede alcanzar hasta 1x1014/gramo de placenta
(rumiantes).
La eliminación de brucelas por vía mamaria es
intermitente pero se puede extender a lo largo de
la lactancia.
La eliminación de brucelas por vía vaginal puede
comenzar una semana antes del parto/aborto
hasta 45-60 días posteriores al mismo.
PATOGENIA Y PATOLOGIA EN BRUCELOSIS
ANIMAL
Brucella sp.
Mucosa oral o nasal Fagocitos
infectados por
Brucella sp. Circulando libre
GANGLIOS REGIONALES
(Linfoadenitis/
Adenomegalia)
PROCESO PUEDE DURAR MESES
UBICACIÓN SECUNDARIA
Brucella sp.
Destruida por MO o PMN Coloniza SRE
Animal Gestante Vía hematógena
Útero
Trofoblasto eritofagocítico del placentoma
Infección contigua
Trofoblasto de la membrana corioalantoidea
(Ulceración y ruptura de la membrana)
Vía hematógena Feto y placentoma
A diferencia de otras bacterias Brucella
posee determinantes moleculares que le
permiten:
Invadir
Resistir la muerte intracelular y
Alcanzar su nicho de replicación en
células fagocíticas no profesionales y
profesionales.
FACTORES DE VIRULENCIA DE Brucella
Genes requeridos de B. abortus 2308 para
expresión optima de HF-1 durante la fase
estacionaria
Roop y col, 2008.
Signos Clínicos:
Abortos
SMP
Disminución de la producción de leche (<20%)
Placentitis
Retención de Placenta
Epididimitis
Orquitis
Seminovesiculitis
Equinos: inflamaciones bursatiles crónicas en
cuello y cruz (Nielsen,1990)
RESPUESTA INMUNE CONTRA Brucella sp.
Tomado de Pappas,2005
RESPUESTA INMUNE HUMORAL
Ig M:
Detectable 8-15 días
post-inoculación o
vacunación.
Declina luego de 12
meses.
Reacciones
inespecíficas o
cruzadas con otros
Ag´s (Nielsen, 1996).
IgG:
Detectables 15 días post-
inoculación o vacunación.
IgG1: es abundante y
persistente.
IgG2: no valor Dx.
Efecto gestacional.
A pH´s acidos o muy
básicos bloquean las
aglutinaciones
inespecíficas de otros
isotipos (FAO/OMS,1986)
DIAGNOSTICO
1897 Wrigth-Smith, describió la primera
técnica de aglutinación.
1909, diseño de fijación de complemento.
Década 70´s ELISA.
En los 90´s FPA y PCR (Nielsen,1999).
Métodos Directos: Aislamiento-Cultivo y PCR.
Métodos Indirectos: RB, FC, SAT, ELISA-I y
ELISA-C,PAL,FPA (Nielsen,2002).
A partir de muestras biológicas, órganos y
tejidos.
Gold Standard para comparativo entre pruebas Dxs.
Largo y complejo procedimiento.
Muchas veces infructuoso por baja [bact].
Medios aislamiento 1rio: Ruiz Castañeda, SDA, TSA.
Medios Selectivos: Farell (SDA+Suplemento
brucella, TSA + antibioticos+ 5% suero equino, 2%
glucosa y 1% NaCl) (FAO/OMS,1986;Mayfield y
col,1990).
CULTIVO BACTERIANO
Diferenciación Brucella
Además de las pruebas antes descritas, es recomendable realizar
las siguientes pruebas especiales:
- Fagotipia con los brucellafagos de referencia: Tbilisi, Weybridge, y
Berkeley cuando menos.
- Aglutinación con sueros monoespecíficos anti-A y anti-M
- Crecimiento en colorantes especiales (Tionina y Fucsina)
TECNICAS SERÓLOGICAS CLASICAS
SAT: lentas en tubo con fenol, 2-ME y modificación en microplaca.
Aglutinación rápida: Huddlesson, Rosa de Bengala (RB), Ag buferado (BAP).
Fijación de Complemento.
Ensayos Inmunoenzimáticos: ELISA-Indirecto
ELISA-Competitivo
FPA (OIE,2004).
TECNICA FENOL 2-ME RIVANOL RB FC PAL ELISA-I ELISA-C FPA
Antígeno
(% C.C.)
B.abortus S99
o 1119-3
12 12 11 8 2 4 sLPS sLPS OPS 22
Kda
Igs M,G y A G y A:
G1
G M,G G1 A, M,G G1 G1
Sens.(%) 29.1-100 56.2-100 50.5-100 21.0-
98.3
23.1-97 92.5-100 97.5-100 99.0-99-3
Espec. (%) 99.2-100 99.8-100 21.9-100 68.8-100 30.6-100 90.6-100 99-7-99.8 96.9-100
Uso Complem
entaria
Comple
mentaria
Complementa
ria
VE Comple
mentaria
VE Complemen
taria
Complementa
ria diferencial
Compleme
ntaria
diferencial
DIAGNOSTICO MOLECULAR
Kary Mullis. Cetus Co. Calfornia. USA.1986.
PCR en Brucelosis
Alta sensibilidad, especificidad, rápido y
económico.
Secuencias usadas:
IS711 (Bricker y Halling,1994)
16sRNA (Romero y col,1995)
OMP31(Baily y col,1992; Streevatsan y
col,2000).
BCSP-31 (Guarino y col,2000)
Se pueden usar muestras clínicas: sangre
completa,suero, leche, semen, tejidos.
AUTOR PRIMERS AMPLIFICADO LIMITE
DETECCION
Romero et
al,1995
F4-R2. 16sRNA
B.abortus
905 pb 170 UFC/ml
B.abortus 2308.
1700 UFC/ml
B.melitensis 115
Leal-Klevesas et
al,1995
JPF-JPR. Omp-2
B.abortus
B.abortus
1,2,3,4,5,6,7,9
B.melitensis
1,2,3
B.suis 1 y5
193 pb 10 cel/ml
Baily et al, 1992 B4-B5. BSCP-31
B.abortus
223 pb
PCR en Brucelosis
Técnicas para caracterización de cepas
y biovares:
AMOS-PCR (Bricker y Halling,1994).
Multiplex (García-Yoldi y col,2006)
RFLP-PCR con IS711 (Halling y col,1993)
Genotipificación: SNP’s (Scott y col,2008)
PCR-Multiplex (García-Yoldi,2006).
Bruc
elas
mar
inas
B. m
elite
nsis
B. m
elite
nsis
REV1
B. o
vis
B.ab
ortu
s
B. a
bortu
s RB
51
B. a
bortu
s S1
9
B. su
is
B. ca
nis
B. n
eoto
mae
Amplificado
Regulador transcripcional de la familia CRP152
rpsL que codifica a una proteína ribosomal
S12218
Proteína transportadora que pertenece a la
familia ABC272
eryC que codifica para una D-eritrulosa-1-
fosfato deshidrogenasa587
Polisacárido desacetilasa794
omp31 que codifica a una proteína de
membrana externa1071
bp26 que codifica para un antígeno
dominante450
Blanco
Tam
año
del
ampl
ifica
do (b
p)Especies que amplifican
wboA que codifica para una
glicosiltransferasa1682
1. Brucelas marinas
2. B. melitensis
3. B. melitensis Rev1
4. B. ovis
5. B. abortus
6. B. abortus RB51
7. B. abortus S19
8. B. suis
9. B. canis
10. B. neotomae
PCR-Multiplex (García-Yoldi,2006).
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