análisis de trazas de somatropina en leche por lc-ms/ms y ... · • es una matriz compleja, con...
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Análisis de trazas de Somatropina en leche por
LC-MS/MS y en modo MRM3
Dr. Fernando A. Iñón
Gte. investigación y Desarrollo – Gte. Capacitación y Aplicaciones
JENCK S.A.
11 de junio de 2015
SEGUNDAS JORNADAS DE ACTUALIZACIÓN ANALÍTICA INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL
CENTRO DE INVESTIGACIONES TECNOLÓGICAS DE LA INDUSTRIA LÁCTEA
INTI Lácteos - Sede Rafaela
Temario
• Importancia de la determinación de somatropina en leche
• Qué es y cómo funciona un LC-MS/MS y que tipo de
espectrómetros existen
• Ventajas y aplicaciones de equipos MS/MS híbridos
• Determinación de somatropina en leche mediante MRM y MS3
JENCK S.A.
• RECURSOS
o HUMANOS
o INFRAESTRUCTURA
JENCK S.A.
• Asesoramiento y provisión
de Instrumental analítico
• Calificación, certificación y
mantenimiento de
instrumental
• Capacitación
• Cursos
• Seminarios
• Desarrollo de aplicaciones
Capacitación Jenck S.A. 2015
• Cursos teórico-prácticos dictados en JENCK
• Seminarios de Innovación y Divulgación Tecnológica
• Seminarios del Departamento de Servicios de Posventa
• Cursos a medida (dictados en planta o laboratorio del cliente o
en JENCK)
• Cursos fuera de nuestra sede, en vinculación con universidades
y centros de investigación de todo el país
NOTIJENCK.COM.AR
GERENCIA DE
CAPACITACIÓN Y APLICACIONES
cursos@jenck.com .:. www.jenck.com
TEL: (54) 11-4014-5300 .:. FAX: (54) 11-4014-5353
Somatropina en leche
• Tratamiento de vacas con Somatotropina Bobina recombinante(rBST) • aumentar su producción en leche (de 10-15%)
• promover su crecimiento,
• Favorecer, según ciertos estudios, la fertilidad.
Somatropina bovina recombinante en leche
• Tratamiento prohibido en muchos países • Comunidad Europea, Japón, Australia, Nueva Zelandia, Canadá,
• …Argentina (¿?!)
• se utiliza comúnmente en los Estados Unidos, ya que está autorizada por la FDA desde 1994.
• La mayoría de los métodos analíticos utilizados para detectar esta hormona implican inmunoensayos, • Incapacidad de diferenciar la hormona natural y la versión recombinante
• La rbST en leche se la encuentra presente en baja concentraciones (~ ng/ml, ppb), • La metodología implementada debe poser buena sensibilidad con elevada
confianza en su confirmación definitiva.
Somatropina bovina recombinante en leche
• De todas las matrices, la leche es la matriz más complicada para detectar rBST, ya que: • es una matriz compleja, con alto contenido de proteínas, lípidos y azúcares;
• contiene un gran número de proteínas que presentan propiedades fisicoquímicas similares a la rBST
• la concentración de rBST muy baja
• la caseína puede actuar como secuestrador de rBST • Secuestro de proteína: donde la proteína activa (en este caso la rBST) se un une a
un complejo proteico inactivo (en este caso la caseína)
• Remoción anticipada de caseínas podría afectar la recuperación de rBST
• La cuantificación de proteínas, especialmente en matrices ricas en proteínas, siempre ha sido un desafío
• Para resolver estos problemas, se debe utilizar técnicas especializadas • Que pueda validarse y defenderse legalmente
Somatropina y somatropina recombinate
• La formas natural y recombinante difieren por un aminoácido N-terminal,
• rBST, 190 aminoácidos, Peso molecular: 22kDa
• Ligera diferencia, pero significativa para que un método basado en espectrometría de
masas sea una alternativa viable
• varias ventajas, incluyendo la especificidad y sensibilidad.
Metionina Alanina
2 ptes disulfuro
53-164,181- 189
Somatropina bovina recombinante en leche
• Es necesario contar con una tecnología analítica diferencial
capaz de discriminar entre el efecto matriz y el analito en
cuestión (rbST);
• al intentar eliminar los interferentes de la matriz solamente por
métodos físico-químicos (extracción líquido/líquido, evaporaciones,
extracción y/o dispersión en fase sólida, cambio de fases, ect.), al fin
de obtener un extracto de inyección aceptable, involucra que en cada
paso adicional de limpieza disminuye el porcentaje de recuperación
del analito.
Comparación de metodologías
Inmunoensayos Se basa en la detección de la proteína entera
a través su unión a anticuerpos específicos
+ -
Alta sensibilidad No discrimina entre
BST y rBST
Facil de realizar
Cuantitativo
Espectrometría de masas
+ -
Discrimina entre BST
y rBST
Dificulta en la
purificación de la
matriz
Altísima sensibilidad No es fácil detectar
la proteína entera,
Digestión enzimática
previa para enfocarse
en el péptido N-
terminal
Principio del espectrómetro de masas (MS)
• Se aplica alto voltaje al eluido de la columna, formando una niebla por adición de nitrógeno (nebulización)
• Las gotas cargadas disminuyen su tamaño gradualmente hasta provocar la evaporación de iones.
• Los iones son separados por tamaños dentro del analizador.
• Al alcanzar el detector, los iones son contados.
Ión positivo
(molécula protonada )
Eliminación de
un protón
Ión Negativo
(molécula desprotonada)
Protón
イオン化したい化合物の分子
Separación en la
columna
Inyección de muestra
Introducción al MS
fase móvil
Adición protónica
Eluido de la
columna
Unidad de enfoque
Analizador Detector Fuente de iones
Región a presión atmosférica
Región de vacío
< ESI >
¿Cuál es el mayor beneficio de un MS como detector en
LC? • El mayor beneficio es:
• Adicionalmente al tiempo de retención, puede obtenerse información sobre la masa relacionada con cada compuesto, de forma sencilla y simultánea.
• La información de la masa permite reducir el riesgo de; • Identificación errónea del compuesto
• Error en la Cuantificación debido a la elución inesperada de interferencias, etc.
m/z 264
m/z 278
m/z 267
m/z 281
La posibilidad de
separar en función
de la masa
↓
Reduce el riesgo de
cometer errores de
identificación y
cuantificación
LC-MS: datos analíticos MS
(1) (2) (3)
(4) (5)
m/z
m/z
(5)
(4)
tiempo
(3) m/z 193
(2) m/z 582
(1) TIC
Espectro de masas
PDA (dispositivo de fotodiodos)
tiempo
(3) 210 nm
(2) 580 nm
cromatograma (2)
(3)
(4)
(5)
int.
int.
Espectro UV
nm
nm
(5)
(4) AU
AU
cromatograma
Espectrometría MS/MS
• Información estructural
• Identificación de compuestos desconocidos
• Selectividad adicional a la cromatografía
• Análisis de mezclas complejas
• No siempre se necesita de un cromatógrafo
• Mejor relación señal/ruidos (S/N)
• Análisis de trazas
• Bajo tiempo de desarrollo de métodos
Alta Sensibilidad y Selectividad en Modo MRM
Triple Cuadrupolos
Generación de Iones
Transporte de Iones
Filtro de Iones Filtro de Iones
Fragmentación
Ideal para “Targered Analysis” (Análisis de Compuestos Conocidos) que requiere
precisión en la cuantificación.
Circuito Iónico Electrónico “Esquiando en Pendiente”
Funcioes de la Fuente de Iones API
• Nexo de unión entre el HPLC y la primer región de vacío del
MS, todo a presión atmosférica.
• Generar iones en fase gaseosa
• Ionizar el analito (APCI, APPI o AP-MALDI).
• Nebulización de los iones en disolución (ESI o NSI).
• Desolvatar los cluster (analito(s) más solvente) antes de
ingresar al MS.
• Eliminar moléculas neutras e iones de carga opuesta a la
polaridad de trabajo antes de ingresar al MS.
Fuente de Iones API
API 3200TM, API 4000TM, API 4500TM, API 5000TM, API 5500TM, 3200 Q TRAP®, 4000 QTRAP®,
4500 QTRAP® 5500 QTRAP® poseen la Fuente de Iones API: Turbo VTM
Los “ turbo heate r” son
calentadores cerámicos del
a i r e q u e p r o m u e v e n l a
desolvatación de los iones.
Se puede programar su
temperatura desde Analyst®,
permitiendo tener para cada
tiempo cromatográfico (δΤ≥1
min.) diferentes temperaturas
que optimizan la señal. A su
v e z r e d u c e e l “ e f e c t o
memoria” y aumenta el rango
d e f l u j o s d e t r a b a j o .
ESI MS disolución en CH3CN:H2O:ác.acético 50:46:4
temp fuente: 100 oC.
thermolysin
34 kDa
proteinase K
29 kDa
ESI - macromoléculas
Gas Cortina
• Interfase ideal para
prevenir contaminación
• Permite una operación
robusta ideal para
secuencias largas.
Interfase de vacío para el sistema API 5000, 5500, 4500 y
5500 QTrap
Región Q1
10 µTorr
Q0,
Potencial
De entrada (EP)
4-7
mTo
rr
Curtain plate
Orifice plate,
Declustering
Potential (DP)
QJet
Diferencia de presiones debido al vacío aplicado por la bomba mecánica externa
Orificio de
Entrada al MS
Presión
atmosférica
Gas Cortina
Skimmer vs Guías
• Guías:
• Cuadrupolo solo RF
• Enfoca iones en Q0
• Introduce más iones y menos gas en Q0
• Más eficiente que un skimmer
QTRAP® 4500
Incrementa la sensibilidad
en todos los modos
4000 Q TRAP®
Nueva guía iónica IonDrive QJet
• Permite la entrada de más iones
• Guía RF de dos etapas • 1ra Etapa: Mejor captura iones entrantes por orificios grandes
• 2da Etapa : Mejor transferencia de iones a la región Q0
• Mayor robustez
• Mejor barrara contra especies neutras y micro gotas
• La eficiencia de transmisión es 2x veces mejor que la guía iónica QJet® original
API 6500, 6500 QTRAP
Sciex QTRAP 4500
High pressure Q0 and
QJet®2 ion guide
Most efficient ion focusing
940 kHz ion path
Extended mass range with best low mass
ion confinement
Qurved LINAC® collision cell
Shortest MRM cycles and highest scan speed
and reduced instrument footprint
Turbo V™ source and
Curtain Gas™ interface
Unmatched robustness
and ruggedness
Linear Accelerator™
Ion trap
More efficient and faster Q
TRAP® scanning
AcQuRate™ pulse counting detector
Highest reproducibility and accuracy
Modo de Barrido Q1 Q2 Q3 Propósito
Full-Scan Scanning Transmisión Total Trans. Total Info. PM
SIM m/z Fijo Transmisión Total Trans. Total Cuantificación
Producto m/z Fijo CE + Transmisión Total Scanning Info Estructural
MRM m/z Fijo CE + Transmisión Total m/z Fijo Cuantif. Específ.
Pérdida neutra Scanning CE + Transmisión Total Scanning Screening Tipo de
Compuestos
Precursor Scanning CE + Transmisión Total m/z Fijo Screening Tipo de
Compuestos
MRM Alta Resolución Scaning Alta
Resolución CE + Transmisión Total
Scaning Alta
Resolución
Cuantif. Específ. +
Cualif. Definitiva.
Multi Target
Screening m/z Fijo CE + Transmisión Total
m/z Fijo +
Scanning
Cuantif. Específ. +
Cualif. Definitiva.
Rojo: MS simple, Triple Cuad., QqTOF y Q TRAP® - Verde: Triple Cuad.,
QqTOF y Q TRAP® - Marrón: solamente QqTOF - Azul: solamente Q TRAP®
Modos de Barrido
Selected/Multiple Reaction Monitoring (SRM/MRM)
• Ventajas
• Monitoreo específico del analito
en cuestión.
• Altos ciclos de Barrido.
• “Simultáneos” Monitoreo de
Múltiples Transiciones.
• Desventajas
• Nula provisión de información
estructural.
• Las moléculas desconocidas
son ignoradas por el MS/MS
(Unknowns Screening).
m/z Fijo Transmisión
Total m/z Fijo
Q1 Q2 Q3
Identificación de Compuestos utilizando Relación de
Áreas o Alturas en modo MRM
Alternativa de Identificación a la Relación de Áreas o
Alturas en modo MRM, el modo FullScan MS/MS
Generación de Iones
Transporte de Iones
Filtro de Iones Filtro de Iones
Fragmentación
Atrapamiento de
Iones
Q3 en un Sistema Q TRAP® puede funcionar como Cuadrupolo o Trampa Lineal.
Ideal para “Targered Analysis” y para GUS (General Unknow Screening) que
requiere precisión en la Cuantificación y Confirmación Definitiva.
Atrapamiento y Barrido Full-Scan dentro de la Trampa
Lineal de Iones Q3
Tecnologías MS/MS
Trampa 3D Sensibilidad Full
Scan
MS3 (o más)
Q TRAP
Sensibilidad Full Scan MS y MS/MS
MS3
Sensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de Precursores
QqQ Sensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de Precursores
Ventajas de las trampas lineales de iones
• El analizador de masas (corazón del espectrómetro) es mucho más rápido que un triple cuadrupolo convencional.
• La tecnología Q TRAP posibilita la utilización de Bibliotecas Espectrales de Compuestos MS/MS
• Permite realizar MS3 y así aumentar la especificidad y sensibilidad significativamente.
• Q3 puede funcionar como Trampa Lineal y posibilita estudios de elucidación de estructuras (Ej.: Estudios de Impurezas de Plaguicidas y Metabolitos), dado que permite alcanzar una alta resolución en masa (~12 ppm)
• Es factible trabajar en modo GUS (General Unknows Screening), para investigar compuestos desconocidos
• La tecnología Q TRAP puede funcionar también como un Triple Cuadupolo, manteniendo las ventajas de éste, por ejemplo el amplio rango dinámico (en modo MRM), gran exactitud de cuantificación, etc.
Barrido realzado de ion producto (EPI)
1) Q1 Selecciona el Ión Precursor.
2) Q2 Genera los Iones Producto.
3) Q3 Atrapa y barre en modo Full-Scan los Iones Producto.
Q1 Q2 Q3
XIC of +MRM (10 pairs): Exp 1, 216.1/174.0 amu from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 1.4e4 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min
0.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
In
te
ns
it
y,
c
ps
7.20
+EPI (216.10) CE (35): Exp 2, 7.028 to 7.344 min from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 4.5e5 cps.
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu
0.0
1.0e5
2.0e5
3.0e5
4.0e5
In
te
ns
it
y,
c
ps
174.0
104.0132.0 146.096.0
216.079.0
138.0110.0 125.9 128.0
+MS2 (216.10) CE (35): Exp 2, 7.074 to 7.382 min from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - MS2 216.wiff (Turbo Spray) Max. 3136.9 cps.
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
In
te
ns
it
y,
c
ps
174.2
104.296.2
79.2
216.0
146.0132.2
138.2126.8
Confirmación con QqLIT o QqQ
(10ng/mL Atrazine) MRM
Barrido EPI (Q TRAP)
Pureza 95.6%
Barrido PI (QqQ)
Pureza 69.5%
x 100
XIC of +MRM (10 pairs): Exp 1, 216.1/174.0 amu from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 660.0 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min
0
100
200
300
400
500
600
660
In
te
ns
it
y,
c
ps
7.21
+EPI (216.10) CE (35): Exp 2, 7.121 to 7.301 min from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 3.5e4 cps.
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu
5000.0
1.0e4
1.5e4
2.0e4
2.5e4
3.0e4
3.5e4
In
te
ns
it
y,
c
ps
174.0
96.1 216.079.0
145.9104.0
+MS2 (216.10) CE (35): Exp 2, 6.628 to 7.861 min from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - MS2 216.wiff (Turbo Spray) Max. 89.2 cps.
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu
0
20
40
60
80
89
In
te
ns
it
y,
c
ps
174.0
(0.5 ng/mL Atrazine)
Confirmación con QqLIT o QqQ
MRM
Barrido EPI (Q TRAP)
Pureza 76.5%
Barrido PI (QqQ)
No hay match
Influencia de la concentración en la búscada en
bibliotecas
0
48.2
76.5
87.1
92.395.6
0.00.02.00.0
54.6
69.5
99.7
98.8
R2 = 0.9992
0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
3.0E+05
3.5E+05
4.0E+05
4.5E+05
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Concentration (ng/mL)
Peak A
rea (
counts
) M
RM
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Linear calibration Fit (%) EPI Fit (%) MS21ng/mL
QTRAP® QqQ
Cuantificación vía MS3
MS/MS/MS Q1 Q2 Q3
1)
2)
3)
1) Selección del Ión Precursor.
2) Fragmentación.
3) Atrapamiento de Ión Producto.
4) Fragmentación del Ión Producto.
5) Escaneo y envío al detector de los
Iones Productos Secundarios.
4)
5)
MRM & MS/MS/MS
Malatión 10 ng/g en Manzana - % CV<5, recuperación entre 90-110 %
MS/MS/MS Aumento de la Selectividad y Sensibilidad
Interferencias en modo MRM
Muestras #1, 10 y 11
fortificadas con 0.25 pg/µL
10 de 33 sujetos presentan interferencias!!!
Muestras blanco de orina de 33 sujetos diferentes. Intensidad normalizada a 0.50 pg/uL
para MRM 277-168 (transición con mejor LOQ).
(flechas indican sujeto con interferencia al TR del clenbuterol
Muestras blanco de orina de 33 sujetos diferentes. Intensidad normalizada a 0.05 pg/µL
para MS3 277168132
Selectividad en modo MS3
Muestras #1, 10 y 11
fortificadas con 0.25 pg/µL
Ninguno presenta interferencias, aún con un umbral 10 veces menor !!!
Determinación de rBST
• Pasos críticos en la preparación de muestras • Recordar que la rBST está en niveles muy bajos (1-5 ng/mL)
• Extracción de grasas de muestras
• Precipitación de proteínas
• Desnaturalización y optimización de la digestión
• Introducción de un estándar interno antes de la preparación de
la muestra es esencial para evaluar y compensar perdidas de
analito o variabilidad del procedimiento analítico
Metodología
• Se agrega estándar interno (hormona equina (rEST) ) a 10 mL de muestra
• Extracción en fase sólida en cartucho C4 • Se lava cartucho con solución acuosa al 0.1% en ácido trifluoroacetico (TFA), y luego con
solución 30:70 (acetonitrilo : sol. aq 0.1% TFA)
• Se eluye con 7 mL de solución 80:20 (acetonitrilo : sol. aq 0.1% TFA)
• Se evapora hasta 1 mL
• Precipitación de proteínas • Se induce con metanol frío, se centrifuga y se seca el sobrenadante
• Digestión • El residuo se reconstituye con 120 µL de buffer carbonato de amonio y se digiere a 37°C,
con tripsina durante 16 hs
• Reconstitución • El digerido se evapora hasta sequedad y se reconstituye con 500 µL de solución 30:70
(acetonitrilo: sol aq. 0.2% ác. fórmico) agregando además antes de la inyección el péptido N-terminal C13 de la de la rBST
Metodología
LC-MS/MS de BST y rBST
Multiple Reaction Monitoring
MS/MS/MS
MRM MRM3
Hormona Secuencia péptido N-Terminal
Transiciones DP (V)
CE (V)
Transiciones DP (V)
CE (V)
AF2 (mv)
rBST MFPAMSLSGLFANAVLR 913.2/774.0 913.2/1047.6
35 37 913.2/774.0/791.0 35 37 0.2
rEST MFPAMPLSSLFANAVLR 933.2/794.2 35 38
rBST 13C6
MFP(A13C)MS(L13C)SG(L13C)F(A13C)N(A13C)V(L13C)R
916.2/777.0 35 37
Condiciones intrumentales
• Shimadzu Nexera XR • Fase móvil A: 90:10 (agua:acetonitrilo), Fase móvil B: 10:90 (agua:acetonitrilo) siempre
conteniendo 0.1% ác. fórmico.
• Columna150 mm x 2.1 mm x 3 µm C18 Interchrom QS Uptisphere HDO.
• Temperatura ambiente, Gradiente 25 min a 300 µL/min.
• MS/MS: SCIEX 5500 QTRAP • Equipado con fuente Turbo V™. Ionización electrospay aplicando 3500 V
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 790.309 to 790.... Max. 9.1e5 cps.
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0.0
1.0e5
2.0e5
3.0e5
4.0e5
5.0e5
6.0e5
7.0e5
8.0e5
9.0e5
Inte
ns
ity
, c
ps
5.66
4.626.094.71
7.846.69
S/N = 74.3
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 960.349 to 960.... Max. 4.6e5 cps.
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0.0
5.0e4
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
4.0e5
4.5e5
Inte
ns
ity
, c
ps
5.67
4.724.904.56 5.75 6.05 6.39
S/N = 60.8
XIC of +MRM (8 pairs): 913.200/774.000 Da from Sa... Max. 4610.0 cps.
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
Inte
ns
ity
, c
ps
5.58
5.94
4.25 4.34 4.62 6.016.335.00 6.60 7.605.18 7.39 7.686.83
S/N = 68.7
XIC of +MRM (8 pairs): 913.200/1047.600 Da from S... Max. 1085.0 cps.
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1085
Inte
ns
ity
, c
ps
5.60
4.834.17 4.58
5.746.17
5.13 7.096.83 7.176.38 7.797.58
S/N = 32.6
rBST MRM 913.2 / 774.0
rBST MRM
913.2 / 1047.6
rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 791.0 rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 961.0
S/N = 74.3 S/N = 60.8
S/N = 68.7 S/N = 32.6
rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 960.9
rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 791.0
rEST MRM 933.2 / 794.2
rBST 13C6
916.2 / 777.0
Cromatograma iónico total rBST 10 ppb
TIC: from Sample 12 (milk, 2 ppb) of rbST 20110512.wiff (Turbo Spray) Max. 3.4e7 cps.
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0Time, min
0.0
5.0e6
1.0e7
1.5e7
2.0e7
2.5e7
3.0e7
3.4e7
In
te
ns
it
y.
..
4.66
4.88
4.51
5.63
5.97
6.67 8.89 13.858.28 9.66 9.95 10.90
XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 933.600/794.300 Da fro... Max. 1.1e5 cps.
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0.00
2.00e4
4.00e4
6.00e4
8.00e4
1.00e5
Inte
ns
ity
, c
ps
5.71
XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 916.200/777.000 Da fro... Max. 1.8e5 cps.
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0.0
5.0e4
1.0e5
1.5e5
1.8e5
Inte
ns
ity
, c
ps
5.63
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 790.190 to 790.... Max. 1.4e5 cps.
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0.0
2.0e4
4.0e4
6.0e4
8.0e4
1.0e5
1.2e5
1.4e5
Inte
ns
ity
, c
ps
5.64
4.834.68
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 960.469 to 960.... Max. 9.8e4 cps.
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min
0.0
2.0e4
4.0e4
6.0e4
8.0e4
9.8e4
Inte
ns
ity
, c
ps
5.66
5.60
4.84
6.456.014.51
rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 791.0
rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 961.0
rEST MRM 933.2 / 794.2
rBST 13C6
916.2 / 777.0
Cromatograma iónico total rBST 2 ppb
Curva de calibración
Conclusiones
• La espectrometría de masas permite un nuevo enfoque para la detección selectiva de rBST en leche,
• A diferencia de los métodos clásicos, permite diferenciar la forma nativa BST de la recombinante rBST
• Esto es un paso importantísimo para el control del uso (indebido) de esta hormona en la producción de leche
• El método presentado podría mejorarse, especialmente en la preparación de muestra para mejorar el porcentaje de recuperación de la rBST y mejorar aun más los límites de detección. Esto incluye el proceso de digestión con tripsina.
• La detección utilizando tecnología MS3 permite reducir significativamente interferencias de matriz, mejorando la relación S/N obtenida.
GERENCIA DE
CAPACITACIÓN Y APLICACIONES
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