72º congreso argentino de bioquÍmica · 72º congreso argentino de bioquÍmica afrontando el...
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72º CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUÍMICA
Afrontando el Constante Desafío de la Bioquímica
22 al 25 de agosto de 2017
HEMOGLOBINURIA PAROXISTICA NOCTURNA
Fisiopatología y diagnóstico del laboratorio
en la hemólisis intravascular
Dra. Mónica T F Aixalá
HEMORRAGIAS HEMOLISIS
REGENERATIVA
destrucción o pérdida excesiva de eritrocitos
ANEMIA
AGUDAS CRONICAS EXTRACORPUSCULAR
adquiridas
INTRACORPUSCULAR
hereditarias
Anticuerpos
Drogas
Hemoparásitos
Quemaduras
Sustancias físicas
Sustancias químicas
Válvulas cardíacas
Enzimopatías
Hemoglobinopatías
Membranopatías
Adquirida
Intracorpuscular
HPN
INTRODUCCION
HEMOGLOBINURIA PAROXISTICA NOCTURNA (HPN)
SINDROME DE MARCHIAFAVA MICHELI
Ettore Marchiafava (1847-1935)
Ferdinando Micheli (1872-1937)
Descripta inicialmente por William Gull (1866)
(1816-1890)
y con precisas observaciones clínicas por Paul Strϋbing (1882)
Góngora-Biachi R et al: Rev Biomed,1999
STEM CELL
PLURIPOTENTE
STEM CELL
LINFOIDE
STEM CELL
MIELOIDE
TIMO
LINFOCITO T
LINFOCITO NK
LINFOCITO B CELULA
PLASMATICA
ERITROCITO
MEGACARIOCITO
MONOCITO
MACROFAGO
GRANULOCITO
Luzzatto L et al: Int J Hematol, 2006
Hernández-Campo P et al: Med Clin (Barc), 2008
GEN
GPI “ANCLA”
CORE GLICANO
FOSFATIDIL INOSITOL
FOSFO
ETANOL
AMINA
PROTEINA
Anclada al GPI Transmembrana
Citoplasma
Espacio
extracelular
GEN
GPI “ANCLA”
CORE GLICANO
FOSFATIDIL INOSITOL
FOSFO
ETANOL
AMINA
PROTEINA
Anclada al GPI Transmembrana
Citoplasma
Espacio
extracelular
Glicosil fosfatidil inositol
MEMBRANA
ETANOLAMINA
PROTEÍNA
CORE GLICANO
FOSFATIDIL
INOSITOL
Bessler M et al: Hematology, 2008
PROTEINAS UNIDAS AL GPI
(deficientes en HPN)
Las proteínas unidas al GPI tienen múltiples funciones:
Enzimas: acetil colinesterasa
fosfatasa alcalina
Receptores/inmunológicas: receptor uroquinasa (UPAR),
receptor FCIII (CD16), antígeno 3 de función linfocitaria (LFA-3) (CD58),
receptor de polisacáridos bacterianos (CD14)
Reguladores del complemento: CD55 (DAF, factor acelerador de la degradación)
CD59 (ILRM; factor inhibidor de la lisis reactiva de membrana)
FHR (factor homólogo de restricción)
Adhesión molecular: Campath-1(CDw52)
PROTEINAS UNIDAS AL GPI
(deficientes en HPN)
Bessler M et al: Hematology, 2008
CELULAS HPN
FENOTIPO
Diferentes células HPN (I, II, III)
Depende del porcentaje presente de las diferentes proteínas unidas al GPI
Diferente sensibilidad al complemento
Anemia hemolítica intravascular mediada por
complemento
Fallo en la médula ósea
Trombosis
DEFICIENCIA DE PROTEINAS
Y MANIFESTACIONES CLINICAS
• disfagia, letargia,
• disfunción eréctil, fallo renal,
• hipertensión pulmonar, hemoglobinuria
Anemia hemolítica intravascular mediada por complemento
• Hepática porta(síndrome de Budd Chiari)
• Esplénica
• Mesentérica
Trombosis
(venas)
• en algun grado: ocurre en todos los paciente
• en las formas más extremas de
presentación: anemia aplásica severa
Fallo en
la médula ósea
HEMOLISIS INTRAVASCULAR
MEDIADA POR COMPLEMENTO
Hemólisis intravascular (hemoglobina libre)
Importantes secuelas clínicas
HPN
Anemia
Fatiga
Trombosis Tromboembolismo (mayor causa
de morbilidad y muerte)
proteínas reguladoras del complemento
Relación con tamaño del clon,
Intensidad de hemólisis,
activación y agregación de plaquetas
Hillmen P et al: Blood, 2007
Yenerel M et al: Blood Cells Mol Dis, 2017
SISTEMA COMPLEMENTO
• Componente clave de la inmunidad innata
• En fase fluida y participan diferentes proteínas
• Tres vías de activación: clásica, alterna, lectinas
• Todas terminan en un mecanismo efector común: complejo de ataque a la membrana (MAC)
Risitano A: Immunobiology, 2012
Macías Pérez I et al: Rev Cub Hematol, Inmunol, Hemot, 2013
CD55
CD55: factor acelerador de la degradación (DAF) Primer regulador del complemento que se detectó disminuido/ausente
en células NPH
Función:
Controla la activación del complemento en la superficie celular
Inhibe la formación y estabilidad de la C3 convertasa (para desactivar a la moléculas)
Protege a las células del ataque del complemento
Consecuencia de su defecto:
Mayor fijación del complemento por las células y hemólisis
intravascular Risitano A: Immunobiology, 2012
Macías Pérez I et al: Rev Cub Hematol, Inmunol, Hemot, 2013
Presente en todas las líneas celulares hematopoyéticas
Presente en todas las líneas celulares hematopoyéticas
Función:
Interviene en la fase final de la cascada del complemento
Bloquea la incorporación del C9 al complejo C5b-C8,
lo que previene el ensamble entre la membrana y
el complejo de ataque (MAC)
Regula y protege de la lisis celular
Consecuencia de su defecto:
Hemólisis intravascular
CD59
CD59: inhhibidor de la lisis reactiva de membrana (MIRL)
Risitano A: Immunobiology, 2012
Macías Pérez I et al: Rev Cub Hematol, Inmunol, Hemot, 2013
VIAS DE ACTIVACION DEL COMPLEMENTO
Bessler M et al: Hematology, 2008
Rother R et al: JAMA, JAMA 2005
Misztal T et al: Postepy Hig Med Dosw, 2011
HEMOLISIS INTRAVASCULAR
Síntomas comunes en diferentes patologías
(anemia drepanocítica, HPN, hemólisis inducida por drogas):
hipertensión, hemoglobinuria, hipercoagulabilidad
Saturación de los mecanismos protectores fisiológicos
“scavenger”: hemoglobina libre,
con consecuente hemoglobinuria, con posible daño renal
biodisponibilidad del óxido nítrico
Rother R et al: JAMA, JAMA 2005
Misztal T et al: Postepy Hig Med Dosw, 2011
HEMOLISIS INTRAVASCULAR
alteración del tono muscular vascular isquemia,
hiperreactividad plaquetaria,
hipertensión pulmonar, tromboembolismo,
alteración de expresión de
moléculas de adhesión
hemoglobina libre
Misztal T et al: Postepy Hig Med Dosw, 2011
HEMOLISIS INTRAVASCULAR
Efectos citotóxicos, prooxidantes y proinflamatorios
hemoglobina libre/HEMO
La HbL promueve la acumulación de radicales hidroxilo,
vía la reacción de Fenton, lo que resulta en
un daño tisular oxidativo
HEMOLISIS INTRAVASCULAR
Fe HEMO
biodisponibilidad
NO
disfunción
endotelio
vascular
Kato G et al: Blood Reviews, 2007
Fallo de médula ósea Expansión clonal de células HPN
(células deficientes en ciertas proteínas)
Alteración de la actividad
del complemento
Hemólisis extravascular
Colelitiasis Pancitopenia
Hemólisis intravascular
Hemoglobinuria
Anemia
Infecciones
Sangrado
Trombosis
Fallo renal
Dolor abdominal
Dolor de cabeza
Disfunción eréctil
Fatiga
Bessler M et al: Hematology, 2008
Pruebas Bioquímicas
y Hematológicas
Hemograma
Reticulocitos
Metabolismo del Fe
Parámetros de hemólisis:
sangre y
orina
Pruebas diagnósticas
HPN NORMALES p
Hematíes
1012/L 3,0 ± 0,7 4,7+0,3 < 0,01
Hb g/dL 8,8 ± 2,2 14,6 ± 0,9 < 0,01
Leucocitos 109/L 4,6 ± 2,1 6,3 ± 1,4 < 0,01
Plaquetas 109/L 208 ± 240 245 ± 55 < 0,01
HEMATIMETRIA
Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014
Plaquetas: media normal
Rango amplio:
60 % (disminuidas)
10 % (aumentadas)
Macrocitosis
Policromatofilia
Aumento de reticulocitos
Aumento de fracción inmadura (V.N.: 0,26+0,07)
MORFOLOGIA ERITROCITARIA
MORFOLOGIA ERITROCITARIA
10 %
50 %
5 %
25 %
20 %
15 %
MORFOLOGIA ERITROCITARIA
Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014
MORFOLOGIA ERITROCITARIA
Microcitosis e hipocromía: ¿descenso de hierro?
Esquistocitos: ¿trombosis?
Dacriocitos: ¿daño medular?
ADE: heterogeneidad del tamaño celular
MetaHb
HEM
Metahemalbúmina
Hemopexina-Hem
HpHb
HEMOLISIS INTRAVASCULAR
Dímeros
+ Hp
Globinas
+ Hx
+ Albúmina + Hx
HEMOGLOBINA
Hb
Hb libre
Hemoglobinuria
Hemosiderinuria
Urobilina
Hemoglobinuria
Hemosiderinuria
PARAMETROS DE HEMOLISIS
Plasma
castaño dorado
Bilirrubina Indirecta
Haptoglobina
LDH
Isoenzimas 1 y 2
Parámetro % de pacientes
LDH 100
Reticulocitos 100
Haptoglobina 95
Hierro N 95
FAL 95
Hb 95
ADE 75
Bilirrubina I 70
Neutrófilos 63
Plaquetas 60
VCM>100fL 45
LDH 1984+1184 UI/L
Reticulocitos 210+147x109/L
PARAMETROS DE LABORATORIO
Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014
Aumento de reticulocitos y LDH: confirman
el estado hemolítico. Son la consecuencia de la susceptibilidad incrementada
de los eritrocitos a la lisis por complemento
LDH: parámetro de hemólisis,
asociado con el HEMO libre,
el metabolismo del óxido nítrico
y el estrés oxidativo.
La actividad de la LDH es la elegida
para monitorear la respuesta a la terapia
con Eculizumab
LDH
LDH ( 1,5 veces valor superior normal)
riesgo trombótico y mortalidad
Pacientes con LDH 1,5 veces valor superior
normal: probabilidad de mortalidad 4,8 veces
más comparado con la población general
(en cuanto a edad y sexo)
LDH
Yenerel M et al: Blood Cells Mol Dis, 2017 Jang J t al: J Korena Md Sci, 2016
HAM/SUCROSA
Tubo prueba (reproducir in vitro la situación del paciente ante pH y activación del complemento)
Tubos controles para descartar “interferencias”
con otras situaciaones (AHA, EH,
incompatibilidad ABO, HEMPAS)
Descenso de la fuerza iónica:
activación del complemento
Mayor especifidad
AHA: anemia hemolítica autoinmune
EH: esferocitosis hereditaria
HEMPAS (ADCII):Hereditary Erythroblast Multinuclearity with Positive Acidified Serum test
HAM
SUCROSA
La más alta Hb del grupo
FAL aumentada
Bajo porcentaje de
expresión de células negativas
(CD55 y CD59 en eritrocitos) Sensibilidad del test de HAM
HAM Y SUCROSA positivos 18/20
HAM negativo y SUCROSA positivo 1/20
HAM positivo y SUCROSA negativo 1/20
HAM/SUCROSA
Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014
HAM/SUCROSA
Si están correctamente estandarizadas, con controles adecuados,
pueden ser útiles como screening
• Sólo se realizan sobre eritocitos
Las transfusiones, hemólisis intensas, tratamientos con corticoides pueden
interferir en los resultados
El resultado puede depender del tipo de células HPN predominantes en el paciente
(I, II, III)
Gupta R et al: Int J Lab Hematol, 2007
Krauss J: Ann Clin Lab Sci, 2003
FOSFATASA ALCALINA LEUCOCITARIA (FAL)
FAL Enzima hidrolítica perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas
Actividad en citoplasma de neutrófilos, osteoblastos, células endoteliales
vasculares, macrófagos
En gránulos secundarios de los neutrófilos
Técnica citoquímica: Kaplow
Otra metodología “en busca”
de proteínas unidas al GPI
en HPN
CITOMETRIA DE FLUJO (CF)
CF Marcación de diferentes proteínas
unidas al GPI
Mayor especificidad y sensibilidad
Permite la detección y cuantificación de las diferentes
poblaciones HPN
CONCLUSIONES
Desorden clonal, caracterizado por deficiencia de la GPI,
y de las proteínas unidas
(muchas relacionadas con la regulación del
sistema complemento)
Hemólisis intrravascular: hemoglobina libre determina
características clínicas y del laboratorio
LDH y reticulocitos son importantes para el diagnóstico,
pronóstico y seguimiento
Diferentes pruebas diagnósticas: Ham y Sucrosa (screening),
citometría de flujo (mayor sensibilidad y especificidad) y
fosfatasa alcalina leucocitaria (otra metodología)
MUCHAS GRACIAS
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