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Introducción a la espectroscopía vibracional

1. .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones

2. .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR

Grupos funcionales "Huellas digitales"

Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas

Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de

fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman

3. .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura

secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales

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Bibliografía

Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984)

Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984).

Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180

Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290

Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311

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Introducción a la espectroscopía vibracional

Espectro electromagnético

Frecuencia (Hz)Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición

1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear

1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos

1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos

4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible Electrones externos

1012-1014 2.5 µm - 700 nm Infrarrojo Vibraciones

108 - 1012 1 mm - 2.5 µm Microondas Rotaciones

100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversión de spin

4

2

34

1

0

E

Distancia internuclear

Estados vibracionales y energía

k

2

1Frecuencia de la vibración

k = constante de fuerza del enlace F = -kx

µ = masa reducida, para un sistema diatómico 21

21

mm

mm

5

cm-1 IR RAMAN

estiramiento (sim)

1340 - +

estiramiento (asim)

2349 + -

deformación 667 + -

deformación 667 + -

Modos normales de vibración (3N - 5)

O OC

O OC

O OC

O OC

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Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección:

No todas las vibraciones serán “activas” en IR

Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración

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INFRARROJO

8

NH CH3

O

N-H C-H

C=O

INFRARROJO

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FTIREspectrometría IR con

Transformada de Fourier1. Mejor relación señal/ruido ya

que la luz no debe pasar por un monocromador.

2. Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez

3. Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1

4. Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral

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C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

OC N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

C N

C

HC

O

estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida II (1567 F) amida III (1299 M)

amida IV (627 D) amida V (725 F)

estiramiento NC (1096 D)

estiramiento CN y CC (881 D)

deformación CCN (436 D)

deformación CNC(289 D)

amida VI (600 M) amida VII (206 M)

Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida)

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12

antiparalela

hélice

transición

ovillo estadístico

Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol

Chem (1967) 242, 5460-5466

Estructura secundaria

13Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957

Estructura

Estructura

Estructura secundaria

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Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y

FTIR

Proteína % Hélice % Cadena extendida

FTIR RX FTIR RX

Carboxipeptidasa 40 39 33 30

α-Quimotripsina 12 10 50 49

Concanavalina A 4 2 60 60

Lisozima 41 45 21 19

Papaína 27 29 32 29

Ribonucleasa A 21 22 50 46

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C N

C

HC

O

1H2O

2H2O

Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I

J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777

Uso de isótopos

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BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa

1682 C=O amida I (hoja )

1660 C=O amida I (giro)

1651–1652 1652 C=O amida I (hélice )

1633 1633 C=O amida I (hoja )

1586–1577 1586–1571 C=O COO– Asp o Glu

1547 1547 N-H amida II

1516–1517 1516–1517 OH anillo Tyr

1443 1455 N-2H amida II y 2HOH

Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6

Uso de isótopos

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C N

C

HC

O

Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1

Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)

1 = 27 min2 = 63 min3 = 180 min4 = 21 h

Uso de isótopos

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FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus.

Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867.

Isótopos y posición de las bandas

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Unión de ligandos

21

Sir Chandrasekhara Venkata Raman, ( சந்தி�ரசேசகர வெங்கடர�மன்)Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888 Bangalore, Karnataka - 21/11/1970

Premio Nobel de Física 1930

Técnicas: RamanDispersión inelástica de fotones

estados electrónicos virtuales

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muestra

Láser, luz monocromática

Monocromador,

espectrógrafo

Regla de selección:

Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula.

Ventajas de Raman con respecto a IR1. Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho

más sensibles2. El agua produce una dispersión Raman muy débil3. La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a

cromóforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor

23

N N

24

25

26

Resonancia Raman

estado electrónico excitado

estado electrónico basal

estado energético virtual

Raman

ResonanciaRaman

La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo

27Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem 254(3): 662-70

= 406.7 nm

28

Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96: 338

[hemo] = 0.34 mM[SO4

2-] = 400 mMSO4

2-

29

Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de Pyrococcus furiosus

= 476 nm

Uso de isótopos

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Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).

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Infrarrojo y Raman

• El fenómeno de absorción es más intenso por lo que se requieren muestras menores

• El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible

• No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia)

• Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles

• El agua produce una dispersión Raman muy débil

• El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor

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Introducción a la espectroscopía vibracional

1. .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones

2. .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR

Grupos funcionales "Huellas digitales"

Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas

Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de

fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman

3. .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura

secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales