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NEIKERInstituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario
Nekazal Ikerketa eta Garapenarako Euskal Erakundea
Aislamiento de nuevos genes de resistencia en patata frente a Phytophtora infenstans y Globodera pallida.
Castañón, S.; Lucca, F.; Urreta, I; Oyanguren, I.; Bagazgoitia, E.; Herrán, A.; Ruiz de Galarreta, J. I. and Ritter, E.
Proyecto financiado por la Unión Europea PL ICA4-1999-30052
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- Se conocen setenta especies de nemátodos que afectan al cultivo. Los más dañinos son los formadores de quistes como Globodera pallida(Stone) Behrens.- Las plantas de patata atacadas por el nemátodo presentan crecimiento y rendimiento reducidos y, a veces, en suelos muy infestados, el follaje presenta un ligero amarillamiento.- La manera más común de luchar contra estos patógenos consiste en utilizar cultivares de patata resistentes. Hasta el presente no existen muchos cultivares resistentes a los nemátodos debido a su carácter poligénico.
PATÓGENOS
- El Mildiu de la patata es la enfermedad más importante de este cultivo, atacando especialmente en condiciones de humedad, durante el desarrollo de la planta y en el periodo de almacenamiento del tubérculo.- Las patatas atacadas presentan manchas blancas en la piel que acaban por meterse en la carne del tubérculo contagiando a los sanos durante el almacenamiento.- La lucha contra el hongo se lleva a cabo mediante la aplicación de grandes cantidades de fungicidas, lo que ocasiona un aumento considerable en los costes de producción y provoca daños medioambientales debidos a la toxicidad de los mismos mientras se favorece la aparición de nuevas variedades resistentes.
Globodera pallida Phytophtora infestans
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MATERIAL VEGETAL
1- BRACHISTOTRICHUM BST79862- BULBOCASTANUM BLB 80083- PHUREJA PHU484- PINNATISECTUM PNT38635- PINNATISECTUM PNT 81756- POLYADENIUM PLD 81827- POLYTRICHON PLT 536508- PAPITA PTA154429- DODDSII DDS2880
10- GOURLAYI GRL 718011- LEPTOPHYES LPH 2721512- MARINASENSE MRN 227813- PASCOENSE PCS 287714- TARIJENSE TAR 2471715- VENTURII VNT 823916- YUNGASENSE YUN 2173
AP24
Snakin
Gro1 y R7 (RGL)
Gpa2 y Rx
GlucanasasQuitinasas
Osmotinas
GENES CANDIDATOS
2- BULBOCASTANUM BLB 80083- PHUREJA PHU484- PINNATISECTUM PNT38635- PINNATISECTUM PNT 81756- POLYADENIUM PLD 81827- POLYTRICHON PLT 53650
1- BRACHISTOTRICHUM BST7986
8- PAPITA PTA15442
12- MARINASENSE MRN 2278
9- DODDSII DDS288010- GOURLAYI GRL 718011- LEPTOPHYES LPH 27215
13- PASCOENSE PCS 287714- TARIJENSE TAR 2471715- VENTURII VNT 823916- YUNGASENSE YUN 2173
CEBADORES DEGENERADOS
Dendograma filogenético de las 1,3-β-glucanasas descritas en diferentes organismos. El análisis de homología se realizó mediante ClustalW. En rojo aparecen las secuencias utilizadas para la creación de cebadores degenerados.
GLUCANASAS
Olea europaeaCoffea arabicaOryza sativaSinorhizobium melilotiLycopersicon esculentumSolanum tuberosumSolanum tuberosumArabidopsis thalianaBacillus thuringiensisCamellia sinensisPrunus persicaVitis viniferaPisum sativumHordeum vulgareNicotiana tabaccum
Citrus sinensisVitis vinifera
Saccharomyces cerevisiaeBrassica rapa
Citrus jambhiriGlycine soja
Glycine sojaAvena sativa
Solanum tuberosumHordeum vulgare
Avena sativa
Solanum tuberosumZea mays
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CEBADORES DEGENERADOS
U01900U01901U01902AF067863S26241AAA63540
GLUCANASAS
AF067863
------------------ATGGCTACCACACAAATAGCTGTTATCGTGCTTCTAGGATTACT---TGTTGCCACCAATATTCACATAACAGAG
ATGTCTACCTCAGATAAACATAATACTCCTCAAATGGCTGCTATCACACTGCTAGGATTACTACTTGTTGCCAGCACCATTGAGATAGCAGGGM60403
------------------ATGGCTACCTCACAAATAGCTGTTATCGTGCTTCTAGGATTACT---TGTTGCCACCAACATTCACATTACAGAGU01901
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CEBADORES DEGENERADOS
Snakin 14 15 16 14 15 16 14 15 16
Control (DNA) H N
AP24
1114900692
501-489404320
bp1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17
RT-PCR
PLANTAS INFECTADAS
PLANTAS CONTROL
RNA Control RNA muestra
cDNA Control cDNA muestra
P. Infestans24 h
G. pallida48 h
PCR
RT RT
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RT-PCR Glucanasas y AP24
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN 2173
Glucanasa (700 pb- 591 pb)Control R1 + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +
R2 + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +R3 + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +C + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +
Infección con P. infestans R1 + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +R2 + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +R3 + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +C + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +
Infección con G. pallida R1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN 2173
AP24 (700 pb)Control R1 - - - - - + - - - - + - - + - -
R2 - + - - + + + - + + + + + + + +R3 - + - - + + + - + - + + + + + +C - + - - + + + - + - + + + + + +
Infección con P. infestans R1 - + + + + - + + - - + - + + + -R2 + + + + + + + + + + + + + + + -R3 + + + + + + + + + + + + + + + -C + + + + + + + + + + + + + + + -
Infección con G. pallida R1 - + + + + + + + - + + + + + + -R2 + + + + + + - - + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +
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RT-PCR Snakin y Osmotina
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN 2173
Snakin (295 pb)Control R1 + + + + + + + + - + + + + + + -
R2 - + + + + + + + - + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + - + + + + + + +
Infección con P. infestans R1 - + + + + + + + + + + - + + + -R2 - + + + + + + + + + - + + + - +R3 - + + + + + + + + + + + + + - +C - + + + + + + + + + + + + + - +
Infección con G. pallida R1 - + + + + + + + + + + + + + + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN 2173
Osmotine (765 pb)Control R1 + + + + + + + + + + + + + + + +
R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +
Infección con P. infestans R1 + + + + + + + + + + + + + + + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +
Infección con G. pallida R1 + + + + + + + + + + + + + + + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN2173
Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +
R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +
Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +
Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN2173
Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +
R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +
Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +
Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN2173
Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU
48PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN2173
Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +
R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +
Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +
- + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +
Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + ++ - + - + + +
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RT-PCR PGR y RGL
Resistente a Phytophtora infectans Resistente a Globodera pallida
ESPECIES SILVESTRES BLB PHU48
PNT3863
PNT8175
PLD8182
PLT53650
BST7986
PTA15442
MRN2278
DDS2880
GRL7180
LPH27215
PCS2877
TAR24717
VNT8239
YUN 2173
RGL I (600 pb)Control R1 s s s s - + s s s s + s s + + s
R2 s s s s - + s s s s + s s + + sR3 s s s s - + s s s s + s s + + sC s s s s - + s s s s + s s + + s
Infección con P. infestans R1 s s s s + + s s s s + s s + + sR2 s s s s + + s s s s + s s + + sR3 s s s s + + s s s s + s s + + sC s s s s + + s s s s + s s + + s
Infección con G. pallida R1 s s s s + + s s s s + s s + + sR2 s s s s + + s s s s + s s + + sR3 s s s s + + s s s s + s s + + sC s s s s + + s s s s + s s + + s
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RT-PCR
HOMOLOGIA E-valueGlucanasa (S. tuberosum) 1e-66
Glucanasa (P. sativum) 1e-33
Glucanasa (N. tabaccum) 2e-54
Glucanasa (L. esculentum) 3e-64
Glucanasa (Vitis vinifera) 5e-28
Cebadores Glu1 y Glu2
GLUCANASAS
Cebadores PGR1 y PGR2
HOMOLOGIA E-valuePGR
Cebadores Pat S2 y Pat as2
HOMOLOGIA E-value
Monoxigenasa P-450 (Z. mays) 3e-04
Monoxigenasa P-450 (N. tabaccum) 8e-05
RGLIIIDRP (A. thaliana) 2e-08
RPS2 (A. thaliana) 2e-08
AP24
PGR
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SEGREGACIÓN Y MAPEO
Snakin
Glucanasa
Población SH x RH (UHD)
Mapa UHDC-I C-IV
PLANTAS INFECTADAS
PLANTAS CONTROL
RNA Control RNA muestra
cDNAds Control cDNAds muestra
P. Infestans24 h
G. pallida48 h
AFLP
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cDNA-AFLP
C N C N C N C N C N C N C N C N
Ase CAT Ase CGT
Taq GAC Taq GTA Taq GTG Taq GGC Taq GAC Taq GTA Taq GTG Taq GGC
C- Planta controlN-Planta infectada con nemátodo
Secuenciación
Análisis homología Diseño de cebadores específicos
Extracción del fragmento diferencial directamente del gel
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cDNA-AFLP
Nª Gen Pb Especie Tipo Homologia E-value4 SCER4-BST 97 BST cDNA-AFLP No homologa5 SCER5-BST 137 BST cDNA-AFLP No homologa6 SCER7-BST 145 BST cDNA-AFLP Supuesta proteína de resistencia 0.687 SCER16-BST 82 BST cDNA-AFLP No homologa8 SCER17-BST 114 BST cDNA-AFLP No homologa9 SCER20-BST 83 BST cDNA-AFLP Maiz mRNA 0,38
A. thaliana: Transportador deamonio 0.59
10 SCER21-BST 103 BST cDNA-AFLP A. thaliana: proteína hipotética 0,007A. thaliana: región rica en Leu 0,007A. thaliana: proteina kinasa 0,015
11 SCER23-BST 92 BST cDNA-AFLP Helicobacter rRNA 0,02712 SCER24-BST 154 BST cDNA-AFLP Tabaco: ATPasa I 3e-1513 SCER25-BST 230 BST cDNA-AFLP Tabaco: DNA Cloroplasto 5e-72
No Fragmento pb Especie Tipo Homologia E-value
14 SCER9-BST 75 BST cDNA-AFLP Caernorhaditis elegans 0.5215 SCER12-BST 91 BST cDNA-AFLP Arroz: cromosoma 4 0.05
Región rica en glutamato 0,08316 SCERVx1 217 BST cDNA-AFLP Cloroplasto DNA 0,09717 SCERVx14 323 BST cDNA-AFLP Región rica en Leu 0.0031
P. infestans
G. pallida
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ANÁLISIS DE GRUPOS SEGREGANTES (BSA)
RSApertura del Bulk
Resistentes SusceptiblesExtracción del fragmento diferencial directamente del gel
Secuenciación
Análisis homología Diseño de cebadores específicos
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No Gen Pb Especie Tipo Homología E-value1 M87 700 AFLP 284 S.cmm AFLP-BSA No homología2 M70b 700 AFLPFL-1 187 S cmm AFLP-BSA *84% EST-Set of cDNA
microarrays*Cf-2
7e-22
6e-373 M85S 800 AFLP 208 S cmm AFLP-BSA No homología4 M87 700 AFLP 127 S cmm AFLP-BSA *98% EST-Set of cDNA
microarrays*A. thaliana putativeglucosyltransferase protein
1e-34
2e-06
5 M88 800 AFLP 160 S cmm AFLP-BSA No homología
ANÁLISIS DE GRUPOS SEGREGANTES (BSA)
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MICROARRAYS
P. infestansControl
TC53628: leucine-rich repeat protein LRP - tomatoTC54362: Homeobox-leucine zipper protein ATHB-7 (HD-ZIP protein ATHB-7).TC53312: class I patatin - potatoTC53957: leucine-rich repeat transmembrane protein kinase 1 putative
CDNA aplificados diferencialmente
CDNA aplificados diferencialmenteTC41389: pathogen-inducible alpha-dioxygenase {NicotianaTC57021: calcium/calmodulin-dependent protein kinase CaMK1TC51558: tubulin beta-2 chain - riceTC49809: xyloglucan endotransglycosylase LeXET2 {LycopersiconTC53628: leucine-rich repeat protein LRP - tomatoTC53591: putative cell division related protein; 50012-47994TC46053: leucine-rich repeat resistance protein-like protein
G. pallida vs. control.
P. infestans vs. control.