agosto 24, 2010 dr. luis c. damas buenrostro...

Uso de levaduras industriales

Agosto 24, 2010

Dr. Luis C. Damas BuenrostroGCM

Descripción de Levaduras

• Las levaduras son hongos cuya forma usualy dominante es unicelular. Hayaproximadamente 50 géneros con más deaproximadamente 50 géneros con más de500 especies descritas. Existen normalmenteen la naturaleza en vegetales, animales,insectos y el suelo. Con pocas excepciones(algunos géneros de la familiaCryptococcaceae como Candida,Cryptococcus, Pityrsosporum) rara vezproducen enfermedades.

Gema

Mitocondrias

Membrana

Vacuola

Célula madre

Mitocondrias

Pared celular

Cicatriz

Estructura fina de una célula de levadura

Saccharomyces cerevisiae

FASES DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA–

Núm

ero

de C

élul

as

60 – 80 mill/ml

Rep

rodu

cció

n de

la le

vadu

ra

–

Fase Lag Fase de Crecimiento Fase Estacionaria Fase de Muerte o Sedimentación

19 – 23 mill/ml

0.5 – 10 mill/ml

Levaduras IndustrialesLevadura Tipo de

levaduraUso industrial

Saccharomyces cerevisiae Ascomiceto Panificación, elaboración de bebidas fermentadas (vino,cerveza, licores, sake, etc.). Producción de etanol.Elaboración de complementos nutricionales, saborizantes,vitaminas, extractos, etc.

Candida utilis Ascomiceto Proteina unicelular, producción de alcohol.

Saccharomycopsis fibuligera Ascomiceto Proteinaunicelular,glucoamilasa,bioquimicos,alcoholSaccharomycopsis fibuligera Ascomiceto Proteinaunicelular,glucoamilasa,bioquimicos,alcohol

Yarrowia lipolytica Ascomiceto Proteina unicelular, lipasa, bioquimicos

Candida milleri Ascomiceto Pan acido (sourdough)

Kluyveromyces marxianus Ascomiceto Proteina unicelular, alcohol

Phaffia rhodozyma

Brettanomyces sp.

Basidiomiceto

Deuteromiceto

Proteina unicelular para acuacultura

Fermentación cervezas “lámbicas”

Ventajas tecnológicas de Saccharomyces cerevisiae1. Tolerancia a concentraciones elevadas de etanol (hasta 18%

vs 1-4 % otras levaduras)2. Poder acidificante y tolerancia a bajos pH (3 – 4) con la

consecuente supresión de patógenos3. Inocuidad comprobada en más de 8,000 años de uso (status

GRAS)3. Inocuidad comprobada en más de 8,000 años de uso (status

GRAS)4. Separación espontánea natural del producto (floculación) o

fácilmente filtrables o sedimentables5. Alta productividad, tanto en condiciones aerobicas (hasta 0.54

g de biomasa por gramo de glucosa) como anaerobica (hasta0.48 g de etanol por gramo de glucosa)

6. Posibilidad de manipulación genética7. Estabilidad genética8. Velocidad de generación aceptablemente rápida (1-2 hrs)

Usos Industriales de S. cerevisiae� Dirigidos a la producción de biomasa• Producción de levadura para panadería• Aditivos alimenticios agrícolas• Complementos nutricionales• Extracto de levadura para Microbiología• Extracto de levadura para Microbiología• Suministro de levadura para uso industrial

� Dirigidos a los productos de fermentación• Elaboración de vino• Elaboración de licores• Producción de alcohol industrial • Elaboración de cerveza

Variedades de uso industrial de Saccharomyces cerevisiae• Saccharomyces cerevisiae var.

cerevisiae: levadura de las fermentaciones“ale”, destilerías, panadería, vinatería,alcohol industrial, productos nutricionales.alcohol industrial, productos nutricionales.

• S. cerevisiae var. uvarum(carlsbergensis): levadura de lasfermentaciones “lager”.

• S. cerevisiae var. bayanus: levadura devinos

• S. cerevisiae var. fermentati (“flor”) :producción de jerez

Tipos de LevadurasS. cerevisiae var. uvarum S. cerevisiae var. cerevisiae

Levadura

Células muertas

• Reacción reducción azul de metileno:

N

S N(CH )(CH ) N+

Oxidado=Azul

S N(CH3)2(CH3)2 N

NADH

N

S N(CH3)2(CH3)2 N

H Reducido=Incoloro

Viabilidad por fluorescencia

Acidos Orgánicos

Acetaldehido

Alcoholes

H2S y SO2

Glucosa

Piruvato

Acetil-CoA

Ac. Graso-CoA

Sulfato

Aminoácidos

Aminoácidos

Resumen de la producción de compuestosen Fermentación

Etanol

Alcoholessuperiores

Esteres

DiacetiloVDKs

AcidosGrasos

CoA

Grasas

Metabolismo de la levadura: producción del sabor

Etanol

60

70

80

90

100

Cél

ulas

sus

pend

idas

X10

6 /mL

10

12

14

16

Células Suspendidas

Extracto

No Floculante

Curva de Fermentación

0

10

20

30

40

50

0 1 2 3 4 5 6 7

Días

Cél

ulas

sus

pend

idas

X10

0

2

4

6

8

Floculante

Etanol

Mecanismo Molecularde la FloculaciónFloculación

Saccharomyces cerevisiae

�Contiene 16 cromosomas de 200 a 2200 Kb.

� 6183 marcos de lectura abiertos �5800 corresponden a genes que

codificaban para proteínas. codificaban para proteínas. �Tamaño promedio de los genes es

de 1.45 kb, o 483 codones

Expresión Global

Genoma

Transcriptoma

Proteoma

1 2 3 4 5 6 7 8

Figure 1. PCR products of FLO genes from S. diastaticus strain. Lanes: 1, 100-1000 bp ladder; 2, Lg-FLO (312 bp); 3, FLO5 (423 bp); 4, FLO9 (347 bp); 5, FLO8 (920 bp); 6, FLO10 (270 bp); 7, FLO11 (749 bp); 8, FLO1 (596 bp)

Strain FLO1 FLO5 FLO8 FLO9 FLO10 FLO11 Lg-FLO # FLO Genes

Flocculation (mL)

Baker's + + - - - + - 3 0.0 Lager 790 + - + - - + + 4 2.5 Lager BRY - - + - + + + 4 3.8 Lager J-2036 - - + + + + + 5 3.6 Lager J-2036 - - + + + + + 5 3.6 Lager 820 + - + - + + + 5 4.5 Lager KJ8 - - + + + + + 5 5.5 Lager LAW + - + + + + + 6 5.0 S. diastaticus - + + + + + w 6 NA S. pastorianus + + + - - + - 4 NA S. willianus - + + + + + - 5 NA

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

2 3 4 5 6 7Number of FLO genes

Flo

ccul

atio

n (m

L, H

elm

Tes

t)

R2 = 0.75

Baker's

790

BRY

J-2036

820

KJ8 LAW

Mar

cado

r

Mar

cado

r

C F

R1*

*C

FR

2C

FR

3C

FR

4

C F

R5

C F

R6

MF

R1*

*M

FR

2

MF

R3

MF

R4

MF

R5

MF

R6

Ctr

l(-)

F

R1*

*C

trl(

-) F

R2

Ctr

l(-)

FR

3C

trl(

-) F

R4

Ctr

l(-)

FR

5C

trl(

-) F

R6

992

992

966 966

1005

1005

998 998

1017

1017

1002

**NOTA: FR1 descartado

1.5% Agarose

Detección de mutaciones por HRM

Levadura

Extracción

DNA RT

qPCR

CPCPHRMHRM

Microarreglos

Análisis de microarreglos

FLO 5

FLO 11FLO 11

FLO 1

Herramientas de análisis de microarreglos

-Spot finder: conversión de imagenes .tiff a valores numericos de intensidad (medido por pixeles).

-GenArise: Determinación de valor Z para detección de genes con represión/inducción relevante

-FatiGo: Determinación, mediante ontología, de posibles funciones de los genes seleccionados como relevantes por microarrays.de los genes seleccionados como relevantes por microarrays.

Expresión global de genes. Análisis Ontológico Base de datos Saccharomyces Genome Database

DISEÑO EXPERIMENTAL

2.- Extracción de RNA

1.- Diseñar diferentes condiciones de

fermentación

3.- Análisis de microarreglos

Genes regulatorios relacionados a floculación

Nombre común Descripción Procesos biológicos Expresión

CLB1 Ciclina B, específica para G2/M Ciclo celular InducidaCLB2 Ciclina B, específica para G2/M Ciclo celular InducidaSWE1 Cinasa de especificidad dual, inhibe Cdc28p Ciclo celular ReprimidaBCK2 Supresor de mutaciones de PKC1, su sobreexpresión estimula

transcripción de ciclina BEstrés osmótico Inducida

MSN1 Activador transcripcional involucrado en regulación de expresión invertasa y glucoamilasa, crecimiento invasivo y diferenciación pseudohifal (FLO11) y respuesta a estrés osmótico. Via MAPK

Estrés osmótico Inducida

PKC1 Protein cinasa C, con actividad choque hipotónico. Via MAPK Estrés osmótico Reprimida

PTC2 Fosfoprotein fosfatasa tipo 2C, defosforila Hog1p y Cdc28p. Inactiva vía MAPK al finalizar estrés osmótico

Estrés osmótico InducidaInactiva vía MAPK al finalizar estrés osmótico

RGD2 GTPasa proteina activadora para Cdc42p y Rho5p. Via PKC1/MAPK


SLG1/WSC1 Sensor requirido para integridad de pared celular y respuesta a estrés hipoosmótico, via señalización Ras, PKC1/ MAPK


STE20 Protein cinasa de la vía MAPK participa en respuesta a feromonas, choque osmotico, y falta de nutrientes

Estrés osmótico Reprimida

HIR1 Regulador de transcripción de histonas, correpresor Factores de transcripción ReprimidaSNF12 Componente SWI/SNF activador global de transcripción,

respuesta a estrésFactores de transcripción Reprimida

ESC1 Establece silenciamiento de cromatina en telómeros uniendose a Sir4p

Silenciamiento de genes Inducida

ESC4 Establece silenciamiento de cromatina, regula transposición Silenciamiento de genes Inducida

HHF1 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de telomeros


HHF2 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de telomeros


HHT2 Histona H3. Interactua con Sir4p para silenciamiento de telomeros


HTZ1 Variante de histona H2AZ. Regula extensión de silenciamiento Silenciamiento de genes Inducida

TAF60 Factor transcripcional TFIID y subunidad SAGA, similar a histona H4


Estrés osmótico

LgFLO1pSLG1

CDC28 (1.13) SNF12 MSN1

Eliminación de estrés osmótico

PTC2

SLN1 (1.02)

IRE1 (1.0)

Alta concentración de nutrientes

CLB1,2

SWE1

MOSTO

Lg-FLO1

ESC1 ESC4TAF60 HTZ1HHF1 HHF2

HHT1

Lg-FLO1 RNAm

BCK2RGD2

PSA1MNN1GMH1END3OCH1GUK1

CDC28 (1.13)

HOR2RHR2

PKC1

Remodelaciónpared celular

SNF12 MSN1

Síntesis de glicerol

Chaperonas

SIR4 (1.24)

Silenciamientode genes

Subtelomericos

Divisióncelular

SWE1

HIR1

5'-adenylyl sulfate

3 phospho 5 adenylyl sulfate (PAPS)

Met14APS KINASE

SO32-

NADPH

PAP + NADP+

Met16PAPS REDUCTASE

3 NADPH

3 NADP+

Met5 Met10Sulfite reductase

S2-

Met3

ATP

sulfurylase

SO42-

ATP

PPi

adenosine

MUP3

Low affinity

Methionine

permease

DNACbf1

Met28 Me31 Met32Met4

S2-

Sulfuro

Met25Homocysteine synthase

O-acetyl homoserine

Met2

Homoserine trans-acetylase

HomoserineAspartate

Met6

Homocysteine

metyl-transferase

CH3

Met13

Methionine

S-AdenosylMethionine

(AdoMet)

ATP

PPi + PiMHT1

S-Adenosyl

Homocysteine

CH3

adenosine

820

790

Acetohidroxiacido reductoisomerasa

Glicolisis

Piruvato

ILV6

2-acetolactato

L-valina

ILV5

2,3 – Dihidroxi-isovalerato

ILV3

2- cetoisovaleratoBAT1

Acetaldehido

PDC1

ILV2

BAT 2

PDC5

PDC6

Piruvato Descarboxilasa

Acetolactato sintetasa

Dihidroxyacido dehidratasa

Alcohol etílico

ADH1

Acetato de etilo

ADH4

ADH2 ADH3

ADH5 ATF2

Alcohol deshidrogenasa

Acetil transferasa

SFA1

ATF1

790820

BAT1 BAT 2

LEU9

L-valina2- cetoisovaleratoBAT1

L-Leucine 2- cetoisocaproato

2- isopropilmalato

LEU 1 3- isopropilmalato

LEU 2

BAT 2

LEU4

AminotransferasaAlfa-isopropilmalato

sintetasa

Isopropilmalato isomerasa.

Beta-IPM-dehidrogenasa

ARO10

THI33 metyl butanol Alcohol isoamilico

Acetato de

isoamilo

ADH4

ADH2 ADH3

ADH5

ADH1

ATF2ATF1

DescarboxilasaSFA1

820

CoenzymeA

Acetyl- CoA

FLO Cepa

1 5 8 9 10 11 Lg

#Genes FLO

Flocula- ción(mL)

Bmax (fmol/cel) Kd

820 + - + - + + + 5 4.5 0.06445 1.337 790 + - + - - + + 4 2.5 0.04259 7.262 7754 + + - - - + - 3 0 0.001178 0.6071

820 = 38.82 millones sitios / cel790 = 25.65 millones sitios / cel7754 = 0.71 millones sitios / cel

agosto 24, 2010 dr. luis c. damas buenrostro...

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