afp corregido
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Universidad Autónoma Del Estado De Hidalgo
Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería
Área Académica de Biología
Licenciatura en Biología
“Proteínas Anticongelantes”
Asignatura: Bioquímica
Catedrático: Q.F.B. Zurisaddai Betanzos Palmeros
Ponentes: Oscar Dimas Martínez Yesenia Ramírez Aviles Josefina Ramos Frías
Segundo Semestre , Grupo uno.
Ciclo: Enero – Julio 2005
Pachuca de Soto, Hgo. Mayo de 2005
BIOQUÍMICA DE LAS PROTEINAS ANTICONGELANTES EN PECES
RESUMEN
Cuatro macromoléculas anticongelantes distintas han sido aisladas y
caracterizadas de diferentes especies de peces marinos, éstas incluyen a las
glicoproteínas (Mr 25-33K), anticongelantes , las cuales son construidas por la
repetición del tripéptido (Ala-Ala-Thr)n, con un disacárido enlazado a los residuos
de treonina, existen 3 tipos de proteínas anticongelantes (AFP).- El tipo I es rico en
alanina, anfifílico, con hélice (Mr 3-5K). El tipo II es una proteína grande (Mr-
14K), con un alto contenido de giros inversos a la hélice y cinco puentes de
disulfuro. El tipo III es de medida intermedia (Mr.-6-7K), sin distinción de
características de estructuras secundarias ó composición de aminoácidos.
A pesar de sus marcadas diferencias estructurales, los cuatro tipos de
anticongelantes aparecen en función de la misma vía uniendo las caras de los
prismas de los cristales del hielo e inhibiendo el crecimiento a lo largo de los ejes
A. (en una sola dirección).
Esto sugiere que el tipo I de AFP se enlaza preferencialmente a las caras de los
prismas que resultan de las interacciones entre la hélice del macrodipolo
proteínico y los dipolos en la molécula de agua del hielo enlazado. Ésta unión es
estabilizada por puentes de hidrógeno de carácter anfifílico de las hélices
resultantes en la fase hidrofóbica de la hélice que está siendo expuesta al
solvente. Cuando la temperatura de la solución es disminuida, el crecimiento de
los cristales de hielo ocurre primordialmente en el plano basal no cubierto ni
ordenado, resultando en la formación de cristales bipiramidales.
La estructura característica de las AFP tipo I podría contribuir a que este
mecanismo de acción sea revertido. Cuando sea resuelta e interpretada la
estructura de otros anticongelantes, podría aparecer un mecanismo de acción
común.
¿Porque algunos peces tienen anticongelantes macromoleculares?
El suero de los teleósteos marinos está en relación hipoosmótica con el agua de
mar, teniendo aproximadamente una tercera parte de la molaridad de los solutos.
Las propiedades coligativas de los solutos en el agua de mar (~0.45 M) bajan el
punto de congelación bajo ~ -1.9°C, mientras que el típico suero del teleósteo será
congelado a –0.7°C. Ésta discrepancia de ~ 1°C en los puntos de congelación
significa que los teleósteos no protegidos en temperaturas polares podrían tener
un riesgo de congelación e incluso muerte cuando su temperatura cayera bajo -
0.7°C. Si bien existe evidencia de que algunos peces pueden sobrevivir en estas
temperaturas en aguas profundas en un estado súper congelado, esto no es
posible en aguas superficiales, donde el contacto con hielo no permite el
enfriamiento . Cuando Scholander y colaboradores iniciaron sus investigaciones
sobre este problema usando un pez ártico observaron un inusual suero capaz de
soportar temperaturas de congelación (~ -1.4°C).
La naturaleza de el anticongelante responsable de esta depresión en el punto de
congelamiento escapó de estos investigadores. Sin embargo en 1969 DeVries y
Wohlschlag, reportan que el anticongelante presente en la sangre del pez
nototheniid, era una macromolécula proteinácea soluble en ácido tricloroacético al
10%. Una caracterización más especializada , reveló que este anticongelante
consta de un juego de glicoproteínas construidas a partir de la repetición de un
tripéptido (Ala-Ala-Thr)n con un fragmento de un disacárido enlazado a los
residuos de treonina. Como han sido estudiados más especies de peces por su
actividad anticongelante, se han identificado tres distintos tipos de proteínas y una
glicoproteína anticongelantes. Estas son ricas en alanina, la cadena helicoidal de
las AFP encontradas en lenguados y sculpins (tipo I), la AFP rica en cisteina de los
animales que habitan las profundidades marinas (tipo II) y una AFP (tipo III)
encontrada en anguilas, las cuales carecen de características distintivas en su
composición y secuencia(Fig.1).
La interacción de las proteínas y glicoproteínas anticongelantes con hielo.
A pesar de las marcadas diferencias en la composición de aminoácidos y
estructura proteica entre esos tipos de anticongelantes macromoleculares, todos
ellos parecen interactuar con el hielo de la misma manera. Tienen un efecto
favorable en el punto de fusión del hielo formado en su presencia y alguna
depresión de el punto de fusión es completamente explicable por las propiedades
coligativas de las proteínas en solución. Este es el punto de congelación de sus
soluciones es bajado más allá del valor predicho desde los efectos coligativos.
Fig.1 Representaciones esquematicas de cuatro estructuras de AF(G)P muestran la repetición estructural del glucopeptido; Tipo I: AFP de la platija invernal mostrando su estructura terciaria en una hélice, el tamaño de la molécula se indica en la cantidad de aminoácidos.
La diferencia entre los puntos de fusión y congelación es determinado por
histeresis térmica. Su valor es en función de la concentración de proteínas y
glicoproteinas anticongelantes (AF(G)P). La relación entre la histeresis térmica y
la concentración de AF(G)P, propone linearidad solo en valores muy bajos,
posteriormente empieza a dibujar curvas hiperbólicas (Fig.2).
Valores de la histeresis térmica para la mayoría de las AF(G)P en peces
proponen un valor estable en mas de 1°C en concentraciones saturadas. La
observación microscópica del crecimiento de cristales de hielo muestra que la
presencia de AF(G)P no solamente baja el punto de congelación de la solución,
sino que también altera el habito y ritmo de crecimiento de los cristales de hielo.
En ausencia de AF(G)P, el hielo crece más rápidamente a lo largo de ejes que
para dar una forma hexagonal a los cristales (Fig.3). Este crecimiento es inhibido
por AF(G)P. Cuando la temperatura de la solución es bajada , el crecimiento de
los cristales de hielo eventualmente vuelve a empezar, pero en un ritmo más
acelerado y primariamente a lo largo de los ejes C para dar cristales con formas
Fig 2.- Comparación de las curvas de histeresis térmica en diferentes especies de organismos. (SR) cuervo marino Mr 14000,(OP) ocean pout Mr 6000, (SH) sculpin Mr 4000, platija de invierno (F) Mr3300 y cod atlántico (C) Mr 2600. la curva patrón se identifica en AFGP-5.
bipiramidales. En concentraciones altas de AF(G)P, se forman cristales similares a
agujas.
El tipo I de AFP de lenguados y sculpins es las más extensivamente proteína
anticongelante caracterizada, es la única por la cual una estructura cristalina es
conocida como rayos X y por los cuales han sido propuestas detalladamente las
relaciones funcionales estructurales.
Presencia de un dipolo péptido macromolecular
El dicroismo circular (CD) en las medidas del tipo I de AFP sugieren que en una
estructura helicoidal , por lo menos las bajas temperaturas donde las AFP son
operativas. A -1°C, fueron reportadas con 85% más contexto de hélice, pero este
valor decrece rápidamente conforme la temperatura es aumentada, siendo 47% a
25°C, formando un anillo al azar, por encima de 70°C. La estructura cristalina en
rayos X de las AFP de los componentes de la platija de invierno muestra que la
proteína es una simple hélice en estado sólido.
Hol ha puntualizado que las hélices son macrodipolares. Asociadas con cada
enlace peptídico en el péptido de unión forma un significativo dipolo eléctrico .
Fig 3.-Crecimiento de los cristales de hielo en presencia y ausencia de AFP. A) cristal hexagonal formado en ausencia de AFP. B)Cristal formado en presencia de AFP, muestra inhibición de la expansión del eje A dando formas bipiramidales. C) Cristal formado en una concentración alta de AFP, muestra formas aciculares.
Cuando ordenado en una hélice , esos dipolos empiezan a alinearse cerrando el
eje de la hélice, primero resultando un macrodipolo a lo largo del eje de la hélice.
Este dipolo es equivalente a una media unidad aislada, cargada en cualquiera de
los polos de la hélice orientada tal que la carga positiva es en el NH2 terminal y la
negativa en el COOH inicial. Sin embargo la fuerza del campo eléctrico de la
hélice más hélices mayores a quince residuos es solamente marginalmente de la
parte de trece residuos que dependen.
Estos investigadores sugirieron que los macrodipolos peptídicos juegan un
importante papel en la unión de sustratos cargados con coenzimas tales como
NAD, NADP y otros compuestos que contienen fosfato, un largo rango de
atracción de sustratos cargados y la aceleración de severas reacciones
enzimáticas.
Recientes estudios de modelos peptídicos han ayudado a definir el papel del
dipolo en la estabilidad de la hélice, si bien como algunas características
estructurales que contribuyen a reforzar el dipolo. Basados en esos encuentros, el
tipo I de AFP en lenguados tiene varias características estructurales que pueden
estabilizar la conformación de la hélice por la interacción favorable con el dipolo
de la hélice, estos incluyen la carga negativa del aminoácido terminal NH2 (Asp);
el cual es realizado por la amidación en el COOH terminal surgiendo por el
procesamiento de la proAFP a AFP. Los puentes salinos intramoleculares tales
como los presentes entre Lys18 y Glu22 en la platija de invierno, la AFP (HPLC-
6) y entre Lys19 y Aps23 y Lys30 y Asp34 de la platija de cola amarilla AFP (Fig.4)
son conocidas para fortalecer la hélice , pero su polaridad (se invierte la carga
positiva hacia la carga negativa, NH2-terminal Asp; carga negativa hacia carga
positiva, COOH-terminal Arg), sugiere que ellos pueden también reforzar la hélice
dipolar.
Anfificidad de la hélice
Las dos mayores AFPS-A(HPLC-6) y B(HPLC-8) en platijas invernales son cada
uno de 37 aminoácidos de largo y contienen tres series de 11 aminoácidos
repetidos en la secuencia ThrX2AsxX7 donde la X usualmente es alanina ó algún
otro aminoácido que favorezca la formación de una hélice , esta estructura
repetida es obviamente cuando las AFPs de la platija de invierno y la de cola
amarilla son comparadas, las últimas proteínas contienen una adición de 11
aminoácidos repetidos. A nivel de DNA hay evidencia de secuencias de AFP en la
platija invernal que contiene cuatro ó a veces cinco repeticiones pero no evidencia
de que sus productos genéticos si fueran expresados hagan una contribución
significativa en los niveles de anticongelantes en sangre.
El efecto de esta serie de estructura repetida es para generar una hélice con
características anfifilicas. Esta estructura helicoidal es estabilizada por la
interacción dipolar con aminoácidos terminales y por intraencadenamiento de la
formación de puentes salinos como fue indicado arriba. Porque la presencia de
algunos residuos de alanina en el polo hidrofilico de la hélice y algunos residuos
hidrofílicos en el lado hidrofobico, la proteína anticongelante AFP no es
estrictamentes anfifilica, de hecho,los momentos hidrofóbicos (M rangos desde
0.1 a 0.27)son bastante pequeños.
Una proyección circular indica que la Ser4, Lys18 y Glu22 en HPLC-6, son residuos
con proyecciones en la cadena hidrofílica, de lado hidrofobico de la hélice. El
último de dos lados de dos cadenas formadas por los puentes salinos
intramoleculares. Mientras tanto el papel de la Ser4 es actualmente desconocido.
Interacciones del hielo a lo largo del aminoácido encadenado a la proteína
anticongelante (AFP).
Desde la construcción de un modelo existen nueve cadenas potencialmente
unidas al hielo formadas por aminoácidos en cadenas largas en HPLC-6: Asp1,
Thr2, Asp5, Thr13, Asn16, Thr24, Asn27, Thr35, y Arg37 (Fig.4). Estudios
cristalográficos con rayos X indican que existe suficiente libertad torsional de las
cadenas laterales para acomodar la unión de las cadenas laterales de
aminoácidos en diversas superficies del hielo. La síntesis de la fase solida de las
formas acortadas han demostrado que Thr2-Arg37 y los ASP5-Arg37 son
anticongelantes activos, aunque son menos eficaces en la inhibición del
crecimiento del hielo en un eje. Esta ultima forma carece de dos residuos
potenciales para la union del hielo, Asp1 y Thr4. Las formas más cortas de HPLC-
6 con solamente dos repeticiones de 11-aminoacidos (26 aminoácidos) están
inactivas, lo cual es constante en observaciones anteriores que limitan la
proteolisis de la destrucción de la actividad anticongelante.
La AFP de la platija de cola amarilla (fig. 4) es más larga que HPLC-6 por una
repetición 11-aminoacidos pero esta contiene un poco (ocho) potencial para unir el
hielo a la cadena lateral.
Su actividad anticongelante es similar a las tres repeticiones de AFPs de la platija
del invierno cuando se calculo en una base molar.
Mecanismos de acción
Fig 4.- estructura secundaria del tipo II de AFP de sculpins y lenguados.
La presencia de AFP como una sola -hélice propuesta por Yang postula que el
momento dipolar creado por la hélice es la fuerza conductora inicial para el
reconocimiento específico de la interacción AFP-hielo.
Cuando AFP acercan a los núcleos del hielo al azar difusiona, el dipolo del péptido
induce a una alineación antiparalela de las moléculas de agua en la rejilla (fig. 5).
La examinación de un modelo de cristal de hielo indica que los dipolos de todas
las moléculas de agua están orientados en una de dos direcciones: o inclinado a
55 del eje-c y a 30 del eje-uno, o bien inclinado a 55 del eje-c y a 90 del eje-
uno. El resultado de estos dos vectores está inclinado a 51 del eje-c y a 60 del
eje-uno (< 211 >, Fig. 5)
Lo único que ocurre naturalmente en los planos del hielo que son paralelos al
vector resultante del dipolo (< 211 >) son las caras del prisma. El AFP puede
mantener su alineación con el vector del dipolo < 211 > y la ubicación en la cara
plana del prisma. Esta alineación preferencial dirige la union de AFP a la cara del
prisma, y su absorción inhibe el crecimiento del eje-uno por la absorción del
modelo de inhibición.
Fig 5.- Representación esquemática del tipo I de AFP en su interacción con el hielo.
La amplificación de la hélice, con la alineación de sus cadenas laterales
hidrofílicas, proporciona los puentes de hidrogeno necesarios para la interacción
con la rejilla del hielo, mientras que el conjunto de cadenas laterales hidrofóbicas
sirven para impedir el crecimiento adicional de los núcleos del hielo.
Los dipolos del agua dentro del cristal de hielo y la superficie de la base plana
estarían desordenadas, y la nucleación y el crecimiento del hielo en la base plana
podrían continuar ocurriendo. La formación nuevamente desordenada del frente
del hielo en la base plana se conservaría cuando este avanza en el arreglo de la
capa externa o está limitado por otras AFPs en la solución. Esta alteración
habitual en el crecimiento provoca el desarrollo de cristales bipiramidales de hielo
(fig. 3 y fig. 5) la frecuente alteración del crecimiento del hielo en AFP sugieren
que las soluciones que unen a las AFP a las caras de los prismas lo hacen con
mayor afinidad que a la base plana. El complejo de la cara del prisma del AFP-
hielo es estabilizado por ambos dipolos y por enlaces de puentes de hidrógeno,
mientras que el complejo de la base plana estabilizado sobre todo por puentes de
hidrógeno.
AFP Tipo I de sculpins
La otra AFP tipo I que ha sido descrita viene de los sculpins (fig. 4). De acuerdo a
la composición de sus aminoácidos, en particular de alanina contenido en más del
60% de los residuos, secuencia, y una estructura secundaria de -hélice, no hay
problema en clasificar este con la AFP de la platija. Sin embargo, no está claro si
estas proteínas son similares porque son homólogas o porque se han
evolucionado convergentemente (tendencia comun, dirigirse a un mismo punto).
Los componentes de AFP del sculpin son aún más amplificados que AFPs de la
platija. Por ejemplo, AFP SS-8 del sculpin tiene un momento hidrofóbico de 0.26
comparado con un valor de 0.13 para la AFP HPLC-6 de la platija. La formación de
un puente de sal de las cadenas laterales en SS-8 es factible en Lys22 y Asp26, y
en los residuos apropiados en SS-3 y GS-5 (fig. 4), aunque la prueba de su
existencia requeriría confirmación por medio de técnicas físicas. Las AFPs del
Sculpin difieren significativamente de AFPs de la platija en que en sus extremos
terminales tiene un grupo amino NH2-. Otra diferencia es que en AFPs del sculpin
tiene una repetición estructural interna que no esta bien demarcada mientras que
si esta determinada en AFPs de la platija. La AFP tipo I más pequeña es SS-3 que
naturalmente aparece en la parte más corta del sculpin . Este peptido tiene 33
aminoácidos de largo con un contenido de la hélice de el 45% con 4C. Tiene una
hélice rompiendo una prolina en la posición 4, la cual puede reducir efectivamente
la longitud de la hélice a 29 residuos.
GLUCOPROTEÍNAS ANTICONGELANTES
Las primeras macromoleculas anticongelantes que se caracterizaron
bioquímicamente fueron los AFGP del nototheniids del océano antártico. Este tipo
de anticongelante se construye encima de un tripeptido que repite las unidades
(Ala -Ala-Thr) al cual se liga el disacárido B-D-galactosa (1 3) - - N acetil-D-
acetil-D-galactosamina a través del hidroxido del oxigeno del residuo de la
treonina. La purificación de AFGPs ha sido facilitado por su superabundancia en
nototheniid serum y su solubilidad en ácido tricloroacetico al 10%. Tanto asi como
ocho componentes han sido detrminados por la electroforesis de gel. Estos han
sido enlistados como componentes del 1 al 8 de acuerdo al orden de aumento en
la movilidad electroforecica y disminución en el tamaño. Su rango molecular de
masas va a partir de 2.600 a 33.000. En algunas de las repeticiones del tripeptido
de los componentes de AFGP más pequeña, la prolina substituye a la alanina en
el lado terminal COOH de la treonina. El análisis detallado de la secuencia
demuestra que el componente 8 del Pagothenia borchgrevinki es en sí mismo una
mezcla de secuencias en las cuales las substituciones de la prolina ocurren en
diversas partes donde se repete el tripeptido. La AFGPs (que contiene prolina)
más pequeñas, son menos activas como anticongelantes que las más grandes.
Este mismo tipo de anticongelante se encuentra en los bacalaos de climas
templados y regiones polares del hemisferio norte. Esto es sorprendente, en vista
de la distancia evolutiva que existe entre los nototheniids y los bacalaos y es que
el número y el tamaño de los componentes de AFGP son similares en ambos
grupos de pescados. La sustitución alanina/prolina también ocurre en AFGPs más
pequeñas de los bacalaos. En estas dos especies, Microgadus tomeod (frostfish) y
Eleginus gracilis (bacalao del azafrán), la arginina aparece como sustituto de los
residuos de la treonina en algunas de las repeticiones del tripeptido. No está claro
si estas substituciones de aminoácidos sean los responsables de la actividad
anticongelante más baja del de los componentes más pequeños. En este sentido
es quizás significativo que la división enzimática, de los componentes de la AFGP
más grande, en fragmentos de 11 o menos unidades de glicotripeptidos dan lugar
a la pérdida considerable de la actividad. Otras manipulaciones que dan lugar a la
pérdida de actividad son modificaciones de los disacáridos de los moieties por la
acetilación, peroxido de oxigeno, formación compleja con boro, o su retiro por la B-
eliminacion. Estas reacciones resultado de la pérdida de puentes de hidrogeno
(que ha sido postulada por DeVries, Feeney, y compañeros de trabajo) estan
implicados en la union de AFGP a la rejilla del hielo.
Aunque se han realizado numerosos estudios físicos con AFGP desde su
descubrimiento (repasado recientemente por Ananthanarayanan,), la
conformación de estas glucoproteínas no han estado inequívocamente definidas.
El modelo más plausible para su estructura es uno en el cual la espina dorsal del
polipéptido forma un poliprolina Il como una estructura helicoidal zurda con tres
residuos por vuelta, y los disacáridos se organizan en una conformación planar
con sus grupos hidrofílicos expuesto al solvente acuoso y sus caras hidrofóbicas
adyacente a la cadena del polipéptido. Este modelo es notablemente similar en
principio a la -helice amfifilica de AFP tipo I, y puede describirce por la función
tan semejante de tales tipos de anticongelantes tan diferentes.
TIPO II AFP
El tipo II AFP esta caracterizado por su alto contenido de cisteína (8 por 100
residuos) e inactivación por los reactivo sulfhidrilo. Este tipo de AFP ha sido
actualmente reportada en una especie de pescado solamente, (Hemitripierus
arnericanus). Aunque se han encontrado proteínas termales de la histéresis ricas
en cisteina/cisteina adentro de algunos insectos, no se sabe lo suficiente sobre
sus características para indicar si se clasifican como AFPs tipo II.
La presencia de cinco cisteinas en una proteína relativamente pequeña ha
complicado su caracterización bioquímica, y una combinación de la proteína y la
secuencia del DNA necesita proporcionar la información estructural definitiva. El
producto primario de la traducción del mRNA de AFP del mar raven fue
secuenciado por Edman la degradación revela la localizacion de los primeros
cuatro residuos de leucyl. Referente a la secuencia reproducida del DNA de AFP
el precursor de AFP tiene por lo tanto 163 aminoácidos. El análisis de los
aminoácidos y la secuencia del peptido NH2-terminal desbloqueado de la forma
circular madura de la AFP indicó que la glutamina en la posición 35 es el residuo
de NH2-terminal. Así la forma madura tiene129 aminoácidos largos y no contiene
cisteinas libres. Según el algoritmo calculado por von Heijne (50), el sitio más
probable del peptide señal está después de alanina en la posición 17. Si es así,
AFP tipo II tendría una forma de la proteina precursora, cuya función es
desconocida. El grado de heterogeneidad en la AFP del mar raven no esta
claramente establecido aun. Hay una cierta evidencia para el múltiplo,
componentes similares del análisis de la cromatografía (HPLC) en el líquido de
alto rendimiento o funcionamiento. Comparación de una secuencia del cDNA con
la una copia de un genoma demuestra si ambos fueron expresados, las proteínas
maduras serian diferentes por un solo aminoácido en la posición 4 (Gly- Pro.). En
conjunto hay 12-15 copias del gene de AFP en el genoma del mar raven. Estos
que no han sido demostrados traz alguna evidencia de diferencias importantes en
la región codificante. Esto parece probablemente, por lo tanto, la AFP del mar
raven es producida por los múltiples genes y ésa heterogeneidad limitada existe
en forma de uno o varios reemplazos de aminoácidos.
Las predicciones de la estructura secundaria indicaron una falta de la -helice y -
capa pero un alto contenido de vueltas inversas. Los estudios del dicroismo
(propiedad de ciertas sustancias cuyo color varia con las circunstancias de
observación) circular confirman el bajo contenido de -hélice y el enriquecimiento
en -estructuras de vueltas inversas. También sugieren la presencia de residuos
aromáticos en un ambiente asimétrico, lo cual consta de una estructura terciaria
doblada.
AFP Tipo III
Las AFP tipo III no contienen cisteína y su composición de aminoácidos está
perfectamente balanceada. Fueron aisladas por primera vez de la anguila
Macrozoarces americanus, de la familia Zoarcidae, y mas recientemente de otros
tres miembros de la familia, Rhigophila dearboni y Austrolycicthys brachycephalus,
ambas anguilas antárticas, y Lycodes polaris, una anguila ártica. Trabajos
recientes de G. L. Fletcher (resultados sin publicar) han mostrado que la AFP tipo
III se distribuye de una manera aún mas amplia apareciendo en al menos, otras
tres familias de Zoarcoide, además de Zoarcidae.
La AFP de océanos de Terranova comprende un juego de proteínas relacionadas,
de las cuales, los mayores componentes son separables por cromatografía de
intercambio iónico y HPLC de fase reversa. AFPs de 8 de los 12 picos definidos de
la HPLC, HPLC 1, 4, 5-7, 9, 11 y 12, han sido secuenciados con secuenciación
protéica convencional (Fig 6). El residuo terminal NH2- de la HPLC 4, 5 y 6 es
glutamina, que ha sido ciclizada del ácido pirolidino carboxílico, y es por lo tanto,
resistente a la degradación Edman. Estas proteínas tienen de entre 62 a 56
aminoácidos, aunque hay algunas diferencias en la longitud del procesamiento de
las terminales NH2- y COOH-, solo un componente (HPLC-5) puede ser producto
de otro (HPLC-6). Todos los otros componentes tienen diferencias de aminoácidos
internos. Basadas en su secuencia de aminoácidos, las AFPs tipo III pueden ser
divididas en dos grupos. El grupo mas grande, comprende a los componentes que
se unen a SP-Sephadex. Su secuencia de identidad es ~90%, y la mayoría de las
sustituciones de aminoácidos son conservativas. El otro, menos común grupo de
AFPs tipo III, se unen a QAE.Sephadex. Aunque muestran ~75% de secuencia de
identidad dentro del grupo, esta cifra cae al ~50% cuando son comparadas con la
serie SP. Esto es de acuerdo a estudios inmunológicos de Hew, que indicó que los
dos grupos, aunque realizan reacciones cruzadas, son inmunológicamente
distintos.
Comparaciones entre AFP genómico y clones de cDNA escogidos al azar para
secuencias de codificación de proteínas que encajan en las series SP o QAE,
confirman la existencia de secuencias protéicas o muestran variaciones menores.
Obviamente existen otros genes activos, aparte de los que hacen surgir los
componentes protéicos mayores, que, en cambio, pueden ser componentes
mayores porque están codificados por múltiples copias de genes. En efecto, dos
clones de cDNA que difieren muy poco en su secuencia de nuclóticos en
posiciones silenciosas, ambas codifican para HPLC-6. En concordancia con estas
Fig 6.- Compendio de secuencias para el tipo III de AFP. Fueron derivadas de de diversas especies de peces árticos marinos.
observaciones, se ha estimado que el océano de Terranova tiene ~150 copias del
gen AFP. La misma especie encontrada en las aguas de New Brunswick tiene
menos copias (entre 30 y 40) del gen y produce AFP en menores proporciones.
A pesar de la abundancia de datos de la secuencia de aminoácidos de las AFPs
tipo III, se conoce muy poco acerca de su estructura o mecanismo de acción. Un
análisis espectral de ambos componentes, QAE y SP, mostraron que este
anticongelante tiene una estructura secundaria y una terciaria bien definidas. En
la región lejana del espectro ultravioleta (190-250nm), es espectro CD es
cualitativamente similar al producido por la AFGP. Sin embargo, en la región
ultravioleta mas cercana (250- 300 nm), existen bandas que indican un arreglo
asimétrico de aminoácidos aromáticos. También la transición sigmoidal termal
observada en el calentamiento de la AFP sugiere la presencia de interacciones
cooperativas que actúan para estabilizar su estructura secundaria. Estas
características no se encuentran en la AFGP. Un estudio espectral en el
componente de tipo QAE de L. polaris confirma la poquedad de α-hélice y β-
plegada originalmente indicados por predicciones de estructuras secundarias, y
confirma además la presencia de una estructura terciaria doblada.
Existe una variabilidad en los extremos NH2- y COOH- de las AFPs tipo I de los
platijos, donde estas terminales y sus modificaciones se cree que juegan un papel
clave en la estructura y por lo tanto en la actividad del anticongelante.
Recientemente estudios de expresión han mostrado que la AFP tipo III producida
en E. coli con una extensión terminal NH2- de Met-Lys, y la producida en
Drosophila melanogaster, con siete extensiones terminales NH2- son
completamente activas y funcionales.
Todas las AF(G)P de peces parecen interactuar con el hielo de manera similar. Es,
por lo tanto, común pensar que la AFP tipo III presenta un grupo de residuos
hidrofilicos en un lado de la molécula que son capaces de formar puentes de
hidrógeno con el hielo, como se propone para el lado de la cadena con asparagina
y treonina, junto con la cara hidrofílica de la AFP tipo I α-helicoidal y los grupos de
carbohidratos de la AFGP. De ser así, existe un número de residuos hidrofílicos
altamente conservados en la secuencia de la AFP tipo III que cumplen esta
función. Estudios preliminares usando mutagénesis de sitio dirigido, han mostrado
que hay una disminución del 25% en la actividad cuando Glu21 o Glu34 son
substituidas por alanina.
Proyecciones para el futuro, relaciones estructura / función.
Aún a nivel protéico, existen muchas preguntas sin contestar acerca de las
moléculas anticongelantes, Una de las observaciones mas fascinantes es que
cuatro estructuras completamente diferentes parecen interactuar con el hielo de
manera similar y si es así, tal vez operen con el mismo mecanismo de acción para
bajar el punto de congelación. ¿Como es que tales estructuras diferentes
presentan fundamentalmente sitios de unión similares que interactúan
específicamente con las caras prismáticas del hielo? Caracterizaciones de las
estructuras de la AFP tipo I y de la AFGP han llevado a la hipótesis de que tal vez
se requieren moléculas anfipáticas para unir el hielo al extremo hidrofílico y excluir
el H2O en el lado hidrofóbico. Estas características son reconocibles en ambos
anticongelantes. Detalles del modelo como la importancia de la hélice macrodipolo
o el espacio entre los puentes de hidrógeno siguen sin ser establecidos. Pueden
ser probadas y refinadas al menos para la AFP tipo I, por un estudio de estructura
de síntesis peptídica de fase sólida o de mutagénesis de sitio dirigido en
conjunción con biosíntesis.
Las AFPs tipo II y III son estructuras mas complejas que parecen tener un
elemento de estructura terciaria. La solución de estas estructuras por cristalografía
de rayos X y la NMR. Bidimensional es una prioridad obvia al ver si también tiene
una estructura anfipática y tal vez un espacio regular entre sus puentes de
hidrógeno. El reconocimiento de un motivo estructural común en las cuatro
estructuras de la AF(G)P recorrerá un largo camino para confirmar el modelo de
interacción con el hielo y complementará los estudios de estructura / función.
El descubrimiento de cuatro estructuras anticongelantes diferentes en teleostos
con muy poca lógica en su distribución dentro del esquema filogenético aceptado
actualmente lleva a la sugerencia de que su elaboración como anticongelantes es
un evento relativamente reciente en la escala de tiempo geológico. Ya que ellas
tienen un origen claramente no monofilético, existe la posibilidad de que tipos
adicionales de anticongelantes se descubrirán en peces. Hoy en día, proteínas
anticongelantes ricas en cisteína han sido caracterizadas en el arenque y el
esperlano. Aún no es claro si pertenecen a la categoría de tipo II o representan un
tipo diferente. También otros tipos de AFP pueden ser descubiertos mientras se
estudian otras especies.
Proteínas anticongelantes han sido descritas en insectos. Estas proteínas no han
sido debidamente caracterizadas para comenzar su clasificación. Una de las
dificultades ha sido obtener suficiente material para trabajar. Sin embargo, con el
avance de la electroforesis capilar, la HPLC y el incremento en la sensitividad de
la fase gaseosa de secuenciación de proteínas, estas dificultades difícilmente
retrasarán la caracterización de anticongelantes en insectos por mucho tiempo.
Debido a que los insectos terrestres invernales usualmente encaran temperaturas
mas abajas que las de un pez, será interesante ver si sus AFPs provocan un
descenso en el punto de congelamiento menor que de 1 °C+, que parece ser el
valor máximo para el anticongelante en peces. Los valores de histeresis termal de
varios grados ha sido reportada para la hemolinfa cruda de insectos, pero falta ver
si estos valores son atribuidos a un solo componente. Si pueden, entonces su
mecanismo de acción puede ser diferente a las AF(G)Ps de los peces.
Últimamente el conocimiento acerca de la relación estructura / función puede
permitir el diseño de un anticongelante macromolecular mejor y mas eficiente, eso
es, uno con valor mayor de histeresis termal por unidad de concentración. Una
AFP con esta propiedad sería particularmente útil para estudios transgénicos
diseñados para conferir resistencia al frío o a través de transferencia de genes.
Bibliografía
•Davies, Peter L. And Choy L. Hew.
Biochemistry of fish antifreeze proteins. The FASEB journal,vol 44, May 1990,
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•Pia, María y Alessandro Minelli, La ballena y los animales del mar. Edit Everest,
España, 1985.