actividad hipoglucemiante de extractos y fracciones de

$: Actividad hipoglucemiante de extractos y fracciones de$
UNIVERSIDAD DEL PAPALOAPAN

CAMPUS TUXTEPEC

DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO

Actividad hipoglucemiante de extractos y fracciones

de plantas silvestre e in vitro de Tecoma stans

Presenta:

LUCÍA MONSERRAT TORRES XOCUA

Para obtener el grado

Maestra en Biotecnología

Director de Tesis

Dr. Paul Mauricio Sanchez Ocampo

Co-director de Tesis

Dra. Jacqueline Capataz Tafur

San Juan Bautista Tuxtepec, Oaxaca, México. 2019

RECONOCIMIENTO

Esta tesis fue realizada en los Laboratorios de Cultivo de Células Vegetales, Analisis

Instrumental y Bioterio de la Universidad del Papaloapan, Campus Tuxtepec bajo la dirección

del Dr. Paul Mauricio Sanchez Ocampo y de la Dra. Jacqueline Capataz Tafur. Se contó con la

asesoría del Dr. Adolfo López Torres para la identificación y cuantificación de metabolitos por

UHPLC.

La investigación fue realizada bajo el financiamiento del proyecto CB-CONACyT N° 18395, e

INFRA 255514 y es parte de la investigación enmarcada dentro del proyecto Cátedras-

CONACyT “3212 Estudio integral de plantas medicinales para la producción y estandarización

de fitoextractos”. Asimismo, se contó con la beca CONACyT con número de registro 593424

perteneciente al programa de Maestría en Biotecnología con registro PNPC 003131, Beca Mixta

de movilidad y Beca de Mujeres Indígenas.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Paul Mauricio Sanchez Ocampo y a la Dra. Jaqueline Capataz Tafur, por su apoyo brindado durante la

realización de este proyecto, por compartir sus conocimientos y sus sabios consejos, por su paciencia y dedicación

para la realización de este proyecto.

A mi comité tutorial conformado por el Dra. Blanca Estela Barrera Figueroa, Dr. Oscar Abelardo Ramirez

Marroquin, la Dra. Hermenegilda Moreno Díaz y al Dr. Adolfo López Torres, por brindarme la oportunidad de

recurrir a su capacidad y experiencia científica en la realización de la investigación.

DEDICATORIA

A Dios:

Por darme la fuerza en momentos difíciles, por escucharme, por bendecirme con una grandiosa

Madre, por mi padre, hermana y sobrino. Gracias por ser más que un padre un amigo, por

guiarme en el camino y permitir la realización de mis sueños.

A mis padres:

Gracias por apoyarme en todo momento, por su amor y sabios consejos. Gracias por ser para mi

esa luz y fortaleza. Estaré siempre agradecida con la vida por tener unos padres como ustedes.

Gracias por ser antes que mis padres, mis mejores amigos. Los amo, respeto y admiro.

A mi hermana y sobrino:

Gracias por ser parte de mi vida, por escucharme y apoyarme, Rodri: Gracias por llegar a

nuestras vidas y llenarlas de Luz, sonrisas, travesuras y amor.

A Daniel:

Gracias por ser un amigo incondicional, por estar conmigo en todo momento y junto con mi

familia ser mis principales motores, por confiar y creer en mi. Te amo.

PRODUCTOS DE INVESTIGACIÓN DE ESTE TRABAJO

Torres-Xocua L., Capataz-Tafur J, Sanchez-Ocampo P. Evaluación hipoglucemiante de

extractos y fracciones de Tecoma stans. XVI Congreso Nacional de Biotecnología y

Bioingeniería. Puerto Vallarta, Jalisco, México. Junio. 25-30 de 2017

Torres-Xocua L, Capataz-Tafur J, Pérez-Picaso L, Sanchez-Ocampo P. Hypoglycemic activity

of extracts from wild and in vitro plants of Tecoma stans. XXVI Congreso Italo-Latinoamericano

de Etnomedicina SILAE 2017 y IX Congreso Colombiano de Cromatografía COCOCRO.

Cartagena de Indias, Colombia. Septiembre 25-29 de 2017.

ÍNDICE

RESUMEN..................................................................................................................................... 1

ABSTRACT ................................................................................................................................... 2

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 3

2. ANTECEDENTES .................................................................................................................... 4

2.1 DIABETES .......................................................................................................................... 4

2.1.1 Clasificación de la diabetes ............................................................................................. 4

2.1.2 Modelos empleados para estudios de diabetes tipo 2 .................................................... 6

2.1.3 Farmacoterapia ................................................................................................................ 9

2.1.4 Uso de plantas medicinales para el tratamiento de DM en México. ......................... 12

2.2 Tecoma stans ...................................................................................................................... 13

2.2.1. Usos en la medicina tradicional de T. stans ................................................................ 15

2.2.2 Actividad biológica de T. stans. ..................................................................................... 15

2.2.3 Estudios fitoquímicos de T. stans .................................................................................. 17

2.2.4 Cultivo in vitro de T. stans ............................................................................................. 20

3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................... 21

4. HIPÓTESIS ......................................................................................................................... 22

5. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 22

5.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 22

5.2 OBJETIVOS PARTICULARES ..................................................................................... 22

6. DESARROLLO EXPERIMENTAL ..................................................................................... 23

7. METODOLOGÍA ................................................................................................................... 24

7.1 Recolección de material vegetal silvestre y obtención de plántulas in vitro de T. stans

................................................................................................................................................... 24

7.2 Preparación del EHAS y EHAI ....................................................................................... 24

7.3 Obtención de la FFAS, FFOS del EHAS y FFAI, FFOI del EHAI de T. stans ........... 25

7.4 Análisis químico del EHAS, FFAS, FFOS EHAI, FFAI y FFOI de T. stans ............... 25

7.5 Animales de experimentación .......................................................................................... 27

7.6 Actividad hipoglucémica del EHAS, FFAS y FFOS, EHAI, FFAI Y FFOI de T. stans

................................................................................................................................................... 27

7.7 Fraccionamiento de las FFOS y FFOI de T. stans ......................................................... 28

7.8 Análisis químico de las fracciones del fraccionamiento químico de la FFOS y de la

FFOI de T. stans ...................................................................................................................... 29

7.9 Cuantificación de compuestos fenólicos por HPLC. ...................................................... 29

7.10 Actividad hipoglucémica de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans ............ 29

7.11 Análisis estadístico .......................................................................................................... 30

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 31

8.1 Rendimiento del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans ....................................................... 31

8.2 Análisis químico del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans ................................................. 31

8.2.1 Identificación de grupos de compuestos por CCF. ..................................................... 31

8.2.2 Fitoquímica del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans ...................................................... 32

8.3 Actividad hipoglucémica del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans ................................... 32

8.4 Fraccionamiento de la FFOS de T. stans ........................................................................ 36

8.5 Análisis químico de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S obtenidas del

fraccionamiento químico de la FFOS de T. stans ................................................................. 38

8.5.1 Identificación de grupos de compuestos por CCF ...................................................... 38

8.5.2 Fitoquímica de las fracciones TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans ......... 38

8.6 Actividad hipoglucemiante de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans .......... 39

8.7 Rendimiento del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans ......................................................... 42

8.7.1 Análisis químico del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans ................................................ 43

8.7.2 Identificación de grupos de compuestos por CCF. ..................................................... 43

8.8 Actividad hipoglucemiante del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans.................................. 44

8.9 Fraccionamiento de la FFOI de T. stans ......................................................................... 47

8.10 Análisis químico de TsC1F11I, TsC1F13I, TsC1F15I y TsC1F17I obtenidas del

fraccionamiento químico de la FFOI de T. stans ................................................................. 49

8.10.1 Identificación de grupos de compuestos por CCF .................................................... 49

9. CONCLUSIONES................................................................................................................... 53

10. REFERENCIAS .................................................................................................................... 54

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Fármacos orales empleados para el tratamiento de DM2.......................................... 010

Tabla 2. Ejemplos y farmacoterapia de sulfonilureas……………………………………….. 10

Tabla.3 Plantas empleadas para DM………………………………………………………… 12

Tabla 4. Taxonomía de T. stans. …………………………………………………………………… 13

Tabla 5. Análisis fitoquímico en los diferentes extractos de las hojas de T. stans…………… 17

Tabla 6. Compuestos aislados de las hojas de Tecoma stans……………………………………. 19

Tabla 7. Cultivo in vitro de Tecoma stans…………………………………………………………. 20

Tabla 8. Pruebas fitoquímicas para extractos de plantas……………………………………. 26

Tabla 9. Tabla Nutricional del alimento empleado para los ratones en la experimentación… 27

Tabla 10. Grupos de animales de experimentación tratados con fracciones silvestre e in

vitro de T. stans……………………………………………………………………………….

28

Tabla 11. Grupos de animales de experimentación tratados con fracciones silvestre de T.

stans…………………………………………………………………………………………..

30

Tabla 12. Grupos de compuestos identificados en los extractos……………………………. 32

Tabla 13. Actividad hipoglucemiante de EHAS, FFAS y FFOS de T. stans………………….. 34

Tabla 14. Peso corporal de los grupos de experimentación con EHAS, FFAS y FFOS de T.

stans………………………………………………………………………………………………………

35

Tabla 15. Fracciones obtenidas del fraccionamiento químico de la FFOS de T. stans……... 37

Tabla 16. Grupos de compuestos identificados en las fracciones TsC1F12S, TsC1F14S y

TsC1F16S de T. stans………………………………………………………………………...

39

Tabla 17. Actividad hipoglucemiante de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans…. 40

Tabla 18. Peso corporal de los grupos de experimentación TsC1F12S, TsC1F14S y

TsC1F16S de T. stans………………………………………………………………………………….

41

Tabla 19. Rendimiento obtenido de la extracción………………………………………… 43

Tabla 20. Actividad hipoglucemiante del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans…………………… 45

Tabla 21. Peso corporal de los grupos de experimentación EHAI, FFAI y FFOI de T. stans. 46

Tabla 22. Fracciones obtenidas del fraccionamiento químico de la FFOI de T. stans……….. 48

Tabla 23. Cuantificación de ácidos fenólicos en extractos y fracciones silvestre y cultivada

in vitro de Tecoma stans………………………………………………………………………………

50

INDICE DE FIGURAS

Figura.1 Estructura química de estreptozotocina…………………………………………… 09

Figura 2 Árbol de T. stans…………………………………………………………………………… 14

Figura 3. Partes características del árbol de T. stans…………………………………………….. 14

Figura 4. Principales alcaloides y compuestos fenólicos de Tecoma stans…………………. 18

Figura 5. CCF, fase normal de EHAS, FFAS y FFOS……………………………………… 31

Figura 6. Fraccionamiento químico de la FFOS……………………………………………. 37

Figura 7. CCF, fase normal de TsC1F12S, TsC1F14S, TsC1F16S…………………………. 38

Figura 8. Plántulas in vitro de T. stans……………………………………………………… 42

Figura 9. CCF fase normal del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans…………………………… 43

Figura 10. Fraccionamiento químico de la FFOI…………………………………………… 47

Figura 11. CCF, fase normal de TsC1F11I, TsC1F13I, TsC1F15I y TsC1F17I……………. 49

Figura 12. Cromatogramas de HPLC de las fracciones activas FFOS, F11 S y F14 S de

plantas silvestre de Tecoma stans……………………………………………………………

52

Figura 13.Cromatogramas de HPLC de la fracción orgánica activa de plantas silvestre de

Tecoma stans…………………………………………………………………………………

52

ABREVIATURA

AMD: Asociación Mexicana de Diabetes

ATP: Adenosín trifosfato

ADN: Ácido desoxirribonucleico

ADP: Adenosín difosfato

CONABIO: Comisión Nacional para el Conocimiento y uso de la Biodiversidad

CCF: Cromatografía de capa fina

CD-1: Marca registrada de Charles River Laboratories, USA

DM: Diabetes mellitus

DM1: Diabetes mellitus tipo 1

DM2: Diabetes mellitus tipo 2

DMG: Diabetes mellitus gestacional

EHAS: Extracto hidroalcohólico silvestre

EHAI: Extracto hidroalcohólico in vitro

FID: Federación Internacional de Diabetes

FFAS: Fracción fase acuosa silvestre

FFOS: Fracción fase orgánica silvestre

FFAI: Fracción fase acuosa in vitro

FFOI: Fracción fase orgánica in vitro

Fe CI3: Cloruro de férrico

GLP – 1: Agonistas del péptido – 1

HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución (Por sus siglas en inglés)

HCI: Ácido clorhídrico

H2SO4: Ácido sulfúrico

NAD: Nicotín Adenín dinucleótido

NaClO: Hipoclorito de Sodio

NaOH: Hidróxido de Sodio

OMS: Organización Mundial de la Salud

RF: Factor de retención

STZ: Estreptozotocina

SNIF: Sistema Nacional de Información Forestal

UV: Ultravioleta

1

RESUMEN

La Diabetes mellitus se encuentra en un constante incremento en todas las regiones del mundo.

La causa de este incremento es multifactorial entre ellos se encuentran: los procesos de

crecimiento y envejecimiento en los últimos años de la población, la creciente urbanización y el

incremento en la prevalencia de obesidad y sedentarismo. Para poder hacer frente a las

enfermedades en los últimos años numerosos grupos de investigación se han enfocado en el

estudio de las plantas medicinales como una alternativa para encontrar compuestos bioactivos

que permitan un tratamiento efectivo contra las enfermedades. Tecoma stans es una planta

medicinal de origen americano la cual ha sido utilizada para tratar una gama de enfermedades

entre las que se encuentra la Diabetes mellitus. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue

evaluar la actividad hipoglucémica de extractos y fracciones silvestre e in vitro de Tecoma stans

en ratones CD-1 inducidos con estreptozotocina. Los resultados indicaron que la administración

oral de los extractos hidroalcóholicos de T. stans silvestre (EHAS) a una dosis de 200 mg/kg

durante 12 días producen un efecto hipoglucémico. El fraccionamiento químico bio-dirigido de

EHAS produjo una fracción orgánica (acetato de etilo, FFOS), fracciones ricas en flavonas

(TsC1F12S), (TsC1F14S), (TsC1F16S) en el cual la TsC1F16S presento una mayor disminución

de los niveles de glucosa en sangre a dosis de 50mg/kg. De forma similar, los extractos

hidroalcóholicos de plantas de T. stans in vitro (EHAI) y su fracción orgánica (FFOI) mostraron

una similitud en la disminución de glucosa, con respecto al efecto obtenido por el EHAS y la

FFOS. La FFOI fue sujeta a un fraccionamiento químico en el cual TsC1F11I, TsC1F13I,

TsC1F15I y TsC1F17I, mostraron una similitud de grupos de compuestos con TsC1F12S,

TsC1F14S y TsC1F16S por CCF. El análisis químico (CCF y HPLC), de los extractos y

fracciones bioactivas confirmó que los compuestos fenólicos como el ácido protocatecúico, ácido

cafeico y 2-hidroxicinámico, son acumulados en las plantas silvestres y en plantas in vitro, por lo

que se sugieren como responsables de dicha actividad biológica. En conclusión, los extractos

hidroalcohólicos y fracciones tanto de las plantas silvestres con las plantas in vitro de T. stans,

presentan actividad hipoglucémica posiblemente por compuestos como el ácido protocatecúico,

ácido caféico y 2-hidroxicinámico los cuales presentan actividad hipoglucemiante previamente

documentada.

2

ABSTRACT

Diabetes mellitus is in constant increase in all regions of the world. The cause of this increase is

multifactorial among them are: the processes of growth and aging in the last years of the

population, the growing urbanization and the increase in the prevalence of obesity and sedentary

lifestyle. In order to cope with diseases in recent years, numerous research groups have focused

on the study of medicinal plants as an alternative to find bioactive compounds that allow an

effective treatment against diseases. Tecoma stans is a medicinal plant of American origin which

has been used to treat a range of diseases including Diabetes mellitus. Therefore the objective of

the present work was to evaluate the hypoglycemic activity of extracts and fractions of plants

wild and in vitro of Tecoma stans in CD-1 mice induced with streptozotocin. The results

indicated that oral administration of hydroalcoholic extracts of wild T. stans (EHAS) at a dose of

200 mg / kg for 12 days produces a hypoglycemic effect. The bio-directed chemical fractionation

of EHAS produced an organic fraction (ethyl acetate, FFOS), fractions of rich flavones

(TsC1F12S), (TsC1F14S), (TsC1F16S) in which the TsC1F16S showed a greater decrease in

glucose levels in blood at a dose of 50mg / kg. Similarly, the hydroalcoholic extracts of T. stans

in vitro (EHAI) and its organic fraction (FFOI) showed a similarity in the decrease of glucose,

with respect to the effect obtained by EHAS and FFOS. The FFOI was subjected to a chemical

fractionation in which TsC1F11I, TsC1F13I, TsC1F15I and TsC1F17I, showed a similarity of

groups of compounds with TsC1F12S, TsC1F14S and TsC1F16S by TLC. The chemical analysis

(CCF and HPLC) of the extracts and bioactive fractions confirmed that phenolic compounds

such as protocatechuic acid, caffeic acid and 2-hydroxycinnamic acid are accumulated in wild

plants and in vitro plants, so they are suggested as responsible for said biological activity. n

conclusion, the hydroalcoholic extracts and fractions of both wild plants and in vitro plants of T.

stans have hypoglycemic activity, possibly due to compounds such as protocatechuic acid,

caffeic acid and 2-hydroxycinnamic acid, which have previously documented hypoglycemic

activity.

3

1. INTRODUCCIÓN

La diabetes es una enfermedad que se caracteriza por la presencia de hiperglucemia crónica,

provocada por la ausencia, insuficiencia, o falta de acción de insulina, lo que repercute sobre el

metabolismo de los carbohidratos, lípidos y proteínas. Produciendo los signos y síntomas

característicos de esta enfermedad: hiperglucemia, glucosuria, polidipsia, poliuria, polifagia,

astenia (Conget, 2009). Existen factores que favorecen su incidencia como la predisposición

hereditaria, los factores ambientales, la prevalencia de obesidad y la falta de actividad física.

Actualmente es una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad, debido a las

complicaciones que conlleva (Reyes et al., 2009), ocupando México el sexto lugar en incidencia

a nivel mundial (FID 2015). Por lo que en nuestro país suelen emplearse diversas plantas como

tratamiento alternativo para la diabetes debido a sus propiedades medicinales, sin embargo, la

mayoría de ellas carecen de estudios científicos que avalen su eficacia y seguridad. Además, de

que carecen de estudios fitoquímicos que demuestren cuales son los metabolitos secundarios

presentes en dichas plantas que se les puede atribuir el efecto biológico.

Tecoma stans es una de las plantas más empleadas por la población mexicana para tratar la

diabetes y la cual cuenta con diversos estudios que comprueban su actividad hipoglucémica. Sin

embargo, la obtención del material vegetal no es sustentable, es por eso el interés de contar con

sistemas biotecnológicos como es el cultivo in vitro, ya que permite la obtención de material

vegetal en menor tiempo, de manera homogénea y libre de patógenos, además que los

compuestos activos de la planta silvestre permanecen en la plántula cultivada in vitro. Por lo

tanto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad hipoglucémica de extractos y

fracciones silvestre e in vitro de Tecoma stans en ratones CD-1.

4

2. ANTECEDENTES

2.1 DIABETES

La diabetes es una enfermedad crónica, esta aparece cuando el páncreas no produce suficiente

insulina o cuando el organismo no utiliza eficazmente la insulina que produce (OMS, 2015). La

diabetes se clasifica o se puede clasificar de diferentes tipos, las cuales dependen de varios

factores.

2.1.1 Clasificación de la diabetes

Diabetes tipo 1

La diabetes de tipo 1 (DM1) también llamada insulinodependiente juvenil o de inicio en la

infancia, se caracteriza por una producción deficiente de insulina y requiere la administración

diaria de esta hormona. Sus síntomas consisten, entre otros, en excreción excesiva de orina

(poliuria), sed (polidipsia), hambre constante (polifagia), pérdida de peso, trastornos visuales y

cansancio. Estos síntomas pueden aparecer de forma súbita (OMS, 2015). En esta el páncreas no

produce absolutamente nada de insulina y la glucosa no tiene la ayuda que proporciona la

insulina para entrar a la célula y alimentarla, por lo que ésta se queda circulando en el torrente

sanguíneo lo que daña a las células porque se debilitan y el cuerpo comienza a intoxicarse con

una reacción llamada cetoacidosis. Para ayudar al cuerpo en éste proceso de aprovechamiento de

glucosa el paciente con DM1 debe de administrarse insulina de manera exógena por medio de

inyecciones u otros dispositivos (AMD, 2014).

Diabetes de tipo 2

La diabetes de tipo 2 (DM2) también llamada no insulinodependiente o de inicio en la edad

adulta, se debe a una resistencia a la insulina. Este tipo representa el 90% de los casos mundiales

y se debe en gran medida a un peso corporal excesivo y a la inactividad física. Los síntomas

pueden ser similares a los de la DM1, pero a menudo menos intensos. Hasta hace poco, este tipo

5

de diabetes solo se observaba en adultos, pero en la actualidad también se está manifestando en

niños (OMS, 2015). A diferencia de las personas con DM1, la mayoría de las personas con DM2

no requieren, por lo general, dosis diarias de insulina para sobrevivir. Muchas personas pueden

controlar su enfermedad a través de una dieta sana y una mayor actividad física, y medicación

oral. Sin embargo, si no son capaces de regular sus niveles de glucosa en sangre, puede que

tengan que tomar insulina. El número de personas con DM2 esta creciendo rápidamente en todo

el mundo. Este aumento esta asociado al desarrollo económico, el envejecimiento de la

población, la creciente urbanización, los cambios en la dieta, la poca actividad física y los

cambios en otros patrones de estilo de vida (FID, 2013).

Diabetes gestacional

La diabetes gestacional se caracteriza por hiperglucemia que aparece durante el embarazo y

alcanza valores que, pese a ser superiores a los normales, son inferiores a los establecidos para

diagnosticar una diabetes. Las mujeres con diabetes gestacional corren mayor riesgo de sufrir

complicaciones durante el embarazo y el parto, y de padecer DM2 en el futuro. Suele

diagnosticarse mediante las pruebas prenatales, más que por sintomatología (OMS, 2015).

Además, tiende a ocurrir alrededor de la semana 24. La condición se produce debido a que la

acción de la insulina es bloqueada, probablemente por las hormonas producidas por la placenta,

provocando insensibilidad a la insulina (resistencia a la insulina). Dado que la diabetes

gestacional normalmente se desarrolla tarde en el embarazo, el feto ya esta bien formado, pero

sigue creciendo. Por tanto, el riesgo inmediato para el bebe no es tan grave como en el caso de

que la madre tenga DM1 o DM2 antes del embarazo. Sin embargo, la diabetes gestacional no

controlada puede tener graves consecuencias, tanto para la madre como para el bebe. La diabetes

gestacional en las mujeres normalmente desaparece después del nacimiento. Sin embargo, las

mujeres que han tenido diabetes gestacional tienen un mayor riesgo de desarrollarla en

embarazos posteriores y la DM2 en edad avanzada. Los bebés que nacen de madres con diabetes

gestacional también tienen un mayor riesgo de obesidad y DM2 en la adolescencia o en la edad

adulta temprana (FID, 2013).

6

2.1.2 Modelos empleados para estudios de diabetes tipo 2

Existe una primera clasificación donde se puede dividir los modelos de DM2 según su

mecanismo de producción en modelos espontáneos e inducidos. Además, en cada uno de ellos se

pueden distinguir dos categorías: modelos análogos y modelos intrínsecos (Arias-Díaz y

Balibrea, 2007).

1. Modelos espontáneos

1.1. Modelos análogos

– La rata Goto-Kakizaki (GK)

– El ratón obeso de Nueva Zelanda (NZO)

– El ratón KK

– Psammomys obesus (rata israelí de la arena)

– La rata OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rat)

1.2. Modelos intrínsecos

– El ratón db/db

– El ratón ob/ob

– El ratón Agouti

– La rata Zucker (fa/fa)

2. Modelos inducidos

2.1. Inducción hormonal

2.2. Administración de fármacos

2.3. Manipulación genética

Modelos espontáneos

Estos proceden de un animal en el cual se ha detectado diabetes espontánea de una serie de

cruces selectivos favoreciendo un determinado rasgo fenotípico de la DM2 humana. En

ocasiones estos no suelen ser totalmente “espontaneos” debido a que se requieren modificaciones

dietéticas adicionales para generar la diabetes.

7

Modelos análogos

Algunos de estos modelos se han sometido a análisis genéticos, intentando descubrir nuevos

genes de susceptibilidad para extrapolar su estudio a humanos. Los modelos de este tipo más

conocidos son: la rata Goto Kakizaki (GK) y el ratón obeso de Nueva Zelanda (New Zea- land

Obese, NZO), una cepa seleccionada por su predisposición a DM2 inducida por obesidad, la cual

es muy semejante a la DM2 humana.

Modelos intrínsecos

Existen diversos modelos portadores de mutaciones localizadas que imitan algunos de los

síntomas de la diabetes tipo 2, estos suelen emplearse para el estudio de la fisiología, de

mecanismos patogénicos que intervienen en este tipo de diabetes y sus complicaciones tardías.

Modelos inducidos

Actualmente son más utilizados los métodos genéticos que generan modelos intrínsecos con

mutaciones específicas, debido a que se pueden reproducir en animales una o más de las

manifestaciones clínicas de la diabetes tipo 2 humana (Arias-Díaz, J., y Balibrea, J. 2007).

2.1.3 Agentes inductores de diabetes tipo 2

La inducción de la diabetes se ha logrado mediante diferentes tecnicas experimentales tales como

la pancreatectomía, sin embargo, presenta un efecto inestable en carnívoros presenta un síndrome

diabético inestable y en onnívoros, algunos herbívoros, aves y peces produce estado diabético

caracterizado con gluocosuria moderada y cetonuria variable (Reid, 1981).

Las hormonas como epinefrina, glucagón, somatotropina y los glucocorticoides poseen un efecto

antagonista sobre la insulina, cuando estos se encuentran en exceso, esto puede observarse sobre

los animales y los seres humanos. También la administración de hidrocortisona y la hormona

adrenocorticotrópica inducen hiperglucemia e hiperplasia de las celulas β del pancreas. Así como

8

las hormonas corticotropina y la prolactina poseen efecto diabetogénico moderado, debido a un

trastorno en la utilización periférica de la glucosa. Los roedores y lagomorfos (conejos, liebres y

picas) desarrollan glucosuria transitoria cuando reciben dosis excesivas de hormona del

crecimiento. Los conejos sometidos a terapia con glucagón, conjuntamente con cortisona o una

alimentación especial, desarrollan un síndrome diabético semejante a la diabetes inducida por

aloxano (Ramos, 1994).

En ese sentido, la cortisona posee acción necrosante específica y selectiva sobre las células ß de

los islotes de Langerhans. En relación con la acción de este compuesto a nivel pancreático, se

postulan dos hipótesis, una describe la interacción de los metabolitos del aloxano con el zinc

pancreático, responsables de la destrucción de las células beta, mientras que otras observaciones

sustentan la teoría de la formación de especies reactivas de oxígeno que desempeñan una función

significativa en la acción diabetogénica de esta sustancia (Cubillos et al., 2009).

Los agentes con efecto diabetógeno en animales de experimentación más utilizados son: aloxano,

estreptozotocina (STZ), vacor, ditizona y 8-hidroxiquinolona (Rees y Alcolado, 2005). El

aloxano es comúnmente utilizado para la inducción de modelos animales insulino dependiente.

Su mecanismo de acción consiste en primero permitir la liberación de insulina a corta duración y

posteriormente suprimir completamente de la respuesta a la glucosa de los islotes de las celulas β

del páncreas (Kliber et al., 1996).

La STZ es un compuesto de origen natural, producida por la bacteria Streptomyces

achromogenes, empleado para la investigación de la diabetes debido a su toxicidad específica

asociada con celulas β pancreaticas. Esta compuesta por una mezcla de estereoisómeros que

aparecen como un polvo cristalino de color amarillo o de color blanquecino pálido, es muy

soluble en agua, cetonas y alcoholes. En muchas especies animales la STZ induce la diabetes que

se asemeja a la del humano hiperglucémico, su peso molecular de STZ es 265g/mol y su fórmula

química es C8H15N3O7 (Figura 1) (Virginia Commonwealth University. 2009). La STZ es

utilizada para inducir tanto insulino dependiente e independiente (Szkudelski, 2001).

9

Figura 1. Estructura química de estreptozotocina.

La acción de la STZ en las celulas β se acompaña por alteraciones características de insulina en

sangre y concentración de glucosa. Debido a que su mecanismo de acción permite desarrollar

una hiperglucemia inicial después de 2 h de su administración, después se presenta una

hipoglucemia a las 6 h y finalmente se desarrolla la hiperglucemia (West et al., 1996). Estos

cambios de concentraciones de glucosa e insulina en sangre reflejan anormalidades en la función

de las celulas β, afectando la oxidación de la glucosa (Bedoya et al., 1996), disminución de la

biosíntesis y secreción de insulina (Bolaffi et al. 1987, Nukatsuka et al. 1988).

La dosis requerida de aloxano y STZ para la inducción de la diabetes depende de las especies

animales, vía de administración y el estado nutricional (Eizirik et al., 1994). La dosis de STZ

para la inducción de DM en ratones es de 40 mg/kg de peso (Like y Rossini, 1976; Wang y

Gleichmann, 1998; González et al., 2010). Sin embargo, otros estudios demuestran que al

administrar STZ más nicotinamida genera un modelo de DM2, debido a que la nicotinamida

desempeña el papel de agente protector de las celulas β del pancreas (Masiello et al., 1998;

Amaya-Chávez et al., 2015).

2.1.3 Farmacoterapia

Para el tratamiento farmacológico de la DM1 se dispone de insulina en sus distintas

presentaciones y para la DM2 de antidiabéticos orales (Alfaro et al., 2000). Como se muestra en

la Tabla 1.

10

Tabla 1. Fármacos orales empleados para el tratamiento de DM2

(Agency for Health Care Research and Quality, 2011).

Familia Fármacos

Biguanidas Metformina

Sulfonilureas Glibenclamida

Glimepirida

Glipizida

Gliburida

Meglitinidas Repaglinida

Nateglinida

Tiazolidinedionas (TZD) Pioglitazona

Inhibidores de la dipeptidil peptidasa-4 Sitagliptina

Saxagliptina

Agonistas del receptor del péptido -1

glucagonoide (GLP-1)

Exenatida

Liraglutida

Inhibidores de alfa glucosidasas Arcabosa

Miglitol

Sulfonilureas

Su mecanismo de acción primario es estimular la secreción de insulina por la célula beta

pancreática, a través de su unión a un canal potasio-dependiente de ATP. Las diferencias entre

las distintas sulfonilureas disponibles se refieren fundamentalmente a su dosificación y semivida

(Tabla 2).

Tabla 2. Ejemplos y farmacoterapia de sulfonilureas (Alfaro et al., 2000).

Fármaco Duración del efecto

(h)

Dosis diaria

(mg)

Tolbutamida 6-12 500-3.000

Clorpropamida 20-60 100-500

Glibenclamida 10-24 1,5-20

Glipizida 6-12 2,5-30

Glisentida 6-12 2,5-20

Gliquidona 6-12 15-20

Gliclazida 10-20 80-320

Glimepirida 24 1-8

Hay que destacar que la gliquidona se elimina en un 95% por metabolismo hepático, por lo que

es la sulfonilurea de elección en la insuficiencia renal, en tanto que la glipizida podría ser la más

apropiada en la insuficiencia hepática. Estudios en animales sugieren que la glimepirida tiene un

11

efecto directo de aumento de la sensibilidad a la insulina, independiente de su efecto secretor de

insulina (Alfaro et al., 2000).

Biguanidas

Las biguanidas actúan fundamentalmente a dos niveles: en el músculo, aumentando la entrada de

glucosa a las células, y en el hígado, disminuyendo la producción de glucosa al disminuir la

neoglucogenesis, la glucogenólisis o ambas. Por otra parte, parecen tener un efecto anorexígeno,

contribuyendo a la disminución de peso en personas con obesidad (Alfaro et al., 2000).

Inhibidores de la alfa-glucosidasa

Los inhibidores de la alfa-glucosidasa actúan inhibiendo los enzimas del borde en cepillo del

enterocito que hidrolizan los oligosacaridos a disacaridos y monosacaridos que posteriormente

son absorbidos. Como lo son Acarbosa y miglitol que tienen un efecto en el retraso de la

absorción de polisacáridos complejos, pero el área bajo la curva no se modifica. Esto se debe a

que sistemas enzimáticos más distales se activan y contribuyen a la hidrólisis de los

polisacáridos. Así, estos fármacos disminuyen la glucemia postprandial, siempre y cuando la

dieta sea rica en hidratos de carbono complejos, (Alfaro et al., 2000).

Tiazolidinedionas

El mas representativo de estos fármacos es la pioglitazona. Actúa a nivel muscular y hepático

disminuyendo la resistencia a la insulina y en menor medida, disminuyendo la producción

hepática de glucosa. El inicio de acción de la troglitazona es muy lento. Se absorbe mal si se

ingiere con el estómago vacío, por lo que debe administrarse en las comidas principales. El

efecto de disminución de la resistencia periférica a la insulina es más potente que el de las

biguanidas, y aparece a dosis menores que el de disminución de la producción hepática de

glucosa (Alfaro et al., 2000).

12

2.1.4 Uso de plantas medicinales para el tratamiento de DM en México.

En México suelen utilizarse con frecuencia plantas medicinales, como tratamiento alternativo

para la DM (Tabla 3) (Romero et al., 2009) y generalmente se utilizan las hojas.

Tabla 3. Plantas empleadas para DM (Romero et al., 2009).

Nobre científico Familia Nombre popular Parte usada /

preparación

Acacia bilimekii Fabaceae Tehuixtle Hojas / infusión

Artemisia ludoviciana Asteraceae Maestra Hojas / infusión

Averrhoa carambola Oxalidaceae Carambola Hojas / infusión

Citrus máxima Rutaceae Toronja Cascara / infusión

Eysenhardtia polystachya Fabaceae Palo azul o dulce Raíz / infusión

Ibervillea sonorae Curcurbitaceae Wareque Raíz, corteza /

infusión

Marrubium vulgare Lamiaceae Manrrubio Hojas / infusión

Medicago sativa Fabaceae Alfalfa Hojas / infusión

Melia azaderachta Meliaceae Paraíso Hojas / infusión

Paullinia cupana Sapindaceae Guaraná Hojas / infusión

Phoradendron

tomentosum

Viscaceae Injerto de mezquite Flores / infusión

Peumus boldus Molina Monimiaceae Boldo Flores / infusión

Punica granatum Punicaceae Granadita Hojas / infusión

Russelia equisetiformis

Schltdl

Scrophulariaceae Cola de caballo Raíz / infusión

Salvia leucantha Lamiaceae Salvia real Hojas / infusión

Schisandra chinensis Magnoliaceae Schizandra Hojas / infusión

Solanum diversifolium Solanaceae Tomatillo Hojas / infusión

Tecoma stans Bignoniaceae Tronadora Hojas / infusión

Uncaria tomentosa Rubiaceae Uña de gato Hojas / infusión

13

2.2 Tecoma stans

Tecoma stans (Tabla 4) tambien conocida como “tronador, tronadora o saúco amarillo” y en

botánica como Bigononia stans L., Tecoma incisa Sweet. Bigonia frutencecens Millere ex DC.

(UNAM, 2009). Su nombre cientifico se deriva de la palabra prehispanica del nahuatl

Tecomaxochitl que significa flor en forma de copa y el nombre de su especie (stans) proviene del

latín sto‐ are, steti, statum = que significa erecto, erguido, debido a sus inflorescencias (Lorenzo-

Cáceres 2011). Es una planta originaria de México que se puede encontrar en los estados de

Aguascalientes, Baja California, Baja California sur, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila,

Ciudad de México, Durango, Guanajuato, Guerrero, Jalisco, Estado de México, Michoacán,

Morelia, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Tabasco, Tlaxcala,

Veracruz, Yucatán y Zacatecas. En latitudes de 0 a 2,400 m (CONAFOR, 2016).

Tabla 4. Taxonomía de T. stans (SNIF 2016).

T. stans es un árbol que llega a medir 20 m de altura, posee una copa densa y globosa (Figura 2).

Entre los nombres más comunes con los que se conoce T. stans en México son: Tronador,

Tronadora, Sauco amarillo, Retama, Lluvia de oro, Corneta amarilla, Campanas amarillas, Palo

de arco, Borla de San Pedro, Hierba de San Pedro, Corneta amarilla, Flor de San Pedro, Gloria,

Guiabiche, Guiebacaná (CONABIO 2016).

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Lamiales

Familia Bignoniaceae

Género Tecoma

Especie T. stans

14

Figura 2. Árbol de T. stans (Biodiversidad Mexicana 2016).

Tiene hojas formadas por 5 a 13 hojuelas, sus flores son amarillas y llegan a medir hasta 5 cm de

largo estas crecen en las puntas de las ramas en forma de racimos. Su fruto es alargado y

cilíndrico, de hasta 21 cm de largo el cual se abre a lo largo para poder liberar semillas finas y

pequeñas aplanadas con alas (Figura 3) (Biodiversidad Mexicana 2016).

Hojas Flores Fruto Semilla

Figura 3. Partes características del árbol de T. stans (Biodiversidad Mexicana 2016).

Su hábitat se encuentra en laderas, a lo largo de cursos de agua, en regiones donde hay abundante

precipitación hasta en zonas más secas de clima tropical. Vive en terrenos muy diversos desde

suelos poco profundos y pantanosos hasta suelos aluviales arcillo- arenosos profundos. Su mejor

desarrollo ocurre en suelos arcillosos café-oscuro, arcilloso profundo, rojo-laterítico, negro,

arenoso y drenado (SNIF 2016).

15

2.2.1. Usos en la medicina tradicional de T. stans

Entre los usos en la medicina tradicional, T. stans es empleada principalmente contra la diabetes.

Suele emplearse además para padecimientos digestivos como dolor de estómago, disentería,

bilis, gastritis, mala digestión, empacho, anorexia, pirosis, atonía intestinal, problemas del

hígado, como estimulante del apetito y para el dolor de muelas. Suele aplicarse localmente en la

piel, para curar llagas y enfermedades cutáneas, cuando hay viruela o urticaria. Además, se le usa

para bajar la fiebre, así como en infecciones, para desinflamar golpes, como analgésico y como

tónico. En casi todos los tratamientos se utilizan las hojas, tallos o ramas, pero se puede emplear

también la corteza, la flor o la raíz, por lo general se preparan en infusión o en cocimiento y se

administra por vía oral (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009).

2.2.2 Actividad biológica de T. stans.

Actividad antidiabética e hipoglucémica

Existen varios reportes acerca del efecto hipoglucémico en diferentes modelos animales, tras la

administración de extractos de T. stans. En los primeros reportes, el efecto antidiabético era

atribuido a la presencia de alcaloides como tecomanina y tecostamina aisladas de T. stans, los

cuales mostraron una reducción marcada de glucosa en la sangre de conejos en ayunas

(Hammouda et al., 1964; Hammouda &Amer, 1966). Sin embargo, recientemente, se demostró

que la tecostamina está inactiva como agente hipoglucémico en ratas normoglucémicas e

hiperglucémicas (Constantino et al., 2003).

De la Paz Naranjo et al., (2003) observaron una disminución en las glicemias en ratones y ratas

con resistencia periférica a la insulina, después de la administración del extracto fluido de las

hojas de T. stans en dosis de 250 y 500 mg/kg en comparación con ratones y ratas no diabéticas.

En otro estudio realizado en ratas macho Sprage-Dawley de 200 a 300 g y ratones Balb-c hembra

de 22 a 25g tratadas con el extracto acuoso de hojas de T. stans mostraron una disminución en

los niveles de glucosa en sangre, tal extracto presento actividad hipoglucémica, incluyendo la

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=golpe

16

inhibición intestinal de la α-glucosidasa, actividad antihiperglucémica, así como efectos de

hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia. Posiblemente la mayoría de estas actividades sean

ejercidas por los compuestos fenólicos presentes en T. stans por lo que es necesario estudios que

confirmen esta hipótesis (Aguilar et al., 2009). Raju et al., (2011) demostraron el efecto

hipoglucémico ácido clorogénico, un fenilpropanoide presente en T. stans.

Actividad anti-inflamatoria

Se han evaluado diferentes extractos de etanol, metanol y acuosos de T. stans para poder

determinar su actividad anti-inflamatoria, así como la inhibición de la enzima lipoxigenasa,

xantina oxidasa y la acetilcolinesterasa. Los extractos mostraron actividad por la

desnaturalización inducida por el calor a la albumina, así como una disminución de la actividad

de la proteinasa (Govindappa et al., 2011).

Actividad cicatrizante

Se evaluó el potencial cicatrizante en dos tipos de heridas: incisión y escisión con dosis de 100 y

200 mg/kg en el que se mostró una reducción en el área de la herida en comparación con los

grupos control, esta actividad se le ha atribuido a la presencia de fitoesteroles, triterpenos,

glucósidos, fenoles, flavonoides, saponinas y taninos (Das et al., 2010).

Actividad antiespasmódica

Gharib et al., (2007) reportaron que el extracto hidroalcohólico de T. stans presenta un efecto

inhibitorio en la contracción del tejido intestinal lo cual indica que los canales de calcio están

involucrados en el efecto espasmolítico.

Actividad antimicrobiana

Se ha probado la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos, metanólicos y acuosos de

las hojas de T. stans en las bacterias Pseudomonas fluorescens, Clavibacter michiganensis subsp.

17

michiganensis, Xanthomonas axanopodis pv. Malvacearum, Staphylococcus aureus, E. coli,

Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumonia encontrando un efecto positivo. Los tres

extractos mostraron un alto contenido de fenoles a los cuales se le atribuyen su actividad

antimicrobiana. (Govindappa et al., 2011, Marzouk et al., 2006).

Actividad citotóxica

La actividad citotóxica de los extractos acuosos de 60% al 100%. De T. stans fue evaluada en la

línea celular HepG2 (Hepato-blastoma humano). Se encontró que los efectos citotóxicos de T

stans son dependientes de la concentración y del tiempo de exposición (Gaitan et al., 2011).

2.2.3 Estudios fitoquímicos de T. stans

Los estudios fitoquímicos realizado a los extractos acuoso, etanólico y hexánico de las hojas de

T. stans se han encontrado grupos de compuestos como: alcaloides, cumarinas, flavonoides,

sesquiterpenlactonas, esteroles, metilesteroles y saponinas (Tabla 5) (Ibarra et al., 2009). Siendo

los alcaloides triterpenoides y fenilpropanoides, los principales grupos que han demostrado tener

actividad biológica importante y dentro de los cuales se han encontrado metabolitos que han

presentado actividad hipoglucemiante.

Tabla 5. Análisis fitoquímico en los diferentes extractos de las hojas de T. stans (Ibarra et al.,

2009).

Extractos

Componentes Prueba Acuoso Etanólico Hexánico

Alcaloides Wagner + + +

Cumarinas NaOH + + +

Flavonoides Salkowski + + +

Sesquiterpenlactonas Baljet + + +

Esteroles y

metilesteroles

Liebermann-

Burchard - + +

Azúcares Molish + - -

Saponinas Liebermann-

Burchard - + +

Quinonas Borntrager - + -

18

Los alcaloides que se han logrado aislar en T. stans son tecomanina (III), tecostanina (IV),

tecostidina (V), Boschniakina (VI), 4-noractidina (VII), Nnormetileskitantina (VIII), 5-

dehidroeskitantina (IX), 9-hidroxieskitantina (X), ∆ 5 - dehidroskitantina (XI) y δ-skitanthina

(XII), (Dohnal, 1976) (Dickinson & Jones, 1968) (Rojo, Barbas, y Rupérez, 2014). Dentro de

los compuestos fenólicos se encuentran el acido ursólico, oleanólico, α-amirina y β-sitosterol

(Castro, et. al., 2014), de los cuales el ácido clorogénico, se le ha atribuido el efecto

hipoglucémico (Raju 2011) (Figura 4).

Figura 4. Principales alcaloides y compuestos fenólicos de Tecoma stans (Castro, et. al., 2014)

19

Por otro lado, Ramírez et al., (2016) reportaron que la purificación química bio-dirigida del

extracto hidroalcohólico de T. stans produjo una fracción orgánica (acetato de etilo, TsEA),

fracciones de flavona (TsC1F13), (TsC1F15), (TsC1F16) y compuestos aislados (crioseriol,

apigenina, luteolina y verbascósido) con la capacidad de inhibir la actividad de la lipasa

pancreática (Tabla 6). La fracción más activa (TsC2F6B) estaba constituida por una mezcla de

Chrysoeriol (5,7-dihidroxi-2- [4-hidroxi-3-metoxifenil] cromen-4-ona, 96%) y apigenina (4%).

Esta mezcla de flavona mostró un porcentaje de inhibición del 85% cuando se evaluó a 0.25 mg /

ml. La luteolina y el crioseriol produjeron una inhibición mixta y no competitiva con valores de

CI 50 = 63 y 158 µM respectivamente. El contenido de crioseriol también se cuantificó en el

extracto hidroalcohólico (TsHAE) y la fracción orgánica (TsEA) como 1% y 7%

respectivamente. Todo esto confirma que una alta proporción de ambas flavonas produce un

aumento de la actividad biológica debido a que muestran la mayor inhibición de la enzima lipasa

en una forma dependiente de la concentración.

Tabla 6. Compuestos aislados de las hojas de Tecoma stans (Ramírez et al., 2016).

Muestra analizada Compuestos identificados

Extracto acetato de etilo

(TsEA, fase orgánica)

Ácido clorogénico, verbascósido, luteolina, apigenina,

chrysoeriol.

TsC1F13 Luteolina, apigenina, chrysoeriol

TsC1F15 Luteolina, apigenina, chrysoeriol

TsC1F16 Verbascósido, glucósidos, fenilpropanoides

TsC2F6A Apigenina

TsC2F6B Chrysoeriol

TsC3F3 Glucósidos fenilpropanoides

TsC3F6 Luteolina

TsC3F10 Luteolina, glucósidos fenilpropanoides

TsC3F12 Verbascósido

TsC4F12 Verbascósido

20

2.2.4 Cultivo in vitro de T. stans

Existen escasos estudios de cultivo in vitro de T. stans, estudios de analisis químico y de

actividad biologica (Tabla 7). Y no se han reportado estudios de la actividad hipoglucémica de

cultivos in vitro de T. stans.

Tabla 7. Cultivo in vitro de Tecoma stans

Explante Cultivo

obtenido Condiciones de cultivo Metabolitos

Actividad

biológica Referencia

Semillas Plántulas

Medio Knop, glucosa 20

g/L, KIN 0.1 mg/L, IAA

0.01 mg/L, agar 8 g/L

--- --- Donhal

1976

Hojas Callos

Murashige-Mei-Lie-Lin

(M-L), sacarosa 20 g/L,

agar 8 g/L.

Medio Murashige

modificado (RT-k),

sacarosa 30 g/L, KIN

0.30 mg/L, agar 8 g/L.

Alcaloides --- Donhal

1976

Callos Suspensiones

M-L, acarosa 20 g/L,

KIN 0.03 mg/L,

IAA,0.10 mg/L

RT.k, acarosa 30 g/L,

KIN 0.03 mg/L,

IAA,0.10 mg/L

--- --- Donhal

1976

Semilla Plántulas MS, sacarosa 3% p/V y

agar 0.8% p/V --- ---

López-

Laredo et

al., 2009

Hojas Callos

B5, sacarosa 30 g/L, 0.5

μM de 2,4-D y 5.0 μM

de KIN y agar 8 g/L.

Fenoles y

flavonoides Antioxidante

López-

Laredo et

al., 2009

Hojas Callos MS, sacarosa 30 g/L , 2,4-

D 2 mg/L and BAP 2 mg/L,

agar 8 g/L. --- Antioxidante

Namde &

Wani, 2014

21

3. JUSTIFICACIÓN

La diabetes es una enfermedad crónica degenerativa siendo una de las principales causas de

muerte en nuestro país y en el mundo. Esto ha motivado a la búsqueda de nuevos tratamientos,

por los altos precios en los medicamentos, por lo que suelen emplearse por la población plantas

medicinales como tratamiento alternativo para la diabetes debido a sus propiedades naturales.

Sin embargo, la mayoría de las plantas empleadas no han sido evaluadas científicamente para

comprobar su eficacia y seguridad.

En el estado de Oaxaca, Tecoma stans ha sido utilizada como apoyo en diversos tratamientos de

enfermedades crónico degenerativas, como es el caso de la diabetes mellitus tipo 2. Esta

actividad ha sido atribuida principalmente a dos tipos de compuestos: los alcaloides (tecomina y

tecostanina) y los fenólicos como es el caso del ácido clorogénico. Sin embargo, la constitución

química de T. stans cultivada en campos es muy variable lo que puede deberse a la estrecha

relación entre la acumulación de metabolitos secundarios y las condiciones fisiológicas y

ambientales. El cutivo in vitro representa una alternativa biotecnológica a la extracción de

plantas cultivadas en el campo para la producción de metabolitos secundarios con valor

farmacológico, brindando la posibilidad de producir material estandarizado, independiente de las

condiciones ambientales, por lo que se evaluó la actividad hipoglucémica de extractos y

fracciones de plantas silvestre e in vitro de Tecoma stans.

22

4. HIPÓTESIS

Los extractos y fracciones de plantas silvestres e in vitro de Tecoma stans, presentarán actividad

hipoglucémica en ratones CD-1.

5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad hipoglucémica de extractos y fracciones de plantas silvestre e in vitro de

Tecoma stans en ratones CD-1.

5.2 OBJETIVOS PARTICULARES

1. Evaluar la actividad hipoglucémica del extracto hidroalcohólico (EHA), fracción fase

acuosa (FFA) y la fracción fase orgánica (FFO) de plantas silvestres e in vitro de Tecoma

stans en ratones CD1 diabéticos inducidos con estreptozotocina.

2. Someter a cromatografía en columna el extracto o fracción con actividad hipoglucémica

de plantas silvestres e in vitro de Tecoma stans.

3. Evaluar la actividad hipoglucémica de fracciones obtenidas de la cromatografía en

columna de Tecoma stans silvestre e in vitro.

4. Analizar los extractos y fracciones bioactivos de plantas silvestres y obtenidas en

condiciones in vitro evaluados mediante técnicas cromatográficas

23

6. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Tecoma stans

Preparación del extracto

hidroalcohólico

(Bipartición)

Fraccionamiento químico

Actividad hipoglucemiante

Identificar los compuestos en las fracciones con efecto hipoglucemiante

24

7. METODOLOGÍA

7.1 Recolección de material vegetal silvestre y obtención de plántulas in vitro de T. stans

Se colectaron 3 kg de hojas frescas del árbol de Tecoma stans, en el mes Mayo de los arboles

ubicados en los jardines de la Universidad de Papaloapan Campus Tuxtepec, del Estado de

Oaxaca. El material recolectado fue lavado y secado bajo sombra y oscuridad a temperatura

ambiente durante dos semanas. Posteriormente a su secado el material seco fue sometido a

molienda en un procesador para alimentos (MoulinexMR). El material pulverizado (1.475 kg) fue

utilizado para la obtección del extracto hidroalcohólico.

Para la obtención de plántulas in vitro se realizó la colecta de vainas de los árboles de T. stans

localizados en la Universidad del Papaloapan, campus Tuxtepec. Las semillas fueron retiradas y

fueron sometidas a un proceso de desinfección el cual consistió en retirar las “alas” sin dañar la

semilla, seguida de dos lavados con detergente comercial. Posteriormente se llevaron a campana

de siembra en donde se realizó un lavado con hipoclorito de sodio (NaClO) al 80% durante 2

minutos y se realizaron 3 lavados con agua destilada estéril durante 3 minutos. Las semillas

fueron germinadas en un medio estéril de Murashige y Skoog (Sigma), sacarosa al 3% (p/v),

fitagel al 0.20% (p/v) y a un pH de 5.8 (antes de esterilizar). Estos fueron incubados en oscuridad

a 25 ± 2 ºC de 2 a 10 días (tiempo de germinación). Una vez germinadas fueron sometidas a un

fotoperiodo de 16h luz a 25 ± 2 ºC.

7.2 Preparación del EHAS y EHAI

Para la preparación del EHAS se emplearon 350 g del material seco recolectado mientras que

para la preparación del EHAI se emplearon plántulas de 2 meses de edad, las partes aéreas

fueron recolectadas, congeladas y liofilizadas. Posteriormente el material seco fue macerado a

temperatura ambiente durante 7 días usando como disolventes etanol: agua (1:1), (Tasayco,

2007; Gómez, 2011). Se empleó por cada 100 g de material vegetal seco 1000 mL de disolvente

para el EHAS mientras que para el EHAI solo 100 ml de disolvente, ambos fueron filtrados

sobre papel Whatman Nº 2 empleando una bomba de vacío, para la recuperación del material

25

vegetal y del disolvente. El disolvente fue eliminado por destilación a presión reducida en un

rota-evaporador (DRAGONLAB RE 100-Pro) a 50 ºC y 90 rpm, Se obtuvieron 280 mL de

EHAS el cual fue congelado a -40 ºC y fue liofilizado (Liofilizadora LABCONCO).

7.3 Obtención de la FFAS, FFOS del EHAS y FFAI, FFOI del EHAI de T. stans

Se realizó una bipartición del EHAS (50g) y del EHAI (4.4651g), empleando como disolventes

acetato de etilo y agua, obteniendo del EHAS 500 mL de cada uno y del EHAI 10 mL.

Obteniendo las FFAS y FFAI con agua destilada y las FFOS y FFOI con acetato de etilo

(Ramírez et al., 2016). Las fases fueron destiladas a presión reducida en un rota-evaporador

(DRAGONLAB RE 100-Pro). Las fases orgánicas fueron destiladas a 40 ºC y 130 rpm mientras

que las fases acuosas fueron destiladas a 50 ºC y 90 rpm. Las fases orgánicas fueron llevada a

sequedad a temperatura ambiente, mientras que las fases acuosas fueron congeladas a -40 ºC y

liofilizadas.

7.4 Análisis químico del EHAS, FFAS, FFOS EHAI, FFAI y FFOI de T. stans

Para este análisis se realizó una cromatografía en capa fina (CCF), se realizó empleando

cromatofolios fase normal y fase reversa de sílica gel 60 merk en diferentes sistemas de elución

para el EHAS y las FFAS y FFOS, mientras que para el análisis químico por CCF EHAI, FFAI y

FFOI de T. stans, se utilizaron placas de cromatofolios de aluminio recubiertas de sílica gel 60

F254 (Fase normal (Sigma-Aldrich) y como fase móvil diclorometano:metanol 90:10v/v

(Sánchez, 2013). Posteriormente, las placas fueron analizadas con una lámpara de luz

ultravioleta (UV) a 254 y 365 nm antes de revelar con una solución de 4-hidroxibenzaldehido

(HS), la cual contiene 0.5 mg de 4-hidroxibenzaldehído (Merck), 90 mL de etanol y 10 mL de

ácido sulfúrico (Sánchez, 2013), como reveladores de feniletanoides, terpenos entre otros.

Seguido de aplicar el revelador las placas se calentaron a 90 ºC para observar las bandas de los

compuestos presentes y realizar la identificación de los compuestos por comparación del factor

de retención (Rf). Para finalmente determinar el Rf por la siguiente fórmula (Capataz et al.,

2007).

26

disolvente elpor recorrida Distancia

soluto elpor recorrida DistanciafR

La coloración azul y café indicaron la presencia de terpenos, magenta y amarillo indicaron

feniletanoides, con esa mezcla también se detectaron componentes de aceites esenciales y

saponinas al obtener colores lavanda, rosa y purpura (Wagner et al., 1996). Posteriormente, se

realizaron ensayos de reconocimiento para la detección de metabolitos secundarios (Tabla 8)

(Devi et al., 2014; Patil et al., 2016).

Tabla 8. Pruebas fitoquímicas para extractos de plantas.

Prueba Metodología Observación

Taninos 2mL de extracto + 2 mL de agua + 2-3

gotas de cloruro de hierro (Fe CI3) al 5%.

Precipitado verde

Flavonoides 2mL de extracto + 2 mL de agua + 1mL

de etanol + 2-3 gotas de cloruro de

aluminio 5%.

Coloración amarilla

(desaparece con el tiempo).

Saponinas 2mg de extracto + disolver en 2mL de

agua hirviendo en tubo de ensayo y

agitar vigorosamente.

Presencia de espuma

Esteroides 2mL de extracto + 2mL de cloroformo +

2mL de H2SO4 concentrado.

Anillo de color marrón rojizo

en la unión

Florataninos 2mL de extracto + 2mL de HCI (1%) +

calor.

Precipitado rojo

Carbohidratos 2mL de extracto + 10mL de agua + 2

gotas de -naftol etanólico (20%).

Anillo de color violeta en la

unión

Glucósidos 2mL de extracto + 2mL de cloroformo +

2mL de ácido acético.

Coloración violeta, azul o

verde

Cumarinas 2mL de extracto + 3mL de NaOH 10%. Coloración amarilla

Alcaloides 2mL de extracto + 2mL de reactivo de

Dragendorff.

Coloración naranja o rojo

intenso

Proteínas 1mL de extracto + 1mL de H2SO4

concentrado.

Precipitado blanco

Antocianina

y Betacianina

2mL de extracto + 1mL de NaOH 2N y

calentar por 5 minutos a 100ºC.

Coloración verde azulado

positivo antocianina y

coloración amarilla positivo a

betacianina

Quinonas 1mL de extracto + 1mL de H2SO4

concentrado.

Coloración rojo

Fenoles 2mL de extracto + 1mL de H2SO4 + 1mL

de etanol + 2- 3 gotas de FeCI3 (2%).

Anillo azul o verde oscuro

27

7.5 Animales de experimentación

Para la evaluación de la actividad hipoglucemiante se emplearon ratones albinos (Mus

musculus), cepa ICR CD-1, de 9-10 semanas de edad y con un peso promedio de 20-35g

aproximadamente. Los ratones se mantuvieron en el bioterio de la Universidad del Papaloapan

campus Tuxtepec a una temperatura de 25 ºC, con un fotoperiodo de 12 horas luz y 12 horas de

oscuridad con agua y alimento nutricubos (Purina) (Tabla 9). Todo bajo el estricto apego a la

norma sobre las Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de

laboratorio (NOM-062-ZOO-1999).

Tabla 9. Tabla Nutricional del alimento empleado para los ratones en la experimentación.

Nutricubos Contenido neto 200Kg

Autorización SAGARPA A-0207-246

Humedad 12.0% MÁXIMO Cenizas 7% MÁXIMO

Proteína 23% MÍNIMO E.L.N 49% P. Dif.

Grasa 3% MÍNIMO Calcio 1.0% MÍNIMO

Fibra 6% MÁXIMO Fósforo 0.6 MÍNIMO

7.6 Actividad hipoglucémica del EHAS, FFAS y FFOS, EHAI, FFAI Y FFOI de T. stans

El estudio consistió en dos etapas, en la primera etapa del estudio se evaluó T. stans silvestre en

la cual se formaron 7 grupos de ratones, un grupo normoglucémico y 6 grupos de ratones

diabéticos. De los 6 grupos diabéticos, se tuvo un grupo diabético sin tratamiento (control

negativo), dos grupos tratados con los fármacos comerciales Glibenclamida y Acarbosa (control

positivo) los otros 3 grupos fueron tratados con EHAS, FFAS y FFOS. En la segunda etapa del

estudio se evaluó T. stans in vitro para el cual se conformó 7 grupos de ratones, un grupo

normoglucémico y 6 grupos diabéticos, de los cuales se tuvo un grupo diabético sin tratamiento

(control negativo), dos grupos tratados con los fármacos comerciales Glibenclamida y Acarbosa

(control positivo) y los otros 3 grupos fueron tratados con EHAI, FFAI y FFOI (Tabla 10).

Los grupos diabéticos durante la evaluación de T. stans silvestre e in vitro fueron inducidos

mediante la administración de STZ vía intraperitoneal (40mg/Kg) durante 5 días consecutivos,

15 minutos después de la administración con nicotinamida (68mg/Kg) vía intraperitoneal (Flores

28

et al., 2006; Ortiz-Andrade et al., 2009). Estos fueron tratados diariamente durante un periodo de

12 días. Se realizó toma de muestra por punción en la cola al día 0 (antes de inducir diabetes),

día 1 cuando fueron considerados diabéticos (10 días después de la inducción de diabetes con

STZ) y posteriormente al día 4, 8 y 12 de tratamiento. Se realizó la medición de glucosa en

sangre por glucómetro comercial Accu-Chek Active (Roche) y el monitoreo de peso corporal.

Tabla 10. Grupos de animales de experimentación tratados con fracciones silvestre e in vitro de

T. stans.

Grupos

Tratamiento durante 12 días

T. stans Silvestre T. stans in vitro

No diabético I Normoglucémicos Normoglucémicos

II Control negativo

(Diabético sin tratamiento)

Control negativo

(Diabético sin tratamiento)

III Control positivo

(Glibenclamida)

Control positivo

(Glibenclamida)

Diabéticos IV Control positivo

(Acarbosa)

Control positivo

(Acarbosa)

V EHAS EHAI

VI FFAS FFAI

VII FFOS FFOI

7.7 Fraccionamiento de las FFOS y FFOI de T. stans

La FFOS (2.5g) y FFOI fueron sujetas a un fraccionamiento mediante cromatografía en columna

(30 cm de alto y 3 cm de diámetro) previamente empacada con sílica gel 60 Merck (50g). Se

eluyó la FFOS empleando como disolventes Diclorometano: metanol 100:0, 95:5, 90:10,

80:20,50:50, 0:100 (Ramírez et al., 2016) y para la FFOI 100:0, 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40,

50:50, 40:60, 30:70, 10:90 y 0:100.

29

7.8 Análisis químico de las fracciones del fraccionamiento químico de la FFOS y de la FFOI

de T. stans

Para el análisis químico por CCF se seleccionaron las fracciones TsC1F12S, TsC1F14S y

TsC1F16S obtenidas del fraccionamiento de la FFOS y las fracciones TsC1F11I, TsC1F13I,

TsC1F15I y TsC1F17I obtenidas del Fraccionamiento de FFOI de T. stans. Se utilizaron placas

de cromatofolios de aluminio recubiertas de sílica gel 60 F254 (Fase normal (Sigma-Aldrich) y

como fase móvil diclorometano:metanol 90:10v/v (Sánchez, 2013). Posteriormente las placas

fueron analizadas con una lámpara de luz ultravioleta (UV) a 254 y 365 nm antes de revelar y se

empleó como revelador la solución denominada HS. Posteriormente se realizó una fitoquímica

de las fracciones (Devi et al., 2014; Patil et al., 2016).

7.9 Cuantificación de compuestos fenólicos por HPLC.

La cuantificación de los compuestos fenólicos en los extractos activos silvestres e in vitro se

realizó por UHPLC de acuerdo con la metodología descrita por Ferreres et al., (2011) y

modificada por Sánchez-Méndez (2017). La cual a continuación se describe brevemente: se

utilizó una columna EVO C18 (Phenomenex, 150 X 2.1 mm con tamaño de partícula de 5 µM).

La fase móvil consistió en: ácido acético al 1 % (A) y metanol (B), iniciando con 20 % de B en

gradiente hasta obtener 50 % a los 18 min, 80 % a los 19 min y 20 % a los 20 min con un flujo

de 0.21mL/min, temperatura de 40 °C y un volumen de inyección de 10 µL. La obtención de los

datos espectrales fue en un intervalo de 200 – 600 nm con capturas de cromatogramas a 270, 320

y 340 nm. El análisis UHPLC-DAD se realizó con un equipo Acquity Arc (Waters) que cuenta

con una bomba cuaternaria, desgasificador, automuestreador, horno de columna y detector de

arreglo de diodos. El equipo UHPLC-DAD fue controlado por el software Empower 3 (Waters).

7.10 Actividad hipoglucémica de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans

Para el estudio se formaron 7 grupos de ratones, un grupo normoglucémico y 6 grupos de ratones

diabéticos, a los cuales se les indujo diabetes mediante la administración de STZ vía

intraperitoneal (40mg/Kg) durante 5 días consecutivos, 15 minutos después de la administración

30

con nicotinamida (68mg/Kg) vía intraperitoneal (Flores C et al., 2006; Ortiz-Andrade R. et al.,

2009).

De los 6 grupos diabéticos, se tuvo un grupo diabético sin tratamiento (control negativo), dos

grupos tratados con los fármacos comerciales Glibenclamida y Acarbosa (control positivo) los

otros 3 grupos fueron tratados con TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S, estos fueron tratados

diariamente durante un periodo de 12 días (Tabla 11). Se realizó una toma de muestra por

punción en la cola al día 0 (antes de inducir diabetes), día 1 cuando fueron considerados

diabéticos (10 días después de la inducción de diabetes), día 4, 8 y 12 de tratamiento. Se realizó

la medición de glucosa en sangre por glucómetro comercial Accu-Chek Active (Roche) además,

se realizó el monitoreo de peso corporal.

Tabla 11. Grupos de animales de experimentación tratados con fracciones silvestre de T. stans.

Grupo Tratamiento durante 12 días

No diabético I Normoglucémicos

II Control negativo (Diabético sin tratamiento)

III Control positivo (Glibenclamida)

Diabéticos IV Control positivo (Acarbosa)

V TsC1F12S

VI TsC1F14S

VII TsC1F16S

7.11 Análisis estadístico

El análisis estadístico para la actividad hipoglucémica fue realizado utilizando el software

Minitab 17 para windows (AppOnFly, Inc., San Francisco, CA, USA). Se usó un análisis de

varianza (ANOVA) de una vía, seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey con un

P < 0.05 cual fue considerado estadísticamente significativo.

31

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1 Rendimiento del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans

La extracción hidroalcohólica de hojas de T. stans produjo un rendimiento del 18,4% (271,49 g,

EHAS), similar a lo reportado por Ramirez et al (2016). La bipartición de acetato de etilo / agua

de este extracto (80 g) produjo 73.28 g de fracción acuosa (91,6%, FFAS) y 6.62 g de la fracción

menos polar (8.3 %, FFOS).

8.2 Análisis químico del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans

8.2.1 Identificación de grupos de compuestos por CCF.

En el análisis por CCF del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans, se identificó la presencia de grupos

de compuestos como terpenos, feniletanoides, saponinas y componentes de aceites esenciales

(Figura 5).

EHAS FFAS FFOS EHAS FFAS FFOS EHAS FFAS FFOS

Figura 5. CCF, fase normal de EHAS, FFAS y FFOS. Fase móvil: Diclorometano:

metanol 90:10. A) Vista en UV 365nm. B) Vista bajo UV 245 nm. C) Vista con revelador

HS. Terpenos (café y azul), feniletanoides (amarillo), saponinas y componentes de aceites

esenciales (púrpura y rosado).

A B C

32

8.2.2 Fitoquímica del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans

Para la fitoquímica del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans se emplearon 2mg de extracto para

cada una de las pruebas (Devi et al., 2014; Patil et al., 2016). En la cual se determinó la presencia

de taninos, flavonoides, saponinas, esteroides, cumarinas, alcaloides, fenoles, florataninos,

proteínas, quinonas y carbohidratos en cada uno de los extractos (Tabla 12).

Tabla 12. Grupos de compuestos identificados en los extractos.

Prueba EHAS FFAS FFOS

Taninos - - +++

Flavonoides ++ ++ +

Saponinas ++++ ++++ +

Esteroides +++ - +++

Cumarinas +++ +++ ++

Alcaloides ++++ +++ +++

Fenoles ++ ++ ++ku

Florataninos - - -

Antocianina - - -

Betacianina - - -

Proteínas +++ +++ +

Quinonas - - -

Carbohidratos - - -

Glucósidos - - -

8.3 Actividad hipoglucémica del EHAS, FFAS y FFOS de T. stans

Se realizó la inducción de diabetes mediante la administración de STZ vía intraperitoneal

(40mg/Kg) durante 5 días consecutivos, 15 minutos después de haber administrado con

nicotinamida (68mg/Kg) por la misma vía. Se emplearon como control positivo: Glibenclamida

(5mg/kg) y Acarbosa (10mg/kg). Los tratamientos EHAS, FFAS y FFOS fueron evaluados a

33

dosis de 270mg/kg respectivamente, vía oral. Se muestra los valores antes de inducir diabetes

(Día 0), cuando fueron considerados diabéticos (Día 1) y 10 días después de la inducción de

diabetes, al día 4, 8 y 12 de tratamiento (Tabla 13). Se realizó monitoreo de peso de cada uno de

los grupos durante la experimentación (Tabla 14).

34

Tabla 13. Actividad hipoglucemiante de EHAS, FFAS y FFOS de T. stans.

Grupos experimental Glucosa mg/dL

Día 0 Día 1 Día 4 Día 8 Día 12

Grupo 1 Normoglucémico 83.60 + 1.83 101.60 + 5.59 107.00 + 7.83 95.40 + 6.91 99.20 + 5.54c**

Grupo 2 Control negativo 80.20 + 2.66 133.40 + 5.50 145.20 + 16.32 144.80+ 5.68 165.8 + 17.88ab

Grupo 3 Control Glibenclamida 76.20 + 1.06 133.40 + 3.13 109.20 + 12.87 99.80 + 14.40 83.00 + 4.69c

Grupo 4 Control Acarbosa 73.20 + 1.32 227.40 + 28.80 115.40 + 4.15 95.40 + 7.91 113.60 + 2.03bc

Grupo 5 EHAS 81.20 + 4.14 133.20 + 12.34 112.80 + 8.84 113.60 + 9.16 83.80 + 5.24c

Grupo 6 FFAS 90.40 + 4.71 168.60 + 25.67 186.40 + 33.71 183.80 + 6.12 192.4 + 33.54a

Grupo 7 FFOS 87.80 + 4.59 200.40 + 5.51 164.57+ 27.83 95.74+ 9.10 75.60 + 1.80 c*

Los valores se expresan como media ± error estándar. Las concentraciones de glucosa por grupo fueron analizadas con Fisher, p <

0.05, fueron considerados como estadísticamente significativo (n=5).

*mejor tratamiento **ratón sano sin tratamiento (Normoglucémico)

35

Tabla 14. Peso corporal de los grupos de experimentación con EHAS, FFAS y FFOS de T. stans.

Los valores se expresan como media ± error estándar, Las concentraciones de glucosa por grupo fueron analizadas con Fisher, p <

0.05 fueron considerados como estadísticamente significativo (n=5).

*mejor tratamiento **ratón sano sin tratamiento (Normoglucémico).

Grupos experimental Peso (g)


Grupo 1 Normoglucémico 36.99 + 0.79 39.60 + 1.13 38.62 + 2.05 39.06 + 2.34 40.56+ 0.74a**

Grupo 2 Control negativo 29.28 + 0.80 29.60 + 0.68 29.42 + 1.48 28.30+ 1.78 29.88 + 1.04c


Grupo 4 Control Acarbosa 39.54 + 0.29 37.82 + 0.54 37.36 + 1.47 38.64+ 1.49 37.16+ 0.56b

Grupo 5 EHAS 30.10 + 0.76 30.04 + 0.67 29.26 + 1.47 29.34 + 1.82 30.38+ 0.60c

Grupo 6 FFAS 31.22 + 1.03 33.50 + 1.56 29.80+ 1.85 29.18 + 2.57 29.28 + 1.18c

Grupo 7 FFOS 39.81 + 1.44 38.60 + 1.60 39.52 + 3.50 37.66 + 5.22 39.86 + 1.71ab*

36

Con base a los resultados obtenidos (Tabla13), el grupo normoglucémico, no mostró variación en

los niveles de glucosa durante la experimentación. A diferencia de los otros grupos, en donde se

presentó un incremento en los niveles de glucosa, después de haber transcurrido 10 días de la

inducción con STZ, donde fueron considerados diabéticos (Día1).

El EHAS y FFOS mostraron un comportamiento de disminución de glucosa, llegando a

restablecer los niveles de glucosa en sangre dentro de los parámetros normales, semejante al

grupo control positivo de glibenclamida, lo cual sugiere una posible similitud en la actividad

biológica. Siendo la FFOS, la que presentó mayor disminución de glucosa en los ratones

diabéticos. Por otro lado, el grupo tratado con la FFAS, no presentó disminución en los niveles

de glucosa, (Tabla 13).

Los resultados muestran una similitud en el peso corporal entre el grupo normoglucémico y el

tratado con la FFOS al término del tratamiento, comparado con los otros grupos diabéticos que

presentaron una disminución en el peso corporal, (Tabla 14).

Debido a los antes mencionado, y que además esta fracción fue la más activa (o una de las más

activas), se procedió a el fraccionamiento químico por cromatografía en columna para separar e

identificar los posibles compuestos activos.

8.4 Fraccionamiento de la FFOS de T. stans

Debido a la actividad hipoglucémica y la identificación de mayor grupo de compuestos en la

FFOS (2.5g), fue seleccionada para un fraccionamiento químico Figura 6. En el que se

recolectaron 42 fracciones de 35 mL cada una, estas fueron concentradas por destilación a

presión reducida en un rota-evaporador (DRAGONLAB RE 100-Pro) a 40 ºC y 100 rpm,

obteniendo de 0.5 a 2 mL de cada fracción (Tabla 15).

37

Figura 6. Fraccionamiento químico de la FFOS. A. Empaquetamiento de la columna.

B. Columna cromatográfica de la FFOS de T. stans.

Tabla 15. Fracciones obtenidas del fraccionamiento químico de la FFOS de T. stans.

Sistema de elución Fracciones colectadas Clave

Diclorometano:metanol 100:0 1-5 TsC1F1S-5








A B

38

8.5 Análisis químico de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S obtenidas del fraccionamiento

químico de la FFOS de T. stans

8.5.1 Identificación de grupos de compuestos por CCF

En el análisis por CCF de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans, mostró la presencia de

grupos de compuestos como terpenos, feniletanoides, saponinas y componentes de aceites

esenciales Figura 7.

8.5.2 Fitoquímica de las fracciones TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans

Se realizó un análisis fitoquímico de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S. Empleando 2mg de

extracto para cada una de las pruebas. (Devirajesh et al., 2014; Patil et al., 2016). En la cual se

determinó la presencia de taninos, flavonoides, saponinas, cumarinas, alcaloides y fenoles (Tabla

16).

TsC1F12S TsC1F14S TsC1F16S TsC1F12S TsC1F14S TsC1F16S TsC1F12S TsC1F14S TsC1F16S

A B

Figura 7. CCF, fase normal de TsC1F12S, TsC1F14S, TsC1F16S. Fase móvil:

Diclorometano: metanol 90:10 A) Vista en UV 365nm.B) Vista bajo UV 245 nm de los

extractos. C) Vista con revelador HS. Terpenos (café), feniletanoides (amarillo), saponinas y

componentes de aceites esenciales (púrpura y rosado).

C

39

Tabla 16. Grupos de compuestos identificados en las fracciones TsC1F12S, TsC1F14S y

TsC1F16S de T. stans.

Prueba Tsc1f12s Tsc1f14s Tsc1f16s

Taninos - - +++

Flavonoides - - ++

Saponinas - - ++

Cumarinas + - +++

Alcaloides ++ + +++

Fenoles +++ + ++++

8.6 Actividad hipoglucemiante de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans


(40mg/Kg) durante 5 días consecutivos, 15 minutos después de la administración con

nicotinamida (68mg/Kg) vía intraperitoneal. Se emplearon como control positivo: Glibenclamida

(5mg/kg) y Acarbosa (10mg/kg). Los tratamientos TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S fueron

evaluados a dosis de 50mg/kg respectivamente, vía oral. Se muestra los valores antes de inducir

diabetes (Día 0), cuando fueron considerados diabéticos (Día 1) 10 días después de la inducción

de diabetes, al día 4, 8 y 12 de tratamiento (Tabla 17). Se realizó monitoreo de peso de los

animales de la experimentación (Tabla 18).

40

Tabla 17. Actividad hipoglucemiante de TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans.



Grupo 1 Normoglucémico 84.60 + 1.60 102.60 + 5.05 107.20 + 7.83 95.40 + 6.91 100.20 + 5.01bc**

Grupo 2 Control negativo 81.20 + 2.00 134.60 + 5.10 145.20 + 16.32 144.80 + 5.68 167.00 + 17.21a

Grupo 3 Control Glibenclamida 76.20 + 1.06 133.40 + 3.13 109.2 + 12.87 99.80 + 14.40 83.00 + 4.69bc

Grupo 4 Control Acarbosa 73.20 + 1.31 227.40 + 28.80 115.40 + 4.15 95.40 + 7.91 113.60 + 2.03b

Grupo 5 TsC1F12S 80.80 + 1.90 149.60 + 6.75 132.40 + 8.84 85.60 + 6.16 93.20 + 7.65bc

Grupo 6 TsC1F14S 85.40 + 1.72 160.00 + 1.92 145.23 + 15.71 77.72 + 3.12 88.00 + 3.30bc

Grupo 7 TsC1F16S 84.40 + 2.37 165.00 + 2.58 113.35 + 13.83 78.47 + 6.10 78.20 + 1.35c*


0.05 fueron considerados como estadísticamente significativo, (n=5).


41

Tabla 18. Peso corporal de los grupos de experimentación TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans.


0.05 fueron considerados como estadísticamente significativo, (n=5)


Grupos experimental Peso g


Grupo 1 Normoglucémico 36.99 + 0.79 39.60 + 1.13 38.62 + 0.91 39.60 + 1.04 40.56 + 0.74a

Grupo 2 Control negativo 29.28 + 0.80 29.60 + 0.68 29.42 + 0.66 28.30 + 0.79 33.08 + 0.95c


Grupo 4 Control Acarbosa 39.54 + 0.29 37.82 + 0.54 37.36 + 0.66 38.64 + 0.66 37.16 + 0.58b

Grupo 5 TsC1F12S 30.10 + 0.76 30.04 + 0.67 29.26 + 0.66 29.34 + 0.81 31.84 + 0.98c

Grupo 6 TsC1F14S 31.22 + 1.03 33.50 + 1.56 29.80 + 0.82 29.18 + 1.14 39.64 + 0.72a

Grupo 7 TsC1F16S 39.81 + 1.44 38.60 + 1.60 39.52 + 1.56 37.66 + 2.33 41.84 + 0.96a

42

Los resultados obtenidos muestran una disminución de glucosa significativa durante el

tratamiento con TsC1F12S, TsC1F14S y TsC1F16S de T. stans. Cabe destacar que la fracción

TsC1F16, presentó una mayor disminución en los niveles de glucosa con respecto a las

fracciones TsC1F12S, TsC1F14S y a los controles positivos: Glibenclamida y Acarbosa, (Tabla

17). Por otra parte, los resultados de peso corporal, mostraron un comportamiento similar entre

los grupos evaluados con TsC1F14S, TsC1F16S y el grupo normoglucémico, lo cual puede

sugerir que estas fracciones podrían tener un efecto regulatorio en el peso, llegando a tener un

comportamiento similar al del grupo normoglucémico (Tabla 18).

8.7 Rendimiento del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans

Para la obtención de del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans, se emplearon plántulas de 2 meses de

edad Figura 8. Los rendimientos obtenidos se muestran en la Tabla 19.

A B

Figura 8. Plántulas in vitro de T. stans.

A) Plántulas in vitro de 2 meses de edad de T. stans.

B) Parte aérea in vitro de T. stans.

43

Tabla 19. Rendimiento obtenido de la extracción.

Extracto/fracción Peso del extracto/

fracción (g)

Porcentaje de

rendimiento (%)

EHAI 4.6078 35.29

FFAI 2.8516 80.22

FFOI 0.7544 21.22

8.7.1 Análisis químico del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans

8.7.2 Identificación de grupos de compuestos por CCF.

En el análisis por CCF del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans, se identificó la presencia de grupos

de compuestos como terpenos, feniletanoides, saponinas y componentes de aceites esenciales

Figura 9.

EHAI FFAI FFOI EHAI FFAI FFOI EHAI FFAI FFOI

Figura 9. CCF fase normal del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans. Fase móvil:

Diclorometano:metanol 90:10. A) Vista en UV 365nm. B) Vista bajo UV 245 nm. C) Vista

con revelador de HS. Terpenos (café y azul), feniletanoides (amarillo), saponinas y

componentes del aceite esencial (púrpura y rosado).

C B A

44

8.8 Actividad hipoglucemiante del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans


(40mg/Kg) durante 5 días consecutivos, 15 minutos después de haber administrado nicotinamida

(68mg/Kg) por la misma vía. Se emplearon como control positivo: Glibenclamida (5mg/kg) y

Acarbosa (10mg/kg).

El tratamiento de EHAI fue evaluado a dosis de 270mg/kg, mientras que la FFAI y FFOI fueron

avaluadas a dosis de 200mg/kg respectivamente, vía oral. Se muestran los valores antes de

inducir diabetes (Día 0), cuando fueron considerados diabéticos (Día 1) 10 días después de la

inducción de diabetes, al día 4, 8 y 12 de tratamiento (Tabla 20). Durante la experimentación se

realizó monitoreo de peso a todos los grupos experimentales (Tabla 21).

45

Tabla 20. Actividad hipoglucemiante del EHAI, FFAI y FFOI de T. stans.



Grupo 1 Normoglucémico 77.20 + 1.15 80.00 + 1.22 94.00 + 6.14 92.00 + 4.06 80.60 + 0.80d

Grupo 2 Control negativo 73.00 + 1.41 245.80 + 32.19 200.20 + 11.89 226.80 + 31.03 247.00 + 21a

Grupo 3 Control Glibenclamida 76.20 + 1.06 133.40 + 3.13 109.20 + 12.87 99.80 + 14.40 83.00 + 4.47cd

Grupo 4 Control Acarbosa 73.20 + 1.31 227.40 + 28.80 115.40 + 4.15 104.60 + 14.67 113.60 + 2.03bcd

Grupo 5 EHAI 75.40 + 1.39 162.80 + 6.55 162.00 + 13.50 127.20 + 6.59 147.80 + 5.65b

Grupo 6 FFAI 73.80 +1.23 220.0 + 54.38 146.20 + 15.38 133.12 + 13.69 125.60 + 7.76bc

Grupo 7 FFOI 71.80 +1.39 269.6 + 45.65 178.8 +23.88 134.20 + 21.68 133.20 +9.04b*


0.05 fueron considerados como estadísticamente significativo, (n=5)

*mejor tratamiento **ratón sano sin tratamiento (control)

46

Tabla 21. Peso corporal de los grupos de experimentación EHAI, FFAI y FFOI de T. stans.


0.05 fueron considerados como estadísticamente significativo (n=5).

*mejor tratamiento **ratón sano sin tratamiento (control).

Grupos experimental Peso g


Grupo 1 Normoglucémico 39.98 + 1.32 41.14 + 1.02 40.94 +2.18 41.64 +2.00 40.32 + 0.53a

Grupo 2 Control negativo 41.82 + 0.92 41.97 + 0.86 42.12 + 0.89 42.46 + 0.81 41.72 + 0.85a

Grupo 3 Control Glibenclamida 31.44 + 1.18 31.24 + 1.13 30.78 + 1.19 31.06 + 1.31 31.46 + 0.82d

Grupo 4 Control Acarbosa 39.54 + 0.30 37.82 + 0.54 37.36 + 0.66 38.64 + 0.66 37.16 + 0.58bc

Grupo 5 EHAI 30.18 + 0.43 32.08 + 0.55 29.50 + 1.06 28.20 + 0.92 27.58 + 0.89e

Grupo 6 FFAI 40.66 + 1.00 41.54 + 1.36 41.54 + 1.36 41.94 + 1.54 42.26 + 0.62a

Grupo 7 FFOI 38.16 + 0.62 37.44 + 1.64 37.44 + 1.65 36.78 + 1.80 36.76 + 0.95c

47

Con base a los resultados obtenidos, el grupo normoglucémico no presentó una variación

significativa en los niveles de glucosa, estos se mantuvieron dentro de los parámetros normales.

A diferencia del resto de los grupos, que mostraron un aumento en los niveles de glucosa,

después de 10 días de la inducción de diabetes con STZ (Día 1). El EHAI y la FFOI mostraron

una similitud en la disminución de glucosa, con respecto al efecto obtenido por el EHAS y la

FFOS. Siendo la FFOI la que presentó mayor efecto en la disminución de glucosa (Tabla 20).

Los resultados muestran una similitud en el peso corporal entre el grupo normoglucémico,

control negativo y la FFAI, en donde se mantuvo una similitud en el peso corporal el tratado en

la experimentación. A diferencia del resto de los grupos, en los que se presentó una ligera

disminución del peso corporal durante la experimentación (Tabla 21).

8.9 Fraccionamiento de la FFOI de T. stans

La FFOI (283.2mg) presentó mayor actividad hipoglucemiante, por lo que fue sujeta a un

fraccionamiento químico Figura 10. En el que se recolectaron 88 fracciones de 10 mL cada una,

estas fueron llevadas a sequedad a temperatura ambiente (Tabla 22).

Figura 10. Fraccionamiento químico de la FFOI. A. Empaquetamiento de la columna

B. Columna cromatográfica de la FFOI de T. stans.

A B

48

Tabla 22. Fracciones obtenidas del fraccionamiento químico de la FFOI de T. stans.

Sistema de elución Fracciones

colectadas

Clave

Diclorometano:metanol 100:0 1-6 TsC1F1I-6





Diclorometano:metanol 60:40 39-48 TsC1F39-48






49

8.10 Análisis químico de TsC1F11I, TsC1F13I, TsC1F15I y TsC1F17I obtenidas del

fraccionamiento químico de la FFOI de T. stans

8.10.1 Identificación de grupos de compuestos por CCF

En el análisis por CCF de TsC1F11I, TsC1F13I, TsC1F15I y TsC1F17I de T. stans, se identificó

la presencia de grupos de compuestos como terpenos, feniletanoides, saponinas y componentes

de aceites esenciales Figura 11.

TsC1F11I TsC1F13I TsC1F15I TsC1F17I TsC1F11I TsC1F13I TsC1F15I TsC1F17I

Figura 11. CCF, fase normal de TsC1F11I, TsC1F13I, TsC1F15I y TsC1F17I. Fase móvil:

Diclorometano: metanol 90:10 A) Vista en UV 365nm. B) Vista con revelador HS.Terpenos

(café), feniletanoides (amarillo), saponinas y componentes de aceites esenciales (púrpura y

rosado).

B A

50

Tabla 23. Cuantificación de ácidos fenólicos en extractos y fracciones silvestre y cultivada in vitro de Tecoma stans.

Material Vegetal Extracto/Fracción Protocatecúico Caféico Siringico Ferúlico 3-

hidroxicinámico

2-

hidroxicinámico

Cinámico

(µg/mg de extracto)

Silvestre EHAS 2,3122 0,1634 0,4759 0,4621 0,7102 0,8387

FFAS 2,1075 0,2631 0,4053 0,3234 1,0384 0,8611

FFOS 2,0367 7,5804 0,5327 0,9785 0,9625 2,3477 0,8681

TsC1F12S 0,3651 0,2664 0,6469 0,1521 4,4013 0,9623

TsC1F14S 1,3719 0,9157 1,0989 1,9703 0,1937 18,736 2,1178

TsC1F16S 2,9988 3,6457 0,0549 0,3437 0,3942 0,3565 0,6551

in vitro EHAI 0,4384 0,1591 0,6764 0,4186 0,2812 0,6593

FFAI 0,3201 0,1316 0,4516 0,1558 0.6531

FFOI 0,1245 0,2795 0,0809 0,5599 0,1556

TsC1F11I 0,5562 0,3236 1,3227 0,2628 0,6966

TsC1F13I 0,3056 0,1958 0,5181 0,2565 0,6198

TsC1F15I 0,2151 0,0431 0,3022 0,1461 0,6676

51

Los resultados de la cuantificacion de los ácidos fenólicos muestran una relación entre las

fracciones que obtuvieron un mayor efecto hipoglucemiante con las concentraciones de los

estandares fenólicos. La mayoria de los estandares fenólicos utilizados en este trabajo se han

encontrado relacionados con un efecto hipoglucemico (Tabla 23).

Los resultados obtenidos de las FFOS, TsC1F14, TsC1F16 y FFOI sobre la presencia del ácido

protocatecuico permiten ser comparado con lo reportado por Harini & Pugalendi (2010), donde

reportan que el ácido protocatecúico cuenta con un efecto anti hiperglucémico. Otro de los

compuestos, identificados en mayor concentración en las fracciones más activas fue el ácido

caféico que funciona como un inhibidor de la α-amilasa permitiendo una menor absorción de

carbohidratos (Tabla 23) (Ganiyu Oboh et al., 2015).

Por otra parte se identificó con mayor concentración el ácido 2-hidroxicinámico el cual se

encuentra relacionado como un compuesto con un funcionamiento potencial antihiperglucémico,

antihiperlipidémico y antioxidantes en ratas diabéticas Winstar (S. Ambika et al., 2013), sin

embargo la fracción Tsc1F14S fue la que presento mayor concentración de este compuesto, esta

no fue la fracción que tuvo mayor efecto hipoglucemiante, lo que nos permite suponer que los

compuestos involucrados en el efecto hipoglucemiante están más relacionados con el ácido

protocatecúico y el ácido caféico ya que su concentración fue encontrada en las fracciones más

activas (Tabla 23).

52

Figura 12. Cromatogramas de HPLC de las fracciones activas FFOS, F11 S y F14 S de plantas

silvestre de Tecoma stans. Deteccionde compuestos fenólicos a 275 nm. FFO=Fracción Fase

Orgánica; F14= Fraccion 11; F14 Fraccion 14; S=silvestre. 1=Ac. galico; 2=Ac. protocatecúico;

3=Ac. caféico; 4=Ac. siríngico; 5=Ac. ferúlico; 6=Ac. 3-hidrocinámico; 7=2-hidroxicinámico;

8= Ac. cinámico.

Figura 13. Cromatogramas de HPLC de la fraccion orgánica activa de plantas silvestre de

Tecoma stans. Deteccion de compuestos fenólicos a 275 nm. FFO=Fracción Fase Orgánica;

S=silvestre. 1=Ac. galico; 2=Ac. protocatecúico; 3=Ac. caféico; 4=Ac. siríngico; 5=Ac. ferúlico;

6=Ac. 3-hidrocinámico; 7=2-hidroxicinámico; 8= Ac. cinámico.

53

9. CONCLUSIONES

La fracción fase organica de plantas silvestres (FFOS) mostró el mayor número de grupos de

compuestos (bandas) con el revelador 4-hidroxi benzaldehído (HS) cuando se analizó por CCF y

estando acorde con el estudio fitoquímico.

La FFOS presentó una disminución en los niveles de glucosa en sangre similar al control

glibenclamida a dosis de 270 mg/kg a diferencia del extracto hidroalcoholico de plantas

silvestres (EHAS) en la cual se observó 1.2 veces menos actividad hipoglucémica. La fracción

fase acuosa silvestre (FFAS) no presentó efecto.

La fracción TsC1F16S fué 1.5 y 1.2 veces más activa que TsC1F12S y TsC1F14S

respectivamente disminuyendo los niveles de glucosa en sangre a dosis de 50mg/kg, pero fueron

0.87 y 1.3 veces menos activas que glibenclamida y acarbosa a la misma concentración.

En la evaluación de la actividad hipoglucémica del extracto hidroalcoholico y las fracciones fase

organica y fase acuosa de plantas in vitro (EHAI, FFAI y FFOI), FFOI presentó 9 y 1.4 veces

mas efecto que EHI y FFAI respectivamente, pero fue muy similar en efecto hipoglucemico al

control positivo acarbosa (1.2 veces) y fue 2 veces mejor que glibenclamida a dosis de

200mg/kg.

Al separar por cromatografía en columna la FFOI, las fracciones TsC1F11I, TsC1F13I,

TsC1F15I y TsC1F17I, mostraron una similitud de grupos de compuestos con TsC1F12S,

TsC1F14S y TsC1F16S al analizarlas por CCF.

La identificación y cuantificación por UHPLC de compuestos presentes en los extractos y

fracciones activas de plantas silvestres e in vitro de Tecoma stans, sugieren que el ácido

protocatecúico, ácido caféico y 2-hidroxicinámico, pueden ser los compuestos responsables de la

actividad biológica.

54

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