Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas

Facultad de Medio Ambiente y Recursos Naturales

Ingeniera Ambiental

Bioqumica

ACCION CONTAMINANTE EN EL ADN

Autores1:

Yeiver Fabian Vega Bello- 20132180281

Jos Lpez Fino- 20132180019

Jeison ngel Arango - 20132180955

Diego Alexander Escobar- 20141180080

INTRODUCCION

Uno de los enfoques que presenta el tema

sugerido tiene que ver con Las enzimas

de restriccin, tambin conocidas como

endonucleasas, son enzimas que cortan

los enlaces fosfodiester del material

gentico a partir de una secuencia que

reconocen. Las mismas permiten cortar

DNA de hebra doble, donde reconocen

secuencias palindrmicas (secuencias

que se leen igual en ambas direcciones).

Son extradas de organismos

procariticos (bacterias), donde actan

como un mecanismo de defensa, para

degradar material gentico extrao que

entre en la clula. Las bacterias tienen la

capacidad de metilar su DNA, lo cual

sirve para distinguir entre el DNA

extrao y el DNA propio. Las enzimas

de restriccin no pueden cortar DNA

metilado, de este modo solo afectan el

DNA extranjero y no el DNA bacterial.

Aplicaciones de las enzimas de

restriccin:

1 Estudiantes de Ingeniera Ambiental, espacio acadmico Bioqumica

1. Hacer mapa de restriccin de un

plsmido o bacterifago.

2Fragmentar DNA genmico para

separacin de electroforesis y Southern

Blot

3Generacin de fragmentos para ser

usados como sondas marcadas en

Southerny Northern blotting.

4. Generacin de fragmentos para ser

subclonados en los vectores apropiados,

creacin de DNA recombinante.

Con este tema se pretende conocer los

diferentes factores que intervienen en el

ADN. Destacando el estudio de

mutaciones con ayuda de herramientas

como la ingeniera gentica; que se

podra definir como un conjunto de

metodologas que permite transferir

genes de un organismo a otro y

expresarlos (producir las protenas para

las cuales estos genes codifican) en

organismos diferentes al de origen. El

ADN que combina fragmentos de

organismos diferentes se denomina

ADN recombinante. En consecuencia,

las tcnicas que emplea la ingeniera

gentica se denominan tcnicas de ADN

recombinante. As, es posible no slo

obtener protenas recombinantes de

inters sino tambin mejorar cultivos y

animales. Los organismos que reciben un

gen que les aporta una nueva

caracterstica se denominan organismos

genticamente modificados (OGM) o

transgnicos. A su vez, la ingeniera

gentica es lo que caracteriza a

la biotecnologa moderna que

implementa estas tcnicas en la

produccin de bienes y servicios tiles

para el ser humano, el ambiente y la

industria

RESUMEN

El cido desoxirribonucleico, abreviado

como ADN, es un cido nucleico que

contiene instrucciones genticas usadas

en el desarrollo y funcionamiento de

todos los organismos vivos conocidos y

algunos virus, y es responsable de su

transmisin hereditaria. La funcin

principal de la molcula de ADN es el

almacenamiento a largo plazo de

informacin

La funcin de la reparacin del DNA es

el mantenimiento de la informacin

gentica intacta La reparacin del DNA

est muy relacionada con la replicacin

puesto que en la mayor parte de los

procesos de reparacin se da algo de

replicacin y con la recombinacin,

puesto que la recombinacin es una de

las vas de reparacin. El DNA est

expuesto a multitud de agentes que

pueden producirle daos.

Cmo se produce el Dao en el DNA?

1) Errores en la replicacin: la seguridad

con que una secuencia de DNA se copia

durante la replicacin depende de la

fidelidad de la polimerasa en la seleccin

correcta del dNTP para insertarlo en la

cadena complementaria que se sintetiza

a partir del DNA parental. Los errores en

la replicacin se incrementan si el

balance de los 4 dNTP en la clula del

DNA precursor se desordena, si un

dNTP se encuentra en exceso se puede

alterar la normalidad de la polimerasa

e incorporar este nucletido en lugar

del correcto.

2) Daos espontneos: a 37 C miles de

bases se pierden espontneamente,

dejando sitios apurnicos y

apirmidnicos incapaces de determinar

la insercin correcta de las bases en la

cadena complementaria.

3) Daos endgenos: la mayor parte de

estos cambios se producen por la

generacin de radicales libres como

subproductos de la respiracin aerobia

normal. Estos radicales que son

molculas o fragmentos moleculares con

electrones sin aparear son capaces de

acelerar la ruptura de las cadenas del

DNA.

4) Daos exgenos:

a) Radiaciones ionizantes: los rayos X

y , provocan ruptura de simple cadena,

ruptura de doble cadena, bases daadas

por ionizacin directa y generan

radicales libres.

b) Radiaciones ultravioleta (UV): es el

agente que daa el DNA ms estudiado,

causa la formacin de enlaces

intracadenas (dimerizacin de

pirimidinas), en orden de abundancia

TT, CT y CC. La figura siguiente

muestra dos tipos de dmero de timina.

Se hace nfasis en La mutagnesis

(generacin de cambios en el ADN)

puede afectar clulas somticas o

germinales (Figura 10). En las clulas

somticas (cualquier clula del cuerpo)

la mutacin puede transmitirse por

divisin celular ocasionando

degeneraciones, como el cncer, o

muerte celular. En las clulas germinales

(vulo, espermatozoide) causa

disminucin en la fertilidad, abortos

espontneos, y defectos en las progenie,

estas alteraciones pueden ser dominantes

o recesivas, es decir manifestarse o no en

la primera generacin (Teaf

&Middendorf, 2000)

ABSTRACT

Modern implementing these techniques

in the production of useful goods and

services to humans, the environment and

industry

Deoxyribonucleic acid, abbreviated as

DNA, is a nucleic acid that contains the

genetic instructions used in the

development and functioning of all

known living organisms and some

viruses, and is responsible for his

inheritance. The main function of the

DNA molecule is a long term storage of

information

The role of DNA repair is the

maintenance of the intact genetic

information DNA repair is closely

related to replication since in most of the

repair processes is given some

replication and recombination since

recombination It is one of the avenues of

redress. The DNA is exposed to many

agents, which can cause damage.

How the DNA damage occurs?

1) Errors in replication: the certainty

with which a DNA sequence is copied

during replication depends on the fidelity

of the polymerase in the correct selection

of dNTP to be inserted into the

complementary strand is synthesized

from the parental DNA. The replication

errors are increased if the balance of the

4 dNTPs DNA precursor cell is

disordered, if a dNTP is in excess can

alter normal polymerase and incorporate

this nucleotide in the correct place.

2) spontaneous Damage: 37 C thousand

bases are lost spontaneously, leaving

apurinic sites apyrimidinic unable to

determine the correct insertion of the

bases in the complementary strand.

3) Damage endogenous: most of these

changes are produced by the generation

of free radicals as byproducts of ordinary

aerobic respiration. These radicals are

molecules or molecular fragments with

unpaired electrons are able to accelerate

the breakdown of DNA chains.

4) exogenous Damage:

a) ionizing radiation: X-rays and , cause

single strand break, double strand break,

damaged bases by direct ionization and

generate free radicals.

b) ultraviolet radiation (UV) is the agent

that damages the DNA studied, causes

the formation of intrachain bonds

(pyrimidine dimerization), in order of

abundance T T, C T & C C. The

following figure shows two types of

thymine dimer.

Emphasis is placed on mutagenesis

(generation of DNA changes) may affect

somatic or germ cells (Figure 10). In

somatic cells (any cell of the body) can

be transmitted by the mutation causing

cell division degenerations, such as

cancer, or cell death. In germ cells (egg,

sperm) causes decreased fertility,

spontaneous abortions, and defects in

offspring, these alterations can be

dominant or recessive, that is manifest or

not in the first generation (FASD &

Middendorf, 2000).

Deoxyribonucleic acid, abbreviated as

DNA, is a nucleic acid that contains the

genetic instructions used in the

development and functioning of all

known living organisms and some

viruses, and is responsible for his

inheritance. The main function of the

DNA molecule is the long-term storage

of information. Many times, the DNA is

compared to a blueprint or a recipe, or a

code, since it contains the instructions

needed to construct other components of

cells, such as proteins and RNA

molecules. The DNA segments that carry

this genetic information are called genes,

but other DNA sequences have structural

purposes or are involved in regulating

the use of this genetic information.

ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

El cido desoxirribonucleico, abreviado

como ADN, es un cido nucleico que

contiene instrucciones genticas usadas

en el desarrollo y funcionamiento de

todos los organismos vivos conocidos y

algunos virus, y es responsable de su

transmisin hereditaria. La funcin

principal de la molcula de ADN es el

almacenamiento a largo plazo de

informacin. Muchas veces, el ADN es

comparado con un plano o una receta, o

un cdigo, ya que contiene las

instrucciones necesarias para construir

otros componentes de las clulas, como

las protenas y las molculas de ARN.

Los segmentos de ADN que llevan esta

informacin gentica son llamados

genes, pero las otras secuencias de ADN

tienen propsitos estructurales o toman

parte en la regulacin del uso de esta

informacin gentica.

COMPOSICIN Y ESTRUCTURA

DEL ADN

La molcula de ADN es una larga doble

hlice enrollada sobre s misma,

semejante a una escalera de caracol. En

ella, dos ramales compuestos de

molculas de azcar (desoxirribosa) y

fosfatos, se conectan gracias al

apareamiento de cuatro molculas

denominadas bases, las cuales forman

los eslabones de la escalera. Estas

cadenas formadas por cuatro nucletidos

distintos, compuestos adems por un

azcar (la desoxirribosa), un cido

fosfrico, y una de las siguientes bases

nitrogenadas: adenina (A), guanina (G),

citosina (C) o timina (T). En los

eslabones, la adenina se aparea con la

timina y la guanina con la citosina. As

un enlace de hidrgeno. Un gen es

segmento de un ADN, que tiene una

determinada funcin y est constituido

por una secuencia especfica de base

Desde el punto de vista qumico, el ADN

es un polmero de nucletidos, es decir,

un polinucletido. Un polmero es un

compuesto formado por muchas

unidades simples conectadas entre s,

como si fuera un largo tren formado por

vagones. En el ADN, cada vagn es un

nucletido, y cada nucletido, a su vez,

est formado por un azcar (la

desoxirribosa), una base nitrogenada

(que puede ser adeninaA, timinaT,

citosinaC o guaninaG) y un grupo

fosfato que acta como enganche de cada

vagn con el siguiente. Lo que distingue

a un vagn (nucletido) de otro es,

entonces, la base nitrogenada, y por ello

la secuencia del ADN se especifica

nombrando slo la secuencia de sus

bases. La disposicin secuencial de estas

cuatro bases a lo largo de la cadena (el

ordenamiento de los cuatro tipos de

vagones a lo largo de todo el tren) es la

que codifica la informacin gentica: por

ejemplo, una secuencia de ADN puede

ser ATGCTAGATCGC... En los

organismos vivos, el ADN se presenta

como una doble cadena de nucletidos,

en la que las dos hebras estn unidas

entre s por unas conexiones

denominadas puentes de hidrgeno.

Para que la informacin que contiene el

ADN pueda ser utilizada por la

maquinaria celular, debe copiarse en

primer lugar en unos trenes de

nucletidos, ms cortos y con unas

unidades diferentes, llamados ARN. Las

molculas de ARN se copian

exactamente del ADN mediante un

proceso denominado transcripcin. Una

vez procesadas en el ncleo celular, las

molculas de ARN pueden salir al

citoplasma para su utilizacin posterior.

La informacin contenida en el ARN se

interpreta usando el cdigo gentico, que

especifica la secuencia de los

aminocidos de las protenas, segn una

correspondencia de un triplete de

nucletidos (codn) para cada

aminocido. Esto es, la informacin

gentica (esencialmente: qu protenas

se van a producir en cada momento del

ciclo de vida de una clula) se halla

codificada en las secuencias de

nucletidos del ADN y debe traducirse

para poder funcionar. Tal traduccin se

realiza usando el cdigo gentico a modo

de diccionario. El diccionario "secuencia

de nucletido-secuencia de

aminocidos" permite el ensamblado de

largas cadenas de aminocidos (las

protenas) en el citoplasma de la clula.

Por ejemplo, en el caso de la secuencia

de ADN indicada antes

(ATGCTAGATCGC...), la ARN

polimerasa utilizara como molde la

cadena complementaria de dicha

secuencia de ADN (que sera TAC-

GAT-CTA-GCG-...) para transcribir una

molcula de ARNm que se leera AUG-

CUA-GAU-CGC-...; el ARNm

resultante, utilizando el cdigo gentico,

se traducira como la secuencia de

aminocidos metionina-leucina-cido

asprtico-arginina-...

Las secuencias de ADN que constituyen

la unidad fundamental, fsica y funcional

de la herencia se denominan genes. Cada

gen contiene una parte que se transcribe

a ARN y otra que se encarga de definir

cundo y dnde deben expresarse. La

informacin contenida en los genes

(gentica) se emplea para generar ARN

y protenas, que son los componentes

bsicos de las clulas, los "ladrillos" que

se utilizan para la construccin de los

orgnulos u organelos celulares, entre

otras funciones.

Dentro de las clulas, el ADN est

organizado en estructuras llamadas

cromosomas que, durante el ciclo

celular, se duplican antes de que la clula

se divida. Los organismos eucariotas

(por ejemplo, animales, plantas, y

hongos) almacenan la mayor parte de su

ADN dentro del ncleo celular y una

mnima parte en elementos celulares

llamados mitocondrias, y en los plastos y

los centros organizadores de

microtbulos o centrolos, en caso de

tenerlos; los organismos procariotas

(bacterias y arqueas) lo almacenan en el

citoplasma de la clula, y, por ltimo, los

virus ADN lo hacen en el interior de la

cpside de naturaleza proteica. Existen

multitud de protenas, como por ejemplo

las histonas y los factores de

transcripcin, que se unen al ADN

dotndolo de una estructura

tridimensional determinada y regulando

su expresin. Los factores de

transcripcin reconocen secuencias

reguladoras del ADN y especifican la

pauta de transcripcin de los genes. El

material gentico completo de una

dotacin cromosmica se denomina

genoma y, con pequeas variaciones, es

caracterstico de cada especie.

-ADN cromosmico

Es el ADN de la clula, en el mismo se

almacena la informacin gentica

perteneciente de la misma. Su ubicacin

depende de la clula en cuestin, en el caso

de las eucariotas se encuentra dentro del

ncleo celular y en las procariontes, en el

citoplasma asociado a la cara interna de la

membrana celular.

Se trata de una doble cadena de bases

complementarias formada cada una

por nucletido, cada uno de ellos formados

por una base de pirmidina o purina, azcar

desoxirribosa y un grupo fosfato. El genoma

humano esta constituido por 23 molculas de

ADN con una longitud de entre 50 y 250

millones de bases.

-ADN recombinante o recombinado

Se trata de una unin de secuencias de ADN

producida de manera artificial generalmente

de forma in vitro. Estas cadenas provienen

de dos organismos de especies diferentes

que no tienen ninguna relacin.

Esta tcnica es utilizada para manipular el

material gentico, lo que permite que sea

aadido un nuevo tipo de ADN al

organismo, esto genera modificacin en los

rasgos o la creacin de nuevos. Este

procedimiento es llevado a cabo con

diferentes fines, como por ejemplo para

tratar algn tipo de enfermedad o la

produccin devacunas. Para esto se busca un

organismo que tenga un ADN de inters y

luego se propaga el mismo en otro

organismo, objeto, etc. Esto es muy utilizado

como tratamiento de fertilidad.

-ADN mitocondrial

Este tipo de ADN se refiere al material

gentico existente en orgnulos de la clula

llamados mitocondrias, los cuales son los

encargados de proveer energa a dicha

clula. Este ADN se reproduce por si mismo

cuando la clula eucariota se divide. Se cree

que evolutivamente este tipo de ADN

desciende del genoma de las bacterias, las

cuales fueron englobadas en s clulas

eucariotas.

Estn organizados en forma de nucloides y

su tamao vara segn diversos factores. Se

encuentra en replicacin constante,

independientemente de la clula que lo aloja,

su reproduccin no depende de su ciclo ni

del tipo de la misma.

-ADN fsil

Se utiliza en el rea

de paleontologa, generalmente para

determinar la antigedad de ADN en

cuestin, para esto se utiliza una reaccin en

cadena de polimerasas lo que permite

estudiar los registros a nivel molecular del

ADN encontrado para determinar la vejez

del mismo. Con este tipo de procedimiento

se dedujo que ADN del fsil ms antiguo

encontrado pertenece a neandertales de no

ms de 50.000 aos.

-ADN superenrollado

Esta molcula tiene como caracterstica

principal que esta, como su nombre lo

indica, enrollada o girada sobre si misma.

Esto fue descubierto gracias a los

diversos estudios topolgicos de la molcula

de ADN. Se reconoce que una secuencia de

ADN puede estar en diferentes estados de

relajacin, es decir planos, o de manera

contraria en varios estados de enrollamiento.

El superenrollamiento se da como

consecuencia de una tensin que sufre la

molcula en su estructura y puede aparecer

de forma tanto negativa como positiva. Esto

est regulado por las enzimas toposomerasas

Mutanogenesis

La mutagnesis (generacin de cambios en

el ADN) puede afectar clulas somticas o

germinales. En las clulas somticas

(cualquier clula del cuerpo) la mutacin

puede transmitirse por divisin celular

ocasionando degeneraciones, como el

cncer, o muerte celular. En las clulas

germinales (vulo, espermatozoide) causa

disminucin en la fertilidad, abortos

espontneos, y defectos en las progenie,

estas alteraciones pueden ser dominantes o

recesivas, es decir manifestarse o no en la

primera generacin (Teaf &Middendorf,

2000).

Los daos en las clulas somticas

embrionarias, causados despus de la

concepcin y antes del nacimiento, es decir

durante el desarrollo del feto, se denomina

teratognesis, este tipo de alteraciones se

producen cuando la hembra en gestacin se

expone a un agente txico. La teratognesis

es consecuencia de diferentes txicos, no

slo aquellos asociados a genotoxicidad

(Vallejo, 1997;Philp, 2001).

La definicin que dio De Vries (1901) de

la mutacin era la de cualquier cambio

heredable en el material hereditario que no

se puede explicar mediante segregacin o

recombinacin.

La definicin de mutacin a partir del

conocimiento de que el material hereditario

es el ADN y de la propuesta de la Doble

Hlice para explicar la estructura del

material hereditario (Watson y Crick, 1953),

sera que una mutacin es cualquier cambio

en la secuencia de nucletidos del ADN.

La mutacin es la fuente primaria de

variabilidad gentica en las poblaciones,

mientras que la recombinacin al crear

nuevas combinaciones a partir de las

generadas por la mutacin, es la fuente

secundaria de variabilidad gentica.

La mutagnesis es el proceso txico por el

cual algunos xenobiticos son

Capaces de inducir una mutacin, o cambio,

en la secuencia normal de los pares bases que

caracterizan la estructura de cada molcula

de ADN. Esta mutacin puede resultar

espontnea, en cuanto consecuencia de un

error en la replicacin

Reparacin del ADN; sin embargo, tambin

puede ser inducida por las actividades de

agentes fsicos, o qumicos, representados

estos ltimos por molculas de xenobiticos

que han penetrado en el organismo vivo.

Muchos compuestos electroflicos pueden

formar enlaces covalentes con la molcula

del ADN para dar lugar a lo que se conoce

con el nombre de aducto. Los aductos se

pueden definir, por lo tanto, como bases del

ADN

Enlazadas a grupos qumicos aadidos, no

asociadas con las funciones fisiolgicas del

ADN. Los aductos no son propiamente

mutaciones; son lesiones en el ADN que en

todo caso pueden ser premutagnicas.

No todos los aductos tienen las mismas

consecuencias fisiolgicas; mientras que

algunos parecen no interferircon las

funciones normales del ADN o son

reparados rpidamente, otros en cambio

son mutagnicos e, incluso, pueden ser

letales.

Los compuestos qumicos electroflicos,

o que dan lugar a metabolitos

electroflicos mediante procesos de

biotransformacin, forman fcilmente

aductos, unas veces de pequeo tamao

debido a la adicin de grupos metilo o

etilo, como en el caso de los compuestos

alquilantes (mostazas nitrogenadas), y

otras por el contrario, pueden ser

voluminosos al intervenir heterociclos

con varios anillos, como aflatoxina Bl,

benzo(a)pireno, etc.

No todos los aductos tienen las mismas

consecuencias fisiolgicas; mientras que

algunos parecen no interferircon las

funciones normales del ADN o son

reparados rpidamente, otros en cambio son

mutagnicos e, incluso, pueden ser letales.

Los compuestos qumicos electroflicos, o

que dan lugar a metabolitos electroflicos

mediante procesos de biotransformacin,

forman fcilmente aductos, unas veces de

pequeo tamao debido a la adicin de

grupos metilo o etilo, como en el caso de los

compuestos alquilantes (mostazas

nitrogenadas), y otras por el contrario,

pueden ser voluminosos al intervenir

heterociclos con varios anillos, como

aflatoxina Bl, benzo(a)pireno, etc.

Daos genticos

Algunas sustancias txicas actan como

agentes mutgenos, es decir que producen

mutaciones en el ADN, en plantas, animales

o seres humanos. La alteracin de los genes

humanos puede causar enfermedades como

deformaciones en los pies, labio leporino,

debilitamiento del sistema de defensa del

organismo, y deformaciones en el desarrollo

embrionario que van desde pequeas

lesiones cardiacas hasta malformaciones

letales.

Alteraciones en el funcionamiento de las

hormonas Algunas de estas sustancias tienen

estructura qumica similar a hormonas

humanas como los estrgenos que regulan la

produccin de espermatozoides y pueden

interferir en el funcionamiento del sistema

genital, provocando disminucin de la

fertilidad.

Cncer

Varios productos sintticos y compuestos

que se extraen del petrleo, como el PAH,

los hidrocarburos y el holln son

cancergenos potenciales.

Alergias

Algunos contaminantes txicos como las

dioxinas y el nquel provocan reacciones

alrgicas. Las personas que desarrollan

hipersensibilidad a esas u otras sustancias

sufren asma, erupciones cutneas,

estornudos, etc.

Alteraciones en el comportamiento

Se ha comprobado que algunos animales,

por ejemplo los peces que viven en grandes

cardmenes como forma de protegerse de

sus depredadores, cuando estn intoxicados

por contaminantes olvidan las pautas de

actuacin que les permiten defenderse y se

hacen ms vulnerables.

Resistencia

Muchas plagas y malas hierbas desarrollan

resistencia y aguantan cada vez dosis

mayores de pesticidas o herbicidas sin sufrir

daos. Algo similar sucede con las bacterias

de las enfermedades que se hacen resistentes

a los antibiticos. Cuantas ms sustancias

qumicas sintticas ponemos en la naturaleza

o cuanto mayor es el nmero de antibiticos

que usamos, ms fcil es que se desarrollen

este tipo de resistencias. Esto obliga, a su

vez, a estar buscando continuamente nuevos

pesticidas y antibiticos.

Efectos sinrgicos

Se habla de sinergia cuando el efecto

provocado por dos sustancias juntas es

mayor que la suma de los efectos que

producira cada una por separado.

("1+1=3"). Este efecto se ha comprobado en

varios contaminantes que cuando estn

juntos son mucho ms dainos que la suma

de sus efectos separados.

Tcnicas para la cuantificacin de

ADN

Dot Blot o Splot Blot o Western Blot

Dot Blot es una tcnica de biologa

molecular para detectar biomolculas.

Representa una simplificacin de los

mtodos Northern blot, Southern blot o

Western blot. En un dot blot las

biomolculas para ser detectados no son

separadas por cromatografa. En cambio,

una gota que contiene la molcula para

ser detectada se aplica directamente

sobre una membrana. Esto es seguido

por la deteccin por sondas de

nucletidos (northern blot y southern

blot) o anticuerpos (para un western

blot).

La tcnica ofrece importantes ahorros en

tiempo. Sin embargo, no ofrece

informacin sobre el tamao de la

biomolcula blanco. Adems, si dos

molculas de diferentes tamaos son

detectadas, se seguir viendo como un

solo punto. Por lo tanto el dot blot slo

puede confirmar la presencia o ausencia

de una biomolcula o biomolculas que

pueden ser detectados por las sondas de

ADN o el anticuerpo.

Se utiliza para determinar la presencia y

cantidad de antgenos y de anticuerpos

especficos. En la actualidad el Western

blot es el estudio confirmatorio ms

empleado para el diagnstico del SIDA.

Se emplean antgenos virales obtenidos

por cultivo celular. Mediante

electroforesis se separan las diferentes

protenas vricas por su diferente peso

molecular. Posteriormente se transfieren

a papel de nitrocelulosa y

secundariamente se incuban con el suero

problema. Los anticuerpos se detectan

aadiendo una anti-IgG humana

marcada con una enzima (peroxidasa)

que produce una banda coloreada al

aadir un sustrato. Esta tcnica identifica

anticuerpos especficos frente a las

distintas protenas del VIH. Las

protenas son separadas en primer lugar

mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida y posteriormente se

transfieren mediante la aplicacin de un

campo elctrico perpendicular al gel a

una membrana. El procedimiento es

anlogo al desarrollado por el Prof. E.

Southern ('Southern blotting') y por ello

se le denomin 'Western'.

Hay sin embargo otros mtodos de

transferir o aplicar protenas sobre una

membrana. El ms sencillo es aplicarlas

directamente en forma de una pequea

gota de una solucin concentrada sobre

la membrana. La absorcin de la gota

provoca la adhesin de la protena a la

membrana, quedando en forma de una

mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'.

Existen dispositivos que facilitan la

aplicacin de las protenas directamente

a la membrana, aplicando una succin

que facilita la penetracin de la solucin,

y reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot

blot' en funcin de que la protena quede

aplicada en forma de una gota circular o

de una lnea.

Tipos

ASO dot blot

Esta tcnica, cuyas siglas ASO vienen

del ingls Allele Specific

Oligonucleotides, constituye una de las

metodologas que aplican la estrategia

dot blot, es decir, la deposicin de

muestras con las molculas de inters

sobre una membrana para,

posteriormente, revelar los resultados de

presencia o ausencia de los elementos de

estudio mediante marcaje con sondas

dirigidas contra dichos elementos.

Este mtodo consiste en amplificar el

ADN de inters (por PCR) por ejemplo)

y fijarlo directamente a la membrana de

trabajo (por ejemplo con irradiacin

UV), para luego aadir oligonucletidos

de unas 20 pb especficos del alelo que

quiere detectarse. Estos oligos son

marcados previamente con

radiactividad, fluorforos o cualquier

otro tipo de marcaje. Tras la hibridacin,

se obtienen los resultados detectando el

marcaje utilizado.

Una aplicacin directa de este protocolo

es la deteccin de mutaciones, de manera

que se fija una fila de muestras, cada una

correspondiente a un individuo diferente,

del cual se ha amplificado la regin de

ADN que puede o no contener la

mutacin. Primeramente se hibridan las

muestras con un oligo especfico de uno

de los alelos (el silvestre o normal, por

ejemplo) y se revela el resultado. A

continuacin, se lava la sonda y se aade

una nueva, especfica del otro alelo (el

alelo mutado, por ejemplo). Aquellos

individuos que dieran positivo para las

dos hibridaciones seran heterocigotos

para la mutacin (poseen un alelo normal

y el otro mutado), mientras que aquellos

que solamente presentasen hibridacin

en uno de los casos seran homocigotos

para ese caso (para el alelo silvestre o el

mutado).

En este ejemplo el individuo 1 sera

heterocigoto para dicho gen

(presenta los dos alelos, silvestre y

mutante), el individuo 2 sera

homocigoto para el alelo silvestre o

wild type, el 3 homocigoto para el

mutante, y as sucesivamente con los

restantes.

ASO dot blot inverso

Se basa en el mismo procedimiento

metodolgico que en el ASO dot

blot, con la salvedad de que son los

alelos las molculas fijadas a la

membrana, mientras que el ADN del

paciente o individuo a estudio es el

que hace las veces de sonda.

Normalmente se establecen dos filas

de muestras, cada una con distintas

variantes allicas normales o

mutantes (cada columna equivale a

un alelo en su versin normal o

mutada). Y sobre dichas muestras se

aplica el ADN marcado del individuo

a estudio. As, se averigua qu alelos

presenta en homocigosis o en

heterocigosis y si ello determinar el

desarrollo de cierta enfermedad.

El paciente del ejemplo presenta las

dos versiones del alelo 1 (luego es

heterocigoto para dicho gen),

solamente posee la variante normal

del alelo 2, de forma que es

homocigoto para este caso (o bien

presenta una delecin en uno de los

cromosomas de dicha regin de

ADN), es homocigoto para el alelo 3

en su variante mutada, homicigoto

para la versin normal de los alelos 4

y 5, etc.

Cuantificacin del ADN mediante

espectrofotometra

El ADN, el ARN, los

oligonucletidos e incluso los

mononucletidos pueden

cuantificarse directamente en

soluciones acuosas, en forma diluida

o sin diluir, midiendo la absorbancia

A (o densidad ptica, DO) de luz

ultravioleta (tambin puede hacerse

en el intervalo visible). Si la muestra

es pura, es decir, no contiene

cantidades significativas de

contaminantes como protenas, fenol

o agarosa, la medicin

espectrofotomtrica de la irradiacin

ultravioleta absorbida por las bases

es sencilla y exacta. En este mtodo,

los tampones acuosos con escasa

concentracin inica (por ejemplo,

tampn TE) resultan idneos. La

concentracin de cidos nucleicos

suele determinarse midiendo a 260

nm y comparando con un blanco. La

interferencia de contaminantes puede

determinarse calculando un

cociente. Dado que las protenas

absorben a 280 nm, se emplea el

cociente A260/A280 para calcular la

pureza de los cidos nucleicos. Los

cocientes respectivos del ADN y el

ARN puros son aproximadamente de

1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm

significa que la muestra est

contaminada con hidratos de

carbono, pptidos, fenoles,

compuestos aromticos u otras

sustancias. El cociente A260/A230

de las muestras puras es de 2,2

aproximadamente. Cuando la

cantidad disponible de cidos

nucleicos es escasa, puede emplearse

el mtodo de la placa de agarosa con

bromuro de etidio. Permite calcular

la cantidad de cidos nucleicos a

partir de la intensidad de la

fluorescencia emitida por el bromuro

de etidio irradiado con luz UV,

comparndola con unos patrones de

concentracin.

El espectrofotmetro se funda en la

transmisin de la luz a travs de una

solucin para determinar la

concentracin de un soluto presente

en la misma. El aparato funciona

conforme a un principio sencillo: se

irradia una muestra con una

radiacin luminosa de longitud de

onda conocida y se mide la energa

luminosa transmitida con una clula

fotoelctrica situada detrs de la

muestra.

Reaccin en cadena de la Polimerasa

La invencin de la reaccin en cadena de

la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus

colaboradores en 1985 ha revolucionado

la biologa molecular y la medicina

molecular (Saiki et al., 1985). La

reaccin en cadena de la polimerasa es

una tcnica in vitro utilizada para

amplificar enzimticamente una regin

determinada de ADN situada entre dos

regiones de ADN cuya secuencia se

conoce. Mientras que antes solo podan

obtenerse cantidades mnimas de un gen

especfico, ahora incluso un nico

ejemplar de un gen puede amplificarse

con la PCR hasta un milln de

ejemplares en tan solo unas pocas horas.

Las tcnicas de PCR se han hecho

indispensables para muchos

procedimientos comunes, como la

clonacin de fragmentos especficos de

ADN, la deteccin e identificacin de

genes para diagnstico y medicina legal,

y en la investigacin de modelos de

expresin de los genes. Ms

recientemente, la PCR ha permitido la

investigacin de nuevos campos, como

el control de la autenticidad de los

alimentos, la presencia de ADN

modificado genticamente y la

contaminacin microbiolgica. Para

comprender los principios de la PCR y

sus aplicaciones, debe atenderse en

primer lugar a la naturaleza de la

molcula del ADN, por lo que en la

seccin siguiente se describen la

estructura y la replicacin del ADN.

La PCR se basa en el mecanismo de la

replicacin in vivo del ADN: el ADN

bicatenario se desenrolla y pasa a ADN

monocatenario, se duplica y se vuelve a

enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos

repetitivos de: desnaturalizacin del

ADN por fusin a temperatura elevada, a

fin de convertir el ADN bicatenario en

ADN monocatenario; unin

(anillamiento) de dos oligonucletidos,

utilizados como cebadores, al ADN

diana; extensin de la cadena de ADN

por adicin de nucletidos a partir de los

cebadores utilizando ADN polimerasa

como catalizador, en presencia de iones

Mg2+.

Factores contaminantes en el ADN

Agentes de tipo qumico, como

algunas sustancias del humo del

cigarrillo, drogas y componentes

vegetales.

Agentes de tipo biolgico, como

ciertos virus que afectan al

material gentico de la clula a la

que parasitan.

Agentes nutricionales y metablicos.

Reacciones de autoinmunidad.

Factores asociados a la edad materna.

Agentes de tipo fsico, como las radiaciones alfa, beta, gamma, X,

ultravioleta, etc. Los cuales

producen rupturas o lesiones

cromosmicas.

La radiacin UV tiene un efecto letal y

mutagnico, que depende de su longitud de

onda. Ello se debe a la absorcin selectiva de

longitudes de onda por parte de ciertas

molculas biolgicas; por ejemplo:

Las protenas tienen dos picos (es

decir, mximos) de absorcin: uno a

280 nm, debido a los aminocidos

aromticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230

nm, debido a los enlaces peptdicos.

El ADN y el ARN absorben a 260 nm,

debido al enlace doble entre las

posiciones 4 y 5 de las bases pricas y

pirimidnicas.

Por su parte Los rayos UV no tienen

actividad ionizante, pero provocan cambios

qumicos en las molculas absorbentes, de

modo que aparecen molculas alteradas

denominadas genricamente fotoproductos.

Los fotoproductos originan la inactivacin

de macromolculas

Los efectos biolgicos de una exposicin a

la radiacin que ms preocupan son un

posible de dao gentico y el cncer. Los

estudios cientficos han mostrado que estos

efectos son poco probables y aparecen varios

aos despus de ocurrida la exposicin. En

el caso de dao gentico en seres humanos,

no se ha demostrado ningn caso de

enfermedad hereditaria causada por una

exposicin a la radiacin. Por el contrario, en

casos de cncer se ha comprobado la

aparicin de ciertos tipos de esta

enfermedad, algunos aos despus de la

irradiacin con dosis altas, superiores a los

100 rads.

EFECTOS GENTICOS

Los efectos genticos de cualquier agente

externo que acte sobre una clula son el

producto de las alteraciones (mutaciones)

que el agente pueda causar en el ADN de las

clulas reproductivas del individuo,

espermatozoides u vulos. Los

descendientes de este individuo son

portadores de la mutacin y pueden sufrir las

consecuencias de sta e incluso trasmitirla a

sus propios hijos,

Diversos estudios experimentales que

utilizan sistemas biolgicos de prueba como

bacterias, roedores y cultivos de clulas

humanas, han demostrado que la radiacin,

las sustancias qumicas y los virus, son

posibles agentes mutagnicos, es decir,

causantes de mutaciones. Con respecto a las

mutaciones reproductivas (mutaciones que

ocurren en el vulo o el espermatozoide), la

evidencia cientfica se limita a los estudios

en roedores, en los que se han medido la

induccin de muerte fetal, las alteraciones en

el color del pelo, en el esqueleto, en la

estructura de los ojos y en los cromosomas

de la descendencia.

Los agentes conocidos capaces de producir

estos efectos son algunas sustancias

qumicas de uso poco frecuente (por

ejemplo, el metil-metano-sulfonato) y la

radiacin. La induccin de estos efectos es

tan poco probable que para poderlos

cuantificar, se requiere exponer a miles de

animales al agente mutagnico estudiado.

La irradiacin del organismo es otra causal

de anomalas cromosmicas.

Experimentalmente, se han irradiado clulas

in vitro durante la etapa G1 del ciclo y las

mismas han desarrollado anomalas al llegar

a la fase M, es decir, cuando se dividen. Se

supone que estas anomalas reflejan

alteraciones fsico-qumicas en los

cromosomas, que impediran su separacin

normal durante la mitosis.

ACCION UV-B en plantas

El ADN es particularmente sensible a

radiacin UV-B, debido a que los fotones del

tipo ultravioleta promueven transiciones P-

P* en las bases nitrogenadas que constituyen

los nucletidos alterando directamente el

establecimiento normal de enlaces qumicos

(95). La fototransformacin producida en el

ADN afecta principalmente a bases de

timina adyacentes, las que por efecto de la

radiacin UV-B forman estructuras cclicas

denominadas dmeros de pirimidina

ciclobutano (CPDs)

Bajo condiciones de radiacin UV-B no slo

se observan lesiones en el ADN del tipo

CPDs, tambin esta radiacin induce la

formacin de otros fotoproductos

denominados dmeros de pirimidina

pirimidona (6-4 PPs) entre bases adyacentes

de timina y citosina y en el caso del RNA

dmeros de uracilo (97).

Del total de las lesiones provocadas por la

radiacin UV-B sobre el ADN, el 75%

corresponde a los CPDs y el resto a

fotoproductos de pirimidina (6-4)

pirimidona (98). Ambos tipos de dmeros

alteran los procesos de transcripcin de

genes y de duplicacin del ADN, debido a

que tanto la Efecto de la radiacin

ultravioleta-B en plantas 67 ADN

polimerasa como la ARN polimerasa no son

capaces de leer la hebra de ADN a travs de

estos fotoproductos (99, 100). Por tal

motivo, la eliminacin de los CPDs y 6-4

PPs resulta esencial para la supervivencia de

las distintas especies afectadas por este tipo

de dao (99)

Niveles de plomo y dao en el ADN en

nios con trastornos del espectro autista

Los trastornos del espectro autista (TEA) se

consideran una familia de alteraciones del

neurodesarrollo caracterizadas por

dificultades en la comunicacin, en la

interaccin social, en la atencin, en los

trastornos cognitivos y en los defectos en el

aprendizaje, en la investigacin se tomaron

15 nios (11 varones y 4 nias) entre 4 y 11

aos de edad que sufran de un trastorno

espectro autista primario procedentes de la

consulta de psiquiatra del hospital

Peditrico del Cerro en la Habana, Cuba.

Fue evaluado el coeficiente de inteligencia

de acorde con la prueba Terman-Merrill; los

nios fueron clasificados segn el grado de

severidad, en dos grupos: trastornos ligeros

y moderados/severos. Los niveles de plomo

fueron determinados en 1mL de sangre total

por el mtodo de espectrofotometra de

absorcin atmica con horno de grafito por

correcion Zeeman.

El dao del ADN fue estimado por el ensayo

cometa (electroforesis alcalina de clulas

individuales de leucocitos de sangre

perifrica). Aislando linfocitos en una

muestra de sangre total (control negativo),

que se utiliz en una corrida electrofortica

junto a los linfocitos de los pacientes.

En los resultados obtenidos no se mostr

diferencia significativa de los niveles de

plomo entre los dos grupos. El dao del

ADN fue mayor en los pacientes autistas en

relacin con el grupo control, cuya

diferencia fue significativa (p < 0.05 ),

cuando comparamos los grupos teniendo en

cuenta la severidad del retardo mental. Los

pacientes con trastorno moderado/severo

mostraron un dao en el ADN

significativamente superior a los que

mostraron un trastorno ligero o del grupo de

control. Con esto se confirmo la presencia de

dao del ADN en pacientes con trastorno del

espectro autista, lo cual suguiere que esto

pudiera ser un factor que se relaciona con la

severidad del retardo mental en los

enfermos.

CONCLUSIONES

El ADN es particularmente sensible a

radiacin UV-B, debido a que los fotones del

tipo ultravioleta promueven transiciones P-

P* en las bases nitrogenadas que

constituyen los nucletidos alterando

directamente el establecimiento normal de

enlaces qumicos (95). La

fototransformacin producida en el ADN

afecta principalmente a bases de timina

adyacentes, las que por efecto de la

radiacin UV-B forman estructuras cclicas

denominadas dmeros de pirimidina

ciclobutano (CPDs)

Uno de las razones por la que se ocasiona

contaminacin en el ADN, tiene que ver con

las tcnicas de laboratorio empleadas;

haciendo hincapi en conocimiento previo

de algunas tcnicas de laboratorio. Por

ejemplo tener condiciones de esterilidad

mayores de las habituales en un laboratorio

a la hora de aplicar tcnicas de biologa

molecular; como Northern Blot y southern

Blot. Ya que se presentan agentes

contaminantes en el ambiente o

endgenos, como ARNasas.

La mutanognesis es un proceso en el cual

se evidencia la formacin de aductos, estos

aductos son compuestos premutagenicos

que dependiendo de la cantidad y

capacidad que tenga, puede o no provocar

una mutacin en gran medida, y

dependiendo del organismo puede

ocasionar cambios tanto fsicos como

metablicos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

-Niveles de plomo y dao en el ADN en

nios con trastornos del espectro autista

Artculo consultado el 111 de mayo de 2015

desde:file:///C:/Users/vega/Downloads/co

ntaminacion-de-adn%20(1).pdf

-Efectos De Los Contaminantes Txicos.

Consultado el 10 de abril del 2015 desde:

http://www4.tecnun.es/asignaturas/Ecologia

/Hipertexto/09ProdQui/140EfToxic.html

-Jos Bello Gutirrez, Adela Lpez de

Cerain Salsamendi (2007) fundamento

de ciencia toxicolgica. EDITORIAL

REVERTE.

-usubel FM, Brent R, Kingston RE,

Moore DD, Seidman JG, Smith JA,

Struhl K (eds) (2005): Current

Protocols in Molecular Biology. Vols 1

a 4. New York: Greene & John Wiley

(New York). Manual de protocolos. La

nueva Biblia del Bilogo Molecular

actualizada trimestralmente

-Chen, W, Kuo T (1993): A simple and

rapid method for the preparation of

gramnegative bacterial genomic DNA.

Nucleic Acids Res 21: 2260.

Biologa y ciencias de la tierra.

Consultado el 10 de mayo del 2015

desde:https://cienciadelatierra.wordpres

s.com/especiales/virus/capsides-viricas/