CENTRO AGRONMICO TROPICAL DE INVESTIGACIN Y ENSEANZA

CATIE

PROGRAMA DE EDUCACIN PARA EL DESARROLLO Y LA CONSERVACIN ESCUELA DE POSGRADO

EVALUACIN MORFOLGICA Y MOLECULAR DE LNEAS AVANZADAS DE MEJORAMIENTO GENTICO DE ARROZ (Oryza sativa) DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIN AGROPECUARIA DE PANAM, (IDIAP).

Tesis sometida a consideracin de la Escuela de Posgrado, Programa de Educacin para el Desarrollo y la Conservacin del Centro Agronmico Tropical de Investigacin y Enseanza como requisito parcial para optar por el grado de:

Magster Scientiae

Por: EVELYN ITZEL QUIRS McINTIRE

Turrialba, Costa Rica 2003

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Esta tesis fue aceptada en su presente forma por la Escuela de Posgraduados, el Programa de Educacin para el Desarrollo y la Conservacin y aprobada por el Comit Consejero del Estudiante, como requisito parcial para optar al grado de: MAGISTER SCIENTIAE . FIRMANTES: _______________________________________ Carlos Astorga Domian, MSc Consejero Principal

___________________________________ Andreas W. Ebert, Ph. D MiembroComit Consejero

_______________________________________ Ismael Camargo B., Ph. D Miembro Comit Consejero

___________________________________________ Nelly Vsquez Morera, MSc Miembro Comit Consejero

_____________________________Glenn Galloway, Ph. D Decano de la Escuela de Posgraduados

________________________________ Director del Programa de Investigacin.

___________________________ Evelyn Itzel Quirs McIntire Candidato

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DEDICATORIA

Con gran amor a mi hijo, Kennet David que es la inspiracin de mis das

Con cario a mi hermana, Charollette por su compaa y apoyo incondicional en todo momento Con amor a mi madre, Evelyn McIntire el mejor ejemplo de superacin

A todo ser humano que se supera a base de sacrificios....

iii 3

AGRADECIMIENTO

Mi sincero agradecimiento a las siguientes personas: En primer lugar a Dios Todopoderoso, por darme la fortaleza y gua. Al Magister Scientiae Carlos Astorga, mi profesor consejero en CATIE, por su gua, por su amistad y colaboracin . Muchas gracias. Al Doctor Andreas W. Ebert, por sus valiosas sugerencias, observaciones y su confianza. Al Doctor Ismael Camargo B., por su confianza, su apoyo en el seguimiento de campo y laboratorio en Panam y amistad. Al Magister Scientiae Nelly Vsquez Morera, por su apoyo incondicional, por su confianza y amistad. Al Magister Scientiae Carmen Yvonne Bieberach, por su colaboracin, sus palabras alentadoras y observaciones. Al Ing. Olman Quirz, por el apoyo brindado en el Laboratorio de Biologa Molecular del CATIE. Al Tcnico Gabriel Montero, por su colaboracin brindada en el Laboratorio de Semillas del CIARG, IDIAP , Panam. A mis colegas del Sub-centro del IDIAP en Penonom, Panam, Manuel Rojas, Fernando Fernndez, Yariela Cedeo. Agradezco a mi hermana, Charollette Quirs , cuya colaboracin fue de asistirme durante el trabajo de campo y laboratorio en Panam. A mis compaeros en CATIE, Alexis Quirz, Esteban Ruz, Anabella Meneses, Mara del Pilar, Paola Solera, Sara Yalle, Manuel Mollinedo y esposa, Octavio Galvn , Walter Robledo y esposa, por su amistad, colaboracin y porque no, a sus chistes.

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BIOGRAFIA

La autora naci en Penonom, Provincia de Cocl, Panam; realiz estudios primarios en la Escuela Simen Conte y secundarios en la Escuela Secundaria ngel Mara Herrera de su cuidad natal. En 1993 se recibi como Ingeniero en Desarrollo Agropecuario, titulo otorgado por la Universidad de Panam, en la Facultad de Ciencias Agropecuarias, David, Chiriqu. En 1997, curso estudios de Profesorado en Educacin Media, en el Centro Regional Universitario de Cocl. Entre 1996 y 2002 se desempe como investigador agrcola y productor de semillas de arroz y hortalizas, en el Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Panam (IDIAP), con sede en el Centro de Investigacin Agropecuaria y de Recursos Genticos (CIARG). En enero de 2002, ingreso al Programa de maestra del Centro Agronmico Tropical de Investigacin y Enseanza (CATIE), en Turrialba, Costa Rica y egresa en diciembre de 2003 como Magister Scientiae en el rea de Agricultura Ecolgica con nfasis en Recursos Fitogenticos.

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TABLA DE CONTENIDO Pag. CONTENIDO........................................................................................................................ LISTA DE CUADROS.......................................................................................................... LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ LISTA DE ANEXOS............................................................................................................. RESUMEN. SUMMARY.... 1. 1.1. 1.2. 1.3. 1.3.1. 1.3.2. 1.4. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8. 2.8.1. 2.8.2. 2.9. 2.9.1. 2.9.2. 2.10. INTRODUCCIN................................................................................................ Definicin del problema...................................................................................... Importancia de la investigacin.......................................................................... Objetivos............................................................................................................. Objetivo general................................................................................................. Objetivos especficos......................................................................................... Hiptesis............................................................................................................. REVISIN DE LITERATURA............................................................................ Origen y distribucin geogrfica del gnero Oryza............................................ Descripcin morfolgica y fisiolgica................................................................. Etapas del cultivo............................................................................................... Germoplasma de arroz....................................................................................... Mejoramiento gentico del arroz en Centroamrica.......................................... Importancia del mejoramiento gentico en Panam.......................................... Descripcin varietal........................................................................................... Caracterizacin morfolgica............................................................................... Marcadores morfolgicos................................................................................... Componentes de rendimiento............................................................................ Caracterizacin molecular.................................................................................. Marcadores moleculares.................................................................................... Descripcin de la tcnica de AFLPs................................................................... Mtodos estadsticos multivariados aplicados a la biologa molecular.............. vi ix x xii xiv xv

1 2 3 3 3 3 4 5 5 5 7 8 8 9 11 13 13 14 15 16 18 21

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3. 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. 3.1.5.1. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6. 4. 4.1 4.1.1. 4.1.2. 4.1.2.1. 4.1.2.2 4.2. 4.3. 4.3.1. 4.3.1.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.4. 4.5.

MATERIALES Y MTODOS.............................................................................. Etapa de campo................................................................................................. Ubicacin............................................................................................................ Material experimental......................................................................................... Semillero, trasplante y manejo agronmico....................................................... Evaluacin de las caractersticas morfolgicas y rendimiento........................... Anlisis estadsticos........................................................................................... Anlisis de los datos cuantitativos y cualitativos................................................. Etapa de laboratorio............................................................................................ Ubicacin............................................................................................................. Material experimental y mtodos........................................................................ Extraccin de ADN.............................................................................................. Determinacin de la concentracin de ADN....................................................... Amplificacin de los fragmentos de ADN............................................................ Anlisis estadsticos............................................................................................ RESULTADOS.................................................................................................... Caracterizacin morfolgica................................................................................ Distribucin porcentajes por lnea de las caractersticas cualitativas................. Anlisis de las caractersticas morfolgicas cuantitativas................................... Anlisis de varianzas de los rendimientos.......................................................... Calidad molinera y temperatura de gelatinizacin.............................................. Estructuras de los agrupamientos....................................................................... Caracterizacin molecular con marcadores AFLP.............................................. Resultados de aislamientos y concentracin de ADN........................................ Descripcin del polimorfismo revelado................................................................ Matrz de distancia y dendogramas.................................................................... Componentes principales.................................................................................... Comparacin de la variabilidad detectada a partir de caractersticas morfolgicas y marcadores moleculares............................................................. Descripcin morfolgica y molecular de lneas promisorias y progenitores.......

22 22 22 22 22 24 26 27 27 27 28 28 28 28 30

32 32 32 38 40 41 42 43 48 49 49 51 52 54 57

4.1.2.1.1 Comparaciones de medias..................................................................................

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5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 6. 7. 8. 9.

DISCUSIN........................................................................................................... Variabilidad en caractersticas cualitativas............................................................ Variabilidad en caractersticas cuantitativas......................................................... Variabilidad gentica molecular............................................................................ Comparacin entre los marcadores morfolgicos y moleculares.......................... Variabilidad gentica entre lneas promisorias y progenitores.............................. CONCLUSIONES.................................................................................................. RECOMENDACIONES.......................................................................................... BIBLIOGRAFA..................................................................................................... ANEXOS................................................................................................................

61 61 65 75 76 77 79 81 82 91

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LISTA DE CUADROS Cuadro

Pg. Anlisis de varianza para la caracterstica de rendimiento en kg/ha de 48 lneas, 5 progenitores y 4 variedades testigos de arroz....................................... Promedio del rendimiento en kg/ha de 57 lneas de arroz del proyecto de mejoramiento gentico de arroz del IDIAP, Panam............................................ Matriz de valores y vectores propios, proporcin absoluta y acumulada que explican el anlisis de los componentes principales............................................ Contribucin de las variables en los componentes principales (C1, C2, C3, C4 y C5)..................................................................................................................... Distribucin de la frecuencia y porcentajes de los grupos de acuerdo al anlisis de varianza mnima de Ward (1967)....................................................... Combinaciones enzima-primer utilizadas, promedio de bandas amplificadas, nmero de bandas polimrficas, porcentaje de polimorfismo y rango de amplificacin......................................................................................................... Matriz de similaridad de 5 lneas avanzadas de mejoramiento de arroz, 5 progenitores y 2 variedades testigos, generada a partir de datos moleculares por el ndice de Jaccard....................................................................................... Matriz de valores y vectores propios, proporcin absoluta y acumulada que explican el anlisis de los componentes principales , de 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos, segn datos moleculares.......................... Matriz de valores y vectores propios, proporcin absoluta y la acumulada que explican el anlisis de los componentes principales , de 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos, segn datos morfolgicos........................ Distribucin de la frecuencia y porcentajes de los grupos de acuerdo al anlisis de varianza mnima de Ward (1967), de 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos de arroz.............................................................................. Matriz de similaridad de 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos arroz, generada a partir de datos morfolgicos por el coeficiente de Gower................................................................................................................... Matriz generada de los datos morfolgicos y datos moleculares sobrepuestas.. 41 42 44 45 45

1 2 3 4 5 6

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56 60

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LISTA DE FIGURASFigura

Pag. Etapas de crecimiento de la planta de arroz...................................................... A. Tratamiento de semillas, B. Semillero en bandejas, C. Trasplante manual, una planta por sitio, D. Parcela con lmina de agua durante todo el ciclo de las plantas........................................................................................................... A. Etiquetado de plantas, B. Registro de altura de planta, C. Medidas en hoja bandera y pancula, D. Secado al sol de grano cosechado, para estimar rendimiento en kg/ha.......................................................................................... A. Rendimiento de molinera: (1) muestra descascarada, (2) muestra de granos pulidos, B. Escala visual de clasificacin para centro blanco del grano................................................................................................................... A. Prueba alcalina con 10 cc de la solucin de KOH al 1.7%, B. Grados de dispersin alcalina (1) temperatura de gelatinizacin baja, (2) temperatura de gelatinizacin alta, (3) temperatura de gelatinizacin intermedia....................... Diseo de la parcela experimental en la etapa de campo.................................. Escala de graduacin para clasificar el hbito de crecimiento de la planta de arroz.................................................................................................................... Escala de graduacin para registrar la caracterstica, posicin de la hoja bandera............................................................................................................... Escala de graduacin para clasificar la forma de la lgula en la hoja de arroz... Esquema de la posicin de la aurcula y lgula en la planta de arroz................. Escala de graduacin para clasificar la caracterstica, densidad de la pancula Escala de graduacin para clasificar la caracters tica, exercin de la pancula de la planta de arroz........................................................................................... Escala de graduacin para registrar la caracterstica, ngulo del pice que forman la lema y la plea en la espiguilla........................................................... Esquema de la semilla de arroz: a) vista frontal; b) vista lateral, para registrar las caractersticas de longitud y ancho de la semilla.......................................... Dendograma de clasificacin de 48 lneas, 5 progenitores y 4 variedades testigos por mtodo de varianza mnima de Ward de las variables cualitativas y cuantitativas..................................................................................................... Amplificacin de las combinaciones enzima-primers EACT/MCAC, EACG/MCAC, EACC/MCAA, EACA/MCAT, en gel de poliacrilamida al 6% con tincin de Nitrato de Plata (AgNO 3)............................................................ x 7

1 2

23

3

24

4

25

5

26 27 32

6 7

8 9 10 11 12 13 14 15

33 34 35 36 37 38 40

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Figura

Pag. WPGMA dendograma del agrupamiento de 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos del proyecto de mejoramiento gentico de arroz de Panam, segn la matriz de distancia y similitud de Jaccard............................................................................................................... Proyeccin de 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos del proyecto de mejoramiento gentico de arroz d IDIAP, por el anlisis de el componentes principales................................................................................... 53 Dendograma de agrupamiento de 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos del proyecto de mejoramiento gentico de arroz del IDIAP por caractersticas morfolgicas..............................................................

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LISTAS DE ANEXOS Anexo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Lneas avanzadas de mejoramiento gentico de arroz (Oryza sativa), generacin y cruces utilizados para la caracterizacin morfolgica.......................................... Progenitores del programa de mejoramiento gentico de arroz (Oryza sativa) del IDIAP, Panam....................................................................................................... Descriptores cualitativos utilizados en el ensayo de caracterizacin morfolgica.. Descriptores cuantitativos utilizados en el ensayo de caracterizacin morfolgica............................................................................................................ Clasificacin de granos en calidad molinera........................................................... Escala de clasificacin utilizada para evaluar centro blanco.................................. Escala de clasificacin para la dispersn alcalina y su relacin con la estimacin de la temperatura de gelatinizacin........................................................................ Protocolo de extraccin de ADN para arroz........................................................... Preparacin de gel de Agarosa.............................................................................. Preparacin de gel de Polyacrilamida..................................................................... Limpieza y preparacin de vidrios.......................................................................... Preparacin de la cmara de electroforesis, desnaturalizacin y revelado del gel de polyacrilamida.................................................................................................... Pg.

91 92 93 96 97 97 98 99 100 100 101 103

Distribucin de los porcentajes por lnea de arroz de las caractersticas cualitativas............................................................................................................. 106 Valores mnimos, mximos, promedio, desviacin estndar (Des.Est) y coeficiente de variacin (C.V.) de los das a floracin de las 57 lneas de arroz........................................................................................................................ 122 Valores mnimos, mximos, promedio, desviacin estndar (Des.Est) y coeficiente de variacin (C.V.) de la longitud de la lmina de la hoja bandera de las 57 lneas de arroz.............................................................................................. 123 Valores mnimos, mximos, promedio, desviacin estndar (Des.Est.) y coeficiente de variacin (C.V.) del ancho de la lmina de la hoja bandera de las 57 lneas de arroz................................................................................................... 124 Valores mnimos, mximos, promedio, desviacin estndar (Des.Est.) y coeficiente de variacin (C.V.) de la longitud de la lmina foliar de las 57 lneas de arroz................................................................................................................... 125 Valores mnimos, mximos, promedio, desviacin estndar (Des.Est.) y coeficiente de variacin (C.V.) del ancho de la lmina foliar de las 57 lneas de arroz....................................................................................................................... 126

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QUIROS McINTIRE, E.I. 2003. Evaluacin morfolgica y molecular de lneas avanzadas de mejoramiento gentico de arroz (Oryza sativa) del Instituto de Investigacin Agropecuaria de Panam, (IDIAP). Palabras claves: Oryza sativa, lneas avanzadas, caractersticas cualitativas y cuantitativas, rendimiento, centro blanco, temperatura de gelatinizacin, marcadores moleculares, AFLPs, variabilidad gentica, mejoramiento gentico.RESUMEN

El objetivo de la investigacin fue determinar la variabilidad gentica presente en lneas avanzadas de arroz, progenitores y variedades comerciales del proyecto de mejoramiento gentico de arroz del IDIAP, a travs de la caracterizacin morfolgica, utilizando descriptores fenotpicos, y molecular mediante el uso de marcadores moleculares. La investigacin, consisti de dos etapas, una de campo realizada en el IDIAP, Penonom, Cocl, Panam y la otra de laboratorio que se realiz en el CATIE, Turrialba, Cartago, Costa Rica. En el IDIAP se evaluaron 48 lneas avanzadas de arroz (Oryza sativa), 5 progenitores y 4 variedades comerciales del programa de mejoramiento gentico. Las evaluaciones morfolgicas se basaron en 28 caractersticas cualitativas, 10 cuantitativas, rendimiento en kg/ha, y otras como rendimiento de molinera, evaluacin del centro blanco y temperatura de gelatinizacin del grano. Para el anlisis de laboratorio se utilizaron 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 variedades testigos analizados a travs de la tcnica molecular AFLPs, con 8 combinaciones enzima-primer con reactivos de Starter Primer Kit (INVITROGEN). La extraccin de ADN se realiz a partir de hojas liofilizadas utilizando el protocolo de extraccin CTAB minipreparaciones, seguido de la digestin, ligacin, preamplificacin, amplificacin selectiva y revelado en gel de polyacrilamida con tincin de nitrato de plata. Las evaluaciones realizadas permitieron demostrar que ciertas caractersticas como el ciclo fenolgico de la planta, la arquitectura como, la altura de la planta, el ancho de la lmina foliar y la fertilidad de la pancula explican el 31.08% de la variabilidad observada en las lneas de arroz estudiadas. Las caractersticas morfolgicas permitieron clasificar a las lneas de arroz en 4 grupos, a travs del agrupamiento de Ward, con tendencia a agrupar de acuerdo a su procedencia, a excepcin de la lnea 6. Las lneas de arroz que presentaron los mejores rendimientos fueron las lneas ms avanzadas del proyecto de mejoramiento, Chi 4523, IDIAP 22 y Chi 3210, superando los rendimientos de sus progenitores y variedades testigos. Las evaluaciones de rendimiento de molinera y calidad de grano reflejaron que las lneas con denominacin FLAR y Chi, presentan las mejores caractersticas. En este estudio la tcnica AFLPs gener un 44% de polimorfismo y 22.12 bandas polimrficas promedio por combinacin, en este estudio. La variabilidad observada mediante la caracterizacin molecular permiti establecer diferencias entre los 12 genotipos estudiados. Los progenitores Anayansi L2 y Surinam 70, presentaron la mayor semejanza gentica de 0.838. La prueba de Mantel permiti determinar la baja correlacin entre los datos morfolgicos y moleculares. Las comparaciones realizadas entre los cultivares prximos a registro y sus progenitores, indican que existen caractersticas propias de cada lnea que establecen diferencias con respecto a sus progenitores. Las distancias genticas a nivel molecular presentaron valores bajos. El uso de descriptores morfolgicos y marcadores moleculares AFLPs, permiti determinar la variabilidad gentica presente en 48 lneas avanzadas de arroz, 5 progenitores y 4 variedades comerciales del proyecto de mejoramiento gentico de arroz del IDIAP.

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QUIROS McINTIRE, E.I. 2003. Morphological and molecular evaluation of advanced breeding lines of rice (Oryza sativa) of the Institute of Agricultural Research of Panama, (IDIAP). Key words: Oryza sativa, advanced breeding lines, qualitative and quantitative characteristics, yield, grain translucency, gelatinisation temperature, molecular markers, AFLPs, genetic variability, genetic breeding.SUMMARY

The objective of this investigation was to determine the existing genetic variability in advanced rice breeding lines, progenies and commercial varieties of the rice breeding project of IDIAP through morphological and molecular characterization using phenotypic descriptors and molecular markers, respectively. The investigation consisted of two stages: one carried out in the field at the IDIAP Research Station in Penenome, Cocle, Panama, the other one in the Molecular Biology Lab of CATIE in Turrialba, Cartago, Costa Rica. The field work focused on the evaluation of 48 advanced breeding lines, five progenies and four commercial varieties obtained through the rice breeding program of IDIAP. The morphological evaluations were based on 28 qualitative characteristics and 10 quantitative ones, among those: yield in kg/ha, milling quality, grain translucency and gelatinisation temperature of the grain. The laboratory work was undertaken with five advanced breeding lines, five progenies and two varieties, which serves as control. The analyses were carried out with the molecular technique AFLPs using 8 enzyme-primer combinations with reagents of the Starter Primer Kit (INVITROGEN). DNA was extracted from lyophilised leaves using the extraction protocol CTAB mini-preparations, followed by digestion, ligation, selective pre-amplification, and development in polyacrylamid gel stained with silver nitrate. The evaluations allowed to conclude that certain characteristics, such as phenological cycle of the plant, plant architecture, plant height, width of the leaf lamina and the fertility of the inflorescence explain 31,08% of the variability observed in the studied rice lines. The morphological characteristics allowed to classify the lines into four groups, using the grouping method of Ward. With the exception of line 6, the grouping coincided with the origin of the lines. The rice lines, which presented the highest yield, were the most advanced lines of IDIAPs breeding project: Chi 4523, IDIAP 22 and Chi 3210, surpassing the yield of their progenies and the control varieties. The evaluations of the milling quality of the grain revealed that the lines with denomination Flar and Chi presented the best results. In this study, the AFLP technique generated 44% polymorphism and 22,12 polymorphic bands on average per combination. The variability observed by means of the molecular characterization allowed to establish differences between the 12 studied genotypes. The progenies Anayansi L2 and Surinam 70 presented the greatest genetic similarity of 0.838. The Mantel test indicated a low correlation between the morphological and molecular data. The comparisons made between the new cultivars, which are close to registration and their progenies indicated that each line has characteristics of its own, which establish differences with its progenies. The genetic distances at the molecular level, however, are low. The use of morphological descriptors and AFLP markers allowed to determine the existing genetic variability in 48 advanced lines of rice of IDIAPs breeding project, five progenies and four commercial varieties, which served as control.

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CENTRO AGRONMICO TROPICAL DE INVESTIGACIN Y ENSEANZA PROGRAMA DE EDUCACIN PARA EL DESARROLLO Y LA CONSERVACIN

ESCUELA DE POSGRADO

EVALUACIN MORFOLGICA Y MOLECULAR DE LNEAS AVANZADAS DE MEJORAMIENTO GENTICO DE ARROZ (Oryza sativa) DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIN AGROPECUARIA DE PANAM, (IDIAP).

Por: EVELYN ITZEL QUIRS McINTIRE

CATIE

Turrialba, Costa Rica 2003

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INTRODUCCIN

Los cereales constituyen el rengln alimenticio ms importante del mundo. El 50% de la base alimentaria de la poblacin mundial est compuesta por siete cultivos, como papa, maz, trigo, yuca, pltano, frijol y arroz. En conjunto, el arroz, maz y el trigo suministran el 50% de las caloras consumidas por la misma poblacin (Martnez y Weeraratne, 1982). Solo en los cultivos de papa, maz, trigo y arroz, se han hecho grandes inversiones en programas de mejoramiento gentico por sectores nacionales e internacionales (Alarcn et al., 1998). El objetivo principal de estos programas es incrementar el rea de cultivo para abastecer la demanda de la poblacin (Rosero, 1977). El arroz constituye uno de los principales renglones alimenticios en Amrica Latina; la tercera parte de las caloras consumidas provienen del arroz (Martnez y Weeraratne, 1982). El cultivo del arroz en Amrica Latina, est influenciado por los programas de mejoramiento gentico que buscan el desarrollo de variedades ms productivas para utilizarlas a nivel de explotaciones (Jennings et al., 1985). Lo anterior, debido a la gran diversidad de problemas como la uniformidad gentica que ha sido responsable de grandes reducciones en la produccin del cultivo como resultado de la aparicin de plagas y enfermedades que atacan el cultivo de arroz en los trpicos (Gonzlez et al., 1991). sto hace necesario que cada pas tenga programas nacionales de evaluacin de nuevas variedades, para la difusin de los materiales o variedades que presenten mejores caractersticas a los productores. Pero muchos de los pases cuentan con un pequeo capital humano y solo estaran en capacidad de adaptar materiales en estados avanzados de seleccin, mientras que otros pases con programas fuertes de investigacin pueden trabajar con materiales de generaciones de mejoramiento gentico tempranas (Posada, 1985). La capacidad de evaluacin del germoplasma mejorado conlleva a utilizar quizs una pequea porcin del germoplasma existente del arroz, como son los casos conocidos que muchas variedades liberadas sean utilizadas en ms de dos pases representando el rea de mayor produccin y que lneas avanzadas, provenientes de los mismos progenitores sean lanzadas como nuevas variedades en un mismo periodo de aos, solo con la nica diferencia del nombre comercial. A pesar que existen ms de 80,000 entradas de arroz (Oryza sativa) que se conservan en bancos de genes, los mejoradores estn interesados en usar solamente una fraccin pequea del

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germoplasma total, ya que existen programas de mejoramiento gentico de los pases para resolver problemas especficos de la produccin de arroz comercial (Guevara et al., 2001). 1.1. Definicin del problema El arroz representa uno de los componentes ms importantes de la canasta bsica de la poblacin panamea (Espinoza, 1977), presentando un consumo percpita de 72 kilogramos para el ao 2001 (FEDACPA, 2001). En Panam se siembran aproximadamente 89,000 hectreas por ao de arroz mecanizado, con una produccin de 224,300 tm. Esta actividad genera 60 millones de balboas, representando un aproximado de 2.3% del PIB agropecuario (MIDA, 2000). La globalizacin representa un desafo para los sistemas agropecuarios del pas, sin dejar de lado que puede representar una buena oportunidad para mejorar los niveles de competitividad del cultivo, en base principalmente a incrementos de la productividad y disminucin en los costos de produccin (IDIAP, 1998). El Instituto de Investigacin Agropecuaria de Panam (IDIAP) mediante la formulacin del Proyecto de investigacin y desarrollo para mejorar la competitividad del arroz en Panam, trata de elevar la productividad en el cultivo del arroz. Participa activamente en el intercambio de germoplasma a nivel nacional e internacional, con el fin de adquirir germoplasma que se usa en el desarrollo de nuevas variedades o para seleccionar lneas adaptadas a una determinada zona ecolgica (Bieberach y de Gonzlez, 1997). El programa de mejoramiento gentico de arroz hace nfasis en el desarrollo y liberacin de cultivares de arroz con resistencia a las principales plagas como Piricularia oryzae, Helminthosporium oryzae, con alto potencial de rendimiento y excelente calidad molinera y culinaria; adems, de buena adaptabilidad especfica para los sistemas de siembra de secano y riego (Camargo Buitrago, 2001). Como seala Shastry (1978), Amrica posee lugares o regiones agroecolgicas variables para el cultivo del arroz, pero la variabilidad gentica es baja. Con lo antes mencionado, existe la probabilidad que las lneas avanzadas y las variedades liberadas por el proyecto de mejoramiento gentico de arroz del IDIAP en Panam, provenientes del programa de cruzas nacionales que buscan nuevas recombinaciones de genes, estn fundamentadas en una base gentica muy estrecha por el nmero limitado de progenitores que son utilizados.

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1.2. Importancia de la investigacin

El IDIAP tiene como misin fortalecer la base agrotecnolgica nacional para contribuir a la seguridad alimentaria, la competitividad del agronegocio y la sostenibilidad de la agricultura, en beneficio de la Sociedad Panamea (IDIAP, 1998). Basados en esta misin institucional y en la importancia del cultivo del arroz, se ha establecido como uno de los productos finales esperados del Proyecto de investigacin y desarrollo, mejorar la competitividad del arroz en Panam, identificar y liberar los genotipos superiores, una vez demostrado que son diferentes, homogneos y estables (DHE) a travs de la definicin de descriptores fenotpicos y/o moleculares que permitan caracterizar e identificar con precisin cada nuevo cultivar liberado. Estas actividades de descripcin varietal de cultivares en proceso de registro, y de materiales sobresalientes con caractersticas deseables en e valuaciones previas (Martnez, 1997a), permitir multiplicarlos en categora gentica para utilizarla despus como progenie de la categora bsica. El proceso se lleva a cabo bajo la supervisin de un programa de mejoramiento y bajo la vigilancia del Comit Nacional de Semillas para que la pureza e identidad gentica sean preservadas (Quirs Mc, 1997). 1.3. Objetivos 1.3.1. Objetivo general

Determinar la variabilidad gentica presente en 48 lneas avanzadas de arroz, 5 progenitores y 4 variedades comerciales del proyecto de mejoramiento gentico de arroz del IDIAP, a travs de la caracterizacin morfolgica utilizando descriptores fenotpicos y moleculares mediante el uso de marcadores moleculares Fragmentos Amplificados de Longitud Polimorfica (AFLPs). 1.3.2. Objetivos especficos Determinar la variabilidad gentica de cuarenta y ocho lneas avanzadas del programa de mejoramiento gentico de arroz a travs de descriptores morfolgicos. Conocer el nivel de diversidad gentica de cinco lneas avanzadas, cinco progenitores y dos variedades comerciales utilizadas como testigos, a travs de marcadores moleculares Comparar la variabilidad gentica obtenida por los descriptores morfolgicos y los marcadores moleculares de ADN.

-

-

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-

Realizar la descripcin v arietal de tres cultivares en proceso de registro, mediante la caracterizacin morfolgica y molecular, utilizando como comparadores a sus progenitores.

1.4. Hiptesis

Existe variabilidad gentica entre las 48 lneas gentico de arroz del IDIAP.

avanzadas del proyecto de mejoramiento

Existen diferencias morfolgicas y moleculares entre los 3 cultivares prximos a registro y sus progenitores y las variedades comerciales testigos. Hay relacin entre la variabilidad gentica obtenida por los descriptores morfolgicos y los marcadores moleculares de ADN. Es posible determinar la variabilidad gentica de los 5 progenitores a travs de marcadores morfolgicos y moleculares. .

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2. REVISIN DE LITERATURA. 2.1. Origen y distribucin geogrfica del gnero Oryza El arroz (Oryza sativa L), pertenece a un grupo de plantas que componen la familia de las gramneas. Estudios botnicos realizados indican que prcticamente todas las plantas cultivadas del mundo civilizado tuvieron origen de formas primitivas silvestres. Carrasco Garca (1951) y Heinrichs (2001), mencionan que la mayora de los autores de historia antigua indican que el arroz es originario del sudeste de Asia y que la domesticacin ocurri alrededor de hace 10000 aos. Center (1976), aade a frica; otros afirman que tiene su origen en las cuencas de los ros Indo y Ganges; algunos aseguran que fue en China porque los especmenes de arroz encontrados datan de 3,000 aos antes de la era cristiana, los primeros escritos histricos chinos indican que de las cinco principales plantas alimenticias en el pas, el arroz fue la ms importante (Heinrichs, 2001). El gnero Oryza pertenece a la subfamilia Oryzoideae de la familia Poaceae (tradicionalmente se conoce como gramneas). Se cultiva en todas las reas tropicales y subtropicales del mundo y se adapta a un rango amplio de condiciones ambientales (Len, 2000). El arroz es cultivado en un rango de temperaturas medias entre 24 y 28C, desde los 53 latitud norte hasta 40 latitud sur, en zonas comprendidas entre 0 y 1,250 msnm, elevaciones altas tales como las terrazas arroceras en las montaas en las Filipinas, altiplanicies, los bajos anegados y elevaciones bajas hasta el nivel del mar (Heinrichs, 2001). La principal formacin ecolgica donde se cultiva este cereal, corresponde al bosque hmedo sub-tropical segn la clasificacin de Holdridge (Romero Medina, 1977). 2.2. Descripcin morfolgica y fisiolgica El arroz es una especie muy variable, se conocen cerca de 100,000 cultivares, por lo que sus caracteres morfolgicos generales son difciles de precisar (Len, 2000). La planta de arroz es una hierba anual con tallos redondos, huecos y con junturas, hojas bastante planas y una panoja terminal. Est adaptada para crecer en suelos inundados; pero se desarrolla muy bien en suelos secos no anegados (UNI, 1975). Las partes de la planta pueden dividirse en rganos vegetativos como los tallos, las hojas y las races; as como en rganos reproductivos, flores, espiguillas. Las races son de dos clases, las

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seminales o temporales y las adventicias o permanentes, las cuales son fibrosas y que consisten en radculas y vellos radiculares (Gonzles et al., 1985) . Los tallos son de color verde, de forma cnica y son ms gruesos que la raz. Se componen de una serie de nudos e internudos, en cada nudo se forma una hoja y una yema (Arroz, 1971). Las hojas se encuentran distribuidas alternamente a lo largo del tallo. En la hoja completa se distinguen la vaina, el cuello y la lmina. La vaina es de forma enrollada como de cilindro, envuelve al tallo cuando es joven y despus envuelve a los internudos (UNI, 1975; Len, 2000). En el cuello de la hoja se encuentra la lgula que es una estructura triangular apergaminada o membranosa y difiere en tamao, color y forma segn la variedad de arroz; y las aurculas, que son dos apndices que tienen forma de hoz, con pequeos dientes en la parte convexa. La lmina es de tipo lineal, punta aguda, larga y ms o menos angosta, segn las variedades. La lmina de la hoja bandera es ms corta y ancha que las dems y segn la variedad, forma diferentes ngulos con el tallo: erecto, intermedio, horizontal o descendente. Segn la presencia de vellos se pueden clasificar como glabras, intermedias o pubescentes, tambin se reconocen por las combinaciones de colores, verdes o prpuras (Gonzlez et al., 1982; 1985). Los rganos florales, son inflorescencias denominadas pancula (Vergara, 1985), la cual es un grupo de espiguillas nacidas en el nudo superior del tallo. El tallo de la pancula se llama raquis y se encuentra dividida en nudos y entrenudos. Las ramas que producen granos en la pancula se forman solas o en conjunto de los nudos del raquis y estas ramas pueden ser simples y divididas. El tamao y la forma de las panculas varan generalmente en las diferentes variedades (Arroz, 1971). Segn la variedad puede extenderse ms all de la hoja bandera o quedar encerrado en la vaina de sta (Gonzlez y Rosero, 1982). La flor del arroz es hermafrodita. Contiene las partes masculinas y femeninas. Es esencialmente autofertilizada con el plen de una flor, fertilizando el estigma de la misma flor (Arroz, 1971). La espiguilla es la unidad de la inflorescencia; est formada por dos glumas externas (lemas estriles), la raquilla y la florecita. El nervio central de la lema se llama quilla y puede ser liso o pubescente. La arista, que es una prolongacin de la quilla, puede ser corta o larga, su tamao est condicionado por factores hereditarios e influenciado por el medio ambiente (Gonzlez y Rosero, 1982; Vergara, 1985).

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El grano de arroz se compone del ovario maduro, consta de una cscara formada por la lema, plea, y asociadas a la raquilla, las lemas estriles y las aristas, cuando se encuentran presentes. El embrin se encuentra en el lado ventral de la espiguilla, junto a la lema el cual contiene las hojas embrionarias (plmula) y la raz embrionaria (radcula) (Len, 2000). 2.3. Etapas del cultivo Las plantas de arroz completan su ciclo de vida pasando por tres etapas distintas, con perodos definidos de crecimiento y desarrollo (Figura 1).

Figura 1: Etapas de crecimiento de la planta de arroz.

La etapa vegetativa comprende la germinacin, el estado de plntula y el macollamiento. La plntula tiene un desarrollo muy rpido, hasta el estado de 4-5 hojas, seguido del macollamiento caracterizado por un vigoroso crecimiento de races y tallos, cuyo nmero depende principalmente de la densidad de la poblacin, la variedad y las condiciones de manejo de cultivo. Es esta etapa la que determina el ciclo de vida de la planta de arroz (Vargas, 1990; Hernndez, 1969). La etapa reproductiva, se inicia con la formacin del primordio de la pancula en la base del tallo, seguida del embuchamiento, estado en el cual ocurre una elongacin de los entrenudos en la parte superior del tallo. A partir de este instante, el cultivo pasa aceleradamente a la floracin con la elongacin rpida de los entrenudos y emergencia de la pancula en pocos das. Tiene una duracin de ms o menos 35 das (Vargas, 1990). Finalmente la fase de maduracin que comprende desde que la pancula emerge de la vaina de la hoja bandera (floracin), consecuentemente se inicia con el estado lechoso hasta el estado de llenado, pasando por el estado pastoso y endurecimiento del grano. Esta etapa dura

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aproximadamente 30 das y puede alargarse debido a das lluviosos o de bajas temperaturas, mientras que das soleados y calurosos pueden acortarla (Vergara, 1985; Arvalo, 2001). 2.4. Germoplasma de arroz

La existencia de diferencias sustanciales en el germoplasma del arroz garantiza la base gentica para el desarrollo de los programas de mejoramiento, que incrementan las fuentes diversas de progenitores, con el objetivo de ampliar la variabilidad en los genotipos mejorados, logrando una estabilidad en los rendimientos y un comportamiento agronmico a ms largo plazo ( Daz et al., 2000). La cantidad de germoplasma de arroz conservado es grande. Por ejemplo, el Instituto de Investigacin Internacional del Arroz (IRRI), establecido desde 1961, conserva una gran coleccin de recursos genticos del arroz. Aproximadamente conserva 120,000 accesiones de Oryza; tiene alrededor de 80,000 entradas de O. sativa, 2,408 entradas de O. glaberrima y 2,214 especies silvestres e hbridos de sus especies que se conservan en bancos de genes. Estas colecciones son duplicaciones de los programas nacionales de ms de 110 pases de Asia, frica, Oceana, Amrica del Norte y Amrica del Sur. Pero los mejoradores estn interesados en usar solamente una fraccin pequea del germoplasma total, ya que existen propsitos u objetivos de los programas de mejoramiento gentico de los pases en mencin, especficos para resolver problemas inmediatos de la produccin de arroz comercial (Guevara et al., 2001). 2.5. Mejoramiento gentico del arroz en Centroamrica

La generacin de materiales genticos mejorados tom un fuerte impulso como consecuencia de la llamada Revolucin verde, perodo en el cual los rendimientos promedios d arroz el aumentaron sustancialmente en algunas regiones del mundo (Fedearroz 1986; Ronnie et al., 1992). Los programas de mejoramiento gentico, de pases productores de arroz y en particular de Centroamrica, tienen una fase en comn en la seleccin de variedades, en donde el proceso de desarrollo de una variedad inicia con el cruce de los progenitores, los cuales han sido previamente evaluados en sus caractersticas y seleccionados para tal fin con base en las prioridades regionales y caractersticas especficas que puedan brindar al fitomejorador. Luego se obtienen lneas promisorias, las cuales pasan por otra fase que consiste en realizar pruebas

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de adaptacin con variedades introducidas con la meta final de incrementar la produccin por unidad de superficie a un menor costo (Rosero, 1977; Fedearroz, 1986). Los objetivos estn dirigidos a caractersticas de alto potencial de rendimiento como lo es la elevada capacidad de macollamiento, tolerancia al vuelco, hojas erectas de color verde oscuro, ciclo intermedio, senescencia tarda, panculas de tamao adecuado, grano pesado y poca esterilidad. Todas estas caractersticas son importantes para los programas de mejoramiento gentico pero la resistencia a enfermedades, principalmente piricularia (Piricularia oryzae) y el virus de la "Hoja Blanca", as como, la tolerancia a plagas merece especial atencin. Otras enfermedades como Rizoctonia (Rhizoctonia solani), Helminthosporium (Helminthosporium orizae), Manchado del grano, Sarocladium (Sarocladium oryzae) y Escaldado de la Hoja (Monograpella albescens), tambin son tomadas en consideracin y por lo general se realiza seleccin negativa en las poblaciones segregantes; as como, el mejoramiento incluye al insecto Sogata (Tagosodes orizicola), el cual es el vector del virus de la hoja blanca. La calidad culinaria est basada en el tamao del grano que debe ser superior a 6.6 mm, con una relacin largo ancho mayor o igual a 3.3 mm y con un contenido de amilosa que debe ser entre 23 y 27%. La calidad de molinera basada en el rendimiento del grano en el molino y la tolerancia a la cosecha retrasada, son los factores en los cuales se hace mayor nfasis al seleccionar las lneas que deben continuar en otros ciclos de pruebas (FLAR, 2002). En publicaciones de CIAT y otros, la tolerancia a la sequa y a la salinidad o alcalinidad son otros de los objetivos del mejoramiento (Jennings et al., 1985; Topolanski, 1975). 2.6. Importancia del mejoramiento gentico en Panam.

El arroz es uno de los cultivos de mayor importancia econmica en Panam. En el pas se cultiva arroz bajo condiciones de secano en un 80% y bajo riego en un 20%. La mayor parte de la produccin est concentrada en las provincias de Chiriqu, Cocl, Veraguas y Panam. Los mayores problemas que enfrentan los productores son los tpicos de las regiones del mundo, incertidumbre de lluvias para el sistema de secano y la incidencia de enfermedades y plagas. As como, la necesidad de cambiar las variedades en uso, buscando aquellas que representen mayores ventajas por su capacidad de rendimiento, calidad de grano, tolerancia a plagas, enfermedades y a la sequa para el sistema de secano. Para el sistema de riego, adems de lo mencionado, se busca que sean tolerantes o resistentes a la toxicidad de hierro (Espinoza, 1977). El Instituto de Investigacin Agropecuaria de Panam (IDIAP), mediante el Proyecto de mejoramiento gentico de arroz apunta a cumplir con el fortalecimiento del sector arrocero,

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mediante la bsqueda de soluciones a los problemas especficos, que en el corto y mediano plazo redundarn en una alta productividad y rentabilidad del sistema. El IDIAP contribuye a una produccin sostenible y competitiva a largo plazo (Camargo Buitrago, 2001). El proyecto se alimenta de muchas introducciones que se realizan por diferentes vas, pero, las principales fuentes de abastecimiento de germoplasma son la Red Internacional para la Evaluacin Gentica del Arroz (INGER) y el Centro Internacional de Agricultura Tropical- Fondo Latinoamericano y del Caribe para Arroz de Riego (CIAT-FLAR). El proyecto tambin produce lneas mediante un programa de cruzamientos y seleccin. Las lneas obtenidas de una u otra forma son consecuentemente conducidas a experimentos de observacin, rendimiento y validacin en numerosos sitios representativos de la produccin arrocera del pas (Lasso et al., 1997). El objetivo general del proyecto est basado en desarrollar y liberar cultivares de arroz con resistencia a las principales plagas y con alto potencial de rendimiento, excelente calidad molinera y culinaria. Adems, debe presentar buena estabilidad y adaptabilidad en los sistemas de produccin tipificados. Entre las actividades que desarrolla el proyecto de investigacin se menciona : ? Introduccin y caracterizacin de germoplasma de arroz de los Viveros de Observacin ? del Fondo Latinoamericano y del Caribe para Arroz de Riego; y Viveros de Observacin de Amrica Latina (VIOFLAR y VIOAL). ? Evaluacin de lneas F8 de arroz del IDIAP en etapa de observacin en los Viveros de ? Observacin de Amrica Latina (VIOIDIAP F8). ? Evaluacin de lneas promisorias y variedades comerciales de arroz de ciclo precoz e ? intermedio, bajo condiciones de riego y secano ? Prueba de adaptabilidad y estabilidad del comportamiento de cultivares promisorios de ? arroz. ? Descripcin varietal de cultivares en proceso de registro. ? ? Prueba de calidad molinera de lneas experimentales. ? ? Prueba de calidad culinaria de lneas experimentales. ? Dentro de los productos esperados del Proyecto de mejoramiento gentico de arroz, se mencionan:

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? Identificar las mejores lneas F8 nacionales e introducidas con resistencia a factores ? adversos biticos y abiticos, calidad de grano y rendimiento. ? Lograr la definicin de descriptores fenotpicos y/o moleculares que permitan identificar ? con precisin cada nuevo cultivar liberado. ? Obtener semilla muy homognea para uso experimental y entregar semilla de alta ? pureza varietal al programa de semilla bsica y registrada. ? Identificar las progenies con rendimiento de granos enteros superiores a 62.0%, ? rendimiento total encima de 70,0% y granos tizas inferiores a 2,0%. ? Identificar las progenies con centro blanco por debajo de 1,2 y digestin alcalina entre ? 4,0 y 7,0. 2.7. Descripcin varietal

La descripcin varietal se puede deducir de los objetivos del usuario para los estudios genticos y evolutivos, los cuales se realizan principalmente en los bancos de germoplasma, donde se precisan datos tomados con exactitud de muchas caractersticas botnicas. La descripcin varietal empleada por los fitomejoradores con fines de promocin comercial, se basa solo en aquellas caractersticas de inters econmico y comercial que tienen importancia para el agricultor (Muoz y Poey, 1993). Por lo que, tan pronto se designa una nueva variedad, el fitomejorador prepara una descripcin varietal para registrarla. Estas descripciones son usualmente una enumeracin de los rasgos ms sobresalientes y de las caractersticas de la variedad. La descripcin varietal debe ser cuidadosa en dos aspectos: (1) no debe ignorar las desventajas varietales en la misma forma que se destaca las ventajas, (2) se debe describir cualquier caracterstica en la que influya el medio ambiente, por insignificante que sea. Se debe incluir tambin comparaciones de rendimiento de la nueva variedad con varias variedades comerciales estndar (Jennings et al., 1981). La descripcin varietal debe realizarse con base en el fenotipo observado de las plantas de una variedad. El fenotipo depende del potencial gentico (genotipo) de cada planta y de expresin del fenotipo acorde con los efectos ambientales aparentes. Aunque, el arroz es una especie autgama, y por lo tanto supuestamente todas las plantas son de constitucin homocigota o pura, los fenotipos variarn por causas ambientales en las caractersticas cuantitativas y cualitativas cuya expresin sea afectada por accin de genes modificadores (Muz y Poey, 1983). El lanzamiento de una variedad, somete a un gran esfuerzo la capacidad de investigacin de un pas y la habilidad de la industria de semilla y de los agricultores para cambiar de

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variedades y mantener su pureza (Vargas, 1986). Una vez terminado el proceso de purificacin de una lnea promisoria, cosa que por lo general ocurre en arroz en la sptima u octava generacin donde se tiene una lnea homocigota, se inicia la produccin de semillas para ser entregada a los agricultores que son a quienes se trata de beneficiar con todo el programa de mejoramiento (Vallejo, 1977). La inscripcin de una variedad es un requisito indispensable para la circulacin como semilla comercial. Esta inscripcin requiere una descripcin varietal donde se registran las caractersticas cualitativas y cuantitativas de la variedad en mencin con el propsito de garantizar semilla de identidad varietal que significa que la semilla debe producir exactamente en la progenie las caractersticas genotpicas y fenotpicas de la planta original; calidad por su pureza fsica que implica que la semilla debe estar limpia y libre de materias extraas; sanidad; debe estar libre de plagas y agentes patgenos y debe tener alto poder germinativo (Fara y Agudelo, 1993; Gonzlez y Johnson, 1983; Higuera et al., 1997). El uso de semillas comerciales inscritas y previamente descritas busca evitar la llamada degeneracin de la semilla de variedades de arroz que se refiere al alto grado de impureza varietal que presenta un material que es usado como semilla y que presenta caractersticas, las cuales reducen el rendimiento y desmejoran considerablemente la calidad comercial del grano pilado (Contreras y Castillo, 1966). Tambin, se busca disminuir problemas de tipificacin de las variedades. Cuando existe un nmero demasiado grande de variedades, eso dificulta el mantenimiento de la pureza varietal. Estos problemas se presentan cuando las caractersticas fenotpicas son muy similares (color de cscara, dimensiones del grano, etc). Si hay bastante similitud entre plantas, se pueden presentar mezclas en ocasiones muy difciles de diferenciar, obligando a un mayor trabajo, tanto para el agricultor en el campo, como para el analista en el laboratorio y el procesador en las plantas de procesamiento (Lpez, 1972). La descripcin varietal que utilice pocos descriptores, adjetivos calificativos sujetos a interpretacin subjetiva y que utilice un rango aproximado para la medicin de caractersticas como una muestra muy pequea de plantas, trae consecuencias a los inspectores de calidad de campo de semilla. A la hora de analizar un lote, y de acuerdo con la variabilidad existente, hace que tengan que analizar criterios subjetivos para determinar la pureza varietal, a falta de una descripcin varietal adecuada a la cual referirse e implica en muchas ocasiones errores involuntarios que pueden representar la prdida de mucho esfuerzo y dinero (Muoz y Poey, 1983).

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2.8.

Caracterizacin morfolgica

La caracterizacin morfolgica de los genotipos permite definir una serie de descriptores tiles por su importancia agronmica, o por su valor para clasificar e identificar grupos genticos (Tapia et al., 1999). Las caractersticas morfolgicas han sido usadas para la identificacin de especies, familias y gneros de plantas. Las cuales involucran resistencia a enfermedades y plagas y el rendimiento (Falconer, 1981). Para la obtencin de patrones de identificacin, caracterizacin y evaluacin de la mayora de las plantas cultivadas, se han realizado estudios bsicos para conocer la variabilidad de las caractersticas dentro y entre plantas y seleccionado aquellas caractersticas cualitativas o cuantitativas que sean tiles para la descripcin. Los rganos ms importantes para la descripcin morfolgica son aquellos que estn menos influenciados por el ambiente como la flor y el fruto, as como las hojas, troncos, races y los tejidos celulares ( Enrquez, 1966; 1991). Siendo el arroz un cultivo autgamo, sus caractersticas varietales deben estar determinados por un mismo genotipo, que se expresa en todas las plantas en una condicin homocigota o pura (Iglesias et al., 1994). Sin embargo, los fenotipos observados seguirn demostrando variaciones por causas ambientales, principalmente en aquellas caractersticas que dependen de muchos genes (variables cuantitativos) como por ejemplo, la longitud de la pancula y el ancho de la semilla. An, las caracters ticas fijas cualitativas pueden segregar si al momento de la liberacin de la variedad no se estabiliza en forma homocigota dentro de la poblacin inicial de incremento como por ejemplo, el hbito de crecimiento, la pubescencia y el color de la hoja. La segregacin puede ocurrir en caracteres que carecen de inters agronmico para el fitomejorador (Muoz, 1993). 2.8.1. Marcadores morfolgicos Los mejoradores seleccionan plantas valindose de indicadores o marcadores cuando una caracterstica importante y difcil de comprobar, est ligado estrechamente con otra caracterstica que puede percibirse sin dificultad. Estos marcadores tienen las siguientes desventajas: a. Solo se conocen unos pocos. b. Tienden a ser especficos de alguna variedad de arroz. c. El marcador y la caracterstica deseable deben ser ambos dominantes o recesivos. d. Solo funcionan si estn controlados por genes principales simples ( Bio...,1994).

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Bernal et al. (1985), concluyeron en sus trabajos que las caractersticas morfolgicas de la arquitectura de la planta que ms influyeron sobre el rendimiento, son el nmero de panculas efectivas por metro cuadrado, nmero de granos por pancula, longitud de pancula, peso de la raz y altura de la planta . Segn Martnez (1997a), el rendimiento del grano es una funcin de la capacidad de rendimiento de las plantas, resistencia a enfermedades e insectos, adaptabilidad y prcticas agronmicas. Se han realizado investigaciones para la deteccin de posibles marcadores morfolgicos para la seleccin temprana de genotipos de arroz tolerantes a la salinidad por Gonzlez (1997), quien encontr que debido a altas concentraciones de salinidad existe estimulacin en el crecimiento radicular en algunas variedades y un rpido crecimiento vegetativo por efectos de la dilucin de sales por los tejidos. Las caractersticas, de altura, longitud de las races, emergencias de nuevas races, acumulacin de materia seca y fresca, as como la supervivencia se afectan por la salinidad y eso puede atribuirse, a la acumulacin de iones de Na y Cl en la planta. Estas caractersticas morfolgicas pueden ser utilizadas como marcadores para la seleccin temprana de genotipos tolerantes a la salinidad. Quipe et al. (1994), sealan que la tolerancia a la marchitez est relacionada con la capacidad del sistema radical y con el tamao ms compacto de la planta. La intensidad de color verde estara posiblemente relacionado con la capacidad de mantener el contenido de clorofila, bajo un dficit hdrico. As mismo, Garca y Gonzlez (1997), concluyen que la elongacin del sistema radicular fue el marcador morfolgico ms adecuado para evaluar la tolerancia ante el estrs de la sequa. 2.8.2. Componentes de rendimiento Como factor importante para el xito del fitomejoramiento, figuran aquellos recursos genticos que posean caractersticas deseables y que se involucren en el rendimiento. Los tallos cortos y fuertes, ms que ninguna otra caracterstica, determinan la resistencia al volcamiento. Una combinacin de la habilidad de alto macollamiento y una agrupacin compacta de tallos son caractersticas deseables para todos los productores de arroz. Las plantas con alto vigor inicial (que llenan rpidamente los espacios entre las plantas y surcos) son deseables si tal vigor no conduce a un crecimiento excesivo y sombro mutuo. La caracterstica ms importante de la hoja es la posicin erecta despus de la iniciacin de la pancula, asociado con la alta

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capacidad de rendimiento. La longitud de la hoja es supremamente variable en e arroz, el l ancho es menos variable y el grosor de la hoja ha sido relacionado con la alta habilidad de rendimiento por tener una tasa fotosinttica mayor por unidad de rea foliar. La rigidez de la hoja parece estar asociada directamente con el grosor de la hoja y la lignificacin de los tejidos foliares. Las hojas y espiguillas de la mayora de las variedades del arroz son pubescentes, algunas pocas son glabras o lisas, con poco o ningn tricoma bicelular (Jennings et al, 1981). Las hojas banderas son importantes para la capacidad de rendimiento por cuanto suministran directamente fotosntatos a las panculas (Martnez y Weeraratne, 1982). Las panculas dispersas son consideradas como indeseables, aunque las variedades de arroz con esta caracterstica no tienen necesariamente menos espiguillas. El peso del grano vara de menos de 10 a ms de 50 mg/grano. Esta caracterstica es ms comnmente expresado como peso de 1000 granos al 14% de contenido de humedad (Jennings et al., 1981). 2.9. Caracterizacin molecular

Los marcadores moleculares son uno de los tantos productos provenientes del desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante, la cual se inici a comienzos de la dcada del 70. El descubrimiento de las enzimas de restriccin, enzimas que cortan el ADN en secuencias especficas, fueron el punto de partida para el inicio y posterior desarrollo de la tecnologa recombinante. Posteriormente el uso de enzimas ligasas y polimerasas permitieron construir molculas recombinantes in vitro (ngel, 2000). Las tcnicas moleculares son una herramienta poderosa para ayudar a resolver problemas en sistemtica. Una de sus principales bondades es la gran cantidad de caractersticas que aportan. sto permite que se puedan utilizar en grupos de plantas con morfologa muy reducida (como parsitas) en los que sera difcil aplicar otra tcnica que diera el mismo nmero de caractersticas. Una aplicacin importante es la valoracin de caractersticas consideradas de valor taxonmico en grupos en los que la rpida divergencia morfolgica o la seleccin sobre ciertas caractersticas deseables han obscurecido sus relaciones, como por ejemplo en las plantas cultivadas (Martnez, 1997a). El advenimiento de los marcadores moleculares revolucion los estudios genticos, debido a sus mltiples ventajas con respecto a los marcadores morfolgicos. Los marcadores moleculares permiten analizar directamente el genotipo sin la influencia de los factores ambientales ( Prez, 2000).

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La tendencia reciente en estudios taxonmicos es el uso combinado de datos morfolgicos y moleculares, especialmente los que provienen de enzimas de restriccin y secuencias de genes particulares. Los continuos desarrollos tecnolgicos estn haciendo posible el muestreo de un nmero mayor de genes y taxa a comparar. Paralelamente, el desarrollo de mtodos analticos basados en la teora cladstica ha provisto la formalidad y robustez para interpretar la variacin de esos datos (Gonzlez y Garca, 1997). Los marcadores moleculares presentan muchas ventajas en comparacin con los marcadores morfolgicos, especialmente por su nmero alto y su independencia de los efectos del ambiente. Permiten revelar las diferencias que han desarrollado los genomas durante su proceso de evolucin. Como aplicaciones de estas tcnicas, se puede mencionar la definicin de grupos genticos al nivel intraespecficos y la organizacin filogentica de las especies (Anthony et al., 1995). En el marco de un programa de mejoramiento gentico, los marcadores moleculares tienen por lo menos tres potenciales aplicaciones: a. Eleccin de progenitores para un cruzamiento: se puede preseleccionar materiales genticamente similares o diferentes, de acuerdo a los objetivos de la cruza. b. En base a estos polimorfismos se pueden construir mapas genticos sobre la base de poblaciones planificadas de acuerdo a la caracterstica de inters y en estos mapas identificar marcadores moleculares asociados a estas caractersticas (genes de resistencia a enfermedades, problemas de origen metablico como el centro blanco del grano, o factores abiticos como tolerancia a fro). A futuro, estos marcadores podran ser de uso rutinario en el anlisis de segregantes, con el consecuente ahorro de tiempo requerido para generar una nueva variedad; y c. Estos marcadores sern la herramienta de eleccin para realizar fingerprinting de variedades comerciales, lo que ser imprescindible para registrar la propiedad del material gentico (Hinrichsen et al., 1996). 2.9.1. Marcadores moleculares En 1944 surgieron pruebas experimentales directas de que los cidos nucleicos, en concreto el ADN, eran los que servan de base a la informacin en el proceso de la herencia. Con el descubrimiento de la estructura del ADN (cido desoxirribonucleico) por Watson y Crick (1953), los cuales expusieron la naturaleza de doble hlice del ADN, as como la suposicin de que las funciones de las molculas se clarificaran ms fcilmente tras determinar su estructura general

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(Klug y Cummings, 1999). Se inicia en el campo del conocimiento biolgico el desarrollo de la biologa molecular. En forma explosiva, la gentica molecular emerge como una de las ciencias ms apasionantes y el hombre empieza a entender el fenmeno de la vida en trminos qumicos (Balbs y Zapata, 1989). Las molculas de ADN se pueden fragmentar mecnicamente al azar en pequeos trozos. Un fragmento que contenga un gen aislado ser uno entre cientos de miles de otros fragmentos, indiferenciables por su tamao.

Algunas de las etapas principales del desarrollo de la tecnologa de ADN, se mencionan a continuacin: (Alberts et al., 1996) 1869 1953 1957 1961 1962 Miescher aisl por primera vez el ADN. Watson y Crick propusieron el modelo de la doble hlice para la estructura del ADN, basados en los resultados de rayos X de Franklin y Wilkins. Kornberg descubri la ADN polimerasa, la enzima que ahora se utiliza para producir sondas de ADN marcadas. Marmur y Doty descubrieron la renaturalizacin del ADN, estableciendo la especificidad y la posibilidad de las reacciones de hibridacin de los cidos nucleicos. Arber proporcion la primera evidencia de la existencia de las nucleasas de restriccin del ADN, que condujo a su posterior purificacin y utilizacin en la caracterizacin de la secuencia del ADN por parte de Nathans y H. Smith. 1967 1985 Gellert descubri la ADN ligasa, la enzima utilizada para unir fragmentos de ADN. Mullis y colaboradores desarrollaron la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, de Polimerase Chain Reaction).

Los marcadores moleculares pueden clasificarse en marcadores dominantes y codominantes. Un marcador codominante significa que al evaluar un individuo diploide, el marcador permite visualizar tanto el alelo aportado por la madre como el aportado por el padre, lo que implica que son identificables los individuos heterocigotos de los homocigotos. Un marcador dominante por el contrario, produce una sola banda que slo en ciertos casos puede ser identificada si proviene de la madre o del padre (Phillips, 1998). Existen dos tipos de marcadores, las protenas y los moleculares de ADN. La seleccin del marcador que se vaya a utilizar en un estudio depender del uso que se le dar, de la especie

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en que se est trabajando, de la disponibilidad de recursos tcnicos y financieros como de otras razones, las cuales deben analizarse antes de tomar una decisin (Phillips et al., 1995). Len, (s/f), los agrupa de la siguiente manera: 1. Post transcripcin-traduccin (Anlisis indirecto del ADN: ej. Isoenzimas) 2. Pre transcripcin-traduccin (Anlisis directo del ADN). a. Basados en hibridacin: RFLP, VNTR ( Minisatlites) b. Basados en PCR con cebadores arbitrarios (Multilocal) RAPD, AP-PCR, DAF, SAMPLE, LSSP, SIR, DAMD. En general muestran alto nmero de bandas/ loci. c. Basados en PCR especfico (Unilocal): Secuenciamiento, TGGE, DGGE, CAPS, SSCP, SSR. Regiones especficas: se conoce la secuencia que flanquea ese fragmento de ADN . De forma general se seala que entre las caractersticas ms ventajosas que pueden tener un marcador molecular se encuentran: -Alto polimorfismo (Nmero de alelos/ loci) -Gran nmero (Disponibilidad de marcadores en el genoma) -Codominancia (Expresin gentica) -Heredables -Modelo Mendel -Simples (Pleiotropa y epistasia: nula o mnima) -Independientes (Recombinacin) -Distribuidos por todo el genoma -Mnima GxE (Interaccin genotipo- ambiente) -Independiente del estado de desarrollo de la planta -Selectivamente neutro (con relacin a efectos fenotpicos) -Fcil de obtener y analizar -Fcil de ser analizados entre diferentes especies y razas -Rpido -Barato (Len, s/f). 2.9.2. Descripcin de la tcnica de AFLPs La tcnica de AFLPs (Fragmentos Amplificados de Longitud Polimrfica) se basa en la amplificacin selectiva de fragmentos de restriccin usando la reaccin en cadena de la

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polimerasa (PCR) en el ADN genmico. La tcnica AFLPs es la ms reciente y la ms resolutiva de las que se aplican para la identificacin varietal. Se basa tambin en la PCR, pero con una variante. El ADN de la planta que se estudia, inicialmente se realiza una extraccin de ADN (Perry et al., 1998), luego es digerido por la accin de dos enzimas de restriccin. sto produce miles de fragmentos cortos de ADN. Posteriormente, los extremos de estos fragmentos son ligados a unas secuencias de nucletidos denominadas adaptadores. A continuacin, se realiza una PCR en la que se utilizan cebadores que hibridan con los adaptadores y uno o dos nucletidos extras, que imponen una seleccin y reducen el nmero de fragmentos que se van a amplificar a unos cientos. El resultado de la amplificacin se somete a electroforesis y deteccin radioactiva, visualizndose cientos de bandas polimrficas (Vos et al., 1995; Cho et al., 1998). En las reacciones de AFLPs se podran presentar posibles problemas como: a. Bandas dbiles o ausencia de ellas en la autoradiografa, lo que puede estar sujeto a una marcacin dbil o no marcacin del primer, insuficiente ADN molde, ADN contaminado (Sales, Triton X-100, SDS, protenas), incorrecto ciclo del PCR, evaporacin durante la amplificacin, baja sensibilidad de la pelcula. b. Pocas bandas pesadas, causado por la combinacin de primer no ptima. c. Prdida de lneas, debido a la evaporacin durante el PCR o error en el pipeteo d. Muchas bandas de alto peso molecular ocasionado por una digestin parcial. e. Bandas slo en la parte superior del gel, producto de una baja actividad de la polimerasa (Rodrguez Barreneche, 2000). En experimentos realizados en vid ha sido posible separar clones dentro de variedades, lo que lo convierte en una herramienta muy til para la seleccin clonal. Tambin es muy til para la elaboracin de mapas genticos, dado que se pueden obtener numerosos marcadores polimrficos en cada experimento. En contra de la tcnica est el hecho de que estos marcadores son dominantes como los RAPDs (ADN Polimrfico Amplificado al Azar), no pudiendo identificarse los loci a los que pertenecen las bandas (Hinrichsen et al., 2000). Esta tcnica AFLPs tiene la cualidad de reunir ventajas del RFLP (Fragmentos de Restriccin de ADN de Longitud Polimrfica) en la reproducibilidad de los ensayos y la PCR en la amplificacin con capacidad de diferenciar mltiples marcadores en una sola muestra. De la misma manera, Narvez et al. (2000), sealan que los AFLPs seran una buena alternativa para diferenciar clones, dado que tienen alta reproducibilidad y entregan mayor informacin por

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cada reaccin que RAPDs. En estudios de diversidad gentica del maz, Marsan Ajmone et al. (1998), sugieren que los AFLPs pueden detectar un nmero ms grande de polimorfismo de una manera ms eficiente en comparacin a RFLP, debido al nmero ms alto de los lugares geomtricos probados en una sola reaccin de PCR. Los AFLPs tienen una mayor capacidad de generar bandas y consecuentemente de detectar polimorfismo, por esta razn constituyen la va ms rpida y reproducible para generar mapas genticos de alta densidad, usados en seleccin apoyada por marcadores genticos. Son ideales para determinar la identidad varietal y detectar plantas fuera de tipo. Como desventaja se puede mencionar que es un marcador dominante, aunque puede ser modificado para que acte como codominante (Phillips, 1998). Es importante sealar que la tcnica no detecta diferencias de longitud, sino presencia o ausencia de fragmentos de restriccin amplificados (Melgarejo Muz, 2000). Slo detecta un alelo, o sea, el fragmento que se amplifica. Las dems variaciones allicas son clasificadas conjuntamente como un alelo nulo. Los marcadores AFLPs son dominantes y los datos tienen naturaleza binaria. Los genomas heterocigotos no pueden discriminarse directamente de los homocigotos. El anlisis de los marcadores de AFLPs, incluyen mayor nmero de etapas, al compararlo con RAPDs, tambin necesitan un mayor nmero de reactivos y equipo de laboratorio. El ADN a usarse en las reacciones debe ser ms puro, donde la calidad del ADN es el elemento crucial para el xito de esta tcnica. Con lo antes mencionado es fcil deducir que es una tcnica ms laboriosa y que demanda recursos econmicos ms altos que RAPDs (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Los AFLPs no se han utilizado mucho en identificacin varietal, debido a su gran complejidad experimental y al hecho de que se han desarrollado en fechas recientes. Sin embargo, presentan una importante caracterstica y es que su poder resolutivo en la separacin de genotipos es el ms alto en comparacin con el resto de las tcnicas. Las actuales tendencias del uso de marcadores moleculares AFLPs, en el cultivo de arroz, se fundamentan en estudios de la diversidad gentica, usados en la generacin de fingerprint de las accesiones, (Zhu et al., 1998). As, como la generacin de polimorfismos comparables con otras tcnicas moleculares (Mackill et al., 1996). Tambin como mtodo para analizar el germoplasma y su caracterizacin (Subudhi et al., 1998) y la generacin de mapas del genoma del arroz (Maheswaran et al., 1997).

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2.10.

Mtodos estadsticos multivariados aplicados a la biologa molecular

Los mtodos y procedimientos estadsticos de utilidad en ensayos biotecnolgicos, Martnez Wilches (1995), los agrupa en categoras como, aquellos que tienen como propsito evaluar la variabilidad, clasificacin, estructura y composicin gentica de las poblaciones. Los desarrollados para construccin de mapas cromosmicos o genmicos y los denominados QTL Quantitative Trait Loci, los cuales son loci asociados con caractersticas cuantitativas de importancia econmica. Tambin seala Martnez Wilches (1995), que los mtodos estadsticos ms usados son las distancias genticas, ndices de similitud, dendogramas y coordenadas principales. En dependencia de su naturaleza y objetivos de aplicacin se utilizan indicadores sobre la base de los cuales se describe la variabilidad y se clasifican las entidades de cuatro tipos principales: a. ndices de similitud, b. ndices de diferenciacin, c. ndices de identidad, d. Distancias genticas (Cornide y Coto, s/f.). Cornide y Coto (s/f), mencionan que los ndices de similitud de caractersticas de forma binaria se conocen como coeficientes de asociacin y sus matrices, como matrices de asociacin. Estos coeficientes expresan la concordancia entre cada par de unidades experimentales, unidades de organizacin taxonmicas, genotipos e individuos de una poblacin, etc, para una serie de caractersticas individuales de 2 ms estados. Los indicadores de asociacin pueden ser de tres tipos; pero los ms usados en trabajos con marcadores moleculares son los que resaltan la doble presencia y en especial los de Nei y Li (1979) y Jaccard.

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3. MATERIALES Y MTODOS 3.1. Etapa de campo 3.1.1. Ubicacin

El ensayo se realiz en el Campo Experimental del Sub- Centro Pacfico Marciaga, ubicado a 7 km al sur de la cuidad de Penonom, en el corregimiento de El Coco, del distrito de Penonom, provincia de Cocl, perteneciente al Centro de Investigacin Agropecuaria de Recursos Genticos (CIARG), del IDIAP. Esta rea de llanuras corresponde al bosque seco tropical (Mariscal et al., 2000), ubicado dentro del Arco Seco del pas, entre 8 05 y los 9 03 de latitud norte y 80 02 y 80 55 de longitud oeste, con una precipitacin promedio anual de 1400 mm distribuidos en 7 meses de mayo a noviembre. El suelo del rea experimental es cido; con bajo contenido de bases intercambiables, fsforo y materia orgnica, con una densidad aparente de 1.7 y con pobre drenaje superficial (Arosemena et al., 1997). Los anlisis de calidad de grano se realizaron en el Laboratorio de Calidad de grano en la Finca de El Bajo, del CIARG, ubicado en el Corregimiento de Ro Hato en la provincia de Cocl. 3.1.2. Material experimental Se evaluaron 48 lneas avanzadas de arroz (Oryza sativa), producto del programa de mejoramiento gentico (Anexo 1), 5 progenitores y 4 variedades comerciales utilizados como testigos de rendimiento y calidad de grano (Anexo 2). 3.1.3. Semillero, trasplante y manejo agronmico

La semilla del material experimental se increment en La Finca El Bajo, cosechando este material en el mes de diciembre del ao 2002. Se rompi la latencia de las semillas en un horno a 70 C por un periodo de 72 horas, en el laboratorio de semilla del CIARG. Las semillas fueron tratadas con una solucin de Carboxin+thiram a 10cc por galn de agua e hidratadas en agua fresca por 24 horas, luego fueron incubadas por 24 horas, colocndolas en un envase plstico a oscuridad (Figura 2A). El semillero se realiz en bandejas plsticas de 60 x 30 cm, con suelo de aluvin, permaneciendo por un periodo de 21 das, hasta alcanzar el tamao adecuado de trasplante (Figura 2B). A los 21 das despus de la siembra se inici el trasplante del material en una parcela de 20 X 50 metros, preparada bajo el sistema de fangueo, trasplantando una planta por sitio en forma manual (Figura 2C). La unidad experimental utilizada fue de 1 metro cuadrado para cada

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tratamiento, en cada metro se trasplantaron 25 plantas a una distancia de 0.25 X 0.25 cm. El manejo agronmico del ensayo fue uniforme para cada tratamiento (Figura 3). La fertilizacin fue fraccionada en 5 aplicaciones, la primera con fertilizante 12-24-12 de NPK a razn de 180 kg/ha, al momento de la nivelacin de la parcela. La segunda, tercera y cuarta a los 10, 20 y 30 das despus del trasplante con Urea al 46% a razn de 180 kg/ha . La quinta aplicacin entre los 55 y 60 das, cuando se observaron los primeros primordios florales, con la misma dosis de urea. Se realiz un nico control de malezas utilizando Bispiribac de sodio 40% a razn de 0.15 lts/ha, ms coadyuvante AD-3 a razn de 0.3 lts/ha; y otro control manual. Para el control de plagas se realizaron seis aplicaciones con Monocrotofos a razn de 0.35 lts/ha, dos controles en el primer mes de trasplante y cuatro controles entre el llenado y maduracin de los granos en la espiga. El manejo del agua, fue mantener la lmina de agua durante el crecimiento vegetativo y reproductivo de las plantas, eliminndola al momento de cosecha. No se realiz control de enfermedades, ya que no se presentaron (Figura 2D).

A

B

C

D

Figura 2: A. Tratamiento de semillas, B. Semillero en bandejas, C. Trasplante manual, una planta por sitio, D. Parcela con lmina de agua durante todo el ciclo de las plantas.

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3.1.4. Evaluacin de las caractersticas morfolgicas y rendimiento.

Para la evaluacin de las caractersticas morfolgicas, en el estado de floracin se etiquetaron al azar 5 plantas por repeticin y tratamiento, y se procedi al registro de 28 descriptores (Anexo 3). Se utiliz escalas y cuadros de colores del libro de Descriptores Varietales (Muz et al., 1993). En el estado de maduracin, se registraron 10 descriptores en maduracin, sobre las mismas plantas (Anexo 3). Se registr la altura de planta (Figura 3B) y se cort el tallo principal con hojas y pancula, de las plantas etiquetadas (Figura 3A), para registrar las medidas de los descriptores cuantitativos con mayor facilidad (Figura 3C). El rendimiento se estim a travs de la cosecha manual de cada tratamiento en estado de maduracin, La cosecha fue secada al sol y limpiada manualmente al viento, se registr el peso en kilogramos y se tomo la humedad, de cada repeticin de los tratamientos (Figura 3D).

A

B

C

D

Figura 3: A. Etiquetado de plantas, B. Registro de altura de planta, C. Medidas en hoja bandera y pancula, D. Secado al sol de grano cosechado, para estimar rendimiento en kg/ha.

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Para la calidad de grano se evalu el rendimiento de molinera de los granos, tomando una muestra de 250 gramos por tratamiento (Anexo 5). Se determin la humedad de la muestra, la cual luego fue descascarada, pulida (Figura 4A) y clasificada por zarandas N 12 y 10 para grano quebrado y N 15 para arrocillo. En el laboratorio de semilla del CIARG, se determin el porcentaje de grano entero, grano quebrado y arrocillo por diferencia de peso con respecto a la muestra original. Para estimar el porcentaje de grano tiza, se tom una muestra de 10 gramos del arrocillo y visualmente se clasific el grano tiza, luego se pes el grano tiza obtenido de la muestra y se estim el porcentaje con referencia al peso inicial. El centro blanco se evalu en una muestra de 2 gramos del grano entero, utilizando patrones y escala visual de clasificacin (Anexo 6), (Figura 4B).

(1)

(2)

A

5

B

Figura 4: A. Rendimiento de molinera: (1) muestra descascarada, (2) muestra de granos pulidos, B. Escala visual de clasificacin para centro blanco del grano.

La calidad culinaria de los tratamientos se evalu con la temperatura de gelatinizacin o prueba alcalina (Anexo 7). Para ello se colocaron 12 granos enteros al azar, en cajas petris cuadradas de tamao 5.5 x 2.3 cm. Agregando 10 cc de la solucin de KOH al 1.7% (Figura 5A). Luego dichas cajas fueron incubadas en un horno a 30 C por 23 horas. Pasadas las 23 horas se realiz el conteo, utilizando la escala del libro Evaluacin de calidad culinaria y molienda del arroz (CIAT, 1989) y se compar visualmente con los testigos (Figura 5B).

40

3 2

A

1

B

Figura 5: A. Prueba alcalina con 10 cc de la solucin de KOH al 1.7%, B. Grados de dispersin alcalina (1) temperatura de gelatinizacin baja, (2) temperatura de gelatinizacin alta, (3) temperatura de gelatinizacin intermedia.

3.1.5.

Anlisis estadsticos

El diseo experimental utilizado fue de bloques incompletos balanceados con 8 unidades de parcelas para cada sub-bloque (Cochran y Cox ,1980; Montgomery,1991), con 57 tratamientos, donde cada tratamiento correspondi a una lnea o seleccin de arroz, (Anexos 1 y 2). El rea de la parcela utilizada fue de 1000 m2, el rea para cada bloque fue de 9.7 m2 con distancias entre bloques de 0.50 m. y el rea para cada repeticin fue de 1 m2, con 25 plantas/repeticin. Teniendo as un total de 200 plantas por tratamiento. La muestra utilizada fue de 5 plantas por repeticin (Figura 6). El modelo matemtico formulado para el ensayo fue: Yijq = + Tli + ij + Tq + eijk Donde; Yijq = Observacin individual = Media comn Tli = Efecto de repeticiones ij = Efecto de bloques Tq = Efecto de la i-sima lnea

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9.75m 1m 1 8.50m 2 3 4 5 6 7 1m 8 9 10 11 12 13 14 1m 2 51 10 11 12 13 14 3 16 51 18 19 20 21 4 23 24 51 26 27 28 5 30 31 32 51 34 35 6 37 38 39 40 51 42 7 9 45 46 33 48 49 50 44 17 25 47 41 51 15 16 17 18 19 20 21 1m 22 23 24 25 26 27 28 1m 16 28 22 53 24 25 36 17 33 34 35 29 30 53

9.75 m 1m 18 38 12 40 41 53 36 19 53 44 45 46 3 48 50 11 7 1 2 8 4 21 6 39 13 53 47 31 20 43 53 23 14 42 9 29 30 31 32 33 34 35 1m 36 37 38 39 40 41 42 1m 30 40 41 42 36 55 38 31 43 44 55 46 47 48 50 55 5 6 7 1 2

9.75m 1m 33 14 8 9 55 11 15 32 17 18 19 20 21 55 34 27 55 22 23 37 25 35 4 28 45 10 24 12 43 44 45 46 47 48 49 1m 50 51 52 53 54 55 56 57 1m 50 3 4 5 6 7 1 45 11 57 13 14 8 9 46 57 20 21 15 16 17

9.75m 47 27 28 57 23 24 25 48 35 29 30 31 57 33 44 19 12 38 57 32 41 49 36 37 22 39 40 57

1m

1m

8.50m

9 15 52 17 18 19 20

10 28 22 23 52 25 26

11 34 35 29 30 31 32

12 52 41 42 36 37 38

14 46 47 52 49 43 44

50 40 4 5 24 52 1

13 3 16 48 6 7 52

23 34 35 29 54 31 32

24 38 39 40 41 54 36

25 49 54 44 45 42 47

50 4 43 6 7 1 2

27 54 9 10 15 12 13

28 8 20 54 30 16 17

26 19 5 21 11 46 54

37 46 47 48 49 56 44

50 6 7 1 2 12 4

39 8 9 19 56 43 13

40 17 18 10 20 21 56

41 26 56 28 22 23 24

42 35 29 56 11 3 15

38 56 27 30 31 32 33

57 8 21 27 33 39 45 43

56 15 27 32 37 49 5 42

52 22 33 37 48 3 14 10

54 29 39 49 22 13 16 26

53 36 45 5 3 16 25 34

51 43 2 10 14 26 36 18

55 1 8 15 18 29 34 2

Figura 6: Diseo de parcela experimental en la etapa de campo. 3.1.5.1. Anlisis de los datos cuantitativos y cualitativos Las observaciones realizadas durante la etapa de campo fueron introducidas en una base de datos, donde se coloc los tratamientos en filas y las variables en columnas. El anlisis de los datos cuantitativos se realiz por el programa computacional (SAS Institute Inc Cary, NC, USA 1999). Para lo cual se estim el mximo, mnimo, promedio, coeficiente de variacin y desviacin estndar. Los datos cualitativos se analizaron porcentajes, para describir morfolgicamente cada tratamiento. Los datos de rendimiento fueron analizados por el programa SAS, utilizando un anlisis de varianzas (ANOVA), mediante el procedimiento GLM y la prueba de rangos mltiples de Tukey. La evaluacin morfolgica, se analiz por medio del anlisis de correlacin de Pearson, anlisis de componentes principales (ACP) y el anlisis de conglomerados. Se utiliz la tcnica de agrupamiento gerrquico de Ward y se determin el ndice de distancia eucludiana. Para la evaluacin se utilizaron 10 caractersticas cuantitativas y 9 cualitativas. por frecuencia y

3.2. Etapa de laboratorio 3.2.1. Ubicacin La caracterizacin molecular de 12 lneas de arroz se realiz en el Laboratorio de Biologa Molecular de la Unidad de Biotecnologa y Recursos Fitogenticos, del Centro Agronmico Tropical de Investigacin y Enseanza (CATIE), ubicado en Turrrialba, provincia de Cartago, Costa Rica.

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3.2.2. Material experimental y mtodos

Para la caracterizacin molecular se utilizaron 5 lneas avanzadas, 5 progenitores y 2 testigos del programa de mejoramiento gentico de arroz del IDIAP (Anexo 1 y 2). El material experimental fue sembrado en los invernaderos de la Unidad de Fitoproteccin del CATIE, en macetas plsticas negras, con tres semillas por maceta, y luego se rale a una planta, por un periodo de 45 das. Luego de ese periodo se cosech dos hojas, y se liofilizaron por 48 horas a una temperatura de 50 C. Se utiliz un liofilizador MODULYO Thermo Savant. 3.2.3. Extraccin de ADN La extraccin de ADN se realiz a partir de hojas liofilizadas utilizando el protocolo de extraccin CTAB minipreparaciones, (Murray y Thompson, 1980), modificado en el Laboratorio de Biologa Molecular (Phillips et al., 2003). Para realizar la extraccin de ADN se tom un fragmento de hoja de aproximadamente 1.5 cm de hojas liofilizadas de cada lnea de arroz (Anexo 8). 3.2.4. Determinacin de la concentracin de ADN

Se realiz a travs de electroforesis en gel de agarosa al 1.2% (Anexo 9) en una cmara de electroforesis marca KODAK, BioMax. HR2025. Para ello se prepar 220 ml de TBE, Buffer 10X, se agreg 2.4 grs. de agarosa, se calent por 4 minutos en microondas (Marca SAMSUNG modelo MG6920w), se coloc en la cubeta de electroforesis y se mezcl con dos gotas de bromuro de ethidio. Esta tcnica se basa en la cuantificacin de la fluorescencia producida por el bromuro de ethidio en el ADN, a travs de una cmara de luz ultravioleta, ULTRA? LUM, Electronic V.V. Transilluminator. Se utiliz 2l de ADN de cada lnea de arroz y 5l de bromofenol, los cuales se colocaron en el gel de agarosa, junto a un marcador testigo Fago Lambda/ Hind III (PROMEGA) y se dejaron migrar por espacio de 40 minutos a 70 watts. 3.2.5. Amplificacin de los fragmentos de ADN

En esta parte se utiliz la tcnica de Fragmentos Amplificados de Longitud Polimrfica (AFLP) (Vos et al., 1995), con reactivos de AFLP Starter Primer Kit (INVITROGEN). Par