ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

Inoculacin de virus en huevos embrionadosASIGNATURA : Virologa DOCENTE : Dra. Graciela Albino Cornejo. ALUMNO : Rmulo Aycachi Inga. CICLO : 2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.

Inoculacin de Virus en Huevos EmbrionadosI. Introduccin:

Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante ms de 15 aos. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrin de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo adems un medio estril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrin en desarrollo. Tambin se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubacin mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usndose huevo de gallina de 6 a 8 das de incubacin aproximadamente (a veces se usa huevos de mas tiempo de incubacin). Los virus slo pueden reproducirse en determinadas partes del embrin; por consiguiente, se deben inyectar en la regin apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infeccin puede producir una lesion tisular local conocida como pstula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus. El mtodo exacto de inoculacin y la edad del embrin que se emplea, dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amnitica de embriones de 7 a 8 das; pero el virus se duplica fcilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 das, despus de varias resiembras (adaptacin) en el amnios. Los focos mas utilizados para la inoculacin, a parte de las cavidades amnitica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrin en desarrollo, recurriendo a la inoculacin intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplic el virus dentro de las clulas de las membranas o del embrin, puede liberarse a los lquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrin y en las clulas de la membrana amnitica, pasa al lquido amnitico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las clulas en las lesiones o pstulas que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucin salina isotnica las membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrin de pollo puede provocar la muerte del embrin (p.ej. virus de la encefalitis), producir pstulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los lquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2). En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la tcnica de inoculacin de huevos embrionados al correlacionar el nmero de pstulas contadas con la dilucion viral inoculada. 2

Actualmente el mtodo preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculacin en huevos embrionados libres de patgenos especficos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos especficos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 das de incubacin y se incuba a 35-37C durante 4-7 das. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubacin se refrigeran a 4 C y el lquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinacin. Si se detecta actividad de hemoaglutinatin hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reaccin negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos. Entre los lugares de inoculacin tenemos: Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 12 das y la cantidad de inculo es de 0.1 0.5 ml. Apropiada especialmente para el aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de Beyer (Pseudorrabia); que provocan focos o pstulas fcilmente visibles. Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 12 das y la cantidad de inoculo es de 0.1 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el endodermo alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de la inoculacin y toma de muestra Cavidad Amnitica: Se emplean embriones de 7 15 das y la cantidad de inculo es de 0.1 0.2 ml. la edad de los mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza. Saco Vitelino: Se emplean embriones de 5 8 das de incubacin y la cantidad de inculo es de 0.2 1 ml. Va es sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de enfermedades venreas, neumona y rickettsias. El vitelo es empleado para la preparacin de vacunas y como antgeno para reacciones serolgicas de los virus ya mencionados. Va Intravenosa: La membrana corialantoidea est irrigada por vasos sanguneos, es susceptible de inoculacin para casos especiales, virus que ocasionan cambios hematolgicos; por ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados embriones de 10 - 15 das y la cantidad de inculo es de 0.02 0.05 ml. Va Intracerebral (embrin): Se emplea embriones de 8 14 das, especficamente para virus que producen alteraciones cerebrales: la rabia, herpes, etc; 0.01 0.02 ml.

II.

Objetivo: Conocer y aplicar correctamente los mtodos adecuados para realizar inoculaciones de virus en embriones aviares. Materiales: Material Biolgico: Virus de New Castle cepa La Sota a virus vivo. Huevos embrionados de gallina de 9 a 11. 3

III.

Material de Laboratorio: Ovoscopio. Tijera Quirrgica. Agua Destilada. Azul de Metileno. Agujas Hipodrmicas. Placas Petri amplias. IV. Procedimiento: A. Inoculacin: Observar en el ovoscopio si el huevo es frtil o infrtil. Determinar la edad del embrin. Localizar la cmara de aire y marcarla. Marcar el embrin. Colocar los huevos frtiles en un porta huevos Limpiar la cscara (con una torunda de alcohol yodado, todo, sobre todo, la parte donde se va a inocular y luego, limpiar con alcohol). Agujerear el cascarn con un taladro (dependiendo de donde se vaya a inocular). Inoculamos el virus. Tapamos el agujero con parafina (o cera de vela). Luego llevamos a estufa (controlar temperatura y humedad adecuada) Controlar, observar dos veces al da, para percatarse si estn vivos o muertos.

B. Otras Formas De Inoculacin: Inoculacin en el Saco Vitelino: El saco vitelino se encuentra en posicin contraria al embrin. Observar al Ovoscopio y marcar el lmite de la cmara de aire, marcando con un aspa la posicin del embrin. La cmara de aire debe estar en el polo. Realizar un agujero en el lmite de las partes del huevo. Tomar el inoculo con aguja de inoculacin N 22 con una jeringa de tuberculina. Inocular en el agujero hecho en posicin directa al embrin con ngulo de 90. Inoculacin en la Cavidad Alantoidea: Colocar el huevo con posicin vertical y con un taladro hacer un orificio en posicin directa del embrin. Con aguja N 22 pinchar en forma oblicua formando un ngulo de 45 en el borde (en relacin al polo de la cmara de aire); introducir las 1 pulgadas. 4

Otra forma es marcar la cmara de aire a 0.5 cm. de la cmara de aire hacer un agujero e inocular 0.3 ml. de inculo con aguja 26 27 de tuberculina. Hacer un agujero por encima de la cmara de aire y en posicin contraria al embrin e inocular.

Inoculacin en la Cavidad Amnitica: Practicar un agujero en posicin directa al embrin; con aguja 22 de 1 pulgadas. Inocular directamente al embrin, introduciendo toda la aguja. Podemos tambin abrir toda la cmara, aadir 1 gota de suero fisiolgico agua destilada, para que la membrana frfara; que inicialmente es blanca se haga transparente, introduciendo pinza y levantar la membrana de la cavidad amnitica, observar al embrin e inocular (la membrana es el amnios). Inoculacin en la Cavidad Coriolantoidea: Se practica un agujero en el polo ms ensanchado del huevo para inocular : o Utilizando la cmara natural, inoculando por debajo de frfara que cubre, depositando el lquido sobre la membrana corioalantoidea, usando jeringa de tuberculina y aguja 26 27. o Fabricando una cmara de aire artificial, practicar dos agujeros; uno en el polo ms ensanchado y otro en uno de los costados del huevo en posicin contraria al embrin. Colocar un torniquete en su boquilla y obtener el aire del polo ms ensanchado (cuando sale el aire). La membrana cono alantoidea baja; es decir este se separa ms de la cscara. Evitar abrir demasiado para que no se contamine. Se inocula con ayuda de una jeringa de 25 27 x 1 pulgada. Para inocular se introduce el basal de la aguja y enseguida se inocula el fluido, en la inoculacin se puede girar la jeringa para que el lquido, quede depositado en la membrana, los agujeros son cubiertos con parafina o cera (despus de haber realizado las inoculaciones Resultados: En la prctica, con la inoculacin de los virus New Castle se debio haber realizado una ensayo de Dosis letal 50%, pero por problemas de mala manipulacin, los resultados obtenidos no fueron suficientes para poder calcularlos. Como trabajo, se nos pidi realizar un ejemplo de DL50 y su breve explicacin.

IV.

-

La dosis letal 50 es la cantidad de una sustancia expresada en gr o mgr capaz de matar al 50 % de los animales inoculados. La DL50 es una medida de uso comn en Toxicologa y en Farmacologa, tambin se aplica para el clculo de ttulo de un virus que en ese caso sera la cantidad de virus necesaria para matar al 50% de la poblacin. En algunos casos suele usarse la DL25 o la DL75. 5

Estos son ensayos donde no se cuenta el nmero de partculas infecciosas presentes en el inculo, pero en su lugar se obtiene un valor para el ttulo de ese virus donde la medida est basada en el principio de todo o nada (hay efecto citoptico o no?, est el animal vivo o muerto?). Adems esta se utiliza en virus que sean capaces de matar el 50% de la poblacin de animales. El ttulo viral es definido como aquella dilucin de virus que infecta (o mata) el 50% de la poblacin inoculada. En estos anlisis para determinar el ttulo viral, se utiliza el mtodo de Reed y Muench, el cual es relativamente simple, la frmula que se utiliza es la siguiente: (% infectividad en la dil. Inmediata superior a 50%) - 50% (% infec. En dil. Inmed. Sup. a 50%) (% infec. En dil. Inmed. Inf. A 50%) Distancia proporcional

=

Ahora, para calcular la dosis letal 50 se utiliza la sgte. frmula: CDL50 = - Log (dil. ms cercana y por encima de 50% ) + DPfd

-

Ahora tomenos el sgte. ejemplo:

Al realizarse una prueba de punto lmite con el virus Vaccinia, se inocul a 6 pericotes por cada dilucin al medio, realizndose 6 diluciones (empezando por la dilucin 1/10), la cantidad inoculada fue 0.3 ml. si por acumulacin de valores se obtuvieron los sgtes. resultados:Dilucin N animales

Muertos 5 5 4 3 1 0

Vivos 1 1 2 3 5 6

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

6 6 6 6 6 6

Total muertos 18 13 8 4 1 0

Total vivos 1 2 4 7 12 18

Relacin

% 95% 87% 67% 36% 8% 0%

18/19 13/15 8/12 4/11 1/13 0/18

Entonces el clculo de la dosis letal 50 sera: 1) Primero, ya que tenemos las relaciones de animales vivos y muertos y los porcentajes de mortalidad respectivos, ahora hallamos la distancia proporcional: Los nmeros ms prximos y que estn por encima y por debajo del 50% son: 67% y 36%, entonces, aplicamos frmula: 67 50 67 - 36 = 17 31 = 0.55

6

2) Ahora hacemos el clculo de la dosis letal 50 (CDL50), entonces aplicamos frmula:

CDL50 =

- Log (10-3)

+

0.55 0.55

CDL50 = - (-3) Log10 + CDL50 = CDL50 = 3 + 0.55 3.55

3) Entonces, como el clculo de la dosis letal 50 es 3.55, el logaritmo del ttulo de la dilucin ser: Log DL50 V. Conclusiones: Debido a la mala manipulacin no se pudo realizar el clculo de la dosis letal 50. A travs de la inoculacin seriada de los huevos embrionados y controlando cuantos mueren por cada dilucin se puede formar una tabla que nos servira para poder hallar la dosis letal 50. Referencias: ACTON, J. (1967) Virologa. Edit. Interamericana. Mxico D.F. MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiologa de los Microorganismos. 8 Edic. Edit. Mc Graw Hill. Mexico D.F. PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiologia. 4 edic. Edit. Mc Graw Hill Mexico D.F. = 10-3.55

VI. -

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