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Participación de las bacterias lácticas en la salud humana y en la calidad

alimentaria

6ª Reunión de la Red Temática BAL Libro de Resúmenes

Tarragona, 28-29 junio 2012

Edición:

Manuel Zúñiga Cabrera

Albert Bordons de Porrata-Doria

Tarragona 2012

6 Red BAL

Tarragona 2012

6 Red BAL

Título original:

6ª Reunión de la Red Temática BAL: Participación de las bacterias lácticas en la salud humana y en la calidad alimentaria. Libro de Resúmenes. Tarragona, 28-29 junio 2012 Edición: Manuel Zúñiga Cabrera

Coordinador de la Red BAL, Científico Titular, Departamento de Biotecnología de

Alimentos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, Consejo Superior de

Investigaciones Científicas, Paterna, Valencia

Albert Bordons de Porrata-Doria Catedrático Emérito, Departament de Bioquímica i Biotecnologia, Facultat d’Enologia,

Universitat Rovira i Virgili, Tarragona

Libro financiado por la Acción Complementaria modalidad B, código AC2012-00020, aprobada el 11 de

mayo de 2012, del Ministerio de Economía y Competitividad conjuntamente con el Instituto Nacional de

Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, con cofinanciación del FEDER.

ISBN: 978-84-8424-212-3

Depósito Legal: T. 622-2012

Servicio de Publicaciones de la Universidad Rovira i Virgili

Tarragona, junio 2012

La Red BAL es la Red Española de Bacterias Lácticas y Probióticos, cuyo objetivo

fundamental es fomentar el intercambio de conocimientos y tecnología entre los grupos de

investigación y empresas que investigan activamente en las bacterias lácticas (o bacterias del ácido

láctico), tanto en aspectos básicos como aplicados, relacionados con la salud humana y con la calidad

alimentaria. En la actualidad la Red BAL está compuesta por 155 investigadores de 33 grupos de

investigación de toda España y 12 empresas. Entre otras actuaciones de la Red se realizan Reuniones

periódicas como ésta, que es la 6ª, después de las anteriores celebradas con mucho éxito de

participación en Madrid (2004), Oviedo (2005), Valencia (2007), Granada (2009) y Logroño (2011).

Se puede obtener más información de la RedBAL en: http://redbal.iata.csic.es/

La 6ª Reunión de la Red Temática BAL ha sido realizada con la colaboración de :

Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos

Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Departament de Bioquímica i Biotecnologia

Facultat d’Enologia de Tarragona

Campus deExcelenciaInternacionalCataluña Sur

Campus deExcelenciaInternacionalCataluña Sur

6ª reunión Red BAL, Tarragona 2012

2

PRÓLOGO

En 2002 surgió la iniciativa de organizar un foro de encuentro de los grupos de investigación

españoles que trabajan en el campo de las bacterias lácticas con el fin de fomentar las colaboraciones

entre los grupos de investigación y poner remedio al escaso contacto que existía entre ellos. Aquella

propuesta finalmente cuajó en la constitución de la Red Española de Bacterias Lácticas y Probióticos

(Red BAL) que celebró su primera Reunión en Madrid en 2004. Desde entonces, hemos celebrado

cinco reuniones con un continuo aumento tanto en participantes como en el número y calidad de las

comunicaciones presentadas. Creo que podemos decir sin pecar de soberbios que la Red ha colmado

con creces las expectativas con las que se creó.

Pero vivimos malos tiempos para la ciencia en España. Durante este año, a una mala noticia le ha

seguido otra peor y la incertidumbre ha anidado en el ánimo de muchos investigadores. Muchos

sentimos que la ciencia ha sido abandonada a su suerte y que ya sólo sirve para llenar discursos

hueros. Este año, por primera vez desde que se constituyó Red BAL, celebramos esta reunión sin

ningún apoyo externo. A pesar de todo, la celebración de esta Sexta Reunión en Tarragona demuestra

que no nos hemos desalentado y que estamos dispuestos a seguir adelante por más trabas que

encontremos en el camino. No podemos dejar que se eche a perder lo que hemos conseguido en estos

años con el esfuerzo de todos. Por ello, os animo a seguir apoyando la Red.

A pesar de las dificultades, las comunicaciones presentadas en esta 6ª Reunión avalan el

excelente nivel científico alcanzado por los grupos de investigación de la red. Se nos podría achacar

que seguimos trabajando sobre los mismos temas: el papel de las bacterias lácticas en los alimentos y

la salud pero es innegable que aún queda mucho por hacer y que hemos avanzado considerablemente

en la profundidad del análisis de estos problemas. Cada descubrimiento abre nuevas vías de

investigación y nuestro campo de estudio no es una excepción. En esta reunión encontraremos

estudios que exploran papeles insospechados de las bacterias lácticas en la producción de alimentos y

en la salud humana, estudios que profundizan en la estructura de comunidades microbianas y el papel

de las bacterias lácticas en ellas junto a estudios básicos de su fisiología. Podemos estar satisfechos

de lo conseguido pero debemos aspirar a más: seguir profundizando en los temas de investigación en

curso pero también abrir nuevos campos de estudio y aplicación de las bacterias lácticas.

Para encontrar estas nuevas ideas y para dar a conocer nuestro trabajo a la sociedad, en esta 6ª

Reunión en Tarragona vamos a celebrar también una Jornada de Divulgación abierta a las empresas y

al público en general. Aunque innecesario, conviene enfatizar la importancia de que la sociedad

conozca nuestra labor y por otra parte, que seamos receptivos a las necesidades e intereses de la

sociedad. Así, la Jornada de Divulgación se ha concebido como una vía de comunicación con la

sociedad. Confiemos en que seamos capaces de transmitir nuestra contribución al avance de la

ciencia, las oportunidades para nuevos desarrollos de nuestro trabajo y los beneficios para la sociedad

que se derivan de él. Y sobre todo, confiemos en que sepamos transmitir que si queremos que España

sea un gran país, tendrá que hacer una apuesta decidida por la ciencia de una vez por todas.

Manuel Zúñiga, Coordinador de la Red BAL


3

ÍNDICE Página

LISTA DE PARTICIPANTES en la 6ª REUNIÓN Red BAL 6

RESÚMENES DE LAS COMUNICACIONES ORALES 9

I. BACTERIAS LÁCTICAS Y SALUD 1. Establecimiento de la microbiota intestinal en niños prematuros. Una posible

diana para la acción de probióticos 11 Silvia Arboleya, Nuria Salazar, Nuria Fernández, Gonzalo Solís, Abelardo Margolles, Ana María Hernández Barranco, Clara González de los Reyes-Gavilán, Miguel Guiemonde 2. Diversidad bacteriana en el meconio y heces de niños prematuros. Comparación

entre las técnicas de cultivo y el microarray HitChip 12 Esther Jiménez, Laura Moles, Marta Gómez, Hans G.H.J. Heilig, Leónides Fernández, Willem M. de Vos, Juan M. Rodríguez 3. “Historias de luchas intestinales y el bálsamo de los dioses”, o cómo el aceite de

oliva modula nuestra microbiota 13 Marina Hidalgo, Antonio Cobo, Isabel Prieto, Hikmate Abriouel, Nabil Benomar, Rosario Lucas, Elena Ortega, Antonio Gálvez, Magdalena Martínez Cañamero 4. El transportador de péptidos OppA actúa como una adhesina que media la unión

de Lactobacillus salivarius Lv72 a cultivos de células epiteliales 14 Carla Martín, Rebeca Martín, Susana Escobedo, Evaristo Suárez, Luis M. Quirós 5. Interacción flavan-3-oles – lactobacilos - células intestinales: efecto sobre la

capacidad de adhesión y actividad antiproliferativa 15 M.C. Martínez-Cuesta, I. Bustos, T. García-Cayuela, B. Hernández-Ledesma, M.V. Moreno-Arribas, B. Bartolomé, C. Peláez, T. Requena II. BACTERIAS LÁCTICAS Y ALIMENTOS 6. Caracterización de lactococos aislados de leche cruda de oveja y cabra 17 Daniel Bravo, Eva Rodríguez, Pilar Gaya, Margarita Medina 7. Lactococcus lactis microbiota from the area of PDO Ossau-Iraty 18 Fabienne Feutry, Paloma Torre 8. Aplicación de Lactobacillus reuteri en productos lácteos para la producción in

situ de reuterina 19 J.L. Arqués, S. Langa, I. Martín-Cabrejas, E. Rodríguez, M. Medina

9. Detección y cuantificación de genes de resistencia a antibióticos en productos

lácteos 20 Ana Belén Flórez, Ángel Alegría, Franca Rossi, Susana Delgado, Elena Fernández, Sandra Torriani, Baltasar Mayo


4

10. Implicación del glutatión y del sistema tiorredoxina en la adaptación de Oenococcus oeni al vino 22

Mar Margalef, Meritxell Bordas, Isabel Araque, Nicolas Rozès, Albert Bordons, Cristina Reguant 11. Acidificación biológica de vinos de pH elevado mediante la utilización de

bacterias lácticas 23 O. Lucio, I. Pardo, J.M. Heras, S. Krieger, S. Ferrer

12. Monitorización on-line de la fermentación maloláctica mediante un sistema de

medida ultrasónico 25 Anna Puig, J. García-Álvarez, M.C. Masqué, D.F. Novoa-Díaz, J.A. Chávez, E. Bertran, M.J. García-Hernández, A. Turó, J. Salazar 13. Polifenoles como una alternativa natural a los sulfitos en el control del

crecimiento de bacterias lácticas en vinos: eficacia tecnológica y mecanismos bioquímicos y moleculares implicados 27

Almudena García-Ruiz, Begoña Bartolomé, Carolina Cueva, Juan José Rodríguez-Bencomo, Teresa Requena, Pedro J. Martín-Álvarez, M.Victoria Moreno-Arribas 14. Actividad esterásica de bacterias lácticas de origen vínico 29 Fátima Pérez Martín, Susana Seseña, Pedro Miguel Izquierdo, María Llanos Palop 15. Diversidad genética de las cepas de Lactobacillus pentosus que pueblan los

biofilms de la epidermis de aceitunas verdes estilo sevillano 30 J. Domínguez Manzano, A. León Romero, O. Cruz Gómez, R. Jiménez Díaz 16. Biodiversidad microbiana en fermentaciones de aceitunas verdes de mesa al

estilo "Español" 32 Helena Lucena Padrós, Belén Caballero Guerrero, Antonio Maldonado Barragán, José Luis Ruiz Barba 17. Nuevos cultivos para embutidos fermentados, ¿otra forma de incorporar

probióticos? 33 Raquel Rubio, Anna Jofré, Teresa Aymerich, Belén Martín, Margarita Garriga III. BIOTECNOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE BACTERIAS LÁCTICAS 18. Producción de heteropolisacáridos y riboflavina por cepas de Lactobacillus

aisladas de sidra 35 A. I. Puertas, I. Ibarburu, A. Garzia, I. Berregi, A. Prieto, P. López, Ana Irastorza, M. T. Dueñas 19. Análisis en tiempo real del comportamiento de líneas celulares en presencia de

compuestos bioactivos: interacción de componentes de Bifidobacterium con la línea intestinal HT29 36

Claudio Hidalgo, Borja Sánchez, Abelardo Margolles, Patricia Ruas-Madiedo 20. α-L-Fucosidasas AlfB y AlfC de Lactobacillus casei: caracterización funcional,

cristalización y síntesis de fucosil-oligosacáridos 37 Jesús Rodríguez-Díaz, Antonio Rubio-del-Campo, Francisca Gallego, Gonzalo N. Bidart, Vicente Monedero, Alberto Marina, María Jesús Yebra


5

21. Las BAL como vectores de inmunización oral pasiva frente a rotavirus 38 Mª Cruz Martín, Noelia Martínez, Víctor Ladero, María Fernández, Miguel A. Álvarez 22. Proteinasa de pared de L. paracasei PrtP: una vieja historia con nuevas

perspectivas 39 José María Coll, Christine Bäuerl, Isabel Pérez Arellano, Vicente Monedero, Manuel Zúñiga, Gaspar Pérez Martínez 23. Papel de la proteína Ant sobre la decisión lisis-lisogenia del fago A2 de

Lactobacillus casei 40 Susana Escobedo, Juan Evaristo Suárez, Begoña Carrasco 24. Análisis proteómico de Oenococcus oeni ATCC-BAA1163 y Lactobacillus

plantarum WCFS1 41 Mª Luz Mohedano, Pasquale Russo, Vivian de los Rios, Pilar Fernández de Palencia, Giuseppe Spano, Paloma López 25. Análisis transcriptómico global de la respuesta de Lactobacillus plantarum

WCFS1 al estrés inducido por el ácido p-cumárico 42 Inés Reverón, José Antonio Curiel, Natalia Jiménez, María Esteban-Torres, Blanca de las Rivas, Rosario Muñoz, Félix López de Felipe

26. Respuesta fenotípica y transcriptómica de cepas de BAL a la presencia de etanol

en el medio de cultivo 43 Lorena Díez, Rocío Fernández, Sonia Sáenz, Ana Solopova, Myriam Zarazaga, Carmen Tenorio, Carmen Torres, Oscar P. Kuipers, Fernanda Ruiz-Larrea

27. Participación de los sistemas de dos componentes TC09 y TC12 de Lactobacillus

casei en la respuesta a estrés por péptidos antimicrobianos y en el control de la integridad de la pared celular 44

A. Revilla-Guarinos, A. Staron, S. Gebhard, T. Mascher, M. Zúñiga 28. Mecanismos implicados en la resistencia de Lactococcus lactis a la bacteriocina

Lcn972 45 Clara Roces, Ana B. Campelo, Verónica Pérez, Diego Blanco, Ana Rodríguez, Beatriz Martínez

ÍNDICE DE AUTORES DE LAS COMUNICACIONES 46

1ª JORNADA DIVULGATIVA: ¿ Qué pueden hacer las bacterias lácticas por ti ? 48


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LISTA DE PARTICIPANTES en la 6ª REUNIÓN Red BAL Agrupados por centros de trabajo, y éstos por localización geográfica.

Inscritos Centro

Susana Escobedo Martín Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, Oviedo

Carla Martín Cueto " Juan Evaristo Suárez "

Miguel Ángel Álvarez González Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA), CSIC, Villaviciosa

Patricia Ruas Madiedo "

Ángel Alegría González Cultivos Lácteos Funcionales, IPLA, CSIC, Villaviciosa

Susana Delgado Palacio " Ana Belén Flórez García " Baltasar Mayo Pérez "

Beatriz Martínez DairySafe, IPLA, CSIC, Villaviciosa

Clara González de los Reyes-Gavilán Probióticos, prebióticos y exopolisacáridos, IPLA, CSIC, Villaviciosa

María Teresa Dueñas Chasco Facultad de Ciencias Químicas, Universidad del País Vasco, San Sebastián

Idoia Ibarburu López " Ana Isabel Puertas González "

Fabienne Feutry Universidad Pública de Navarra, Pamplona

Paloma Torre "

Fernanda Ruiz Larrea Universidad de La Rioja e Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (ICVV, CSIC-UR), Logroño

Carmen Tenorio "

Margarita Garriga Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA), Monells

Anna Jofré " Raquel Rubio "

Susana Martín Orúe Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra

M. Carme Masqué Tell Institut Català de la Vinya i el Vi (INCAVI), Vilafranca del Penedès y Reus

Anna Puig Pujol "

M. Isabel Araque Facultat d'Enologia, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona

Meritxell Bordas " Albert Bordons "


7

Albert Hurtado " Mar Margalef " Cristina Reguant " Nicolas Rozès " Paloma Toraño "

Olga Lucio Costa ENOLAB, Facultad de Biología, Universitat de València, Valencia

Isabel Pardo Cubillos "

Christine Bäuerl Bacterias Lácticas y Probióticos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), CSIC, Valencia

Gonzalo Bidart " Vicente Monedero García " Gaspar Pérez Martínez " Ainhoa Revilla Guarinos " Jesús Rodríguez Díaz " María Jesús Yebra " Manuel Zúñiga Cabrera "

Blanca de las Rivas González del Rey Biotecnología Bacteriana, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN), CSIC, Madrid

María Esteban Torres " Natalia Jiménez Martín " Félix López de Felipe Toledano " Rosario Muñoz Moreno " Inés Reverón Poján "

M. Carmen Martínez Biología Funcional de Bacterias Lácticas, Instituto de Investigación en Ciencias de Alimentación (CIAL), CSIC-UAM, Madrid

Carmen Peláez " Teresa Requena "

M. Victoria Moreno Arribas Biotecnología Enológica Aplicada, CIAL, CSIC-UAM, Madrid

Paloma López García Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid

Mª Luz Mohedano Bonilla "

Juan Luís Arqués Orobón Dpto. Tecnología de Alimentos, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Madrid

Daniel Bravo Vázquez " José Mª Landete Iranzo " Antonia Mª Picón Gálvez "

Rosa del Campo Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria, Madrid


8

Rebeca Arroyo Rodríguez PROBILAC, Universidad Complutense de Madrid, Madrid

Marta Gómez Delgado " Esther Jiménez Quintana " Virginia Martín Merino " Laura Moles Alegre " Juan Miguel Rodríguez Gómez " Ana Soto Carrión "

Fátima Pérez Martín Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Universidad de Castilla La Mancha, Toledo

Susana Seseña Prieto "

Hikmate Abriouel Hayani Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad de Jaén, Jaén

Nabil Benomar " Antonio Gálvez " Magdalena Martínez Cañamero "

Mercedes Maqueda Abreu Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada

Manuel Martínez Bueno " Eva Valdivia Martínez "

Rufino Jiménez Díaz Biofilms, Instituto de la Grasa, CSIC, Sevilla

Helena Lucena Padrós Instituto de la Grasa, CSIC, Sevilla

José Luis Ruiz Barba "

Total: 78 inscritos

Por procedencia geográfica:

Asturias 11 País Vasco 3

Navarra 2 Rioja 2

Cataluña 14 Comunidad Valenciana 10

Madrid 24 Castilla La Mancha 2

Andalucía 10

Por organismos: Universidades públicas 35 CSIC 27 Centros mixtos Univ.-CSIC 6 Otros OPI 9


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RESÚMENES DE LAS COMUNICACIONES ORALES

6ª reunión Red BAL, Tarragona 2012 I. Bacterias Lácticas y Salud

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I. BACTERIAS LÁCTICAS Y SALUD


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1. Establecimiento de la microbiota intestinal en niños prematuros. Una posible diana para la acción de probióticos

Silvia Arboleya1, Nuria Salazar1, Nuria Fernández2, Gonzalo Solís3, Abelardo Margolles1, Ana María Hernández Barranco1, Clara González de los Reyes-Gavilán1 y Miguel Guiemonde1 1Departamento de Microbiología y Bioquímica de Productos Lácteos. IPLA-CSIC. Villaviciosa 2Servicio de Pediatría, Hospital de Cabueñes, SESPA, Gijón 3Servicio de Pediatría, Hospital Universitario Central de Asturias, SESPA, Oviedo

La colonización microbiana del intestino del niño juega un papel determinante en el desarrollo de este órgano y del sistema inmune del recién nacido. La microbiota intestinal de niños nacidos a término y alimentados con leche materna se considera actualmente como referente de salud en neonatos. En contraste con esto, la inmadurez del intestino, el frecuente uso de antibióticos y de leche de fórmula y las largas estancias en hospitales dificultan en gran medida el desarrollo correcto de la microbiota intestinal en niños prematuros.

En nuestro trabajo comparamos el establecimiento de la microbiota intestinal en niños prematuros durante los tres primeros meses de vida con el de niños nacidos a término y alimentados con leche materna. La composición microbiana se determinó en heces por PCR cuantitativa (qPCR) y análisis metagenómico y los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) se cuantificaron por cromatografía de gases acoplada a detector de ionización de llama/espectrometría de masas. Todas las técnicas empleadas permitieron diferenciar claramente el grupo de los prematuros respecto al de los niños a término. Los prematuros mostraron niveles más elevados de anaerobios facultativos y menores niveles de anaerobios estrictos (Bifidobacterium, Bacteroides y Atopobium), así como menores niveles de AGCC durante los primeros días de vida. Las profundas alteraciones detectadas en el proceso de establecimiento de la microbiota en niños prematuros, sugieren la posibilidad de implementar estrategias de intervención que puedan contrarrestarlas. Como primera aproximación en este sentido, se probaron 16 cepas de Bifidobacterium en un modelo de cultivo en discontinuo (batch) para determinar su capacidad de contrarrestar en estas condiciones las desviaciones identificadas previamente en heces de prematuros comparadas con las de niños a término. Tres cepas pertenecientes a la especie Bifidobacterium bifidum aisladas de heces de niños, así como dos cepas de la especie Bifidobacterium breve aisladas de leche materna, provocaron los cambios más favorables en los perfiles de AGCC así como en las poblaciones de anaerobios facultativos y anaerobios estrictos. Estas cepas se consideran candidatos para continuar su estudio in vitro e in vivo.

Finalmente, nuestros resultados sugieren que el estrés oxidativo en el intestino inmaduro de los niños prematuros podría constituir también una diana importante para el desarrollo de estrategias de modulación del proceso de establecimiento de la microbiota intestinal en estos niños.

Bibliografía: S. Arboleya, A. Binetti, N. Salazar, N. Fernández, G. Solís, AM Hernández-Barranco, A. Margolles, C.

G. de los Reyes-Gavilán, M. Gueimonde. 2012. Establishment and development of the intestinal microbiota in preterm neonates. FEMS Microbiology Ecology. 79, 763-772.

S. Arboleya, L. Ang, A. Margolles, L. Yiyuan, Z. Dongya, X. Liang, G. Solís, N. Fernández, C. G. de los Reyes-Gavilán, M. Gueimonde. Deep 16S rRNA metagenomics and quantitative PCR analyses of the premature infant fecal microbiota. Anaerobe (aceptado para su publicación)

S. Arboleya, N. Salazar, G. Solís, N. Fernández, A M Hernández-Barranco, I. Cuesta, M. Gueimonde, C. G. de los Reyes-Gavilán. Assessment of intestinal microbiota modulation ability of Bifidobacterium strains in in vitro fecal batch cultures from preterm neonates. Anaerobe (en revisión).

S. Arboleya, G. Solís, N. Fernández, C.G. de los Reyes-Gavilán, M. Gueimonde. Intestinal oxidative stress in preterm neonates: a target for microbiota modulation?. Gut Microbes (Addendum, enviado).

Palabras clave: niños prematuros, heces, Bifidobacterium, anaerobios facultativos, anaerobios, ácidos grasos de cadena corta


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2. Diversidad bacteriana en el meconio y heces de niños prematuros. Comparación entre las técnicas de cultivo y el microarray HitChip

Esther Jiménez, Laura Moles, Marta Gómez, Hans G. H. J. Heilig, Leónides Fernández, Willem M. de Vos, Juan M. Rodríguez

Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid. Laboratory of Microbiology, Wageningen University, 6703T Wageningen, Holanda

La colonización microbiana del intestino humano es un proceso complejo que se inicia, a pequeña escala, en las últimas fases del periodo fetal y se intensifica drásticamente tras el nacimiento debido al contacto del neonato con microorganismos procedentes de las microbiotas vaginal, intestinal y/o mamaria de la madre, y del medio ambiente que le rodea. La composición de la microbiota neonatal puede ejercer una notable influencia a corto, medio y largo plazo en diversos procesos del hospedador, incluyendo el metabolismo, la protección frente a enfermedades infecciosas o la correcta maduración del sistema inmunológico. Existen numerosos estudios acerca de la microbiota de niños nacidos a término, pero aún es muy desconocida la composición microbiana del meconio de niños prematuros y su evolución en las primeras semanas de vida. En este contexto, la finalidad de este trabajo fue analizar la diversidad bacteriana del meconio de 14 niños prematuros y compararla con la de sus propias heces a las tres semanas de edad. Para ello se emplearon técnicas de cultivo y técnicas moleculares, fundamentalmente la micromatriz HitChip (Human Intestinal Tract Chip).

El cultivo microbiológico de ambos tipos de muestras permitió el aislamiento de ciertas bacterias Gram-negativas (E. coli, Serratia spp.) y Gram-positivas (Staphylococcus spp., Enterococcus spp.). Sin embargo, el número de bacterias lácticas o estreptococos obtenidos a partir de las mismas fue muy escaso.

Con relación al microarray HitChip, los géneros predominantes en las muestras de meconio fueron Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Bifidobacterium y Klebsiella mientras que, en las de heces, las bacterias detectadas pertenecían a los géneros Escherichia, Bifidobacterium, Enterococcus (2), Clostridium y Streptococcus. El índice de Shannon-Weaver reveló que la diversidad bacteriana era menor en las muestras de meconio con respecto a las de heces. Más concretamente, se observaron diferencias notables en la abundancia relativa de determinados géneros de bacterias lácticas (Lactobacillus, Lactococcus) y de Streptococcus. Globalmente, los resultados de este trabajo indican una alteración del patrón de colonización inicial en los neonatos prematuros con respecto al descrito en la literatura para los niños nacidos a término. El uso de antibióticos durante los primeros días de vida o la propia inmadurez de estos niños pueden influir en la composición de la microbiota intestinal en este periodo de vida. En cualquier caso, los resultados obtenidos en este trabajo subrayan la importancia de combinar distintas técnicas para el estudio de un mismo ecosistema microbiano.

Palabras clave: prematuros, meconio, heces, HitChip, bacterias lácticas


13

3. “Historias de luchas intestinales y el bálsamo de los dioses”, o cómo el aceite de oliva modula nuestra microbiota Marina Hidalgo1, Antonio Cobo1, Isabel Prieto2, Hikmate Abriouel1, Nabil Benomar1, Rosario Lucas1, Elena Ortega1, Antonio Gálvez1, Magdalena Martínez Cañamero1 1 Área de Microbiología, 2 Área de Fisiología, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad de Jaén

El aceite de oliva es el eje fundamental en torno al cual se elaboran la mayoría de los platos de la dieta mediterránea. Esta importancia del aceite de oliva es indiscutible y es debida a sus muchas virtudes, tanto gastronómicas como saludables. Nutricionalmente es el alimento que aporta más calorías a nuestra dieta, por lo que podríamos decir que la dieta mediterránea no existiría sin el aceite de oliva. Entre sus componentes destaca el ácido oleico, un ácido graso monoinsaturado. El aceite de oliva es el único producto natural sobre la tierra que está constituido, en su gran mayoría, por dicho ácido graso. Alternativamente, las grasas de origen animal, como la mantequilla, son también la base calórica de otras dietas, siendo su componente principal el colesterol.

Resultaría natural que una diferencia tan básica en la fracción grasa de ambas dietas produjera diferencias apreciables en la composición de la microbiota intestinal y que ello tenga consecuencias fisiológicas. Por ejemplo, dos de los problemas de salud más importantes en los países desarrollados en la actualidad, muy relacionados entre si, son la obesidad y la diabetes, y existen motivos razonados para pensar que una dieta basada en el aceite de oliva (dieta mediterránea) modifica la microbiota intestinal con consecuencias positivas que afectan directamente a la incidencia de estas enfermedades en la población.

Por ello, hemos abordado una línea de trabajo sobre la influencia del aceite de oliva, en comparación con otras grasas, sobre la población bacteriana del intestino. Para ello, hemos alimentado ratones con tres dietas altas en grasas (aceite de oliva virgen, refinado y mantequilla) así como con una dieta control, estudiando las poblaciones microbianas en heces. Presentamos los resultados obtenidos hasta la fecha con especial atención a la población de bacterias lácticas, tanto con métodos dependientes como independientes de cultivo, y su relación con diferentes variables fisiológicas.

Agradecimientos: Este estudio ha sido financiado por el Plan Propio de la Universidad de Jaén (PP2009/13/03) y por la CEIC de la Junta de Andalucía (PI Excelencia_2010 AGR 6340)

Palabras clave: microbiota intestinal, aceite de oliva, ecología microbiana


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4. El transportador de péptidos OppA actúa como una adhesina que media la unión de Lactobacillus salivarius Lv72 a cultivos de células epiteliales

Carla Martín1, Rebeca Martín1, Susana Escobedo1, Evaristo Suárez1 y Luis M. Quirós1,2 1Área de Microbiología. Universidad de Oviedo; 2Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (IUOPA).

La adherencia de los microorganismos de la microbiota autóctona a las mucosas es un requisito imprescindible para la colonización estable de las cavidades orgánicas, ya que el barrido que llevan a cabo los fluidos que discurren por ellas podría eliminarlos de la superficie epitelial. Por otro lado, constituyen una defensa de primer orden frente al establecimiento de organismos foráneos, previniendo así sus posibles efectos patológicos.

En una comunicación anterior (Workshop “Probióticos y Salud: Evidencia Científica”, 2010, Madrid) habíamos indicado que los proteoglicanos de la superficie celular eucariota actúan como receptores específicos para los lactobacilos de origen intestinal y vaginal, como se demostró a través de la interferencia de su adherencia a cultivos de células HeLa y HT-29 por glicosaminoglicanos solubles.

Dado que la heparina es un glicosaminoglicano y que existen matrices de cromatografía que la presentan como ligando, nos planteamos la posibilidad de usarlas en columnas de afinidad que pudieran retener las adhesinas bacterianas que participan en el reconocimiento de los receptores eucarióticos. Para ello, se propagó la cepa Lactobacillus salivarius Lv72, de origen vaginal, en medio MRS hasta fase exponencial tardía, se lavaron las células y se lisaron por tratamiento sucesivo con mutanolisina y ruptura mecánica en una prensa de French, en presencia de un coctel comercial de inhibidores de proteasas. Los restos celulares se ultracentrifugaron, se resuspendieron en tampón con lisozima (5mg/ml) y e incubaron a 37ºC durante una noche, pasada la cual se trataron con Tritón X-100 durante 30 min. El sobrenadante obtenido se cargó en la columna de heparina, que se eluyó con un gradiente de NaCl (0 – 2 M). Se tomaron las fracciones obtenidas por encima de 0,5 M NaCl y se ensayó la capacidad de las proteínas presentes en las mismas de interferir con la adherencia del lactobacilo a cultivos de células HeLa. Las proteínas de las fracciones interferentes se separaron por cromatografía de intercambio aniónico y se repitió el ensayo de inhibición de la adherencia. Así se obtuvo una fracción en que solo se observaba una banda en SDS-PAGE, que se identificó por MALDI-TOF (MS) como homóloga al presunto transportador de péptidos OppA de L. salivarius UCC118, cuya masa molecular sería de unos 60 kDa y que aparece como un monómero en solución.

Para comprobar si realmente OppA de L. salivarius Lv72 era una adhesina, amplificamos la secuencia del gen correspondiente, la insertamos en el vector de expresión pRSETb, la sobreproducimos en Escherichia coli BL21 (DE3)/pLysS y la purificamos, tras lisis de los cultivos, mediante unión a una columna con heparina como ligando y elución con un gradiente de NaCl. OppA eluyó a una concentración 0,8 M de sal. Tras diálisis, se determinó la capacidad de la proteína purificada para interferir con la adherencia de L. salivarius a cultivos de células HeLa. A los controles se les añadieron concentraciones iguales de albúmina bovina. El resultado obtenido indica que OppA inhibe la unión entre ambos tipos de células, en un proceso dependiente de la concentración utilizada de la proteína, lo que demuestra que realmente es una adhesina que participa en el reconocimiento específico de los receptores de la superficie epitelial.

Palabras clave: Microbiota autóctona, Lactobacillus, adherencia, OppA, adhesinas, glicosaminoglicanos


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5. Interacción flavan-3-oles – lactobacilos - células intestinales: efecto sobre la capacidad de adhesión y actividad antiproliferativa

Martínez-Cuesta, M.C., Bustos, I., García-Cayuela, T., Hernández-Ledesma, B., Moreno-Arribas, M.V., Bartolomé, B., Peláez, C., Requena, T.

Biología Funcional de Bacterias Lácticas. Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL) (CSIC-UAM). C/Nicolás Cabrera 9, Campus Cantoblanco, 28049, Madrid. [email protected]

Los flavan-3-oles constituyen uno de los principales grupos de polifenoles que son ingeridos en la dieta, siendo de gran interés por sus posibles efectos beneficiosos en la salud. La bioactividad de estos compuestos in vivo depende en gran medida de su biodisponibilidad, absorción y metabolismo en el individuo después de su ingestión. La microbiota presente en el tracto intestinal puede jugar un papel esencial en estos procesos al transformar estos compuestos fenólicos en metabolitos más bioactivos y con distinta significación fisiológica. Paralelamente a este metabolismo microbiano, los polifenoles de la dieta también pueden interaccionar con la microbiota modificando su composición y/o actividad así como la capacidad de colonización de las diferentes bacterias intestinales.

En este trabajo se ha pretendido evaluar la interacción flavan-3-oles-epitelio intestinal-bacterias lácticas mediante el estudio del papel de los flavan-3-oles (formas monoméricas y procianidinas díméricas), sobre la adhesión de potenciales cepas probióticas de lactobacilos a células intestinales humanas (Caco-2 y HT-29), así como la actividad antiproliferativa de estos compuestos sobre las líneas celulares. Asimismo, se ha profundizado en el estudio del metabolismo de estos compuestos por Lactobacillus plantarum IFPL935, cuya capacidad de metabolizar estos compuestos se ha comprobado en ensayos realizados in vitro en medio de cultivo.

Los resultados han mostrado que la actividad antiproliferativa de los flavan-3-oles depende tanto de su estructura química (grupos galato y grado de polimerización) como del nivel de diferenciación de las líneas celulares ensayadas. Asimismo, mientras que ninguno de los compuestos ensayados inhibió el crecimiento de las cepas de lactobacilos estudiadas, se constató que el efecto sobre la capacidad de adhesión variaba enormemente entre cepas y líneas celulares. Todos estos datos sugieren el potencial papel de los flavan-3-oles para modular la microbiota intestinal modificando su capacidad de adhesión. Asimismo, en presencia de células intestinales se confirmó la capacidad de L. plantarum IFPL935 de metabolizar estos polifenoles de la dieta observándose la formación de nuevos metabolitos.

Palabras clave: flavan-3-oles, lactobacilos, microbiota intestinal

6ª reunión Red BAL, Tarragona 2012 II. Bacterias Lácticas y Alimentos

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II. BACTERIAS LÁCTICAS Y ALIMENTOS


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6. Caracterización de lactococos aislados de leche cruda de oveja y cabra

Daniel Bravo, Eva Rodríguez, Pilar Gaya y Margarita Medina Departamento de Tecnología de Alimentos, INIA, Carretera de la Coruña km 7, 28040 Madrid

Con el fin de obtener nuevas cepas para su aplicación como cultivos iniciadores de interés en tecnología láctea, se han caracterizado un total de 116 lactococos aislados a partir de muestras de leche de oveja y cabra obtenidas en diferentes fábricas de queso de leche cruda. Los aislados se identificaron a nivel de especie por PCR y su diversidad genética se evaluó mediante PFGE. Se estudió la actividad acidificante y la actividad proteolítica en leche, así como la capacidad de producción de bacteriocinas.

Lactococcus lactis subsp. lactis fue el principal genotipo aislado de leche de oveja (30 aislados) y el único que se detectó en leche de cabra (67 aislados). El resto de aislados de leche de oveja se identificaron como L. lactis subsp. cremoris (16) y L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis (3). Se observó una gran diversidad génica, identificando 59 pulsotipos diferentes. La mayoría de los aislados presentaron actividades acidificante y proteolítica moderadas, en consonancia con su origen. Únicamente 3 aislados dieron lugar a valores de pH, en leche reconstituida al 10%, inferiores a 5,4 tras 6 h de incubación a 30ºC. En la evaluación del olor de los cultivos en leche por un panel de catadores, no se detectó la presencia de aromas desagradables.

Por otra parte, se encontraron 13 aislados productores de bacteriocinas, de los cuales 11 se identificaron como L. lactis subsp. lactis y 2 como L. lactis subsp. cremoris. Se adscribieron a 4 patrones de PFGE diferentes. Mediante PCR se identificó la presencia simultánea de los genes precursores de nisina Z y lacticina 481 en 10 de los L. lactis subsp. lactis pertenecientes a dos pulsotipos distintos. Se confirmó la producción de ambas bacteriocinas mediante semipurificación con columnas Sep-Pak, y se detectó su actividad utilizando indicadores específicos.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se han seleccionado algunos lactococos con mayor potencial tecnológico para su evaluación como cultivo iniciador en la elaboración de quesos. Asimismo, la coproducción de dos bacteriocinas por una misma cepa se considera una característica de interés en seguridad alimentaria, apuntando a la utilidad de las cepas coproductoras de nisina y lacticina como cultivos bioprotectores en tecnología de productos lácteos.

Palabras clave: Lactococcus, cultivos iniciadores, nisina, lacticina 481


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7. Lactococcus lactis microbiota from the area of PDO Ossau-Iraty Fabienne Feutry, Paloma Torre

Área de Nutrición y Bromatología, Departamento de Ciencias del Medio Natural, Universidad Pública de Navarra, Campus Arrosadía s/n, 31006 Pamplona, Navarra, Spain

Ossau-Iraty cheese is one of two French PDO ewe’smilk cheeses. It is a ripened, uncooked and pressed ewe’s milk cheese. It is produced in southwestern France, in a limited geographic area comprising the Basque Country and the Bearn. It is manufactured from raw or pasteurized milk and coagulated by animal rennet.

Lactococci of the Lactococcus lactis (Lc. lactis) species are of great interest in the manufacture of Ossau-Iraty cheese. Indeed, these Generally Recognized as Safe (GRAS) (Casalta and Montel 2008) lactic acid bacteria (LAB) grew during the first stage of manufacture of this cheese and maintained in the beginning of ripening (Feutry et al., 2011). Moreover, many studies showed the novel potential properties of lactococci from natural dairy products and their potential application in the manufacture of traditional products.

In a previous study (Feutry et al., 2011), lactococci population was counted from ewe’s raw milks from Ossau-Iraty cheese area and it did not exceed 2 log10 CFU/mL. The protracted chilled strorage have been hypothesized to explain these low levels. Consequently, the Lc. lactis microbiota from ewe’s milks produced in the Ossau-Iraty cheese area was focused and investigated in this study according several aspects: levels, genotypic diversity and geographical distribution. Thirty-two milk samples from 32 farms spread over 3 sub-areas (A, B, C) were collected after first milking during the same period. Lactococci were isolated from modified M17L medium. Lc. lactis strains were identified and quantified with a combination of species and sub-species specific Polymerase Chain Reaction (PCR) and PCR amplification of repetitive bacterial DNA elements (Rep-PCR).

Lc. lactis was detected in 62% of the milk samples. Levels varied between 1.9 and 5.2 log10 cfu mL-1 and were below 4 log10 cfu mL-1 in 75% of them. The genotype of subspecies lactis was represented twice as often (119 isolates; 66%) as the cremoris genotype (61 isolates; 34%). Moreover, in 10 milk samples, only the lactis genotype was detected. No isolate belonging to the biovar.diacetylactis was identified. Milks containing Lc. lactis hosted 1 to 4 distinct strains. Except for two strains, each strain was found in milk from only one farm. Lc. lactis strains were detected in only 33% of the milks from C sub-area while they were retrieved in 70% and 90% of the milks collected from A and B sub-areas respectively.

These results raise questions as to the environmental factors that influence such natural microbiota diversity and the impact on cheese characteristics.

Palabras clave: Lactococcus lactis, level, diversity, Rep-PCR, technological, ewe’s milk


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8. Aplicación de Lactobacillus reuteri en productos lácteos para la producción in situ de reuterina

Arqués, J.L., Langa, S., Martín-Cabrejas, I., Rodríguez, E., Medina, M.

Dpto. Tecnología de Alimentos, INIA, Ctra. La Coruña Km 7, Madrid 28040

La reuterina (β-hidroxipropionaldehido, β-HPA) es un compuesto antimicrobiano de gran interés

potencial en alimentos. La reuterina es excretada por algunas cepas de Lactobacillus reuteri durante el metabolismo anaeróbico del glicerol y es activa frente a un amplio espectro de bacterias patógenas y alterantes, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Su producción in situ en los alimentos mediante la aplicación de L. reuteri y glicerol se considera una alternativa a su adición directa como bioconservante.

Se estudió la producción de reuterina de 5 pulsotipos de L. reuteri de la colección de cultivos del INIA en presencia de fermentos comerciales de yogur y queso en leche desnatada con cantidades crecientes de glicerol (0, 10, 25, 50, 100 y 250 mM), a las 24 h en anaerobiosis a 37ºC. La cantidad de glicerol en leche se optimizó en 50 mM para todos los casos.

En yogures elaborados con leche suplementada con 50 mM de glicerol y con las diferentes cepas de L. reuteri al 1% como adjuntos al fermento, se observaron los valores más altos de reuterina (1,1-1,7 mM) con las cepas L. reuteri INIA P570, INIA P572 e INIA P579. Se detectó actividad antimicrobiana empleando Escherichia coli K12 como cepa indicadora en los yogures con L. reuteri INIA P570 a los 3 y 6 d, y en los yogures con L. reuteri INIA P572 o INIA P579 a los 9, 14 y 21 d de refrigeración. Los niveles de L. reuteri se mantuvieron entre 5 y 6 log ufc/ml hasta el final de la refrigeración, excepto en el caso de L. reuteri INIA P569, que descendió por debajo de 4 log ufc/ml.

En quesos modelo elaborados con leche suplementada con 50 mM de glicerol se observaron los niveles más altos de reuterina (4,2-5,7 mM) con las cepas INIA P572 e INIA P579 en quesos de 10 - 20 d. La mayor actividad antimicrobiana se registró en los quesos de 10 y 15 d fabricados con estas mismas cepas.

Según nuestros resultados, las cepas seleccionadas de L. reuteri son capaces de excretar reuterina en yogur y queso modelo fabricados con fermentos comerciales y en presencia de una cantidad optimizada de glicerol en leche de 50 mM. En una primera valoración sensorial, ninguna de las cepas objeto de estudio dio lugar a olores desagradables. Las cepas L. reuteri INIA P572 y P579 están actualmente siendo evaluadas como cultivos protectores frente a microorganismos patógenos en productos lácteos.

Palabras clave: reuterina, Lactobacillus reuteri, productos lácteos, bioprotección


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9. Detección y cuantificación de genes de resistencia a antibióticos en productos lácteos

Ana Belén Flórez1, Ángel Alegría1,2, Franca Rossi2, Susana Delgado1, Elena Fernández1, Sandra Torriani2, y Baltasar Mayo1

Departamento de Microbiología y Bioquímica de Productos Lácteos, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Carretera de Infiesto, s/n, 33300-Villaviciosa, Asturias, España1, Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di Verona, Strada Le Grazie, 15, 37134-Verona, Italia2 Introducción. La resistencia a antibióticos en microorganismos oportunistas y patógenos es un problema de salud pública a escala mundial que complica y encarece el tratamiento de las enfermedades infecciosas (Levy and Marshall, 2004). La resistencia a antibióticos en los microorganismos comensales y beneficiosos no constituye en sí misma una preocupación. Sin embargo, estas poblaciones podrían servir de reservorios de determinantes de resistencia que, en último término, se pueden transferir a los patógenos. De hecho, varios autores creen que la cadena alimentaria es una de las principales vías de transmisión de genes de resistencia, sea durante la elaboración de los alimentos o durante el tránsito intestinal (Teuber et al., 1999; Salyers et al., 2004). En general, el análisis de la resistencia a antibióticos implica el aislamiento de los microorganismos y su ensayo frente al antibiótico de interés. En algunos ecosistemas, sin embargo, se estima que una mayoría de microorganismos no es cultivable, incluyendo los ecosistemas alimentarios (Justé et al., 2008). Con el fin de paliar estas limitaciones se han desarrollado una serie de técnicas moleculares cultivo-independientes (DGGE, qPCR, metagenómica funcional, etc.) para la caracterización microbiológica de estos hábitats. Estos métodos se están comenzando a aplicar también a la detección y cuantificación de determinantes de resistencia a antibióticos. Objetivos. En este trabajo, que se ha realizado en parte mediante una Acción Integrada entre España e Italia (IT2009-0080), nos hemos marcado dos objetivos complementarios. Por un lado, la identificación y cuantificación de genes de resistencia a los antibióticos tetraciclina y eritromicina, cuya resistencia está ampliamente extendida entre las bacterias ácido-lácticas (Ammor et al., 2007). En un segundo objetivo pretendemos hacer un catálogo de los genes de resistencia (resistoma) presentes en nuestro queso modelo por excelencia, el queso de Cabrales. Material y Métodos. Quesos. Se han utilizado 10 quesos españoles (Cabrales, Zamorano, Majorero, Mahón, Torta del Casar, Manchego, Ibores, Garrotxa, Boffard y Monteoro) y 10 quesos italianos (Gorgonzola dulce, Gorgonzola picante, Caprino, Quartirolo Lombardo, Pecorino Sardo, Grana Padano, Montasio, Monte Veronese, Asiago y Taleggio) procedentes de regiones distintas, elaborados con distintos tipos de leche y con diversas tecnologías, incluyendo queso de leche cruda y leche pasteurizada. Análisis microbiológicos. Los quesos se sometieron a un análisis microbiológico convencional en medios selectivos y diferenciales suplementados y no suplementados con antibióticos. Aislamiento de ADN. Se aisló ADN microbiano total directamente de las muestras de queso, así como de los microorganismos de las placas de recuento de aerobios totales (PCA). PCR específicas. La presencia de determinantes de resistencia a tetraciclina y eritromicina se investigó mediante reacciones de PCR, con oligos específicos para genes de resistencia a tetraciclina (tetM, tetW, tetO, tetS, tetK y tetL) y eritromicina (ermB, ermF, ermA y ermC). DGGE y qPCR. La técnica de DGGE se utilizó para estudiar la heterogeneidad de los genes de resistencia a tetraciclina, y la técnica qPCR para la cuantificación de éstos en el ADN total del queso. Metagenómica funcional. Se ha construido una librería génica con ADN total de un queso Cabrales en el vector pCC1FOS. La librería se transformó en Escherichia coli y se han seleccionado los clones que confieren resistencia a tetraciclina. Resultados y Discusión. El número de microorganismos resistentes a tetraciclina y eritromicina ha sido muy variable para las distintas poblaciones de bacterias y en los distintos quesos. El rango de resistentes a tetraciclina y eritromicina fluctuaba entre 102y 106 ufc/g de queso en las placas de PCA (bacterias aeróbicas totales). Este mismo rango para los recuentos en MRS (bacterias lácticas) se situó entre 102 y 105 ufc/g. Las poblaciones resistentes de Enterococcus (Slanetz and Blartey) y Staphylococcus (Baird-Parker) variaba entre 102 y 104 ufc/g. En general, el número de resistentes estaba muy relacionado con el tratamiento de la leche de elaboración, siendo mayor en los quesos elaborados con leche cruda.


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Mediante las reacciones de PCR específicas se obtuvo amplificación positiva para uno o más genes de resistencia a tetraciclina en todos los quesos, excepto en los quesos italianos Gorgonzola dulce, Grana Padano y Montasio. En los quesos Cabrales, Zamorano, Torta del Casar, Boffard, Pecorino Sardo y Asiago se detectaron al menos 4 determinantes genéticos distintos para este antibiótico. El principal mecanismo involucrado en la resistencia fue la presencia de los genes de protección ribosomal tetS, tetM y tetW. El gen de protección ribosomal tetO se detectó en dos quesos españoles y en dos quesos italianos. En algunos quesos se detectaron también, los genes tetK y tetL que codifican para sistemas efflux. En cuanto a genes de resistencia a eritromicina, el gen ermB parece estar ampliamente extendido tanto en quesos españoles como en italianos, detectándose en todos excepto en tres (Mahón, Quartirolo Lombardo y Pecorino Sardo). También se detectó el gen ermF en 7 de los 10 quesos italianos, aunque solo se observó amplificación positiva para este gen en un queso español (Boffard).

En estos momentos, estamos tratando de analizar el ADN total de los quesos mediante PCR-DGGE, utilizando oligonucleótidos para los genes tetS, tetM, tetW y tetO. Lo que se pretende es poner a punto un método capaz de detectar variantes de cada uno de estos genes. Posteriormente, el ADN se utilizará también para la cuantificación por qPCR de los genes de resistencia más habituales, y los resultados se compararán con los que se obtengan con primers universales para el gen que codifica el ARNr 16S.

Mediante la librería metagenómica hemos obtenido un total de 3,6x105 colonias resistentes a tetraciclina. El tamaño medio del inserto fue de aproximadamente 30 kpb, lo que representa unos 2100 genomas bacterianos (estimando un tamaño medio de 5 Mb). Se ha aislado DNA de 113 clones, de los que se han caracterizado sus perfiles de restricción con el enzima EcoRI. Se ha encontrado una gran diversidad de perfiles, aunque muchos de ellos pueden tener bandas de ADN comunes (y, por tanto, contener el mismo gen de resistencia). La secuenciación de uno de los extremos de los 113 insertos y la comparación de secuencias sugiere que el 99% de los insertos contiene ADN de enterobacterias (Escherichia, Salmonella, etc.). Dada su mayor carga de resistencias, este grupo podría ser la fuente de transferencia de genes de resistencia a antibióticos a otros grupos bacterianos del queso. En la actualidad, hemos iniciado la caracterización de los genes de resistencia que contienen y de sus regiones adyacentes, de dónde se esperan obtener datos de los mecanismos y vías de transferencia Bibliografía Ammor, M.S., Flórez, A.B., and Mayo, B. 2007. Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacteria. Food Microbiol. 24: 559-570. Levy, S.B., and Marshall, B. 2004. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nat. Med. 10: 122-129. Justé, A., Thomma, B.P., and Lievens, B. 2008. Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in food-associated matrices and processes. Food Microbiol. 25: 745-761. Salyers, A.A., Gupta, A., and Wang, Y. 2004. Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic resistance genes. Trends Microbiol. 12: 412-416. Teuber, M., Meile, L., and Schwarz, F. 1999. Acquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria from food. Antonie van Leeuwenhoek 76: 115-137. Palabras clave: seguridad alimentaria, resistencia a antibióticos, resistencia a tetraciclina, resistencia a eritromicina, productos lácteos, microbiología cultivo-independiente


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10. Implicación del glutatión y del sistema tiorredoxina en la adaptación de Oenococcus oeni al vino

Mar Margalef, Meritxell Bordas, Isabel Araque, Nicolas Rozès, Albert Bordons, Cristina Reguant

Departament de Bioquímica i Biotecnologia, Facultat d’Enologia, Universitat Rovira i Virgili, Campus Sescelades N4, c/ Marcel·lí Domingo 1, 43007 Tarragona. E-mail: [email protected]

Oenococcus oeni es la principal especie responsable de la fermentación maloláctica (FML) del vino. Pese a ser la mejor adaptada al vino, los cultivos inoculados no siempre se desarrollan debido a las condiciones inhibidoras a las que se enfrentan (etanol, pH bajo, sulfuroso). El conocimiento sobre los mecanismos moleculares de respuesta al estrés involucrados en la adaptación de O. oeni a estas condiciones adversas ha avanzado últimamente, pero los mecanismos redox de respuesta al estrés oxidativo son muy poco conocidos. Básicamente, estos mecanismos son los sistemas glutatión / glutatión reductasa y tiorredoxina / tiorredoxina reductasa, que actúan frente al desequilibrio redox causado por la presencia del etanol y otros compuestos tóxicos. El glutatión (GSH) es un tripéptido antioxidante que neutraliza las especies reactivas de oxígeno, oxidándose a glutatión-disulfuro (GSSG), que vuelve a ser reducido mediante la glutatión reductasa. La tiorredoxina (TRX) es una pequeña proteína que también actúa como antioxidante y mantiene muchas proteínas en estado reducido mediante un intercambio tiol-disulfuro. La TRX oxidada se vuelve a reducir por la tiorredoxina reductasa.

Se ha estudiado el efecto de la adición de GSH en la etapa de precultivo de cuatro cepas, así como durante la FML. Se ha observado que el efecto del GSH sobre la supervivencia de la población inoculada y la velocidad de la FML, en vino simulado con 14% etanol, es mayor cuando el GSH se añade en la etapa de precultivo que cuando éste se adiciona durante la fermentación. Se han evaluado diferentes concentraciones de GSH, constatando que es necesaria una concentración de al menos 0,5 mM de GSH añadido al precultivo de O. oeni para que se observe el efecto protector de este compuesto. Este efecto es mayor en las cepas menos tolerantes al etanol.

También se ha estudiado y optimizado la expresión de los genes de la tiorredoxina (trxA) y la tiorredoxina reductasa (trxB) en un conjunto de cepas de O. oeni aisladas de vinos, más la cepa tipo, mediante RT-qPCR. A diferencia de la cepa tipo en la que no habido cambios en la expresión, en las otras cepas se observan variaciones importantes desde la inoculación hasta el final de la fase exponencial, y especialmente en las cepas más tolerantes al etanol, donde se ha visto una importante sobreexpresión de los genes trxA 1625, trxA 1702 y trxB 0163.

Los estudios de posible adición de glutatión en los preinóculos y la caracterización de la tiorredoxina en diferentes cepas de O. oeni pueden contribuir a una mejor selección de cepas y a conocer las condiciones óptimas de adaptación al vino. Además, el conocimiento del funcionamiento de estos sistemas antioxidantes en O. oeni puede ser aplicado a otras bacterias lácticas utilizadas en otros procesos fermentativos, o como probióticos, sometidas a diversas condiciones de estrés.

Palabras clave: vino, Oenococcus oeni, estrés, adaptación, glutatión, tiorredoxina


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11. Acidificación biológica de vinos de pH elevado mediante la utilización de bacterias lácticas

Lucio, O.1*, Pardo, I.1, Heras, J.M.2, Krieger, S.2, Ferrer, S. 1

1ENOLAB. Dpto. de Microbiología y Ecología, Facultad de Biología, Universidad de Valencia. Avda. Vicent Andrés Estellés s.n., 46100-Burjassot, Valencia. 2Lallemand España, C/Zurbano, 71, 28010 Madrid.

Una de las consecuencias del cambio climático ha sido el progresivo descenso de la acidez de los mostos en numerosas regiones vitivinícolas de clima relativamente cálido. Además de las implicaciones organolépticas que supone la falta de acidez, los mostos de estas características son muy susceptibles a sufrir alteraciones microbianas importantes.

Para corregir este defecto normalmente se recurre a la adición de ácidos, fundamentalmente ácido tartárico, aunque también está autorizada por la OIV la adición de ácido málico, ácido cítrico y ácido láctico. Como alternativa a la acidificación química hemos desarrollado un proceso de acidificación biológica. Este nuevo proceso presenta las ventajas de ser una metodología no sujeta a una legislación tan estricta como la acidificación química o física, y de ser válida para la acidificación de vinos ecológicos, ya que evita la incorporación de compuestos químicos no autorizados en este tipo de vinificación.

Para este nuevo proceso se han seleccionado dos cepas bacterianas de origen vínico de la especie Lactobacillus plantarum, en base a su óptimo crecimiento en mosto a pHs altos, su capacidad para degradar el ácido málico en mosto que tiene sabores herbáceos desagradables, su elevada producción de ácido láctico a partir de azúcares y su elevada resistencia al anhídrido sulfuroso y la lisozima, utilizados durante el proceso de vinificación para controlar el crecimiento de los microorganismos indeseables.

La empresa Lallemand generó cultivos iniciadores liofilizados de las dos bacterias seleccionadas, aplicando la metodología propia de la empresa, para su aplicación en el proceso a nivel industrial. En el laboratorio ENOLAB se comprobó una elevada viabilidad, alta pureza y buena actividad acidificante de las cepas sometidas a este proceso de liofilización.

El modo de utilización de estas cepas que mejores resultados de acidificación proporcionaron consistió en la adición del cultivo iniciador bacteriano de forma previa a la FA, tras un paso previo de rehidratación durante aproximadamente 2 horas en una solución de Optimalo Plus® (Lallemand) de 20 g/L. La inoculación debe realizarse a una concentración de 106 células/mL en mosto con una cantidad de anhídrido sulfuroso libre inferior a 10 g/hL. El cultivo iniciador bacteriano debe dejarse actuar durante un periodo de entre 24 y 72 horas, transcurrido el cual se inocula el cultivo iniciador de levadura VN® (Lallemand). Se realizaron ensayos en volúmenes y condiciones de laboratorio, piloto e industrial.

En los ensayos realizados a nivel de laboratorio para evaluar la capacidad acidificante de las cepas, ambos cultivos bacterianos fueron capaces de acidificar un mosto blanco estéril, disminuyendo el pH en 0.5 unidades y produciendo hasta 20 g/L de ácido láctico en el mosto final. En estos ensayos sólo se inocularon las bacterias dejándose actuar un periodo de 7 días. Para determinar el efecto acidificante durante una vinificación, se realizaron microvinificaciones de laboratorio inoculando en mosto blanco estéril las bacterias previamente al inicio de la fermentación alcohólica. En este caso, se consiguió una disminución de pH de 0.3 unidades y una producción de 7-8 g/L de ácido láctico en el vino final.

En los ensayos realizados en volúmenes piloto de mostos blancos, rosados y tintos vinificados en condiciones industriales no se han conseguido niveles de acidificación adecuados. Las razones que explican estos resultados podrían ser la importante mortalidad inicial de las bacterias (de dos órdenes de magnitud) y una incapacidad posterior de retomar un crecimiento activo. Las bacterias se mantuvieron viables aunque en baja concentración durante todo el proceso de vinificación y no fueron suplantadas por la microbiota autóctona. La existencia de levaduras antagonistas de las cepas bacterianas inoculadas podría ser la explicación, dada su incapacidad para crecer y acidificar tal cual lo había hecho en experimentos a otros niveles de ensayo. En cambio, sí se apreciaron diferencias organolépticas entre los vinos inoculados o no con las bacterias, siendo más apreciados los primeros en el análisis realizado por catadores expertos. Aunque la utilización de los azúcares del mosto por las bacterias ha sido muy reducida en estos experimentos, otros sustratos distintos del mosto pueden ser utilizados y ser los productos finales de su metabolismo los responsables de estos cambios


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organolépticos. Esto sucede, por ejemplo, con el ácido málico que es rápidamente transformado en ácido láctico. Este ácido tiene importancia organoléptica por sí mismo y porque es sustrato para la síntesis de ésteres como el lactato de etilo.

Palabras clave: mosto, vino, acidificación, pH, Lactobacillus plantarum


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12. Monitorización on-line de la fermentación maloláctica mediante un sistema de medida ultrasónico

Anna Puig1 J. García-Álvarez2 C. Masqué3, D.F. Novoa-Díaz2, J.A. Chávez2, E. Bertran1, M.J. García-Hernández2, A. Turó2, J. Salazar2 1 Secció d’Investigació Enològica. Institut Català de la Vinya i el Vi (INCAVI).Plaça Àgora, 2. Polígon Industrial Domenys II. 08720 Vilafranca del Penedès, Spain. 2 Grup Sistemes Sensors. Departament Enginyeria Electrònica. Universitat Politècnica de Catalunya. C/ Jordi Girona, 1-3. 08034 Barcelona, Spain. 3 Institut Català de la Vinya i el Vi (INCAVI). Passeig Sunyer, 4-6. 43202 Reus, Spain. [email protected] / [email protected]

En la industria vinícola, el control automático de procesos como la fermentación alcohólica o la fermentación maloláctica (FML) puede resultar útil para reducir costes de producción y mejorar la calidad del producto, incrementando así su competitividad.

La fermentación maloláctica, en la que son protagonistas las bacterias lácticas principalmente de la especie Oenococcus oeni, es una poderosa herramienta en la elaboración del vino tinto, no sólo para reducir su acidez, sino también para influir positivamente en el aroma y en su perfil sensorial. En la actualidad y por lo general, la medida de las propiedades del vino durante este proceso se lleva a cabo de manera off-line mediante técnicas analíticas en los laboratorios de las bodegas. Existen, por lo tanto, retrasos significativos entre la toma de muestras para el análisis y el momento en que se comunica el resultado. Proporcionar medidas en tiempo real de los parámetros que indican la evolución de la fermentación del vino mediante un sistema monitorizado permitiría al personal técnico mejorar la estrategia de control y la toma de decisiones.

El uso de técnicas analíticas basadas en ondas ultrasónicas, sensibles a los cambios de propiedades físico-químicas del medio donde se propagan como la densidad, la dureza, la turbidez, la viscosidad y otros, se presentan como una atractiva alternativa a las técnicas tradicionales de medida para este propósito. Se ha demostrado que los ultrasonidos proporcionan medidas fiables, precisas, económicas, higiénicas, no invasivas y en línea. Las técnicas basadas en ultrasonidos se han utilizado desde hace algunos años en ciertos sectores de la industria alimentaria y en procesos similares al del vino como la fermentación de la cerveza.

El objetivo global del presente trabajo ha sido desarrollar y aplicar un nuevo sistema de medida basado en tecnologías ultrasónicas para controlar y monitorizar en tiempo real el proceso de fermentación maloláctica en entornos industriales.

Durante la vendimia de 2011 se realizaron en la bodega de INCAVI en depósitos de acero inoxidable de 100 L de capacidad, caracterizaciones ultrasónicas de dos fermentaciones malolácticas de la variedad Tempranillo y una de la variedad Merlot, inducidas con una cepa estárter de O. oeni. Se instaló en cada uno de los depósitos un sensor de ultrasonidos para la realización de medidas no invasivas de velocidad de propagación, junto con un sensor para monitorizar la temperatura interna a la que se desarrollaba el proceso, ya que se comprobó que este último parámetro presenta una gran influencia sobre la velocidad de propagación de los ultrasonidos a través del vino. Las señales adquiridas por los sensores de forma regular en cada depósito (cada 3 horas) fueron registradas a través de un software adaptado de forma ininterrumpida hasta el final del proceso. Paralelamente, y con frecuencia diaria, se separaba un volumen de vino (50 ml) representativo del depósito para llevar a cabo medidas tradicionales de la evolución de la FML: población de bacterias lácticas, ácido málico, ácido láctico, acidez volátil y turbidez.

Los resultados obtenidos hasta el momento han sido satisfactorios, observándose una muy buena correlación (Pearson) entre los datos registrados de las velocidades de ultrasonidos con compensación de temperatura con los parámetros de concentraciones de ácido málico (correlación negativa), láctico (correlación positiva) y evolución de la carga de bacterias lácticas (correlación positiva) en los tres depósitos ensayados. Así mismo, la velocidad de ultrasonidos ha proporcionado resultados altamente significativos, con lo que se descarta que las correlaciones se establezcan al azar.

Así pues, la instalación en entornos industriales de un sistema de medida basado en tecnologías ultrasónicas en los depósitos donde se desarrolla la fermentación maloláctica del vino, permite la monitorización continua y en tiempo real del proceso, proporcionando un mejor conocimiento y supervisión de los parámetros que influyen en su desarrollo, sin necesidad de toma de muestras ni de ningún tipo de análisis adicionales.


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Agradecimientos: Este trabajo ha sido realizado con la financiación del proyecto DPI2009-14468-C02-01 del MICINN

Palabras clave: fermentación maloláctica, sensores ultrasonidos, bacterias lácticas, vino


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13. Polifenoles como una alternativa natural a los sulfitos en el control del crecimiento de bacterias lácticas en vinos: eficacia tecnológica y mecanismos bioquímicos y moleculares implicados

Almudena García-Ruiz, Begoña Bartolomé, Carolina Cueva, Juan José Rodríguez-Bencomo, Teresa Requena, Pedro J. Martín-Álvarez, M.Victoria Moreno-Arribas

Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL), (CSIC-UAM). c/ Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco. Universidad Autónoma de Madrid. 28049 Madrid. Tel 910017900- Fax 910017905. E-mail: [email protected]

Con el objetivo de desarrollar alternativas naturales al tradicional empleo de los sulfitos en enología, en este trabajo se ha llevado a cabo un estudio sistemático del efecto de los polifenoles sobre el crecimiento y metabolismo de bacterias lácticas del vino, y su mecanismo de acción, evaluando además el posible uso de extractos fenólicos naturales como aditivos antimicrobianos durante la elaboración del vino. Para ello, en una primera fase, se ha evaluado el efecto de distintos compuestos fenólicos presentes en el vino sobre el crecimiento y metabolismo de las principales especies de bacterias lácticas implicadas en el proceso de fermentación maloláctica y/o causantes de alteraciones en los vinos, y se ha establecido la relación estructura/actividad. A su vez, se ha dilucidado el mecanismo de acción antimicrobiana y la posible interacción de los polifenoles con actividades metabólicas bacterianas relevantes, como la implicada en la degradación de aminas biógenas. Estos trabajos previos han servido de base para la selección de los mejores extractos fenólicos, obtenidos a partir de plantas y diferentes productos vegetales (incluida la vid), con actividad antimicrobiana frente a bacterias lácticas de origen enológico. La aptitud tecnológica e impacto organoléptico de los extractos más activos se ha estudiado en experimentos de fermentación maloláctica en vinos a escala de microvinificación y de bodega. Finalmente, se ha caracterizado genéticamente la población de Oenococcus oeni representativa de los vinos tratados y no tratados con extractos fenólicos como antimicrobianos, y se ha evaluado la influencia de estos extractos sobre marcadores genéticos de interés en esta especie.

Los resultados indican que los compuestos fenólicos del vino, especialmente los flavonoles, presentan capacidad para inhibir el crecimiento de O. oeni, la principal especie implicada en la fermentación maloláctica, así como de L. hilgardii y P. pentosaceus, asociadas a alteraciones del vino. Para O. oeni, la mayoría de los compuestos fenólicos muestran un efecto inhibidor -expresado como IC50- superior al del metabisulfito potásico. El mecanismo de acción antimicrobiana de los polifenoles es diferente al del dióxido de azufre, comprobándose mediante microscopía de electrónica de transmisión que los polifenoles dañan la integridad de la membrana celular bacteriana. Se han seleccionado 12 extractos fenólicos de origen vegetal y distinta composición fenólica con elevada capacidad antimicrobiana frente a bacterias lácticas y bacterias acéticas del vino. El extracto de hojas de eucalipto (Eucalyptus) presenta la mayor capacidad antimicrobiana. En un experimento a escala de laboratorio sobre vinos tintos elaborados a nivel industrial, se ha conseguido que la adición del extracto de hoja de eucalipto retrase significativamente la fermentación maloláctica, tanto inducida por un inóculo como llevada a cabo de forma espontánea, aunque el efecto resulta considerablemente inferior al conseguido por el empleo de anhídrido sulfuroso. En un experimento a escala de bodega sobre vinos blancos sometidos a crianza en madera, se ha comprobado que la adición del extracto de hoja de eucalipto (0,1 g/l) conjuntamente con una dosis reducida a la mitad de SO2 asegura la estabilidad microbiológica de los vinos durante la crianza, lo que confirma la eficacia tecnológica de este tipo de extractos para el control de la fermentación maloláctica y el crecimiento indeseable de microorganismos durante la vinificación. Por otro lado, la adición de extractos fenólicos antimicrobianos durante la elaboración de los vinos tintos, no parece condicionar las propiedades organolépticas asociadas a su composición volátil y fenólica. Finalmente, aplicando diversas técnicas moleculares, se ha encontrado que las cepas de O. oeni aisladas de vinos tintos tratados con extractos fenólicos antimicrobianos presentan un menor número de marcadores genéticos relacionados con la adaptación y supervivencia a las condiciones en las que transcurre la fermentación maloláctica, en comparación con las cepas de la misma especie y aisladas de los vinos no tratados. En nuestro conocimiento, éstos son los primeros indicios de que la acción de los polifenoles sobre las bacterias lácticas representa un mecanismo de selección de especies y cepas, y abren el camino a futuras investigaciones que sienten las bases sobre los mecanismos moleculares y evolutivos implicados.


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Palabras clave: vino, bacterias lácticas, alternativas al SO2, polifenoles, actividad antimicrobiana, marcadores genéticos


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14. Actividad esterásica de bacterias lácticas de origen vínico

Fátima Pérez Martín1, Susana Seseña1, Pedro Miguel Izquierdo2, 3 y María Llanos Palop1 1Dpto. de Química Analítica y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Universidad de Castilla-La Mancha. Avda. Carlos III s/n. 45071 Toledo. [email protected] 2 Instituto de la Vid y el Vino de Castilla-La Mancha (IVICAM). Ctra.Toledo-Albacete s/n. 13700, Tomelloso (Ciudad Real). 3 Parque Científico y Tecnológico de Albacete, Paseo de la Innovación, 1, 02006 Albacete. Spain.

El objetivo de este estudio fue conocer la capacidad esterásica de 243 aislados de bacterias lácticas representantes de los genotipos obtenidos tras la caracterización genética, mediante la técnica RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR) (Ruiz et al., 2008), de 1313 aislados procedentes de muestras de vino de distintas variedades de uva tomadas en bodegas de Castilla-La Mancha. Estos aislados pertenecen a los géneros Oenococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Enterococcus.

Para ello, se realizó un primer screening utilizando como sustrato el p-nitro-fenil octanoato. Las condiciones utilizadas en este ensayo fueron las descritas por Matthews et al. (2007), determinándose el p-nitrofenol liberado por medida de la absorbancia a 400nm.

Trece de los aislados, 6 del género Oenococcus, 3 del género Enterococcus y 4 Lactobacillus, mostraron valores de actividad frente al octanoato significativamente superiores, y fueron por ello seleccionados para los ensayos siguientes, en los que se estudió 1) la localización celular del enzima, para lo que se obtuvieron y analizaron las diferentes fracciones celulares a partir de cultivos en caldo de los aislados, 2) la especificidad de sustrato, utilizando 6 diferentes sustratos: el p-nitrofenil acetato, el p-nitro-fenil butirato, el p-nitrofenil decanoato, el p-nitrofenil dodecanoato, el p-nitrofenil tetradecanoato y el p-nitrofenil octadecanoato y 3) la influencia de factores como el pH (3, 4, 5, 6, 7 y 8), la temperatura (15, 25, 37, 45 y 55ºC) y la presencia de etanol (4, 8, 12 y 14% v/v) en la actividad esterasa, utilizando como sustrato el p-nitro-fenil octanoato.

Los resultados han puesto de manifiesto que en la totalidad de los aislados, la actividad esterásica se localiza en la fracción intracelular, presentando en algunos casos actividad a pH=3 y a temperaturas en torno a los 20ºC, condiciones habituales durante la FML. La presencia de etanol producía en todos los casos un descenso considerable de la actividad.

Los ensayos de especificidad de sustrato han mostrado que la mayoría de las cepas muestran una mayor facilidad para la hidrólisis de esteres de cadena larga.

Bibliografía: Matthews, A., Grbin, P., Jiranek, V. (2007). Biochemical characterisation of the esterase activities of

wine lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 77: 329-337. Ruiz P., Izquierdo P. M., Seseña S., Palop M. Ll. (2008). Intraspecific genetic diversity of lactic acid

bacteria from malolactic fermentation of Cencibel wines as derived from combined analysis of RAPD-PCR and PFGE patterns. Food Microbiol., 25: 942-948.

Palabras clave: esterasas, bacterias lácticas, Oenococcus oeni, fermentación maloláctica, aroma


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15. Diversidad genética de las cepas de Lactobacillus pentosus que pueblan los biofilms de la epidermis de aceitunas verdes estilo sevillano

J. Domínguez Manzano, A. León Romero, O. Cruz Gómez y R. Jiménez Díaz

Departamento de Biotecnología de Alimentos, Instituto de la Grasa (CSIC), Avda. Padre García Tejero, 4, 41012 Sevilla

A lo largo del proceso de fermentación de aceitunas verdes estilo español o sevillano, sobre todo en aquellas elaboraciones que se rigen por la metodología tradicional (fermentaciones espontáneas, sin adición de cultivos iniciadores), se aísla de las salmueras un gran número de cepas de Lactobacillus pentosus que presentan grandes diferencias entre sí, ya que presentan perfiles plasmídicos y de RAPD-PCR a veces muy diferentes. Debido a ello, y después de numerosos seguimientos de las poblaciones de esta bacteria del ácido láctico en dichas fermentaciones, elaboramos la hipótesis de la sucesión ecológica de cepas de L. pentosus a lo largo del proceso de fermentación. Por otro lado, cuando estudiamos la diversidad de cepas de esta bacteria extraídas de los biofilms de los frutos en fermentación, elaborados por el método tradicional sin adición de cultivo iniciador alguno, encontramos también una gran diversidad entre las cepas aisladas. Así pues, nos preguntamos si esa variedad que se percibía a nivel global (salmuera y frutos) existía también a pequeña escala. Por ello, iniciamos el estudio de la diversidad de cepas de L. pentosus aisladas de frutos procedentes de fermentadores inoculados o sin inocular, de la industria y de nuestra propia elaboración, según el esquema siguiente:

Procedimiento: - 3 frutos por fermentador, 3 cortes de la epidermis de cada fruto de aprox. 1 cm2 - cada corte se frotaba en una placa de medio MRS sólido con un asa y se incubaba a 30ºC hasta que

las colonias tuvieran un tamaño adecuado - de cada placa se procesaban 5 colonias al azar por RAPD-PCR, utilizando el primer OPL5 (5’-

ACGCAGGCAC-3’) - electroforesis de todas las muestras en un mismo gel de agarosa (0,7%) - tratamiento de los datos con el software BioNumerics, versión 6.6 (dendogramas)

Los resultados demostraron que, si bien la diversidad entre cepas de L. pentosus procedentes de diferentes lugares de un mismo fruto no inoculados previamente con un cultivo iniciador, era mayor que la de aquellas aisladas de aceitunas previamente inoculadas, entre éstas últimas existía también una considerable variabilidad genética. Si bien gran parte de dichas divergencias se pueden atribuir a


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errores metodológicos, es también posible que el hecho de formar parte de un biofilm, constituido por múltiples micronichos ecológicos en los que los microorganismos están en contacto íntimo, envueltos en una matriz polimérica y rodeados de proteínas y ácidos nucleicos, contribuya en gran parte a dicha diversidad genética, originándose mutantes de la misma cepa adaptados a súbitos cambios ambientales, lo que contribuiría a la supervivencia de la especie por encima de la del individuo.

Bibliografía: Kolter and Greenberg, 2006. The superficial life of microbes. Nature 441: 300-302

Palabras clave: Lactobacillus pentosus, fermentaciones, aceitunas, biofilms


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16. Biodiversidad microbiana en fermentaciones de aceitunas verdes de mesa al estilo "Español"

Helena Lucena Padrós, Belén Caballero Guerrero, Antonio Maldonado Barragán y José Luis Ruiz Barba

Instituto de la Grasa (CSIC); Avda. Padre García Tejero, 4; Aptdo. 1078; 41012, Sevilla

Hemos estudiado la biodiversidad microbiana asociada a las fermentaciones de aceitunas verdes de mesa al estilo "Español" o "Sevillano". En esta elaboración las aceitunas son tratadas con álcali y fermentadas por bacterias lácticas, siendo las de mayor impacto económico para nuestro país. Hemos seguido la evolución de la microbiota a lo largo de las tres etapas de la fermentación (7-8 meses) de veinte fermentadores de 10.000 Kg en dos "patios" de fermentación pertenecientes a industrias de gran tamaño en la provincia de Sevilla. En total, se han aislado y caracterizado molecularmente casi 1400 cepas de bacterias y levaduras. Entre las bacterias, encontramos un extraordinario predominio de la especie Lactobacillus pentosus, con entre un 70 y un 80% de los aislados, según el patio. El resto de la microbiota estaba compuesta por una amplia variedad de especies de los géneros Lactobacillus (coryniformis, casei, paracasei, rapi, rhamnosus, parrafaginis y plantarum), Pediococcus (parvulus y ethanolidurans) y Enterococcus (mundtii, faecium, faecalis, casseliflavus y gallinarum). La composición de esta microbiota acompañante varió bastante según el patio y la fase de fermentación. Otros géneros y especies minoritarias fueron también aislados, como Enterobacter, Clostridium, Paenibacillus, Staphylococcus epidermidis, Weissella paramesenteroides, Sporolactobacillus inulinus, y Aerococcus viridans, entre otros. Entre las levaduras aisladas, más de 200 cepas, destaca la presencia de diversas especies de los géneros Candida, Hanseniaspora, Pichia y Saccharomyces. Finalmente, hemos aislado y descrito por primera vez hasta cuatro nuevas especies bacterianas, que hemos nombrado como Enterococcus olivae, Vibrio olivae, Propionibacterium olivae y Propioniobacterium malorum, respectivamente. Esta bien caracterizada colección de bacterias y levaduras, aislada de un nicho ecológico poco explorado, es una fuente inestimable de nuevos recursos genómicos para nuevas aplicaciones biotecnológicas.

Palabras clave: biodiversidad, fermentación, aceitunas de mesa, Lactobacillus pentosus


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17. Nuevos cultivos para embutidos fermentados, ¿otra forma de incorporar probióticos?

Raquel Rubio, Anna Jofré, Teresa Aymerich, Belén Martín y Margarita Garriga

IRTA-Programa de Seguridad Alimentaria. Finca Camps i Armet s/n. 17121 Monells

El consumidor busca productos alimenticios nutritivos que ofrezcan beneficios para su salud. Las bacterias del ácido láctico (BAL), por su clasificación como microorganismos seguros (GRAS y QPS) y por su importancia numérica en el tracto gastrointestinal, se presentan como excelentes candidatas para su uso como probióticos. Por el momento, el consumo de productos probióticos está limitado, básicamente, a productos lácteos y complementos alimenticios.

El objetivo de este estudio fue valorar la idoneidad de un embutido tipo fuet como una nueva forma de incluir probióticos en nuestra alimentación. Para ello, se seleccionaron 3 cepas potencialmente probióticas aisladas de neonatos (L. casei/paracasei CTC1677, L. casei/paracasei CTC1678 y L. rhamnosus CTC1679) y 3 cepas probióticas comerciales (L. plantarum 299V, L. rhamnosus GG y L. casei Shirota) para la elaboración de 6 lotes de fuet (tres réplicas independientes). Cada cepa se inoculó ca. 106 ufc/g. La fermentación/maduración se desarrolló a 12ºC y 85% HR. Los análisis microbiológicos y fisicoquímicos se realizaron durante la fermentación/maduración y después de 2 meses de almacenaje a 4ºC. La capacidad de implantación de las cepas inoculadas se determinó mediante RAPD-PCR con el cebador KS. Finalmente, se realizó el análisis sensorial de los productos finales.

Los recuentos de bacterias lácticas (BAL) fueron similares, 108 ufc/g en el producto final, en las tres réplicas (R), aunque la implantación de las cepas fue diferente. Así, en R1, durante los 6 primeros días, todas las cepas mostraron el 88-100% de implantación en su lote respectivo, dominando de esta manera sobre las BAL endógenas. Al final del proceso mantuvieron la dominancia, a excepción de L. plantarum 299V. Cabe destacar que L. rhamnosus CTC1679 y L. rhamnosus GG fueron las únicas cepas que consiguieron implantación del 100% a lo largo de todo el proceso y las únicas que dominaron sobre las BAL endógenas en R2. En esta réplica el proceso no transcurrió de la manera esperada y, a diferencia de los valores de pH obtenidos en R1 (6,1-6,3) y R3 (5,6-5,8), se obtuvieron valores de pH superiores (7,3) que son poco deseables y que favorecieron un aumento del nivel de Enterobacteriaceae. En R3, a tiempo 6, ninguna de las cepas probióticas inoculadas dominaba sobre las BAL endógenas, aunque los recuentos oscilaron entre 106 (cepa L. plantarum 299V) y 107 ufc/g (las demás cepas). En el producto final, sólo la cepa L. rhamnosus CTC1679, con el 88% de implantación, consiguió predominar sobre las BAL endógenas. Los CGC+ alcanzaron recuentos entre 105 y 106 ufc/g en producto final (R1 y R3) y de 107 ufc/g en R2. No se detectó L. monocytogenes ni Salmonella en ninguna de las réplicas, aunque los niveles de Enterobacteriaceae (>6 log ufc/g) en R2 desaconsejaron su evaluación sensorial.

El análisis sensorial de los productos finales (R1 y R3) no evidenció diferencias significativas (p>0.05) para los atributos de aspecto, textura, olor, sabor/flavor evaluados, siendo buena (6 sobre 10 de puntuación) la aceptabilidad general en todos los casos. Los resultados indican que el grado de implantación de una cepa probiótica en concreto, de las ensayadas en este estudio, no altera las propiedades sensoriales típicas de este tipo de embutido.

Para conseguir la ingesta recomendada L. rhamnosus CTC1679 sería la cepa de elección como cultivo probiótico en embutidos fermentado-curados.

Este proyecto está financiado por INIA RTA 2009-00045-00-00.

Palabras clave: L. casei, L. rhamnosus, L. plantarum, cultivos iniciadores, embutidos fermentados, probióticos

6ª reunión Red BAL, Tarragona 2012 III. Biotecnología y Biología Molecular de Bacterias Lácticas

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III. BIOTECNOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE BACTERIAS LÁCTICAS


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18. Producción de heteropolisacáridos y riboflavina por cepas de Lactobacillus aisladas de sidra

A. I. Puertas1, I. Ibarburu1, A. Garzia1, I. Berregi1, A. Prieto3, P. López2, Ana Irastorza2, M. T. Dueñas 1

1Departamento de Química Aplicada, Facultad de Ciencias Químicas. Universidad del País Vasco (UPV/EHU), San Sebastián. 2Departamento de Microbiología Molecular y Biología de las Infecciones. Centro de Investigaciones Biológicas, (C.S.I.C.), Madrid. 3Departamento de Biología Medioambiental, Centro Investigaciones Biológicas, (C.S.I.C.), Madrid.

En este trabajo hemos estudiado la producción de exopolisacáridos (EPSs) y de riboflavina por varias cepas del género Lactobacillus aisladas de sidras ahiladas. Estas estirpes pertenecen a las especies L. vini, L. suebicus y L. paracollinoides/collinoides, y fueron seleccionadas por su capacidad de aumentar la viscosidad del medio de cultivo y por su mayor rendimiento en EPS. Previamente, se analizó mediante PCR la presencia de genes implicados en la síntesis de homopolisacáridos, obteniendo en algunas cepas resultados positivos para el gen gtf que codifica la glicosiltransferasa GTF responsable de la síntesis de (1→3)-β-D-glucano con ramificaciones 1→2, y negativos para los genes deg y fru de levanos y fructanos, respectivamente. Así mismo, usamos cebadores dirigidos al gen epsE que codifica la enzima priming-glicosiltransferasa/undecaprenil-glicosiltransferasa iniciadora de la síntesis de heteropolisacáridos. En siete cepas se obtuvieron amplificaciones positivas y la secuenciación y alineamiento de la banda, reveló una región de 29 pb fuertemente conservada correspondiente al centro activo de la proteína. El análisis de la composición monosacarídica de los EPSs producidos por L. vini A19 y L. paracollinoides SN6c mostró que ambas sintetizan heteropolisacáridos, constituidos por glucosa, galactosa y ramnosa, y por glucosa, galactosa y glucosamina, respectivamente.

Por otra parte, fue evidente la coloración amarillo-verde que adopta el medio de cultivo tras ser fermentado por L. paracollinoides SN6c. El análisis de este medio semidefinido mediante métodos fluorimétricos reveló la presencia de un compuesto fluorescente de longitud de onda de máxima excitación de 450 nm y de máxima emisión 525 nm, indicativo de la presencia de riboflavina (vitamina B2). Posteriormente, se cuantificó la cantidad de riboflavina mediante un sistema HPLC provisto de un detector de fluorescencia, y en las condiciones ensayadas encontramos una acumulación en el medio de 4.4 mg/L. Además, se utilizaron los cebadores ribF y ribR para detectar mediante PCR la presencia del operón rib, que contiene los genes implicados en la síntesis de riboflavina en bacterias lácticas, y obteniéndose amplificaciones positivas en L. paracollinoides SN6c y en otras estirpes de Lactobacillus productoras de EPS.

Palabras clave: exopolisacáridos, riboflavina, Lactobacillus, sidra


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19. Análisis en tiempo real del comportamiento de líneas celulares en presencia de compuestos bioactivos: interacción de componentes de Bifidobacterium con la línea intestinal HT29

Claudio Hidalgo, Borja Sánchez, Abelardo Margolles y Patricia Ruas-Madiedo

Instituto de Productos Lácteos de Asturias – Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IPLA-CSIC). Carretera de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias. Tel: 985892131, e-mail: [email protected]

Numerosos estudios demuestran que el mantenimiento de una microbiota intestinal “saludable” es de especial relevancia para la salud humana, dado que desequilibrios (o disbiosis) en la composición de la comunidad microbiana que habita nuestro intestino están relacionados, o incluso pueden ser la causa, de ciertas patologías. Este hecho sugiere que se establece una estrecha interacción entre los microorganismos y el hospedador. El uso de probióticos para la prevención y tratamiento de ciertos desórdenes intestinales, así como para la restauración de la microbiota intestinal después de tratamientos drásticos (como el uso de antibióticos), está siendo cada vez más popular dado que las evidencias científicas de su eficacia también van en aumento. Sin embargo, no todos los probióticos tienen la misma capacidad para conferir efectos beneficiosos en la población humana. Por tanto, es crucial disponer de herramientas y métodos fiables, reproducibles y rápidos que nos permitan evaluar in vitro la posible respuesta del hospedador en presencia de distintas cepas probióticas. En nuestro grupo de investigación hemos implementado una nueva técnica, utilizada de forma habitual en el campo de la farmacología, para analizar en tiempo real el comportamiento de líneas celulares adherentes en presencia de diversas cepas con potencial probiótico, o de sus componentes purificados. Para ello empleamos un equipo que registra cambios de impedancia relacionados con el estado de crecimiento (en proliferación o confluencia) y morfología celular. Como ejemplo ilustrativo hemos utilizado la línea de adenocarcinoma de colon humano HT29 para estudiar su comportamiento frente a distintas cepas de bifidobacterias (en estado viable o inactivadas por radiación UV) y a distintos componentes purificados de las mimas, como polímeros de carbohidratos extracelulares (exopolisacáridos) y extractos su superficie. Resultados preliminares muestran que, para un compuesto dado y a distintas dosis, el comportamiento de las células eucariotas varía con el tiempo y el efecto es diferente según se añada a células HT29 en estado proliferativo (en división) o en estado confluente y diferenciado (en monocapa). Uno de los extractos analizados ejerció un efecto citotóxico sobre HT29 en estado proliferativo a altas dosis, mientras que a dosis menores, hemos detectado un efecto anti-proliferativo inicial finalizando con muerte celular a tiempos más prolongados. Además este efecto se retardó cuando la concentración del extracto bacteriano fue menor.

Este método nos permite evaluar de forma rápida el efecto de cepas con potencial probiótico sobre líneas celulares intestinales, pero la técnica podría ser aplicada a cualquier compuesto bioactivo presente en alimentos o suplementos alimentarios ingeridos habitualmente en la dieta humana. Creemos, por tanto, que esta técnica podría tener prometedoras aplicaciones en el ámbito de la Ciencia y Tecnología de los Alimentos en relación con la salud humana.

Palabras clave: líneas celulares, respuesta celular, proliferación, citotoxicidad, Bifidobacterium, exopolisacáridos


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20. α-L-Fucosidasas AlfB y AlfC de Lactobacillus casei: caracterización

funcional, cristalización y síntesis de fucosil-oligosacáridos

Jesús Rodríguez-Díaz1, Antonio Rubio-del-Campo1, Francisca Gallego2, Gonzalo N. Bidart1, Vicente Monedero1, Alberto Marina2 y María Jesús Yebra1 1Laboratorio de Bacterias Lácticas y Probióticos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Av. de Agustín Escardino 7, 46980 Paterna 2Unidad de Cristalografía de Moléculas, Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC, Jaime Roig 11, 46010 Valencia

Los fucosil-oligosacáridos (FUS) están presentes en la leche humana, antígenos sanguíneos, glicoproteínas de las superficies celulares de mamíferos y mucina intestinal. Están implicados en procesos biológicos muy variados, tales como metástasis de tumores, inflamación, adhesión celular y colonización del tracto gastrointestinal por la microbiota simbiótica. Por un lado, se ha demostrado anteriormente que los FUS de la leche humana ejercen una actividad anti-adhesiva contra patógenos bacterianos y víricos, protegiendo a los niños frente a diarreas. Por otro lado, la adaptación de las bacterias probióticas al tracto gastrointestinal de ambos, niños y adultos, depende de varios factores, incluyendo su habilidad de competir por los substratos disponibles.

En Lactobacillus casei se han caracterizado tres α-L-fucosidasas, AlfA, AlfB y AlfC, que hidrolizan in vitro FUS naturales. L. casei es capaz de crecer en presencia de fucosil-α-1,3-N-acetilglucosamina (Fucα1,3GlcNAc) como fuente de carbono, liberando L-fucosa en el medio de cultivo y metabolizando la GlcNAc. Análisis de la secuencia del genoma de L. casei BL23 ha mostrado que por debajo de alfB, que codifica para la α-L-fucosidasa AlfB, está presente el gen alfR, que codifica para un regulador transcripcional. De forma divergente a alfB se encuentran los genes alfEFG, que codifican proteínas con homología a los componentes EIIAB, EIIC y EIID del sistema de transporte de azúcares de la fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS). Se ha determinado que AlfB y el PTS específico codificado por alfEFG son necesarios para el metabolismo de Fucα1,3GlcNAc. La regulación de los clusters alfBR y alfEFG es dual y comprende inducción por Fucα1,3GlcNAc mediada por el represor transcripcional AlfR y represión catabólica vía el regulador global CcpA.

La síntesis de FUS utilizando la capacidad de transfucosilación de AlfB y AlfC se ha ensayado y han sido capaces de catalizar la síntesis de cantidades altas de Fucα1,3GlcNAc y Fucα1,6GlcNAc, respectivamente. Ambas α-L-fucosidasas han sido cristalizadas y se ha determinado la estructura para la AlfB, arrojando luz sobre las interacciones enzima-substrato y el posible mecanismo catalítico, permitiendo diseñar mutantes específicos dirigidos a mejorar el rendimiento en la síntesis de FUS.

Palabras clave: fucosidasas, oligosacáridos, Lactobacillus


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21. Las BAL como vectores de inmunización oral pasiva frente a rotavirus

Mª Cruz Martín, Noelia Martínez, Víctor Ladero, María Fernández y Miguel A. Álvarez

Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Carretera de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias

Debido a su condición de bacterias seguras, a su resistencia al paso por el tracto gastrointestinal y a sus propiedades inmunomoduladoras, se han propuesto las BAL, y especialmente el grupo de los lactobacilos mesófilos, como los microorganismos ideales para su utilización como vectores vivos de vacunación oral. La estrategia más habitual es su utilización como agentes de inmunización activa mediante la expresión de genes que codifican antígenos. Una estrategia alternativa consiste en la expresión de genes que codifican anticuerpos frente a determinados patógenos o toxinas, y usar las BAL como agentes de inmunización pasiva. En este contexto, es importante destacar que las inmunoglobulinas procedentes de camélidos, a diferencia de las de otros mamíferos, están constituidas por una única cadena pesada, facilitando enormemente la clonación de los genes que las codifican, su expresión heteróloga y el plegamiento correcto del péptido. Además, son altamente resistentes al calor y al pH ácido. Todo ello hace que estos anticuerpos sean los candidatos ideales para nuestros objetivos.

Mediante el uso de vectores integrativos, basados en el sistema de integración del bacteriófago A2, se ha construido una cepa de L. rhamnosus GG de grado alimentario que produce anticuerpos de llama anti-rotavirus, anclados covalentemente al exterior de la pared celular. Además, como mecanismo de contención biológica se ha eliminado el gen thyA, comprobándose que la cepa resultante es incapaz de crecer en ausencia de timidina, evitándose así su propagación en el medio ambiente. Durante la presentación, además de la construcción de la cepa, se mostrarán los resultados previos obtenidos para su utilización como agente terapéutico frente a infecciones por rotavirus.

Palabras clave: Lactobacillus, expresión heteróloga, vectores integrativos, anticuerpos, vacunas orales


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22. Proteinasa de pared de L. paracasei PrtP: una vieja historia con nuevas perspectivas

José María Coll, Christine Bäuerl, Isabel Pérez Arellano, Vicente Monedero, Manuel Zúñiga y Gaspar Pérez Martínez

Laboratorio de Bacterias Lácticas y Probióticos, Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia

Determinadas cepas de bacterias lácticas poseen gran capacidad de cuajar la leche, que se debe a la presencia de una serin-proteasa de gran tamaño (≈150.000 Da) en la pared celular con una marcada especificidad en el reconocimiento e hidrólisis de secuencias peptídicas. Cuando procedimos a determinar diversas propiedades de crecimiento de una amplia colección de mutantes de sistemas de regulación de dos componentes (del tipo sensor-quinasa) de Lactobacillus paracasei BL23, observamos que una de ellas (BL368) tiene una gran capacidad de proliferación y cuajado de la leche. Un estudio más detallado mostró que ésta posee una altísima actividad proteinasa, tal como se ha descrito para la proteinasa de pared PrtP, también llamada lactocepina. Comprobamos que la mayor parte de la capacidad de hidrólisis de β-caseína desaparece en las cepas BL332 y BL369, obtenidas por inactivación del gen PrtP, tanto en la cepa silvestre (BL23) como en el mutante sobreproductor (BL368). Recientemente, se ha determinado que la proteinasa de pared PrtP de la cepa probiótica L. paracasei VSL#3 es la posible responsable de su efecto antiinflamatorio, pues destruye la quimioquina proinflamatoria IP-10 en sistemas modelo. Hemos podido determinar que la cepa sobreproductora BL368 posee también capacidad antiinflamatoria, pues disminuye IP-10 secretada por cultivos celulares de HT29 inducidos con TNFα (inflamación). La inactivación del gen prtP ha ayudado a demostrar que esta actividad probiótica se debe específicamente a la proteinasa de pared PrtP. Paralelamente, determinamos que la cepa tipo de L. bulgaricus también posee una notable actividad proteinasa, proporcional a su capacidad de degradación de IP-10. Similares proteinasas de pared (C5a, PrtA y CspA) constituyen importantes factores de patogenicidad de Streptococcus pyogenes, S. pneumoniae y S. agalactiae, debido a que destruyen específicamente citoquinas y quimioquinas tipo CXCL proinflamatorias (como IP-10) eludiendo así la respuesta de defensa innata de las mucosas. Nuestras cepas probióticas podrían actuar de forma similar, pero a diferencia de aquellas, carecen de capacidad invasiva y patogénica.

Palabras clave: Lactobacillus paracasei, proteinasa PrtP, probiótico, actividad antiinflamatoria, IP-10


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23. Papel de la proteína Ant sobre la decisión lisis-lisogenia del fago A2 de Lactobacillus casei

Susana Escobedo, Juan Evaristo Suárez y Begoña Carrasco

Área de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, c/Julián Clavería 6, 33006 Oviedo. E-mail: [email protected]

Los bacteriófagos que atacan a las cepas iniciadoras son la principal causa de fallos en las fermentaciones lácteas. Por ello, los fagos que infectan a las bacterias del ácido láctico son probablemente los mejor conocidos de cuantos atacan a bacterias Gram positivas. En nuestro grupo hemos dedicado una especial atención al fago A2, que infecta cepas de Lactobacillus casei y L. paracasei. A2 pertenece a la familia Siphoviridae (cápsida isodiamétrica y cola larga no contráctil) es atemperado y presenta un genoma de ADN en doble cadena con 43.411 nucleótidos, en el que se han identificado 61 orfs. En dicho genoma, el interruptor genético que regula la decisión del tipo de ciclo de desarrollo del fago, está compuesto por dos promotores adyacentes de expresión divergente (PL y PR) que gobiernan la síntesis de los represores del ciclo lítico (CI) y del lisogénico (Cro) respectivamente. Adyacente a cro se encuentra ant, que se co-transcribe con él y del que postulamos que podría modular el efecto de Cro.

Prácticamente todos los fagos atemperados de bacterias lácticas presentan versiones del gen ant (llamadas así porque presentan homología, en su tercio carboxi-terminal, con el antirrepresor de CI del fago P1 de Escherichia coli). Sin embargo, la proteína que resulta de la expresión de ant en A2, de 160 aminoácidos, carece de ese motivo funcional. Para estudiar el papel de Ant se obtuvieron tres formas de la misma: la silvestre; la extendida, de 255 aminoácidos (resultante de una mutación que convirtió el triplete stop en codificante) y la corta, que contiene únicamente los 142 residuos aminoterminales. La sobreexpresión de Ant y de Ant-255 provoca un aumento muy significativo de las progenies obtenidas a partir de cultivos infectados e inducidos de L. casei, aunque, en los primeros, dicho incremento es paulatino. Ant no se une a otras proteínas implicadas en la decisión del tipo de ciclo ni al ADN del interruptor genético, pero sí al extremo 5’, no codificante, del ARNm resultante de la expresión de PR. Ant-255 se une a este ARNm, pero lo hace con mayor afinidad al segmento de ADN intergénico que alberga a PL y a PR. De los experimentos realizados se deduce que ambas proteínas favorecen la expresión de cro a través de su unión al interruptor genético del fago A2 y/o al ARNm de PR, provocando que una mayor proporción de las células de los cultivos infectados e inducidos sigan el ciclo lítico. Por lo tanto, Ant no sería un antirrepresor de CI sino un coadyuvante de Cro en su función de neutralizar el ciclo lisogénico.

Palabras clave: bacteriófagos, Lactobacillus casei, lisogenia


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24. Análisis proteómico de Oenococcus oeni ATCC-BAA1163 y Lactobacillus plantarum WCFS1

Mª Luz Mohedano1, Pasquale Russo2, Vivian de los Rios1, Pilar Fernández de Palencia1, Giuseppe Spano2 y Paloma López1 1Departamento de Microbiología Molecular y Biología de las Infecciones, Centro de Investigaciones Biológicas, Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid. 2Departamento de Ciencia de la Alimentación, Universidad de Foggia, Via Napoli 25, 71100 Foggia, Italia

Durante los últimos años, el grupo de la Dra. Paloma López, del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), ha estandarizado el análisis del proteoma de Lactococcus lactis y de otras bacterias lácticas (BAL) mediante la utilización de geles bidimensionales (2D) y posterior identificación de los péptidos utilizando análisis de MALDI-TOF, después de su separación electroforética y digestión tríptica.

En colaboración con el grupo del Prof. Giuseppe Spano (Universidad de Foggia, Italia, UF), se ha optimizado una metodología para caracterizar el proteoma de Oenococcus oeni. Esta bacteria que realiza la fermentación maloláctica, es responsable de la desacidificación del vino después de la fermentación alcohólica. Por ello es de interés industrial el conocimiento de las proteínas implicadas en las rutas metabólicas y en los sistemas de transporte de esta bacteria. Así, las predicciones in sílico inferidas de la secuencia del genoma pueden ser complementadas con datos proteómicos.

En este trabajo se describe la caracterización del proteoma de O. oeni ATCC-BAA116, microorganismo seleccionado debido a que la secuencia de su genoma ha sido determinada lo que permite la identificación de las proteínas codificadas por él. En el estudio 225 polipéptidos diferentes han sido identificados, clasificados por su función putativa y sometidos a análisis bioinformático para predecir su localización topológica.

Por otra parte, Lactobacillus plantarum es una BAL que está presente en alimentos fermentados de origen animal y vegetal, como integrante del cultivo iniciador o formando parte de la microbiota indígena y también es un microorganismo comensal del tracto digestivo humano. Esta amplia distribución de L. plantarum indica su capacidad para adaptarse a diversos ecosistemas y el estudio de su respuesta a distintas situaciones de estrés puede contribuir al conocimiento de sus mecanismos de adaptación a los diferentes nichos ecológicos. Además, el análisis del proteoma bacteriano puede ser utilizado para caracterizar las respuestas globales de los microorganismos a distintos tipos de estrés. En bacterias Gram-positivas incluyendo las BAL, CtsR es un regulador transcripcional global, que controla la expresión de la denominada clase III de genes, cuyos productos, incluyendo las chaperonas, están implicados en la respuesta a distintos estreses. La capacidad de CtsR para unirse al DNA es dependiente de la temperatura. Así, en este trabajo y en colaboración los grupos del CIB y de la UF, se ha utilizado el análisis proteómico para caracterizar en Lactobacillus plantarum la función de CtsR en condiciones fisiológicas normales y en condiciones de choque térmico. Las estirpes silvestre (ctsR) y mutante (∆ctsR) de Lactobacillus plantarum WCFS1 se crecieron a la temperatura óptima de 30ºC y sometidas posteriormente a un tratamiento de 30 min a 42ºC. Los extractos totales de los cultivos tratados o sin tratar obtenidos, fueron analizados en geles 2D. La posterior cuantificación de las manchas peptídicas detectadas revelaron la alteración de los niveles de 23 péptidos cuya identidad fue determinada. Los niveles de proteínas típicas de respuesta al estrés, tales como Hsp1, Hsp3, GroEl, GroEs y DnaK se incrementaron después de la exposición al calor, mientras que los niveles de la proteína CspC implicada en la respuesta al choque por frío disminuyeron. A temperaturas óptimas, los niveles de ClpB, ClpE y ClpP (correspondientes a 13 manchas proteicas) observados en el mutante ∆ctsR, difirieron considerablemente de los niveles encontrados en la estirpe salvaje. Finalmente el análisis de qRT-PCR de la expresión de los genes relevantes, confirmó los resultados obtenidos mediante el análisis proteómico.

Palabras clave: proteoma de O. oeni, respuesta a estrés de L. plantarum


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25. Análisis transcriptómico global de la respuesta de Lactobacillus

plantarum WCFS1 al estrés inducido por el ácido p-cumárico

Inés Reverón1, José Antonio Curiel1, Natalia Jiménez1, María Esteban-Torres2, Blanca de las Rivas1, Rosario Muñoz1 y Félix López de Felipe2

1Laboratorio de Biotecnología Bacteriana, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN), CSIC. C/Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid 2Laboratorio de Biotecnología Bacteriana, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN), CSIC. C/José Antonio Novais 10, 28040 Madrid.

El ácido p-cumárico (PCA) es un ácido hidroxicinámico abundante en una variedad amplia de cereales, frutas y verduras que posee actividades antioxidantes y antiinflamatorias demostradas. El PCA esterificado puede persistir en el colon donde interacciona con la microbiota del intestino. La actividad de la microbiota intestinal sobre el PCA determinará en gran parte su biodisponibilidad, absorción y por consiguiente, los efectos fisiológicos en el cuerpo humano. Puesto que este ácido posee una fuerte actividad antimicrobiana serán las bacterias intrínsecamente resistentes al PCA las que principalmente determinen su bioactivación. En este estudio se ha realizado un análisis transcriptómico de la respuesta global de Lactobacillus plantarum WCFS1 al ácido p-cumárico con la finalidad de incrementar el conocimiento acerca de los mecanismos de resistencia de la microbiota intestinal a los ácidos hidroxicinámicos. Para el análisis transcriptómico se utilizó una micromatriz con 3066 genes y la hibridación se realizó de acuerdo a protocolos previamente descritos (Agilent Technologies, G4140-90051). La tasa de descubrimientos erróneos se estableció menor de 5%. Los resultados observados se validaron por qRT-PCR evaluando la expresión diferencial de los genes lp_3665 (pdc), y genes housekeeping (ldh, 16S rRNA y gyrA) entre otros. De un total de 288 transcritos cuya expresión se vió alterada, 148 aumentaron y 140 disminuyeron su expresión. Los genes expresados diferencialmente pertenecen a 18 diferentes categorías funcionales (COGs), siendo los más afectados los de “transporte y metabolismo de aminoácidos” (19%), “traducción” (10%) y “biogénesis de la membrana y pared celular” (8%). De acuerdo al perfil transcriptómico los mecanismos relevantes implicados en la respuesta al PCA se pueden resumir en: respuesta general al estrés; respuesta a nivel de membrana y pared celular; adaptación de las principales actividades fisiológicas; respuesta adaptativa del metabolismo del nitrógeno; mecanismos de detoxificación; respuesta al estrés oxidativo y mecanismos reguladores.

Este estudio representa una aproximación integrativa que mejora el conocimiento y proporciona una visión general acerca de los mecanismos y rutas metabólicas implicadas en la respuesta de Lactobacillus plantarum a la presencia del PCA. La respuesta al estrés que se ocasiona es compleja y co-regulada. Este conocimiento se puede aplicar para la selección de microorganismos resistentes a ácidos hidroxicinámicos y para conocer las rutas de bioactivación de estos compuestos fenólicos en el intestino humano.

Palabras clave: transcriptómica, Lactobacillus plantarum, ácido p-cumárico


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26. Respuesta fenotípica y transcriptómica de cepas de BAL a la presencia de etanol en el medio de cultivo

Lorena Díez1, Rocío Fernández1, Sonia Sáenz1, Ana Solopova3, Myriam Zarazaga2, Carmen Tenorio1, Carmen Torres2, Oscar P. Kuipers3 y Fernanda Ruiz-Larrea1 1Universidad de La Rioja ICVV (CSIC-UR-GR). 2Área de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Agricultura y Alimentación, Universidad de La Rioja. C/ Madre de Dios 51, 26006 Logroño, La Rioja. 3Molecular Genetics, Centrum voor Levenswetenschappen, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute (GBB), Rijksuniversiteit, Groningen (RUG), the Netherlands.

El etanol es un potente agente antimicrobiano responsable de la inhibición del crecimiento, o incluso de la muerte de especies de bacterias lácticas (BAL) desde el momento en que la concentración de etanol en el medio de cultivo alcanza su umbral de tolerancia. Por otro lado, la fermentación maloláctica de los vinos, llevada a cabo por BAL, proporciona suavidad, una mayor complejidad en el aroma y sabor del vino tinto, además de una estabilidad microbiológica, y por lo tanto, las BAL desempeñan un importante papel en la elaboración de vinos tintos de calidad. Los objetivos del trabajo que se presenta fueron: estudiar la viabilidad y tolerancia al etanol de cepas de BAL enológicas y realizar un estudio transcriptómico de la expresión diferencial de genes debida a la presencia de etanol en el medio. Un total de 69 cepas de BAL enológicas de las especies Oenococcus oeni, Lactobacillus plantarum y Leuconostoc mesenteroides fueron empleadas en este estudio, además de la cepa Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9700 para la cual se disponía de microarrays específicos y que se empleó como cepa modelo. En el estudio fenotípico se cultivaron las cepas enológicas en medio líquido MRS con distintas concentraciones de etanol (0 %, 2%, 4%, 6%, 8% y 12% vol/vol) y en el medio líquido BHI para determinar su capacidad formadora de biofilms. Para el estudio transcriptómico la cepa modelo se cultivó en el medio líquido GM17 en ausencia y en presencia de 2 % etanol en el medio y se tomaron muestras a mitad de la fase exponencial de crecimiento y en la fase estacionaria; se realizó la extracción del mRNA total, se obtuvieron las correspondientes copias de cDNA marcadas con los fluoróforos cyanine-3 o cyanine-5, y se llevó a cabo la hibridación sobre microarrays (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Los resultados del estudio fenotípico mostraron que todas las cepas enológicas crecieron en forma planctónica en presencia de hasta 6 % etanol en el cultivo, y todas ellas mantuvieron su población de células viables en presencia de 12 % etanol durante el periodo de 1-2 días que se mantuvo la incubación en el medio. Los resultados obtenidos con las cepas enológicas también mostraron que el 5,6 % del total (4 cepas): O. oeni (1), L. plantarum (1) y L. mesenteroides (2) fueron capaces de formar biofilms en los ensayos "in vitro", y que a mayor concentración de etanol en el medio, la capacidad formadora de biofilm iba disminuyendo hasta desaparecer con una concentración entre 6 % y 12 % de etanol, dependiendo de la cepa. Los resultados del estudio transcriptómico mostraron que en presencia de etanol se inducía una expresión diferencial de 140 genes, entre los que cabe destacar la sobre-expresión de genes de la ruta de degradación de la arginina deiminasa (ruta ADI) (20-40 veces sobre-expresados), genes de la alcohol deshidrogenasa (2-4 veces), genes relacionados con el equilibrio redox de la célula (12-20 veces) y genes relacionados con el metabolismo de la ribosa y de la glucosa (2-4 veces). Además, como cabría esperar, se encontraban reprimidos genes implicados en el crecimiento bacteriano, como son genes del metabolismo de bases nitrogenadas (reprimidos hasta 16,4 veces) o genes de sistemas de transporte (hasta 4.2 veces). Con estos resultados se ha profundizado en el conocimiento de los mecanismos de respuesta bacteriana y de resistencia al etanol, lo cual permitiría seleccionar por un lado las BAL más adecuadas y robustas para realizar la fermentación maloláctica de los vinos, y por otro lado métodos de limpieza e higiene optimizados para evitar bacterias contaminantes.

Palabras clave: resistencia al etanol, biofilm, Oenococcus oeni, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis, transcriptómica.


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27. Participación de los sistemas de dos componentes TC09 y TC12 de Lactobacillus casei en la respuesta a estrés por péptidos antimicrobianos y en el control de la integridad de la pared celular

A. Revilla-Guarinos a , A. Staron´b , S. Gebhard b , T. Mascher b and M. Zúñiga a aInstituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA-CSIC), Valencia, Spain bLudwig-Maximilians-Universität München, Planegg-Martinsried, Germany

Lactobacillus casei se encuentra de manera natural en hábitats muy variados que comprenden desde alimentos (leche cruda y fermentada, carnes, productos vegetales) hasta la cavidad oral y tractos intestinal y genital de humanos y otros animales. Durante el procesado industrial L. casei es expuesto a condiciones ambientales variables tales como estrés osmótico, cambios de temperatura o cambios en la acidez del medio, entre otros. Durante el tránsito por el tracto gastrointestinal, un estrés adicional lo constituyen los péptidos antimicrobianos (AMPs) que forman parte del sistema inmune innato y que en muchos casos son producidos de manera constitutiva por células del epitelio y células circulantes del sistema inmune para mantener la homeostasis microbio-huésped.

Uno de los mecanismos de transducción de señal comúnmente encontrado en bacterias para percibir y responder frente condiciones ambientales adversas, incluida la presencia de sustancias antimicrobianas, lo constituyen los sistemas de dos componentes (TCS). Entre éstos, se ha demostrado en diversas bacterias que los TCS de tipo BceRS están implicados en respuestas de defensa frente a péptidos antimicrobianos catiónicos (CAMPs). Estos sistemas están formados por una proteína histidina quinasa intramembrana (IM-HK) y un regulador de respuesta (RR) de la familia OmpR, y se encuentran generalmente asociados a transportadores ABC de tipo BceAB pertenecientes a la familia Peptide-7-Exporters. La peculiaridad de estos módulos consiste en que tanto la proteína sensora del TCS como el componente permeasa del transportador, son necesarios para la percepción del estímulo.

L. casei BL23 tiene dos TCS de tipo BceRS, TC09 y TC12, y tres transportadores Pep7E: LCABL_16400/16410 y LCABL_19580/19590, junto al TC09 y TC12 respectivamente, y un transportador huérfano, LCABL_ 21670/21680, sin TCS asociado.

Para determinar el papel fisiológico de estos módulos, se obtuvieron cepas de L. casei BL23 deficientes en los RR de ambos TCS y en cada una de las permeasas de los tres transportadores ABC. Se estudió su crecimiento en presencia de distintos tipos de estrés ambiental (pH ácido, estrés térmico…) y en presencia de péptidos antimicrobianos catiónicos (CAMPs) como nisina y subtilisina, así como estudios de expresión génica en respuesta a choque con nisina, mediante RT-PCR.

Los resultados obtenidos muestran que el módulo constituido por el TC09 y su transportador adyacente, constituyen posiblemente un sistema detoxificador implicado en la resistencia a péptidos antimicrobianos, puesto que estos mutantes sólo mostraron un fenotipo de sensibilidad frente a este tipo de estrés. En cambio, los mutantes deficientes en el módulo formado por TC12 y el transportador adyacente presentaron un fenotipo pleiotrópico con sensibilidad frente a distintas condiciones ambientales y a CAMPs. Los resultados de RT-PCR en respuesta a choque con nisina mostraron que los genes del operón Dlt y el gen MprF, están bajo control de este sistema. El sistema Dlt y el gen MprF aumentan la concentración de cargas positivas en la superficie bacteriana lo que constituye uno de los mecanismos de resistencia frente a CAMPs. Estos resultados implican que el módulo 12 constituye un sistema sensor que regula un operón más amplio implicado en el control de genes necesarios para el mantenimiento de la integridad de la pared celular en L. casei.

Palabras clave: Lactobacillus casei, TCS, CAMPs, estrés ambiental.


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28. Mecanismos implicados en la resistencia de Lactococcus lactis a la bacteriocina Lcn972

Clara Roces, Ana B. Campelo, Verónica Pérez, Diego Blanco, Ana Rodríguez y Beatriz Martínez

Grupo DairySafe. Departamento de Tecnología y Biotecnología de Productos Lácteos. IPLA-CSIC. Carretera de Infiesto s/n. 33300 Villaviciosa (Asturias).

Lactococcus lactis es un microorganismo de gran relevancia industrial ya que es uno de los componentes mayoritarios de los cultivos iniciadores mesófilos utilizados en la elaboración de queso. Con el objeto de conocer mecanismos implicados en la respuesta de L. lactis al daño de la envuelta celular y desarrollar estrategias para la selección de cultivos iniciadores más robustos, hemos abordado la caracterización fenotípica y genética de mutantes resistentes a la bacteriocina lactococina 972 (Lcn972). Esta bacteriocina no modificada inhibe la síntesis de pared celular durante la formación del septo de división en Lactococcus lactis y es un potente activador del sistema de dos componentes CesSR que modula la respuesta a dicho estrés en Lactococcus. La selección de cultivos resistentes se realizó in vitro mediante el cultivo sucesivo de la cepa sensible L. lactis MG1614 (CIM 10 UA/ml) en presencia de concentraciones crecientes de Lcn972. Se seleccionaron dos mutantes, L. lactis D1 y D1-20, resistentes a >320 UA/ml y 80 UA/ml, respectivamente.

La caracterización fenotípica de estos mutantes demostró que la resistencia a Lcn972 no repercute negativamente en el crecimiento de L. lactis en condiciones de laboratorio, ni se correlacionó con cambios sustanciales en las propiedades físico-químicas de la superficie celular. Sin embargo, el análisis del peptidoglicano de los mutantes resistentes reveló una mayor concentración de muropéptidos con cadenas amino acídicas formadas por tripéptidos y una reducción de las formadas por pentapéptidos, asociándose por primera vez cambios en la composición del peptidoglicano con la resistencia a bacteriocinas. También se detectó la existencia de resistencia cruzada a lisozima y nisina y una mayor susceptibilidad a penicilina G y bacitracina. Sorprendentemente, los mutantes resistentes a Lcn972 lo fueron también a la infección por el fago lítico c2. El análisis de la región del gen pip, que codifica la proteína de membrana Pip necesaria para la infección por este fago, puso de manifiesto la existencia de una deleción de 22.6 kpb que engloba, entre otros, pip y genes implicados en el metabolismo de maltosa y almidón. La contribución de estas funciones al fenotipo de resistencia no se ha podido establecer experimentalmente.

Por otro lado, el análisis transcripcional de L. lactis D1 reveló la activación de 14 genes de los cuales llmg2447, que codifica un posible factor anti-sigma de función extracelular (ECF), presentaba el factor de inducción más alto (x37.6) respecto a la cepa parental. Comprobamos que la activación de llmg2447 era consecuencia de la integración de la secuencia de inserción IS981 en la región promotora y que la sobreexpresión de este gen protege de forma específica a L. lactis de la acción de Lcn972 pero no de otros antimicrobianos de pared.

A la vista de estos resultados podemos concluir que la bacteriocina Lcn972 puede constituir una herramienta útil para la selección de mutantes de L. lactis más resistentes a lisozima, nisina y a fagos y, por tanto, con una funcionalidad mejorada como cultivos iniciadores.

CIM: concentración inhibitoria mínima. UA: unidades de actividad

Palabras clave: cultivo iniciador, estrés, pared celular, bacteriocina

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ÍNDICE DE AUTORES DE LAS COMUNICACIONES

autor página autor página Abriouel, H. 13 Alegría, Á. 20 Álvarez, M.Á. 38 Araque, I. 22 Arboleya, S. 11 Arqués, J.L.. 19 Aymerich, T. 33 Bartolomé, B. 15, 27 Bäuerl, C. 39 Benomar, N. 13 Berregi, I. 35 Bertran, E. 25 Bidart, G.N. 37 Blanco, D. 45 Bordas, M. 22 Bordons, A. 22 Bravo, D. 17 Bustos, I. 15 Caballero, B. 32 Campelo, A.B. 45 Carrasco, B. 40 Chávez, J.A. 25 Cobo, A. 13 Coll, J.M. 39 Cruz, O. 30 Cueva, C. 27 Curiel, J.A. 42 De las Rivas, B. 42 De los Rios, V. 41 De Vos, W.M. 12 Delgado, S. 20 Díez, L. 43 Domínguez, J. 30 Dueñas, M.T. 35 Escobedo, S. 14, 40 Esteban-Torres, M. 42 Fernández, E. 20 Fernández, L. 12 Fernández, M. 38 Fernández, N. 11 Fernández, P. 41 Fernández, R. 43 Ferrer, S. 23 Feutry, F. 18

Flórez, A.B. 20 Gallego, F. 37 Gálvez, A. 13 García-Álvarez, J. 25 García-Cayuela, T. 15 García-Hernández, M.J. 25 García-Ruiz, A. 27 Garriga, M. 33 Garzia, A. 35 Gaya, P. 17 Gebhard, S. 44 Gómez, M. 12 González, C. 11 Guiemonde, M. 11 Heilig, H. 12 Heras, J.M. 23 Hernández, A.M. 11 Hernández-Ledesma, B. 15 Hidalgo, C. 36 Hidalgo, M. 13 Ibarburu, I. 35 Irastorza, A. 35 Izquierdo, P.M. 29 Jiménez, E. 12 Jiménez, N. 42 Jiménez, R. 30 Jofré, A. 33 Krieger, S. 23 Kuipers, O.P. 43 Ladero, V. 38 Langa, S. 19 León, A. 30 López, F. 42 López, P. 35, 41 Lucas, R. 13 Lucena, H. 32 Lucio, O. 23 Maldonado, A. 32 Margalef, M. 22 Margolles, A. 11, 36 Marina, A. 37 Martín, B. 33 Martín, C. 14 Martín, M.C. 38

6ª reunión Red BAL, Tarragona 2012 Índice de autores

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Martín, R. 14 Martín-Álvarez, P.J. 27 Martín-Cabrejas, I. 19 Martínez, B. 45 Martínez, M. 13 Martínez, N. 38 Martínez-Cuesta, M.C. 15 Mascher, T. 44 Masqué, M.C. 25 Mayo, B. 20 Medina, M. 17, 19 Mohedano, M.L. 41 Moles, L. 12 Monedero, V. 37, 39 Moreno-Arribas, M.V. 15, 27 Muñoz, R. 42 Novoa-Díaz, D.F. 25 Ortega, E. 13 Palop, M.Ll. 29 Pardo, I. 23 Peláez, C. 15 Pérez, F. 29 Pérez, G. 39 Pérez, I. 39 Pérez, V. 45 Prieto, A. 35 Prieto, I. 13 Puertas, A.I. 35 Puig, A. 25 Quirós, L.M. 14 Reguant, C. 22 Requena, T. 15, 27 Reverón, I. 42

Revilla-Guarinos, A. 44 Roces, C. 45 Rodríguez, A. 45 Rodríguez, E. 17, 19 Rodríguez, J.M 12 Rodríguez-Bencomo, J.J. 27 Rodríguez-Díaz, J. 37 Rossi, F. 20 Rozès, N. 22 Ruas-Madiedo, P. 36 Rubio, R. 33 Rubio-del-Campo, A. 37 Ruiz, J.L. 32 Ruiz-Larrea, F. 43 Russo, P. 41 Sáenz, S. 43 Salazar, J. 25 Salazar, N. 11 Sánchez, B. 36 Seseña, S. 29 Solís, G. 11 Solopova, A. 43 Spano, G. 41 Staron, A. 44 Suárez, J.E. 14, 40 Tenorio, C. 43 Torre, P. 18 Torres, C. 43 Torriani, S. 20 Turó, A. 25 Yebra, M.J 37 Zarazaga, M. 43 Zúñiga, M. 39, 44

6ª reunión Red BAL, Tarragona 2012 1ª Jornada Divulgativa

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1ª JORNADA DIVULGATIVA ¿ Qué pueden hacer las bacterias lácticas por ti ?

Organizada por: Red Española de Bacterias Lácticas y Probióticos (Red BAL) 29 junio 2012, sede de la reunión: Universitat Rovira i Virgili (Tarragona), Campus Catalunya

Presentación de la Red Española de Bacterias Lácticas y Probióticos

Dr. Manuel Zúñiga Cabrera

Científico Titular del CSIC, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC) Coordinador de RedBAL

Las bacterias lácticas del vino y la fermentación maloláctica

Dr. Albert Bordons de Porrata-Doria

Catedrático Emérito, Facultat d'Enologia de Tarragona, Universitat Rovira i Virgili Bacterias lácticas como bioprotectoras en productos cárnicos

Dra. Margarita Garriga Turón

Jefa del Programa de Seguridad Alimentaria del IRTA Microbiología de quesos tradicionales y diseño de fermentos autóctonos

Dr. Baltasar Mayo Pérez

Investigador Científico del CSIC, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (CSIC) Aplicaciones biotecnológicas de las bacterias lácticas

Dra. Carmen Peláez Martínez

Profesora de Investigación del CSIC, Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CSIC-UAM)

Microbiota autóctona, probióticos y prebióticos

Dr. Evaristo Suárez Fernández

Catedrático de Microbiología, Universidad de Oviedo

Libro financiado por la Acción Complementaria modalidad B, del Ministerio de Economía y

Competitividad y el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, AC2012-

00020, con cofinanciación del FEDER.

ISBN: 978-84-8424-212-3

Depósito Legal: T. 622-2012

Servicio de Publicaciones de la Universidad Rovira i Virgili

6 red balredbal.iata.csic.es/miembro/doc/res6redbal.pdf · participación en madrid (2004 ......

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