568-1147-1-sm.pdf

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

1/14

133Rev. Me d. Vet.: N. 21 enero-junio del 2011 pginas 133-145

Recibido: 21de enero del 2010. Aceptado: 16 de septiembre del 2010

ResumenLa leptospirosis es una enfermedad zoontica, causada por especies del gnero Leptospira(orden Spirochaetales, familiaLeptospiraceae), de gran importancia mundial, debido a su am-plia distribucin y diversidad de serogrupos y serovares que afectan a varias especies. Una delas especies ms afectada por esta bacteria es la canina, en la cual esta bacteria desencadenauna infeccin renal o heptica aguda. La falla renal crnica es una consecuencia comn de la

infeccin y los abortos pueden ocurrir en hembras preadas. En los ltimos aos, la leptospi-rosis se ha catalogado como uno de los posibles diagnsticos diferenciales ms comunes paraperros que presentan signos de enfermedad renal aguda o heptica. En el presente trabajose estudiaron treinta caninos con enfermedad renal, a los cuales se les realiz una prueba dediagnstico serolgico para leptospirosis: la tcnica de aglutinacin microscpica (MAT)para seis serovares deLeptospira interrogans, y una prueba de diagnstico en orina por mediode la prueba Dot-Elisa para los serovarescanicola, icterohaemorrhagiae, pomonaygrippotypho-sa.Se diagnosticaron como positivos a Leptospira, como causa de la enfermedad renal, utili-zando los resultados de las dos pruebas, diez caninos (33,3%), los cuales presentaron ttulos aMAT para los serovares icterohaemorrhagiae, canicolaygrippotyphosaprincipalmente. Nuevede los diez perros fueron positivos a Dot-Elisa con una distribucin homognea en los cuatroserovares que se manejaron. Los veinte perros restantes (66,7%) fueron negativos. La asocia-cin entre la prueba Dot-Elisa y la prueba MAT fue altamente significativa (P< 0,01).

Palabras clave:leptospirosis, serovares, Dot-Elisa, aglutinacin microscpica.

Diagnostic of Canine Leptospirosis by Dot ELISA and MATtests in dogs with renal disease in Bogota

AbstractLeptospirosis is a zoonotic disease that is caused by species of genus Leptospira (Order Spi-rochaetales, FamilyLeptospiraceae). This is very important on a global level, due to its wides-pread distribution and diversity of serogroups and serovars that affect an extensive group ofanimal species. Canines are one of the most affected species, where this bacterium generates an

acute renal or hepatic infection. Chronic kidney disease is a common consequence of the in-fection and miscarriage can also happen in pregnant females. During the past few years, Lep-tospirosis has been catalogued as one of the most common differential diagnostics for dogswith acute renal and hepatic disease symptoms. Thirty (30) dogs with renal disease were eva-luated during this project, undergoing serological testing for Leptospirosis: the MicroscopyAgglutination Test (MAT) for sixLeptospira interrogansserovars and a diagnostic urine testthrough DotELISA for serovars canicola, icterohaemorrhagiae, pomona and grippotyphosa.The results of both tests came out positive for Leptospira as the cause of the renal disease inten (10) dogs (33.3%), which showed titles on MAT mainly in serovars icterohaemorrhagiae,

Diagnstico de leptospirosis canina por mediode las tcnicas Dot-ELISA y MAT en perros

con enfermedad renal en Bogot*Catalina Medrano Galarza1/Csar Augusto Daz Rojas 2/ Ernesto Andrs Dalmau Barros3

* Trabajo realizado por el Grupode Investigacin Biologa delDesarrollo de la Universidadde La Salle, clasificado enColciencias en la categora B.

Hace parte del trabajo de gradoDiagnstico de leptospirosiscanina por medio de la tcnica

Dot-ELISA en perros conenfermedad renal en la ciudad deBogot, para optar al ttulo demdico veterinario.

1 Mdica veterinaria, Universidadde La Salle. Investigadoraprofesional asistente,Corporacin Colombiana deInvestigacin Agropecuaria(Corpoica). [email protected]

2 Mdico veterinario. M.Sc.,

Ph.D.(c). Docente asistente,Facultad de MedicinaVeterinaria, Universidadde La [email protected].

3 Mdico veterinario M.Sc.,Docente asistente, Facultad deMedicina Veterinaria, Universi-dad de La [email protected].

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

2/14

134 Rev. Med. Vet.: Bogot (Colombia) N 21: 133-145, enero-junio del 2011

Catalina Medrano Galarza / Csar Augusto Daz Rojas / Ernesto Andrs Dalmau Barros

canicolaand grippotyphosa. DotELISA was positive in 9 of the 10 dogs, with a homoge-neous distribution in the 4 serovars. The remaining 20 dogs (66.7%) came out negative. Theassociation between the DotELISA test and the MAT test was highly significant (P< 0.01).

Keywords:leptospirosis, serovars, Dot-ELISA, Microscopy Agglutination.

I

La leptospirosis es una enfermedad zoontica deimportancia mundial, ya que las formas de trans-misin hacia el hombre son variadas, teniendo en

cuenta la cantidad de riesgos existentes, sobre todoen personas que trabajan con animales, conside-rndose una enfermedad ocupacional; aunque losltimos reportes informan que la poblacin msafectada son personas que tienen contacto conaguas estancadas y lagos, como turistas y deportis-tas, debido al agua contaminada por secrecionesprovenientes de animales infectados o portado-res deLeptospiras(Stornelli et l. 1999; Langston yHeuter, 2003; Sessions y Greene, 2004a).

En caninos, los serovares ms comnmente impli-cados en la leptospirosis son canicolae icterohaemo-rrhagiae, pero, en los ltimos aos, se han venidoaislado con ms frecuencia los serovares pomona,bratislava y grippotyphosa como causantes de laenfermedad, debido a que las vacunas comercialessolo protegen contra los dos primeros (Greene,2000; Sessions y Grreene, 2004b).

En Colombia, el ltimo brote reportado fue en hu-manos en las regiones de la costa Atlntica y en el

Valle del Cauca. En caninos, los reportes ms recien-tes muestran que en Bogot, en el 2000, el serovargrippotyphosafue el de mayor presentacin, inclu-so sobrepasando a canicola e icterohaemorrhagiae(Celis y Vargas, 2000). En el 2004 se report que

los serovares hardjoy bratislavahan incrementadosu presentacin (Sandoval, 2004).

En la cotidianidad, la tcnica utilizada para el diagns-tico de la leptospirosis es la aglutinacin microscpi-ca (MAT), en la cual se detectan anticuerpos contradiferentes serovares deLeptospiraspp. (Davis et l.,1972; Ettinger y Feldman, 2002; Carr et l., 2003;Sandow y Ramrez, 2005). Tiene una sensibilidad

y especificidad hasta del 92% y el 95% respectiva-mente. El punto de corte ms recomendado paracaninos es 1:50. Los ttulos vacunales generalmente

van desde 1:100 a 1:400 con una persistencia de 1 a2 meses, pero se pueden presentar casos con ttulos

vacunales hasta 1:3.200 con una permanencia hastade 6 meses (Ross y Rentko, 2000). Al igual que otras

pruebas serolgicas, para diagnosticar una infeccinindividual, se requiere estudiar dos muestras parea-das de 15-20 das de intervalo entre la primera y lasegunda; si se observa que se present seroconver-sin, se considera de valor diagnstico un cambio enel ttulo de, al menos, cuatro veces el ttulo inicial. Sicon la primera muestra presenta ttulos mayores oiguales a 1:800 y hay compatibilidad clnica y de la-

boratorio, se considera positivo a Leptospirosis sinnecesidad de realizar muestras seriadas (Davis et l.,

1972; Ross y Rentko, 2000). Otras tcnicas utiliza-das con alguna regularidad para el diagnstico de laleptospirosis son la visualizacin por medio de mi-croscopio de campo oscuro e intento de aislamiento.

La constante bsqueda de tcnicas diagnsticassensibles y especficas para la leptospirosis canina

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

3/14

Rev. Med. Vet.: Bogot (Colombia) N 21: 133-145, enero-junio de 2011 135

Diagnstico de leptospirosis canina por medio de las tcnicas Dot-ELISA y MAT en perros con enfermedad renal en Bogot

ha hecho que se trabaje en los ltimos aos contcnicas de Elisa modificadas, como el Dot-Elisa.Esta prueba se ha desarrollado para diagnosticardiferentes enfermedades como toxoplasmosis, leis-

hmaniasis y la enfermedad de Newcastle, con re-sultados favorables (Pappas et l., 1983; Watt etl., 1988; Roy y Venugopalan, 1999). El Dot-Elisa,como todo ensayo inmunoenzimtico, recurre alempleo de inmungenos, haptenos o anticuerposmarcados con una enzima, para revelar el reactivocomplementario en distintos fluidos biolgicos;es una prueba cualitativa, pues indica la ausenciao presencia de un antgeno o anticuerpo determi-nando, mas no cuantitativa, como la mayora de los

Elisa que utilizan espectrofotometra para leer lareaccin colorimtrica (Coligan et l., 2005; Rei-na, 2006; Laboratorios Gminis, 2006; Winipe-dia, 2006). Para el diagnstico de la leptospirosis,se ha comparado el Dot-Elisa, pero detectandoanticuerpos en suero, con la tcnica de eleccin,la prueba MAT, y se han obtenido resultados de91,2% de sensibilidad y 81,3% de especificidaddel Dot-Elisa frente al MAT (Pappas et l., 1985).

En el presente trabajo se correlacionaron la pruebaDot-Elisa con la prueba de eleccin en la cotidia-nidad para el diagnstico de leptospirosis canina,la tcnica de aglutinacin microscpica (MAT), apartir de muestras de suero y orina de perros conenfermedad renal, a fin de evaluar la efectividaddiagnstica del Dot-Elisa.

M

El trabajo se realiz en Bogot. La recoleccin delas muestras se efectu en clnicas veterinarias ubi-cadas en las localidades de Usaqun, Teusaquillo ySuba. El trabajo de laboratorio se desarroll en elLaboratorio de Microbiologa de la Facultad deMedicina Veterinaria, Universidad de La Salle, sedeLa Floresta.

Para el trabajo se recolectaron muestras de suerosanguneo y de orina de treinta caninos, de diferen-tes razas, sexo y edad, que manifestaron signos deinsuficiencia renal aguda o crnica y que fueron

confirmados por la medicin serolgica de nive-les de creatinina y BUN como pacientes con dis-funcin renal.

Muestras

De cada paciente se obtuvieron muestras de sueropor venopuncin de la vena ceflica o vena yugular,

y orina por cistocentsis o por sonda. El suero sedeposit en tubos viales de 5 ml, los cuales se man-

tuvieron congelados a -25 C hasta la realizacinde la prueba de MAT (Myers, 1985). La orina fuediluida 1:1 en solucin salina amortiguadora defosfatos (SSAF) 0,01 M, pH 7,6 para su trans-porte al laboratorio para la prueba de Dot-Elisa.

Prueba de aglutinacin microscpica(MAT)

La prueba se trabaj con los siguientes serovares

de Leptospirainterrrogans: canicola, icterohaemorr-hagiae, pomona, bratislava, hardjoy grippotyphosa,mantenidos en medio EMJH. El trabajo se basen la tcnica de Myers (1985), modificada as:

Realizar una dilucin madre 1:50 del suero conSSAF 0,01 M, pH 7,6.

En una caja de microtcnica fondo en u de 96pozuelos, se agregan 50 ml de la solucin ma-dre y 50 ml de antgeno consistente en cultivos

puros de leptospira, libres de aglutinacin y concrecimiento de media unidad de Mc Farland. Incubar por 60 minutos a 37 oC en cmara

hmeda. Leer en microscopio de campo oscuro a 100X.

Se da como positiva la presencia de aglutina-cin en ms de 50% de las leptospiras.

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

4/14



Los sueros positivos se llevan a titulacin porseries dobles desde 1:100 hasta 1:102.400. Elttulo se da como la recproca de la dilucinmayor donde aglutine el 50% de las leptospiras.

Se establecieron dos grupos entre los perros quepresentaron ttulos a MAT para facilitar el enten-dimiento de los resultados: el grupo A lo formarontodos los animales que presentaron ttulos a MATa partir de 1:50; en el grupo B se ubicaron todoslos perros que presentaron ttulos iguales o mayo-res a 1:1.800.

Prueba Dot-ELISA

Elaboracin y obtencin de sueroshiperinmunes contra Leptospiraspp.

Se inocularon cuatro conejos nueva zelanda hem-bras de 4 meses de edad, y de 1 kg de peso, concultivos de 7 das de los serovares deLeptospirain-terrrogans: canicola, icterohaemorrhagiae,pomonaygrippotyphosa, en medio lquido EMJH, va intra-venosa en la vena auricular externa; un serovar por

cada conejo (tabla 1).

Tabla 1. Calendario de inmunizaciones

Da 1 Da 8 Da 15 Da 22

Inmunizacin 1ra 2da 3ra 4ta

Cantidad (mL)por inocular decada serovar

0,24 0,6 1,2 2,4

Fuente: elaboracin propia.

El sacrificio se realiz al alcanzar ttulos de1:12.800 por sangra en blanco bajo un protocolode anestesia general (Harcourt, 2002) aprobadopor el Comit de tica de la Facultad de Medicina

Veterinaria de la Universidad de La Salle. El suerose almacen en alcuotas de 1,5 ml y congelados a-20 C.

Estandarizacin de la prueba Dot-Elisaen orina

A fin de encontrar las diluciones ptimas de los

sueros hiperinmunes y de la protena G marcadacon peroxidasa para la prueba, se realiz la estan-darizacin segn el protocolo descrito por Daz(1995), trabajando los sueros hiperinmunes a unadilucin de 1:3.200 y la peroxidasa a 1:4.000.

Tcnica

El protocolo de Dot-Elisa fue descrito por Daz(1995), as:

Centrifugar a 3.500 RPM la muestra de 4 ml deorina diluida en SSAF 0,01M, pH 7,6 por 10minutos.

Descartar el sobrenadante. Recortar cuatro tiras de papel de nitrocelulosa

0,45 mm (SIGMA) de dimensiones de 1 x 5crculos marcados con una caja de microtcnica.

En el crculo 1 se colocaron 2 ml de suero hi-perinmune contra el serovar correspondiente(control positivo para la peroxidasa), en el

crculo 2, 2 ml de SSAF (control negativo), enlos crculos 3 y 4 se colocaron 2 ml del preci-pitado de la orina centrifugada y en el crculo 5,2 ml del antgeno respectivo (control positivopara los sueros hiperinmunes).

Dejar secar completamente por 15 minutos. Sumergir las tiras en la solucin bloqueadora a

base de leche descremada al 1% con 300 ml deH

2O

2y 4 ml de metanol, durante 90 minutos a

37 C en cmara hmeda.

Lavar por 3-4 veces con SSAF 0,01M, pH 7,6durante 5 minutos. Depositar cada tira en 6 ml de una dilucin

1:3.200 del suero hiperinmune respectivo. Incubar por una hora a 37 C en cmara hmeda. Lavar por 3-4 veces con SSAF 0,01M, pH 7,6

por 5 minutos.

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

5/14



Sumergir las tiras en 8 ml de la solucin de pe-roxidasa de rbano 1:4.000 en SSAF 0,01M, pH7,6 protegida de la luz.

Incubar a 37 C por una hora en cmara hmeda.

Lavar por 3-4 veces con SSAF 0,01M, pH 7,6durante 5 minutos. Sumergir las tiras en la solucin reveladora por

5-10 minutos con luz tenue. Composicin de la solucin reveladora. 10 ml de Solucin Amortiguadora de Citrato

Fosfato pH 5,0 (Burleson etl., 1992). 10 ml de perxido de hidrgeno (H

2O

2).

3,78 mg de DAB(di-amino-benzidina). Labo-ratorios Sigma.

Parar la reaccin con agua corriente. Se considera resultado positivo cuando aparece

una mancha de color caf rojizo en los crculos3 y 4 correspondientes a la muestra de orina.

Anlisis estadstico

El anlisis estadstico se bas en estadstica des-criptiva, distribucin de frecuencias, correlacinlineal simple de Pearson y tablas de contingenciade chi-cuadrado (c2) (Martnez, 1999).

Tablas de contingencia de chi-cuadrado

Se realiz una distribucin de frecuencias a las va-riables sexo, MAT en general, MAT por serovaresrespecto a los ttulos que se presentaron para cadauno, Dot-Elisa en general y Dot-Elisa por serovares.Para la realizacin de las tablas de asociacin entrelas pruebas Dot-Elisa y MAT, se agruparon los re-sultados de la prueba de MAT en dos grupos: gru-po A: animales positivos a ttulos 1:50 y grupo B:

animales positivos a ttulos 1:800. La asociacinestadstica se consider para valores deP< 0,05.

Estadstica descriptiva

La estadstica descriptiva, basada en la media arit-mtica, la media geomtrica y la desviacin estn-

dar, se realiz para las variables peso, edad, nive-les sricos de creatinina, niveles sricos de BUN yMAT por serovares.

Correlacin lineal simple

La correlacin se hizo entre las variables MAT y losniveles de creatinina, entre MAT y los niveles deBUN y entre niveles de creatinina y de BUN. Elanlisis estadstico se realiz con el programa Sta-tistix, bajo los procedimientos de modelos linea-les generales y anlisis de asociacin.

R

Se muestrearon veinte caninos machos y diez ca-ninos hembras con un peso de 14,97 12,29 kg, yuna edad de 7,8 4,3 aos. Los niveles de creatini-na fueron 3,7 3,51 y BUN de 79,17 94,25.

Prueba aglutinacin microscpica MAT

De treinta perros con enfermedad renal, diecisiete(56,7%) presentaron ttulos (a partir de 1:50) para

algn serovar de Leptospira interrogans; los restan-tes no los presentaron, y corresponden al grupo A.Dentro del grupo de los que presentaron ttulos, treceperros presentaron ttulos para el serovar icterohaemo-rrhagiae, doce para el serovargrippotyphosa, one parael serovar canicola, cuatro para el serovarpomona, dospara el serovar hardjoy uno para el serovar bratislava.

De los diecisiete perros que presentaron ttulos aMAT, solo seis perros (20%) tuvieron ttulos ma-

yores o iguales a 1:800 (grupo B) para algn sero-var, los once restantes presentaron ttulos menores(36,7%), por lo que solo el 20% de los perros mues-treados fueron positivos por MAT a leptospirosiscon una sola muestra. De estos 6seis perros positi-

vos, se encontr que los ttulos mayores o igualesa 1:800 se repartieron entre los serovares canicola,

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

6/14



pomona y grippotyphosa, con mayor presentacinpara el serovar canicola, seguido de grippotyphosa

y, por ltimo,pomona.A los seis serovares utiliza-

dos en MAT se les realiz estadstica descriptiva ydistribucin de frecuencias para cada ttulo, utili-zando la media geomtrica (tabla 2).

Tabla 2. Estadstica descriptiva de los ttulos a MAT por serovares, utilizando la media geomtrica

Serovares NX

S Mnimo Mximo

Sv. canicola 30 8,75 23,48 0 51246,3

Sv. icterohaemorrhagiae 30 6,59 9,27 0 200,9

Sv. grippotyphosa 30 10,52 24,51 0 102436,6

Sv. pomona 30 1,94 6,30 0 3200,9

Sv. hardjo 30 1,29 2,71 0 50,9

Sv. bratislava 30 1,14 2,04 0 50,9


Observando la tabla 2, se pude ver que la presen-tacin de ttulos para todos los serovares real-mente fue baja, pero algunos llegaron a presentarttulos mximos altos como los serovares canico-la, grippotyphosa y pomona. Para el serovar cani-cola, once perros (36,7%) presentaron ttulos, de

los cuales tres mostraron ttulos 1:50; para los t-tulos 1:200 y 1:1.600, cuatro perros distribuidosequitativamente presentaron estos ttulos. Paralos ttulos 1:100, 1:400, 1:800 y 1:51.200, un pe-rro respectivamente para cada ttulo; los restan-tes fueron negativos a este serovar. Para el serovaricterohaemorrhagiae, trece perros (43,3%) pre-sentaron ttulos, la mayora (ocho perros) parael ttulo 1:50, tres perros presentaron ttulos de1:200 y dos perros para 1:100. Los restantes die-

cisiete animales no presentaron ttulos para esteserovar. Del total de perros muestreados, doce(40%) presentaron ttulos para el serovar gri-ppotyphosa; de los doce, tres presentaron ttulos1:50, cuatro para 1:200, dos perros tuvieron ttu-los para 1:400, y para los ttulos 1:800, 1:1.600

y 1:102.400, un perro respectivamente present

estos ttulos. Los serovares restantes no presenta-ron tanta reactividad como los otros tres anterior-mente mencionados. Para el serovarpomona, solocuatro perros presentaron ttulos, tres para 1:50 yuno para 1:3.200. Para el serovar hardjo, dos perrospresentaron ttulos en 1:50, los dems no presen-

taron ttulos para este serovar. Y para el serovar bra-tislavasolo un perro mostr ttulos en 1:50.

Prueba Dot-Elisa

De treinta perros con enfermedad renal, nueve(30%) fueron positivos a Dot-Elisa en orina paraalguno de los serovares manejados, y los restantesfueron negativos. Durante la realizacin de la prue-

ba Dot-Elisa no se presentaron inconvenientes, y

los pozuelos marcaron bien (figura 1). Dentro delgrupo de los positivos, seis perros fueron positivosal serovar canicola (20%). Para el serovar grippo-typhosa, cuatro perros (13,3%) fueron positivos.Para el serovar icterohaemorrhagiae, cinco perros(16,7%) fueron positivos. Siete perros (23,3%)fueron positivos al serovarpomona.

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

7/14



Asociacin entre la prueba Dot-Elisay la prueba MAT

Asociacin de las pruebas en general

De los diecisiete perros (grupo A) que presentaronttulos a MAT, nueve fueron positivos a Dot-Elisa.De los veintiun perros negativos a Dot-Elisa, ochopresentaron ttulos a MAT. En consecuencia, se

puede confirmar que trece perros no tenan comoetiologa de la enfermedad renal la leptospirosis,

pues fueron negativos a ambas pruebas; nueve pe-rros padecan leptospirosis, pues salieron positivosal Dot-Elisa, y tuvieron ttulos en MAT; por lo que

veintids perros fueron correctamente diagnostica-dos. Los restantes ocho casos quedan sin diagnsti-co establecido, pues solo tuvieron ttulos en MATque no fueron confirmados por Dot-Elisa (tabla 3).

Figura 1. Combinaciones del Dot-Elisa

Serovar pomona

Serovar icterohaemorrhagiae

Serovar icterogrippotyphosa

Serovar grippotyphosa

A: Dot-Elisa negativo a todos los serovares. B: Dot-Elisa positivo a todos los serovares. C: Dot-Elisa positivo a icterohaemorrhagiaeycanicola. D: Dot-Elisa positivo apomonaygrippotyphosa. CP: control positivo de la peroxidasa. CN: control negativo. M: muestra.CPS: control positivo de los sueros hiperinmunes.


CPP CN M M CPS CPP CN M M CPS

Serovar pomona

Serovar icterohaemorrhagiae

Serovar icterogrippotyphosa

Serovar grippotyphosa

A B

C D

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

8/14



Con el grupo B del MAT, seis perros presenta-ron ttulos 1:800 en MAT, pero solo cinco fue-ron positivos a Dot-Elisa, lo que indica que un pe-rro no estaba en fase de leptospiruria. De los nueve

perros positivos a Dot-Elisa, cuatro no tenan ttu-los 1:800. Fueron correctamente diagnosticadosveinticinco perros, por ambas pruebas (tabla 4).

Tabla 3. Asociacin entre Dot-Elisa positivos y ttulos a MAT

(grupo A)

MAT con ttulos

Dot-Elisapositivos

0 (-) 1 (+)

0 (-) 13 8 21

1 (+) 0 9 9

17 13 30Chi-cuadrado: 9,03; valorP: 0,0017; grados de libertad: 1.


Tabla 4. Asociacin entre Dot-Elisa positivos y MAT con

ttulos mayores o iguales a 1:800 (grupo B)

MAT con ttulos 1:800

Dot-Elisapositivos

0 (-) 1 (+)

0 (-) 20 1 21

1 (+) 4 5 9

24 6 30

Chi-cuadrado: 10,16; valorP: 0,0014; grados de libertad: 1.


Las asociaciones estadsticas entre la prueba Dot-Elisa y la prueba MAT (grupos A y B) fueron alta-mente significativas (P< 0,01).

Asociacin de las pruebas por serovares

Para el serovargrippotyphosa, la asociacin entre am-bas pruebas fue altamente significativa (P= 0,0085**),donde veintids perros fueron correctamente diag-nosticados, dieciocho negativos a las dos pruebas

y cuatro positivos en ambas; los ocho restantespresentaron ttulos a MAT para este serovar, perono fueron positivos en Dot-Elisa. Para el serovar

pomona, la asociacin fue altamente significativa(0,0087**), donde veinticinco perros fueron co-rrectamente diagnosticados, veintids negativos ytres positivos; de los cinco restantes, cuatro fueron

positivos al Dot-Elisa para el serovar pomona, perono presentaron ttulos a MAT para este serovar ypara el restante, fue viceversa. Para los serovares ca-nicolae icterohaemorrhagiae, la asociacin entre lasdos pruebas no fue significativa.

D

Prueba de aglutinacin microscpicaMAT

La reactividad de perros con enfermedad renal a pre-sentar anticuerpos contraLeptospiraspp. en Bogotes alta, independientemente de si son anticuerpos

vacunales o por infeccin, pues ms de la mitaddel grupo muestreado present ttulos, mostrandoque la leptospirosis es una entidad muy importantepara tener en cuenta como diagnstico diferencialde causas potenciales de disfuncin renal (Couto

y Nelson, 2000; Ettinger y Feldman, 2002; Mc Do-

nough, 2005). Se puede ver que el serovar que msse present, sin importar los ttulos, fue icterohae-morrhagiae, solo o acompaado de otros serovares.

Autores como Ross y Rentko (2000) y Sessions yGreene (2004a) reportan que cuando se presentancasos con ttulos a varios serovares, se toma el se-rovar con el ttulo ms alto como el causante delcuadro y los dems serovares con ttulos ms ba-

jos se presentan debido a reaccin cruzada; segnesto, el serovar que present ttulos ms altos fue el

serovar canicola, seguido de icterohaemorrhagiae,luego le siguegrippotyphosa, luego la combinacinde canicola y grippotyphosa, seguido por el sero-

var pomonay la combinacin de canicola, grippo-typhosaypomona. Los serovares hardjoy bratislavasolo se presentaron con ttulos bajos y en combi-nacin con otros serovares, por lo que se atribuye

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

9/14



a reaccin cruzada (Ross y Rentko, 2000; Sessions yGreene, 2004a). La correlacin directa ms impor-tante que se present entre los serovares en MAT fueentre canicolaygrippotyphosa, lo cual indica que es la

combinacin ms presente en el estudio; despus deesta sigue la correlacin directa entre el serovar ictero-haemorrhagiaey el serovarpomona, aunque no fue tansignificativa como la primera.

Autores como Brown et l. (1996); Adin y Cowgill(2000); Sessions y Greene (2004a) reportan quelos serovares comnmente implicados en la leptos-pirosis canina son canicola e icterohaemorrhagiae,pero otros serovares comogrippotyphosaypomona

han venido incrementando su presentacin, posi-blemente, debido a la falta de estos serovares enlas vacunas comerciales. Esto es similar a lo encon-trado en el presente estudio, pues el serovar msimplicado fue el canicola, seguido por los serovaresicterohaemorrhagiaey grippotyphosa. No se repor-tan otros estudios de leptospirosis en perros conproblemas renales, pero hay estudios como el rea-lizado por Venkataraman et l. (1992), en la India,que muestra que los serovares ms evidenciados

en perros en ese pas son, en orden de mayor im-portancia, icterohaemorrhagiae, canicolay pomona.Otros estudios en pases estacionales como Esta-dos Unidos y Australia reportan que en poca delluvias y humedad el serovar que ms se presenta,sobrepasando a icterohaemorrhagiaey canicolaes elserovargrippotyphosa(Ward et l., 2004a; Ward etl., 2004b). Adin et l., entre 1990 y 1998, realiza-ron un estudio con el que se demostr que en elestado de California en Estados Unidos, ha aumen-

tado la presentacin de serovares como pomona,hardjoy bratislava.

En Colombia, Celis y Vargas, en el 2000 reportanel grippotyphosa como el serovar con mayor pre-sentacin en perros de la ciudad de Bogot, segui-do por icterohaemorrhagiaey canicola. Sandoval en

el 2004, en Bogot, muestra que la presencia de losserovares hardjoy bratislava se ha vuelto ms co-mn que en tiempos pasados.

Al analizar los resultados de este estudio y de losanteriormente mencionados, se puede ver que lapresentacin de serovares, como grippotyphosa

ypomona, que hace unos aos no era comn, hoyen da ha aumentado, superando los dos serovaresque antiguamente eran ms comunes en perros,canicola e icterohaemorrhagiae. Se atribuye comocausante de esta situacin la vacunacin para elcontrol de la leptospirosis en perros, ya que se uti-liza una vacuna bivalente que solo controla los se-rovares canicola e icterohaemorrhagiae, por lo quelos perros quedan desprotegidos contra los otrosserovares que pueden causarle la enfermedad.

Prueba Dot-Elisa

La prevalencia de perros con enfermedad renalcausada por leptospirosis (en fase de leptospiru-ria) en Bogot es significativa, pues el 30% delgrupo muestreado result positivo a la enferme-dad. La distribucin de la presentacin de los se-

rovares en la prueba Dot-Elisa fue homognea, enla cual siete perros fueron positivos apomona, seisa canicola, cinco a icterohaemorrhagiae y cuatro agrippotyphosa.

Asociacin entre la prueba Dot-Elisay la prueba MAT

La asociacin presentada entre la prueba Dot-Elisaen orina y la prueba MAT en suero con el gru-

po A y B, fue altamente significativa (P< 0,01).Esto muestra la importancia del Dot-Elisa comoprueba diagnstica de leptospirosis, en relacincon la prueba utilizada en la cotidianidad que esla prueba MAT, ya que por esta, de los treinta pe-rros muestreados, diecisiete presentaron ttulos,pero solo a seis se les dio el diagnstico de lep-

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

10/14



tospirosis por presentar ttulos mayores o igua-les a 1:800, y once perros falsos positivos, lo quehara necesario realizarles una segunda o terceramuestra, para confirmar o descartar el diagns-

tico, pero al utilizar Dot-Elisa simultneamente,se confirm el diagnstico de cuatro perros falsospositivos con la prueba MAT, evitando dar un re-sultado errneo.

Lo anterior resalta la necesidad de encontrar tc-nicas ms sensibles y especficas que la pruebaMAT, debido a las desventajas que presenta comola toma de muestras seriadas, con intervalos de 15a 20 das (McDonough, 2005), la presencia de

anticuerpos vacunales residuales o de reactividadcruzada. Una de estas pruebas es el Dot-Elisa enorina, que no detecta anticuerpos como la pruebaMAT, sino que detecta estructuras antignicas deleptospiras no necesariamente viables, por lo queno presenta los problemas que presenta el MAT encuanto a los niveles de anticuerpos presentes en lasangre, los cuales dependen de la etapa de la en-fermedad en que se encuentre el animal. En casosagudos, los anticuerpos van a estar elevados, pero

ya en casos crnicos los anticuerpos tienden adisminuir a niveles basales (Daz, 1995); y comola mayora de los casos clnicos en los que se sos-pecha leptospirosis son casos crnicos (Greene,2000) en los cuales la leptospiruria est presente,una prueba que detecte antgenos en orina es idealpara confirmar o descartar el diagnstico que se haobtenido con la prueba MAT.

C

De una poblacin de treinta caninos con enferme-dad renal en Bogot, el 33,3% (diez perros) fueronpositivos a leptospirosis como etiologa del daorenal en la unin de los resultados de las pruebasDot-Elisa y MAT. El 66,7% restante fue negativo,lo cual indica que de cada diez perros con enfer-

medad renal, tres tienen leptospirosis. La asocia-cin existente entre la prueba Dot-Elisa y la pruebaMAT fue altamente significativa (P< 0,01), lo queseala que cualquier paciente canino que presente

un resultado positivo a Dot-Elisa va presentar, conmuy alta probabilidad, ttulos a MAT y viceversa.

La asociacin entre la prueba Dot-Elisa y el MAT,para los serovaresgrippotyphosaypomona, respecti-

vamente, fue altamente significativa, concluyendoque un canino que presente un resultado positivopara alguno de estos serovares en Dot-Elisa, pre-sentar ttulos en MAT para el mismo serovar y

viceversa. Aunque la asociacin entre ambas prue-

bas para los serovares canicola y icterohaemorrha-giaeno fue significativa. La ausencia de asociacinentre las dos pruebas para estos serovares se puededeber posiblemente a la vacunacin previa y al es-tado de hospedero principal que tienen los cani-nos frente a estos dos serovares.

La reactividad a presentar ttulos a Leptospira in-terrogans spp. en perros con enfermedad renal enBogot es considerablemente alta, independien-

temente de si se deben a infeccin o a vacunales,porque de treinta perros muestreados, el 56,7%(diecisiete perros) presentaron ttulos para algnserovar, mientras que solamente el 43,3% no lospresent. La reactividad serolgica en MAT ma-

yor o igual a 1:800 con signos clnicos y datos delaboratorio compatibles con la enfermedad, in-dica positividad a leptospirosis (Ross y Rentko,2000; Sessions y Greene, 2004a y 2004b), porlo que este estudio encontr que de los trein-

ta perros muestreados, solo a seis (20%) se lesdiagnostic con certeza, por medio de la pruebaMAT, leptospirosis como etiologa de la falla re-nal, pues presentaron ttulos mayores o iguales a1:800; estos ttulos se repartieron entre el sero-

var canicola, elgrippotyphosay elpomona. El serovarque ms present ttulos altos (mayores o iguales

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

11/14



a 1:800) y, por tanto, al que se atribuy como elserovar causante de la mayora de cuadros, fueel canicola, seguido en orden descendente por elicterohaemorrhagiae, luego por el grippotyphosa,

despus por la combinacin de los serovares cani-colaygrippotyphosa, seguidos del serovarpomona

y, por ltimo, de la combinacin de los serovarescanicola,grippotyphosaypomona.

La correlacin directa ms importante que se pre-sent entre los serovares en MAT fue entre canicola

y grippotyphosa, lo que indica que es la combina-cin que ms se present en el estudio. Despusde esta, sigue la correlacin directa entre el serovaricterohaemorrhagiaey elpomona, aunque no fue tansignificativa como la primera. Los serovares gri-ppotyphosa y pomonahan venido incrementandosu presentacin como causantes de leptospirosiscanina, incluso llegando a sobrepasar a los serova-res comnmente implicados, icterohaemorrhagiae

y canicola, debido a la falta de vacunacin contraestos primeros.

Durante el desarrollo del presente trabajo se con-firmaron las desventajas que presentan las tcnicasusualmente utilizadas para el diagnstico de lep-tospirosis, principalmente del MAT, pero se viocomo la prueba Dot-Elisa toma importancia frentea la primera como prueba diagnstica.

R

La informacin que provee este trabajo muestra la

utilidad de una prueba diferente a las comn-mente utilizadas para el diagnstico de leptospi-rosis canina, la prueba Dot-ELISA en orina, unaprueba que ayuda a dar un diagnstico ms rpido

y ms confiable en perros con enfermedad renal,para que el mdico veterinario establezca un tra-tamiento adecuado y a tiempo, por lo que se reco-

mienda el uso de esta prueba junto con la pruebaMAT para el diagnstico de leptospirosis. Adems,sea cual sea la prueba que se utilice para el diagns-tico, no se debe usar como nica prueba, se debe

complementar con otra para poder confirmar eldiagnstico.

Igualmente, este trabajo es importante como sopor-te para realizar nuevos estudios en leptospirosis, uti-lizando la prueba Dot-Elisa, no solo en caninos, sinotambin en otras especies; asimismo, se puede apli-car para otras enfermedades que tambin necesitanpruebas diagnsticas ms sensibles y especficas.

Con los resultados obtenidos, se recalca el cambioascendente que ha sufrido la presentacin de otrosserovares (grippotyphosa y pomona) en relacincon los que se atribuan como causantes de la lep-tospirosis, serovar canicola e icterohaemorrhagiae,lo cual demuestra que esta enfermedad es muy di-fcil de controlar as exista una vacuna, que se po-dra decir, ha servido para controlar la leptospiro-sis causada por los dos serovares que la componen,

pero que no acta frente a los dems serovares. Fal-ta proteccin contra estos, lo que hace pensar enla posibilidad de desarrollar una vacuna que protejacontra ms serovares.

Se recomienda hacer algn estudio sobre la vacu-na existente y ver cmo es la presentacin de losttulos vacunales durante los primeros meses pos-

vacunacin, para poder saber cul es el compor-tamiento de estos, y poder diferenciar con mayor

facilidad un ttulo vacunal de uno infeccioso, y aspoder dar un diagnstico ms confiable. Igualmen-te, el grupo ha venido avanzando en proyectos deinvestigacin con anticuerpos monoclonales con-tra diferentes serovares deLeptospira spp., a fin demejorar las tcnicas diagnsticas al aumentar su es-pecificidad y sensibilidad.

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

12/14



R

Adin, C.A. y Cowgill, L.D. (2000). Treatment andOutcome of Dogs with Leptospirosis: 36 Cases

(1990-1998).Journal of the American Veterinary Me-dical Association, 216(3), 371-376.

Brown, C., Roberts, W., Miller, M., Davis, D., Brown, S.,Bolin, C., Jarecki-Black, J., Greene, C. y MillerLiebl,D. (1996). Leptospira Interrogans Serovar Grippo-typhosa Infection in Dogs. Journal of the AmericanVeterinary Medical Association,209(7), 1265-1268.

Burleson, F.G., Chambers, T.M. y Wiedbrauk, D.L.(1992). Virology. A Laboratory Manual. USA: Aca-demic Press.

Carr, A., Nielssen, A. y Heseltine, J. (2003). ManagingLeptospirosis in Dogs. Veterinary Medicine, 98 (7),586-592.

Celis, C.T. y Vargas, P. (2000). Prevalencia serolgicadeLeptospiraen caninos de la Clnica de PequeosAnimales de la Universidad Nacional de Colombia.Tesis de pregrado, Facultad de Medicina Veterinariay Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia.

Coligan, J.E, Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach,E.M. y Strober, W. (2005). Short Protocols in Immu-nology. A Compendium of Methods from Current Pro-

tocols in Immunology. USA: Wiley & Sons.

Couto, G.C. y Nelson, R.W. (2000).Medicina interna deanimales pequeos. Buenos Aires: Inter-Mdica.

Davis, J.W, Karstad, L.H. y Trainer, D.O. (1972).Enfer-medades infecciosas de los mamferos salvajes (Se-gunda parte. Enfermedades bacterianas, rickettsicasy micticas). Zaragoza: Acribia.

Daz, C.A. (1995). Desarrollo y evaluacin de proced-imientos serolgicos e inmunohistoqumicos en eldiagnstico de la leptospirosis bovina. Tesis de mae-

stra, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia dela Universidad Nacional de Colombia.

Ettinger, S.J. y Feldman, E.C. (2002). Tratado de medici-na interna veterinaria. Enfermedades del perro y el gato(5 ed.). Buenos Aires: Inter-Mdica.

Fowler, M.E. y Cubas, Z.S. (2001). Biology, Medicineand Surgery of Outh American Wild Animals. Iowa:Iowa State University Press/Ames.

Greene, C.E. (2000).Enfermedades infecciosas. Perros y

gatos. Seccin III. Infecciones bacterianas. Mxico: In-teramericana Mc Graw Hill.

Harcourt, F. (2002). Textbook of Rabbit Medicine. Ox-ford, Great Britan: Butter Worth Heinemann.

Laboratorios Gminis (2006). La tcnica de Elisa.Recuperado de: .

Langston, C.E. y Heuter, K.J. (2003). Leptospirosis.A Re-Emerging Zoonotic Disease. The VeterinaryClinics of North American. Small Animal Practice,33(4), 791-805.

Martnez, C. Estadstica y muestreo (9 ed.). Bogo-t: Ecoe.

Mc Donough, L. (2005). Leptospirosis en caninos-estado actual. IVIS. Recuperado de: .

Myers, D.M. (1985). Manual of Laboratory Methodsfor the Diagnosis of Leptospirosis. Pan AmericanZoonoses Center/Pan American Health Organiza-tion/Pan American Sanitary Bureau Regional Officeof the World Health Organization Tec. Not., 30, 5-36.

Pappas, M.G., Ballou, R., Gray, M.R., Takafuji, E.T.,Miller, R.N. y Hockmeyer, W.T. (1985). Rapid Se-rodiagnosis of Leptospirosis usingthe IgM - specificDot-ELISA: Comparison with the Microscopic Ag-glutination Test. The American Society of Tropical

Medicine and Hygiene,34(2), 346-354.

Pappas, M.G., Hajkowski, R. y Hockmeyer, W.T. DotEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (dot-ELI-SA): A Micro Technique for the Rapid Diagnosis

of Visceral Leishmaniasis. Journal of ImmunologicalMethods,64, 205-214.

Reina, M. (2006). Elisa. Universitat de Barcelona. Re-cuperado de: .

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

13/14



Ross, L.A. y Rentko, V. (2000). Leptospirosis. Kisk`sCurrent Veterinary Therapy XIII. Small Animal Prac-

tice. USA: W. B. Saunders.

Roy, P. y Venugopalan, A.T. Dot-Enzyme linked im-

munosorbent assay for demostration of newcastledisease virus infection. Comparative Immunology,

Microbiology & Infectiuos Diseases,22(1), 27-31.

Sandoval, C.E. (2004). Leptospirosis canina: revisin,correlacin entre resultados de campo oscuro frentea resultados de hematologa, bioqumica sangunea,urianlisis y MAT en 11 perros con leptospirosiscomo diagnstico diferencial ms posible. Informede pasanta. Laboratorio Clnico de la Facultad deMedicina Veterinaria y Zootecnia de la UniversidadNacional de Colombia.

Sandow, K. y Ramrez W. (2005). Leptospirosis. Mono-grafas.com. Recuperado de: .

Sessions, J.K. y Greene, C.E. (2004a). Canine Lepto-spirosis: Epidemiology, Pathogenesis, and Diagno-sis. Compendium,26 (8), 606-618.

Sessions, J.K. y Greene, C.E. (2004b). Canine leptospi-rosis: treatment, prevention, and zoonosis. Compen-dium,26(9), 700-705.

Stornelli, A., Arauz, S., Arias, D., Stanchi, N. y Renner,E. (1999). Leptospirosis canina. Revisin mdica.Selecciones Veterianarias,7(5), 544-547.

Venkataraman, S. y Nedunchelliyan, S. Epidemiology

of an Outbreak of Leptospirosis in Man and Dog.Comparative Immunology, Microbiology and infectiousDiseases15 (4). (1992): 243-247.

Ward, M. P., Guptill, L. F. and Prahl, A. (2004a). Se-rovar-Specific Prevalence and Risk Factors for Lep-tospirosis among Dogs: 90 Cases (1997-2002).

Journal of the American Veterinary Medical Associa-

tion, 224, 1958-1963.

Ward, M. P., Guptill, L. F., Prahl, A. y Wu, C. C.(2004b). Evaluation of Environmental Risk Factorsfor Leptospirosis in Dogs: 36 Cases (1997-2002).

Journal of the American Veterinary Medical Association225, 72-77.

Watt, G., Alquiza, L. M., Padre, L. P., Tuazon, M. L.,Laughlin, L. W. (1988). The Rapid Diagnosis ofLeptospirosis: A Prospective Comparison of theDot Enzyme-Linked Immunosorbet Assay and theGenus-Specific Micrscopic Agglutination Test atDifferent Stages of Illness. The Journal of Infectious

Diseases,157(4). 840-842.

Winipedia, Enciclopedia Libre. Elisa. Winipedia.2006. .

7/25/2019 568-1147-1-SM.pdf

14/14

568-1147-1-sm.pdf

Documents