Instituto del Profesorado en Enfermería “Padre Luis Tezza” (A-691) Carrera de Técnico en Laboratorio Prácticas I de Laboratorio. Técnicas Hematológicas Trabajo Práctico N°: Fecha: / / Alumno:

Recuento de Reticulocitos Objetivos: Adquirir la habilidad técnica para realizar la técnica de tinción, reconocer los reticulocitos y cuantificar su presencia en una muestra de sangre venosa. Materiales: Microscopio con objetivos de 10 X, 40 X y 100 X Aceite de Inmersión Portaobjetos de vidrio Sangre Entera recogida sobre EDTA Azul Brillante de cresilo Baño termostático a 37°C Pipeta de Pasteur Tubos de Hemólisis o de Kahn. Fundamento: Los Reticulocitos son elementos pertenecientes a la serie roja que se encuentran en el estadio de maduración previo al eritrocito maduro y en una proporción de cinco a diez por mil hematíes en una muestra de sangre venosa correspondiente a un adulto. Su tamaño es similar al de los hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulo-filamentoso, evidenciable mediante el empleo de microscopía óptica, para lo cual se colorea el frotis previamente utilizando azul brillante de cresilo o azul de metileno. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. La anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera que la médula ósea se encuentra regenerativa, mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en un período aproximado de 24 horas una vez que se encuentran en la sangre periférica. Técnicas: El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA) y a ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4º C, el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. Tinción vital y observación con microscopio óptico. 2. Citometría de flujo. Recuento manual El método manual carece de exactitud ya que presenta un coeficiente de variación que varía entre 15% a 20%), lo cual limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a

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Instituto del Profesorado en Enfermería “Padre Luis Tezza” (A-691) Carrera de Técnico en Laboratorio Prácticas I de Laboratorio. Técnicas Hematológicas terapéuticas agresivas y a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador posee. Método de tinción supravital con Azul de Metileno (Método de referencia) Este método utiliza como colorante el azul de metileno: 0,5 g de azul de metileno, 1,4 g de oxalato de potasio, 0,8 g de cloruro de sodio y se lleva a volumen final de 100 ml con agua destilada c.s.p Mediante una pipeta Pasteur se añade a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. En caso de valores muy bajos de hematócrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transcurrido este tiempo, se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos., una vez seca se observa, al microscopio con objetivo de inmersión de 100x (aumento total 1000x). Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1.000 eritrocitos. Para incrementar la precisión del recuento es preferible contar los reticulocitos presentes en 3.000 hematíes. El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida, siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje, siendo el 100 por ciento el número total de hematíes contado. Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total. (Ver en fórmula de Ajuste por hematócrito) Para estimar el porcentaje de reticulocitos se aplica el siguiente cálculo:

Número de reticulocitos Reticulocitos (%) = ---------------------------------- x 100 Número de eritrocitos

Para estimar la cantidad absoluta de reticulocitos por mm3 de sangre se aplica el siguiente cálculo:

Reticulocitos (%) Reticulocitos / mm3 = -------------------------- x Número de eritrocitos / mm3

100 Fórmula de Ajuste por hematócrito La disminución del número total de eritrocitos como suele ocurrir en la anemia, el valor porcentual debe corregirse según el hematócrito empleando la siguiente fórmula:

Hto del paciente Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto normal En caso de una anemia significativa, el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica. Ello obedece a que la anemia se

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Instituto del Profesorado en Enfermería “Padre Luis Tezza” (A-691) Carrera de Técnico en Laboratorio Prácticas I de Laboratorio. Técnicas Hematológicas acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador, que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica, y un acortamiento de su período de maduración intramedular, lo que supone un aumento del período de maduración periférica. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y de la tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa, aproximadamente lineal, entre el hematócrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos. De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) también denomina Índice de Reticulocitosis, aplicando la fórmula siguiente: (En Fisiopatología I, se abordará nuevamente el concepto en la unidad de Trastornos Hematológicos, capítulo Anemias)

Reticulocitos del paciente x Hto del paciente IPR = Período de maduración en días x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa) Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia se puede realizar mediante la siguiente tabla:

Hematócrito 45 40 35 30 25 20 15 Niveles de Hemoglobina (g/L) 150 133 117 110 83 66 50 Recuento de reticulocitos (%) 1 2 5 10 15 20 30 Recuento de reticulocitos corregido (%) 1 1,8 4 7 8,3 9 10 Tiempo de maduración estimado ± 1 día ± 2 días 3 días Índice de reticulocitos 1 2 5 5 7,5 10 10

Método de coloración supravital con azul brillante de cresilo Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia. La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C. Luego de este tiempo se realizará el extendido y se realiza el recuento de la misma forma indicada. Recuento automatizado Estos equipos realizan un recuento muy exacto de reticulocitos a partir de sangre total. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo, mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante Citometría de Flujo y Luz Láser. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.

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Instituto del Profesorado en Enfermería “Padre Luis Tezza” (A-691) Carrera de Técnico en Laboratorio Prácticas I de Laboratorio. Técnicas Hematológicas Valores de referencia:

Valor relativo (%)

Valor absoluto (x109 /L)

Recién nacido (sangre de cordón)

3,2 - 6,0 110 - 330

Niños y adultos jóvenes de 4 a 19 años

0,2 - 2,2 25 - 89

Adultos (20-50 años) Mujeres Hombres

0,2 - 2,5 0,5 - 2,8

25 - 86 32 - 97

Variaciones patológicas Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias por pérdida de sangre Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis Bibliografía Davidsohn, Israel; Bernard, Henry John. Diagnóstico clínico por el laboratorio. Todd – Sanford. Editores Salvat SA. Barcelona 6ta. Edición. Sans Sabrafen J. Hematología clínica. 4 ed. Barcelona: Hartcourt, 2001. Beutler E et al., editors. Williams: Hematology. 6 ed. New York: McGraw-Hill, 2001. Lewis SM, Bain BJ, Bates I. Dacie and Lewis practical haematology. 9 ed. London; New York: Churchill Livingstone, 2001. Ióvine-Selva. El laboratorio en la Clínica.Editorial Panamericana. Buenos Aires. 3ra. Edición.

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