3 microbiología predictiva.pdf

Microbiologa Predictiva y su

relacin a la Evaluacin de Riesgo

2

Contenido

Concepto y principios de la microbiologa predictiva

Concepto de modelo microbiolgico predictivo

Clasificacin de modelos predictivos

Empricos vs mecansticos

Determinsticos vs estocsticos

Cinticos vs probabilsticos

Primarios, secundarios y terciarios

Modelos de crecimiento microbiano

Modelos primarios

Modelos secundarios

Modelos de inactivacin microbiana

Modelos primarios

Modelos secundarios

Modelos terciarios

Seleccin de un modelo

Aplicaciones de la microbiologa predictiva

Evaluacin de riesgo y microbiologa predictiva

3

Microbiologa Predictiva

Sub-disciplina de la Microbiologa de Alimentos cuyo objetivo es predecir el comportamiento microbiano en alimentos especficos bajo condiciones definidas.

Su evolucin se remonta a solo 35 aos, y ha sido aceptada por la industria y autoridades reguladoras como un enfoque preferible para predecir inocuidad y tiempo de vida de los alimentos.

Se basa en la premisa que las respuestas de las poblaciones microbianas a las condiciones ambientales pueden reproducirse.

Convierte DATOS en CONOCIMIENTO

4

Principios de la Microbiologa Predictiva

Los organismos incrementan (crecimiento) en nmero por divisin

Bacterias atenuandas son muertas

Todos los organismos de una poblacin tienen las mismas caractersticas

Los organismos se multiplican (y mueren) independientemente

El crecimiento ocurre en condiciones adecuadas (T, pH, aW) y despues de un tiempo lag

El crecimiento reduce debido a la disminucin de nutrientes, produccin de toxinas

Modelos de crecimiento basados en asunciones de distribucin probabilstica

5

Tringulo de Seguridad Alimentaria

HACCP (25-30 aos)

Microbiologa predictiva

(30-35 aos)

Evaluacin de riesgo

(10 aos)

Estrategias para la

gestin del riesgo

Planes HACCP

usados para

posibilitar esas

estrategias

Sostienen la

necesidad de

seguridad alimentaria

6

Modelo microbiolgico predictivo

Expresin matemtica que describe el

crecimiento, supervivencia, inactivacin o

proceso bioqumico de un microorganismo

presente en un alimento.

7

Fases del crecimiento microbiano

Fase Lag

Fase de crecimiento

Fase estacionaria

Fase de muerte

8

Clasificacin de modelos predictivos Perspectiva Causal

Empirical Mechanistic

Efectos de variacin y oportunidad

Deterministic Stochastic

Microbiologa clsica o cuntica

Kinetics Probabilistic

Dependencias entre las variables

Primary Secondary Tertiary

Modelos cinticos vs

probabilsticos

10

Modelos cinticos vs

probabilsticos

Modelos cinticos El tiempo que lleva cierto crecimiento microbiano, en funcin de la T, pH, Aw, Eh, composicin gaseosa, HR, etc.

Condiciones ambientales favorables que permiten que la poblacion microbiana crezca, y puede ser predicha con poca variabilidad

Modelos de probabilidad A medida que las condiciones ambientales se hacen ms desfavorables, las poblaciones microbianas despliegan mayor variabilidad e impredecibilidad (puede q crezca, puede q no)

Limites de crecimiento por tanto son difusos e inciertos

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40

days

log

10 c

fu/c

m2

A

0.913

0.933

0.953

0.973

0.993

5.5 5.7 5.9 6.1 6.3 6.5

pH

aw

Modelos empricos vs

mecansticos

12

Modelos empricos vs

mecansticos

Modelos empricos

Describe las observaciones con una funcin matemtica

pero sin un fundamento terico

Funciones polinmicas (80s-), redes neurales artificiales

(2000-), PCA

Modelos mecansticos

Intentan relacionar las respuestas observadas a principios

fisicoquimicos y/o biolgicos.

Son preferibles a los modelos empricos porque pueden ser

extrapolados

13

Ejemplo de modelo emprico

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20

Time

Lo

g1

0(

org

an

ism

s m

ean

de

ns

ity)

B =0.5 M =5

B =1 M =5

B =0.5 M =10

B =1 M =10

A,D are fixed at 6.9, 9

Modelo Gompertz

modificado

Describe la curva de

crecimiento pero los

parmetros no tienen

interpretacin biolgica

)( MtBExpDExpAExpNt

14

Ejemplo de modelo mecanstico

Modelo de parmetros cardinales

Velocidad de crecimiento=f(variables ambientales)

Parmetros con interpretacin biolgica: opt, pHmin, pHmax,

pHopt.

),,,()()()()( 112max LacawpHTLacSRawSRpHCMTCMopt

maxmin

minmaxmin

maxmin

min

,

,0

)(pHpHpH

pHpHpHpHpHpHpHpH

pHpHpHpH

pHpH

pHCM

optoptopt

15

Modelos determinsticos vs

estocsticos

Modelos determinsticos

Predice a nivel poblacional (en forma promediada).

La tamao de la poblacin microbiana se describe

mediante un conjunto nico (determinstico) de parmetros

Ej: max=0.25 log cfu/hr

Modelos estocsticos

Considera la variabilidad biolgica, y/o variabilidad entre

celulas individuales.

Por tanto, los parmetros del modelo son representados por

distribuciones estadsticas.

Ej: max ~ Normal (0.25,0.08) log cfu/hr

16

Ejemplo de modelo determinstico

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20

Time

Lo

g1

0(

org

an

ism

s m

ean

de

ns

ity)

B =0.5 M =5

B =1 M =5

B =0.5 M =10

B =1 M =10

A,D are fixed at 6.9, 9

Modelo Gompertz

modificado es

tambien un

modelo

determinstico!

Para cada t solo

existe un N lo

cual representa un

crecimiento

promedio de la

poblacion

)( MtBExpDExpAExpNt

17

Ejemplo de modelo estocstico

Modelo de crecimiento de Yule

Se asume que las bacterias crecen independientemente por division con un proceso de Poisson

Para cada t existe un rango de valores de Nt lo cual representa la variabilidad entre celulas

00 , nenNegBinn tt

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 5 10 15

Time (hr)

Nt (c

ells/g

)

18





00 , nenNegBinn tt

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 5 10 15

Time (hr)

Nt (c

ells/g

)

19





00 , nenNegBinn tt

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 5 10 15

Time (hr)

Nt (c

ells/g

)

Modelos primarios, secundarios

y terciarios

21

Modelos primarios

Describen crecimiento, inactivacin o supervivencia microbiana usando densidad celular (log cells/g) versus tiempo bajo condiciones ambientales constantes

Definido (por lo menos) por dos parametros:

Fase lag () y velocidad max de crecimiento (k, max)

Temp constante

22

Modelos secundarios

Describen uno o ms parametros del modelo primario (fase lag () y velocidad max de crecimiento (max)) en funcin de las condiciones ambientales (i.e., Temperatura, pH, Aw, Eh, etc.)

23

Modelos terciarios

Combina un modelo primario N=f(t) y un secundario ,max=f(T, pH, Aw) para predecir la poblacin microbiana bajo condiciones dinmicas.

Pseudomonas in

poultry

Modelos de crecimiento

microbiano

Modelos primarios

Modelos secundarios

25

Modelos primarios (Condiciones ambientales constantes)

Exponencial

Logistico

Gompertz, Modificado-Gompertz

Baranyi y Roberts

26

Modelo exponencial y logstico

Crecimiento exponencial, cintica de primer orden (log-lineal)

Velocidad de crecimiento N

N = Nmero o densidad de microorganismos

k = Tasa de crecimiento

Tiempo - lag determinados a partir de datos

Sin limitaciones medioambientales

kNt

N

N

NkN

t

N1

En realidad, el crecimiento se deteriora:

Dismninucin de nutrientes, produccin de toxinas production

Inhibicion en la fase estationaria

ktNNNNN

Nt

exp00

0

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

5 105 205 305 405 505 605

hours

log

cfu

/gd

w

kteNN 0

Listeria durante la maduracin de queso de

leche cruda

N

t

27

Modelos de Gompertz y Gompertz modificado

Modelo de Gompertz (curva sigmoidal)

La densidad bacterial usualmentemodela en log

Nuevos modelos fueron creados usando modelos funcionales similares a la forma del modelo Gompertz :

Nt = densidad al tiempo t

D = log(N) log(N-)

M = tiempo al cual la tasa de crecimiento absoluto es mximo

B se relaciona con pendiente st: BD/e = pendiente de la tangente en el tiempo M

A es un parmetro de localizacin, sin equivalente en la realidad, = log(N-), not log(N0)

Gompertz modificado es la ms exitosa funcin sigmoidal

A diferencia de Gompertz, sin embargo, no tiene base terica, convirtindose en ejercicio de ajuste sin ningn aprendizaje (modelo emprico)

)( MtBExpDExpAExpNt

)(expexp MtBNNt

29

Modelo de Baranyi & Roberts

Modelo mecanstico que considera la historia de crecimiento celular a travs

de un parmetro.

Las ecuaciones diferenciales permiten el modelado en ambientes dinmicos

resultantes de perfiles de temp no isotrmicos

Puede usarse para crecimiento e inactivacin

Definido por 4 parmetros: N0, q0, Nmax and m

Funcin de ajuste A(t) predice la duracin de la fase lag

La popularidad de este modelo ha sido facilitada por la disponibilidad de 2

softwares: DMFit y MicroFit.

0max

0lnlnexp

1exp1ln

1

NNm

tAm

mtALnNtLnN mm

0

0

1

expln

1

q

qvt

vttA

30

Modelo de Baranyi & Roberts

Crecimiento de Listeria monocytogenes a 5C

31

Modelos secundarios (Parmetros en funcin de las condiciones

ambientales)

Tipo Blehrdek o raz cuadrada

Concepto Gamma

Parmetros Cardinales

32

Modelos de tipo Belehradek (k = a(T-T0)d)

En su forma simple, son modelos que describen la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura

Extendida para cubrir el rango completo biocintico de temperatura (Ratkowsky et al., 1983):

Los parmetros se usan para clasificar microorganismos como psicrfilos, mesfilos o termfilos.

Belehradek es el mejor modelo de temperatura pero existen otros:

Modelo de Arrhenius a partir de las reacciones qumicas; polinomial (puramente emprico)

)( minTTbk

maxmin exp1)( TTcTTbk

33

Modelos de tipo Belehradek (k = a(T-T0)d)

)( minTTbk

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

10 15 20 25 30 35 40 45 50

Temperature (C)

Raw bratwurst

Broth pH=5.9, Aw=0.97

(lo

g C

FU

/h)

R2=0.77

Velocidad de crecimiento de Salmonella spp. en salchichas crudas de cerdo

34

Concepto Gamma

Los factores que afectan la velocidad de

crecimiento microbiano actan

independientemente

El efecto de los factores ambientales es

multiplicativo

....cos otrosfnicidosorgafpHfAwfeTemperaturf

35

Concepto Gamma

Staphylococcus xylosus y

Halobacterium spp.,

respectivamente en

pescado seco salado

Yersinia enterocolitica

Pediococci spp. en

productos de carne

fermentada

Lactobacillus curvatus

Lactobacillus

Lactobacillus

minmin ww AATTbk

minmin pHpHTTbk

minminmin pHpHAATTbk ww

2minmaxminmin TTpHpHpHpHAAbk ww

apKpHpHpHww ULACAATTbk 101][1101 minminmin min cDLAC pHpKa 101][1 min

pHpHwwww AAdAATTcTTbk min101exp1exp1 maxminmaxmin eDLACULAC pHpKpKpHpHpH aa 101][1101][1101 minminmax

36

Modelo de los parmetros cardinales

Basado en el Concepto Gamma

Los CMPs consisten de un trmino para cada factor ambiental. Cada

trmino expresado como la velocidad de crecimiento relativa a aqulla

cuando el factor es ptimo (i.e., cada trmino tiene un valor entre 0 y 1). A

condiciones ptimas de crecimiento, todos los trminos tienen un valor de 1

y as max = opt.

n

i

iwoptm cpHCMACMTCM1

122

max

maxmin

minmaxmin

1

min

minmax

min

,0

,1

,0

XX

XXXnXXXnXXXXXXXX

XXXX

XX

CM

optoptoptopt

n

opt

n

n

37

Modelo de los parmetros cardinales

Tambin la duracin de la fase lag puede expresarse en

funcin de las condiciones ambientales con CPM.

tiene un valor mnimo (min) cuando la velocidad de

crecimiento es ptima (opt)

Modelos de inactivacin

microbiana

Modelos primarios

Modelos secundarios

39

Modelos primarios (Condiciones ambientales constantes)

Exponential

Gompertz

Modelo Geraaerds

Weibull

40

Exponential and Gompertz model

Modelo Exponencial (log-

lineal): kt

t eNN 0

))(())((0 bExpaExpctbExpaExpExpNNt

Modelo de Gompertz:

Empirical

a,b, c are just fit parameters

Used for Listeria during heat processes

The effect of combined high pressure and mild heat on the inactivation of

Escherichia coli and Staphylococcus aureus in milk and poultry

Inhibition of Enterobacteriaceae and clostridia during sausage curing

Gompertz model is inappropriate to describe the survival curves without a

tail phase.

N(t)=100Exp(-0.1t)

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50

41

Geraaerds model

Geeraerd et al. (2000) extended log-linear model to account for shoulder and tail

with several transition functions or adjustment factors

Survival of Salmonella enterica and Listeria monocytogenes (Greenacre et al.,

2003); mild temperature inactivation of Escherichia coli K12 (Valdramidis et al.,

2005); Listeria monocytogenes on the surface of smear ripened cheese; etc..

resres

Y

dd

d

d

YY

tkSk

SktkY 10

exp1exp1

expexp.1010log 0

42

Weibull model

Basado en la asuncin que los eventos letales son probabilsticos en lugar de

determinsticos

Weibull Distribucin de tiempos de inactivacin (: shape parameter; : scale

parameter)

1 indica que las clulas restantes incrementan su deterioro (curvas convexas)

Ventajas: simplicidad y la capacidad de modelar curvas de supervivencia lineal, as

como aquellos que contienen regiones de hombro y/o cola

Clostridium botulinum, esporas de Bacillus stearothermophilus, Salmonella Typhimurium,

Listeria monocytogenes, Bacillus cereus spores, esporas de Bacillus pumilus, Yersinia

enterocolitica. Listeria monocytogenes mediante la aplicacin simultnea de alta presin y el

calor suave; inactivacin de alta presin de una variedad de Vibrio spp. En ostras; inactivacin en

alta de presin de Yersinia enterocolitica en leche entera UHT, etc.

ttSLog

)10log(

1

43

Modelos secundarios (Parmetros en funcin de las

condiciones ambientales)

Arrhenius

Arrenhius Modificado

44

Modelo de Arrhenius

Derivada empricamente de consideraciones termodinmicas, para describir la

relacin entre velocidad de inactivacin/crecimiento en funcin de la

temperatura.

Usado extensivamente para calcular tiempo de vida en anaquel

Desventaja: Se puede ajustar solo sobre un rango limitado de temperaturas

RT

EA

ekk

0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0.00288 0.00292 0.00296 0.00300 0.00304 0.00308

1/Temperature (K-1

)

Lo

g D

(m

in)

R2=0.983

45

Modelos modificados de Arrhenius

Todas las modificaciones son empricas.

Davey (1989): Efecto de Temp y Aw

Davey (1990): Efecto de Temp y pH (Yersinia enterocolitica)

Davey & Daughtry (1995): Efecto de Temp, Aw y sal (Salmonella spp)

Koutsoumanis (2000): Efecto de Temp y CO2 (Pseudomonas en pescado

empacado en atmsfera modificada)

46

Modelos terciarios (Modelo primario + secundario)

Modelo terciario

Temp, Aw cambia en el tiempo. Ex: T(t)

Encontrar (T(t)) en intervalos infinitesimales

Encontrar N(t)

h0 Nmax N0 b Tmin

5.6426 18.4207 4.24467 0.017 -5.0129

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0.00 50.00 100.00 150.00 200.00

Time (h)

Y (

Ln

CF

U/g

)

Te

mp

era

ture

(C

)

Salmonella typhimurium en salchicha de cerdo

48

Modelo terciario

h0 Nmax N0 b Tmin

5.6426 18.4207 4.24467 0.017 -5.0129

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0.00 50.00 100.00 150.00 200.00

Time (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16Y

(L

n C

FU

/g)

Te

mp

era

ture

(C

)

Salmonella typhimurium en salchicha de cerdo

49

Modelo terciario

Los modelos terciarios hacen de la microbiologa predictiva una herramienta poderosa para todas las areas de la industria alimentaria e investigacin.

Tienen la capacidad de predecir realsticamente el crecimiento y la sobrevivencia de los microorganismos bajo condiciones ambientales dinmicas

Por eso se han incorporado en simulaciones de evaluacin cuantitativa de riesgo.

Pero, los modelos terciarios no son tan fciles de simular

50

Modelos terciarios enlatados y base de

datos disponibles

Name Brief description Source

Pathogen Modeling

Program

(PMP)

Package of models that can be used to predict the growth

and inactivation of food-borne bacteria, primarily

pathogens, under various environmental conditions.

USDA-Agricultural Research

Centre and Eastern

Regional Research

Centre (USA)

http://portal.arserrc.gov/PMIP

Home.aspx

MicroFit Software that estimates growth rate, doubling time and

lag time from challenge test data. Fits Baranyi

models

Institute of Food Research

(UK)

http://www.ifr.ac.uk/microfit/

DMFit Excel add-in that fits log counts versus time data and

extract parameters such as growth/death rate and

lag time/shoulders. Fits Baranyi models


(UK)

http://www.ifr.ac.uk/safety/D

MFit/

Growth Predictor

and Perfringens

Predictor

Set of models for predicting growth as a function of

temperature, pH, Aw, and in some cases,

concentration of carbon dioxide or acid acetic. A

web-based version of this programme is included in

the ComBase Modelling Toolbox.


(UK)

http://www.ifr.ac.uk/safety/gr

owthpredictor/

51

Modelos terciarios enlatados y base de

datos disponibles

Name Brief description Source

ComBase Database consists of thousands of microbial

growth and survival curves that have been

collated in research establishments and from

publications

Food Standards Agency

and Institute of Food

Research (UK),

http://www.combase.cc

Seafood Spoilage

and Safety

Predictor

(SSSP)

Software package that predicts shelf-life and

growth of bacteria in different fresh and

lightly preserved seafood

National Institute of

Aquatic Resources,

Technical University

of Denmark

http://sssp.dtuaqua.dk/

GInaFit A Microsoft Excel add-in freeware created to

assist with the fitting of data to inactivation

models. Fits nine types of inactivation

models

Department of Chemical

Engineering,

Katholieke

Universiteit Leuven

http://cit.kuleuven.be/biot

ec/

52

Consideraciones para la seleccin de

modelos

Estimacin de parmetros: Mtodo requerido para estimar parmetros. Si el modelo es no-estocsticos, es usual transformar y aplicar regresin, pero esto supone errores normalmente distribuidos.

Asuncin estocstica: Para una pequea cantidad bacteriana puede ser muy importante. Los modelos son generalmente no-estocsticos, pero existen.

Significado de los parmetros: Son preferibles los modelos donde los parmetros tienen una interpretacin fsica.

Parsimonia: No utilizar modelos complejos cuando funciona uno simple.

Interpolacin: Es significativa?

53

Consideraciones para la seleccin de

modelos

Necesisdades de recursos

Co

mple

jida

d

Determinstico, mecanstico

Determinstico, emprico

Datos especficos, modelos sofisticados

Nmeros genricos, modelo(s) simple

estocstico, mecanstico

54

Aplicaciones de la Microbiologa Predictiva

Los modelos microbiolgicos proveen informacin

de forma rpida.

HACCP MP asiste en el anlisis preliminar de peligros, identificacin de PCC y

acciones correctivas.

MP ayuda a entender las interacciones entre variables como Temp y

Aw, lo cual es importante para la aplicacin de HACCP en el

procesamiento de alimentos.

La combinacin de MP y HACCP ofrece un enfoque sistemtico a la

resolucin de problemas, con clculos cuantitativos cuando sea

necesario.

55


Objetivo Inocuidad de los alimentos (FSO)

Criterios de rendimiento (PC)

Criterio de proceso

Para alcanzar un nivel de

100g en el punto de

consumo

Reduccin 6D

Calor

2 min @ 70C

Z=7.5C

UHP

7.5 min @ 500 MPa

Radiacin Ionizante

2.6 kGy @ 0C

4.6 kGy @ 5C

HACCP

56


Estudios de vida en anaquel de alimentos

MP predice los efectos de almacenamiento variable y condiciones de abuso que un producto pueda experimentar.

Debe considerar todas las etapas de produccin de un alimento incluyendo la carga microbiana en las materias primas.

Diseo de experimentos

Investigacin y desarrollo de productos

Evaluar las consecuencias de cambios en la formulacin o proceso.

Diseo inocuo/estable de un nuevo producto

57


Crecimiento y no-crecimiento dominante para Listeria

monocytogenes usando modelos probabilsticos

Concepto barrera

Los alimentos pueden permanecer estable y seguro incluso sin refrigeracin y son aceptables organolpticamente y nutricionalmente debido al suave proceso funcional

barreras tradicionales: calor suave, ambiente cido, sal y modificado

Tecnologas de nueva generacin: irradiacin, procesamiento de alta presin

58


Evaluacin cuantitativa de riesgo microbiolgico

(QMRA)

MP permite entender la cintica microbiana a lo largo de la

cadena

En la evaluacin de la exposicin, MP permite estimar los

cambios en concentracin microbiana, y permite

determinar la exposicin del consumidor a un patgeno

particular:

Ej: 2.5 UFC/porcin de chorizo cocido

Los modelos predictivos estn integrados en los modelos

de QMRA

59

QMRA y Microbiologa Predictiva

Para estimar el nivel de un peligro, se construye un modelo de exposicin de toda la cadena de alimentos hasta el consumo.

El nivel de exposicin humana depende de varios factores como: la contaminacin inicial de la materia prima, caractersticas del proceso de alimentos, supervivencia de los MO, multiplicacin o muerte durante almacenamiento, condiciones de almacenamiento y preparacin antes del consumo.

Chacra Beneficio Procesamiento Venta por

menor Inicio

60

QMRA y Microbiologa Predictiva

61

Comunicacin de riesgos

Evaluacin de riesgo

Gestin de riesgo

Aportes cientficos Decisin

poltica y valores

Interaccin

62

Comunicacin de riesgos

Evaluacin de riesgo

Gestin de Riesgo

Aportes cientficos Decisin

poltica y valores

Interaccin

Epidemiologia

Microbiologa Predictiva

Estadstica

Ciencia de los

alimentos

Toxicologa

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