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Manual de microbiología UPIBI_IPN

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL

INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

ACADEMIA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

ELABORADO POR:

Martha Morales Martínez

Refugia Pérez Sánchez

Miriam Juárez Juárez

María de Lourdes Moreno Rivera

Segunda edición

Refugia Pérez Sánchez

ENERO 2012


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PRÓLOGO

El presente manual de laboratorio de Microbiología tiene la finalidad de dar apoyo a la asignatura con el mismo nombre, en este manual tenemos las prácticas que se realizarán a lo largo del curso, la cual contiene los fundamentos mínimos, los materiales, el procedimiento y la bibliografía para ampliar los fundamentos.

Se presentan algunas técnicas básicas de microbiología, algunas de ellas basadas en la normatividad de la Secretaria de Salud para que el alumno poco a poco se vaya adentrando a la legislación sanitaria mexicana.

Uno de los principales objetivos es poner en práctica el método científico para despertar el interés y seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.

Como una aportación a las estructuras didácticas de este manual, colocamos una serie de imágenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.

NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________________________________

PROFESOR DE TEORÍA: ________________________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _______________________________________________

________________________________________________

________________________________________________

GRUPO: _____________________

PERIODO LECTIVO: ____________________________________________________________

CARRERA: ___________________________________________________________________

ESCUELA: ___________________________________________________________________


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ÍNDICE

Prologo__________________________________________________________________________ 2

Índice ____________________________________________________________________________3

Instrucciones generales _____________________________________________________________ 4

Practica No. 1 Microscopia __________________________________________________________ 9

Practica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco ____________________________________________ 16

Practica No. 3 Métodos de esterilización y reducción de la carga microbiana ___________________ 23

Practica No. 4 Nutrición y cultivo de microorganismos aeróbicos ____________________________ 31

Practica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aeróbicos________________________ 46

Practica No. 6 Conservación de microorganismos_________________________________________ 52

Practica No. 7 Identificación de microorganismos (bacterias)________________________________ 63

Practica No. 7 Identificación de microorganismos (mohos y levaduras)________________________ 83

Practica No. 8 Crecimiento microbiano _________________________________________________ 95

Practica No. 9 efecto de los factores fisicoquímicos sobre el crecimiento microbiano _____________104

Practica No. 10 Métodos rápidos para la identificación de microorganismos____________________113

Agares __________________________________________________________________________122

Caldos __________________________________________________________________________125

Medios semisólidos________________________________________________________________ 128

Soluciones y reactivos _____________________________________________________________ 130

Colorantes, decolorantes y mordente_________________________________________________ 133

Nefelómetro de McFarland________________________________________________________ 135


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INSTRUCCIONES GENERALES

I.- EVALUACIÓN

1.- El laboratorio se evalúa como sigue:

a) Trabajo laboratorio 3.4

b) Diagrama de la practica 0.5

c) Examen 1.0

d) Discusión 2.5

e) Reporte de la práctica 2.5

Nota. Solo se promedia el laboratorio si se aprueba la teoría.

2.- El reporte se evalúa:

a) Objetivo y bibliografía 0.5

b) Resultados y cuestionario 1.0

c) Discusión y análisis 0.5

d) Conclusiones 0.5

3.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas,

aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de seis.

4.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la

práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte

correspondiente.

5.- La calificación de laboratorio se obtendrá por cada departamental

6.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.

7.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos miembros del equipo lo hayan elaborado. Si no es así el alumno que no lo presento tendrá cero y para acreditar el laboratorio deberá entregar el 80 % de prácticas

8.- Cuando a un equipo le toque preparar los materiales para utilizarse en la práctica o bien la esterilización de material limpio y /o sucio y no lo realice tendrá cero en la práctica.

9.- Cada grupo de 6 equipos deberá traer un candado para su gaveta y cada equipo tendrá una llave, donde podrá guardar solo material de Microbiología.

II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

10.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:

Una bata limpia y con botones

Manual de laboratorio

Dos asas bacteriológicas

Una fotografía tamaño infantil

Colores

Un marcador indeleble de punto mediano

11.- El cuaderno de reporte de prácticas debe ser de tamaño profesional forrado de color blanco

(2LM1), Verde claro (2LM2) Verde obscuro y Morado el grupo (2LV1), en la portada se colocará una

etiqueta con el título de la asignatura, el nombre de los tres alumnos que conforman el equipo,


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colocando en primer término el del dueño del cuaderno, de manera remarcada o con letra más grande

y en la parte superior derecha se pondrá una etiqueta de 5 cm con el número de equipo.

Por equipo deberá traer:

Un rollo de Masking tape

Papel periódico 5 cm de altura

Una tijera de punta recta

Una pinza de punta roma

Tres botes de lámina

Una llave del candado

Una esponja

Una jeringa de 5 ml

Una caja de portaobjetos

Fibra suave para trastes

Una cuchara sopera y una cafetera de acero inoxidable

Una regla graduada

Un metro de franela

Un jabón para las manos

Dos frascos de boca ancha de vidrio

Dos frascos de vidrio de aprox. 13x4cm

Una caja de ligas del número 18

Encendedor

250 ml de alcohol

Una brocha de cerdas suaves

Rollo de papel aluminio de hoja gruesa

Por sección

Por sección se deberá traer un candado

Dos frascos de 1/2 L de Jabón líquido para trastes

1 kg de algodón

Paquete de papel higiénico de 4 rollos suave

Una canastilla

Una caja de cubreobjetos

Un barniz de uñas transparentes

Dos frascos de jabón líquido para manos

1 kg de bolsas de plástico de polipapel con capacidad de 1kg

Por grupo

Bolsa de cofias

III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

12.- Se impartirán dos sesiones por semana de 3.0 horas cada una.

13.- Cada sesión principiará y terminará a la hora indicada.

14.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica.

15.- Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos.

16.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento del profesor, se considerará que no asistió a la práctica.

17.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.

18.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el alumno adquiera habilidades y destrezas. La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada


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con una tolerancia de 10 minutos y con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar ya no se le permitirá la entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta.

19.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión, excepto la práctica que este cercana al periodo de evaluación y no se permitirá que el reporte se entregue escrito todo o alguna fracción con lápiz, se sugiere el uso solo de colores negro, azul, rojo y en caso de esquemas lápices de colores.

20.- El alumno utilizará el Manual de Prácticas de Laboratorio, obligatoriamente en cada sesión,

apegándose a la metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor y corregirá lo

que se vaya cambiando.

21.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por el equipo

responsable, para ello tiene como mínimos una semana, de lo contrario el vale se irá al

expediente del alumno.

22.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo

práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.

23.- Después de terminada la práctica, el material debe ser entregado limpio por el equipo

responsable a la persona encargada del almacén.

24.- Evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.

25.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un

lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados.

26.- La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará

condicionada a la autorización del profesor responsable de la práctica, y en caso de retirar su

material de la incubadora deberá traer bata, además traerá su material que va a necesitar.

27.- Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejará enfriar y posteriormente se

depositará en una bolsa de plástico para su desecho.

28.- Equipo que no traiga el material biológico solicitado en la práctica no se le permitirá la entrada.

IV BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

1.- Las reglas de seguridad son para TODAS las personas que estén en el laboratorio.

2.- Uso de bata de laboratorio. Las batas protegen de contaminaciones químicas o biológicas, por ello se recomienda su cambio al salir de laboratorio.

3.- Lavarse las manos al inicio y al final cada práctica: Recordar que se manejan microorganismos

patógenos.

4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Cualquier material que no se utilice en la realización de la práctica debe estar apartada del área de trabajo. Antes de comenzar desinfectar la superficie de trabajo.

5.- Prohibido comer, beber, fumar y mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz ojos u oídos.

6.- No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores o pipetas automáticas.

7.- Evitar generar aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente inhalados. Todas las operaciones bruscas como el manejo rápido de las asas pueden generar microparticulas que pueden ser inhaladas por el analista. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la flama del mechero en un área de 15 cm o en una campana de seguridad.


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8.- Evitar desplazarse en el laboratorio.

9.- Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones en los cultivos.

10.- El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos. Se debe realizar con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material de una sola vez y siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan.

11.- Bajo ningún concepto se deben sacar muestras contaminadas del laboratorio.

12.- El material contaminado debe esterilizarse antes de procesarlos como residuos. El material de vidrio debe esterilizarse para luego lavarse, secarse y volverse a emplear.

13.- El material de vidrio roto depositarlo en los contenedores específicos y designados en el laboratorio

14.- El botiquín de primeros auxilios está en el interlaboratorio

15.- La mesa de trabajo se debe limpiar con una esponja que contenga benzal como desinfectante,

este proceso se hace antes y después de terminar la sesión de laboratorio.

16.- En caso de accidente. Avisar inmediatamente al profesor, en caso de derrame del cultivo se deberá cubrir con un desinfectante y dejar actuar por cinco minutos, para luego limpiar con la esponja.

17.- Tomar las precauciones necesarias en el suministro de gas, evitar la presencia de sustancias inflamables, revisar periódicamente las instalaciones y la flama del mechero beberá estar en azul, para ello el mechero cuenta con una entrada de la cantidad de aire con el que se obtiene una mezcla de aire-gas, de forma que la llama tenga oxigeno suficiente.

18.- Incendio de disolventes. En el caso de que se produzca un accidente al incendiarse un solvente, nunca soplar, se deberá emplear una franela mojada para cubrir el recipiente. Si el fuego se extiende, usar el extintor dirigiéndolo a la base de las llamas.

19.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada de personas ajenas al grupo que

visiten a los alumnos y a profesores.

20.- Los alumnos con el pelo largo se lo recogerán, no se permite el uso de flecos.

21.- Queda prohibido el uso de celulares y aparatos electrónicos durante el desarrollo de la práctica.

22.- Al entrar al laboratorio evitar, traer chamarra, bufanda, guantes y la bata deberá estar

abrochada.


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Actividades: I.- Lectura de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)

A. Norma oficial mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

B. Norma oficial mexicana NOM-026-STPS-2008, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías

a. Desinfección del área de trabajo

b. Código de colores (instalaciones de gas)

c. Uso del contenedor para punzocortantes

d. Botiquín

e. Extinguidores

C. Norma oficial mexicana NOM-120-SSA1-1994, bienes y servicios. Prácticas de higiene y sanidad para el proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas.

II.- Conocimiento del material básico de laboratorio

a. Material de cristalería

b. Uso del mechero

III.- Equipo de laboratorio

a. Cuarto de incubación

b. Cuarto de refrigeración

c. Incubadoras

d. Balanza de dos platillos, granataria, digital y analítica

e. Campana de flujo laminar

f. Campana de extracción

IV.- Material para la gaveta

a. Frasco con benzal

b. Frasco con alcohol

c. Frasco con torundas

d. Frasco con benzal para pipetas

e. Varilla acodada y base de caja de Petri

f. Frasco con benzal para material de desecho


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PRÁCTICA No. 1 MICROSCOPÍA

UNIDAD: II Microscopia y tinciones 1. OBJETIVOS: 1.1 Objetivo general

1.1.1. El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno manejará correctamente el microscopio compuesto.

1.2.2 El alumno realizará correctamente la técnica de iluminación de Köhler

2.- INTRODUCCIÓN

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.

Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:

Microscopio óptico

Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.

El microscopio compuesto está formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico y 3. Sistema mecánico.

El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparación y está formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)

El sistema óptico está formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y está formado por los objetivos, tubo y el ocular.

El sistema mecánico está formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y está formado por la base, estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y porta-revolver.


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Función básica de cada parte del microscopio:

a.- Sistema mecánico

Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato

Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio

Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.

Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.

Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.

Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.

Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.

Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento.

Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco.

b.- Sistema de iluminación

Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-15 W ó 12 V, 50-100 W

Diafragma de campo. Está situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparación.

Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.

c. Sistema óptico

Oculares

El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.


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Tubo

El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, además está adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una cámara de televisión. El tubo generalmente está diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.

Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numérica y está diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuáles son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:

1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1)

2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos

3.- El lado superior derecho la apertura numérica.

4.- El lado inferior la distancia mecánica

5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos

6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 2)

En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que:

Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,

10= No requiere cubreobjetos ó

0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.

Anillo superior

Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:

Aumentos totales:

El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de

Tabla 1. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores grabados Aumentos Color anillo superior

1.0X Negro

2.5 X Pardo 4.0 X Rojo

6.3 X Anaranjado 10 X Amarillo

16 X Verde claro 25 X Verde oscuro

40 X Azul claro 63 X Azul oscuro

100X Blanco

Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo

Carácter

Sustancia

Índice de refracción

Color del anillo

Oil Aceite 1,515 Negro W Agua 1,333 Blanco

Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado

Metileno

Yoduro de metileno

1,740 Amarillo


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aumentos que tiene el objetivo con el que se está observando.

Distancia mecánica:

Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm.

Poder de resolución:

El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico de 6 Ángstrom.

Apertura numérica:

Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo.

Microscopio de contraste de fase

Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.

Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio también se realiza la técnica de iluminación de Köhler.

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR EQUIPO

Microscopio compuesto

Papel seda

Preparaciones fijas de bacterias

3.2 REACTIVOS

Aceite de inmersión Atomizador con benzal

3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

Colores


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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

a) Acudir con el profesor al cuarto donde están los microscopios.

b) Transportar el microscopio de forma vertical tomándolo del brazo con una mano y en la otra la base.

c) Colocar el microscopio sobre la mesa de trabajo, y observar si presenta alguna irregularidad en caso de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.)

d) Con una perilla retirar el polvo de la parte mecánica y de la parte óptica.

e) Limpiar la parte mecánica del microscopio con una brocha de cerdas suaves.

f) Limpiar la parte óptica del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata.

g) Se dará la clasificación del microscopio según el sistema mecánico, óptico y el de iluminación.

h) Conectar el microscopio a la toma de corriente

i) Bajo las instrucciones del profesor realizar la técnica de Köhler.

4.1 Cuidado y limpieza del microscopio

Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:

a) Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.

b) Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.

c) Las partes mecánicas se deben lubricar y se limpian por fuera con una brocha de cerdas suaves.

Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio.

d) Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos

e) Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica.

f) Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o

remover residuos de aceite de inmersión.

4.2 TÉCNICA DE ILUMINACIÓN DE KÖHLER

A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler

propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación se forma de dos diafragmas: un

diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma

llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.

Pasos a seguir para la iluminación de Köhler.

1.- Luz amarilla (bajo voltaje)

2.- Ajustar la distancia interpupilar

3.- Ajustar las dioptrías

4.- Abrir el diafragma de campo e iris


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Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio

5- Subir completamente el condensador con la

lente frontal introducida

6.- Enfocar la preparación con el objetivo 4X

o 10X y utilizando los tornillos macro y

micrométrico

7.- Observar y cerrar el diafragma dispuesto en

el pie del microscopio

8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener

máxima nitidez de la imagen del diafragma

9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en

el campo visual, recurriendo a los dos tornillos

el condensador

10.- Abrir el diafragma de campo luminoso

casi hasta el borde del campo visual,

centrando con exactitud y abrirlo hasta que

desaparezcas detrás del borde del campo

visual.

11.- Regular el contraste de la imagen con

ayuda del diafragma del condensador.

12.- Insertar el filtro azul, regular la intensidad

de la luz con el control del voltaje.

13.- A cada cambio de objetivo: enfocar con el

micrométrico y contrastar con el diafragma del

condensador.

14.- Al utilizar objetivos panorámicos de bajo

aumento rebatir la lente frontal del

condensador sin alterar su altura.

4.3 OBSERVACIONES DE UNA PREPARACIÓN FIJA.

a) Tomar una preparación y enfocarla a 10 y 40 X.

b) Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X

c) Observar la preparación que contiene una bastante muestra y realizar el esquema biológico


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d) Ahora mover la preparación en la periferia donde hay poca cantidad de muestra y realizar un esquema, en donde se anote el aumento real

e) Ahora colocar el filtro azul y observar nuevamente

f) Compara y analiza lo realizado y concluye lo más conveniente.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Esquematiza la preparación observada a 40 y 100X, anota el nombre de la muestra (etiqueta): _____________________

40x 100x

5.1 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla

Tipo de microscopio Poder de resolución Aplicaciones

Compuesto

Contraste de fase

Electrónico

5.2 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:

Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece (mecánico, óptico de iluminación)

Condensador

Diafragma

Objetivo

Filtro azul

Lámpara

Ocular

Platina

Revolver

Tornillo macrométrico

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir las ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler.

6.2 Discutir las ventajas y desventajas de un microscopio óptico, así como la cantidad de muestra que presente una preparación.

7.- CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada.

8.- BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Barrera E. Héctor El Microscopio Óptico 1ª edición. 1997. Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V.

8.2. Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté Mexicana, S.A. de C.V. 1991.

8.3 Locquin Marcel, Manual de Microscopía I 1° edición, 1985. Ed. Labor S.A.

8.4 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes–Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición. 1991. Editado por la Asociación de Químicos del INN.


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PRÀCTICA No. 2

PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO

UNIDAD II: Microscopia y tinciones.

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo general

1.1.1 El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio óptico

I.2 Objetivo específicos

Al término de la sesión el alumno:

1.2.1 Realizará una preparación en fresco de una muestra líquida de agua.

1.2.2 Realizará una preparación en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol.

1.2.3 Realizará un frotis para una preparación fija.

1.2.4 El alumno realizará preparaciones fijas y tinciones simples y diferenciales.

2. INTRODUCCIÓN

La gran mayoría de los microorganismos no son visibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante o tinciones diferenciales.

Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad.

Las preparaciones fijadas y teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos como de colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con un asa, recordando siempre tener una preparación delgada y homogénea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de solución salina, y luego extendiéndola con un asa sobre un portaobjetos. Las películas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1 EQUIPO

Microscopio óptico

Microscopio de contraste de fases


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3.2 MATERIAL

Portaobjetos

Cubreobjetos

Pipeta Pasteur

Gradilla

1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm

Asa bacteriológica

Mechero

Asa y porta asa

Puente de coloración

Gradilla metálica

Frasco gotero con solución de cristal violeta

Frasco gotero con solución de lugol

Frasco gotero con solución de alcohol – acetona

Frasco gotero con solución de safranina

Frasco gotero con solución de fucsina fenicada

Frasco gotero con solución de alcohol ácido

Frasco gotero con solución de azul de metileno

Frasco gotero con solución de verde de malaquita

Solución salina o agua de la llave

Lámpara de alcohol

3.3 CEPAS MICROBIANAS

Staphylococcus aureus

Saccharomyces cerevisiae

Escherichia coli

Bacillus subtilis

Rhizopus sp

Aspergillus niger

Lodos activados,

Micrococcus sp

3.3 MUESTRA BIOLÓGICA

Muestra de agua estancada o producto en descomposición (tortilla)


4.1 Preparación de Frotis:

Método A

4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol.

a. Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha.

b. En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.

c. En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo.

d. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla.

e. Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

f. Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente, realizar esta operación una vez más. El


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calor deseable es aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en el dorso de la mano. Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir.

Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis

Método B

a. Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.

b. En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión.

c. Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla

d. Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm 2, y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.

4.2 Examen en fresco de una muestra de agua estancada

a. De la muestra de agua estancada que se ha traído al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos limpio

b. Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un cubreobjetos.

c. Al colocarle el cubreobjetos evitar dejarla caer bruscamente, ya que se formaran burbujas.

d. Observar al microscopio óptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.

4.3 Preparación de una muestra en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol

a. Colocar una gota del colorante azul de algodón lactofenol

b. Colocar el inoculo y hacer una pequeña extensión

c. Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas

d. Observar la preparación al microscopio con el objetivo 10 X y 40 X. Si se requiere que la preparación dure un poco más se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uñas transparentes.

4.4 Tinción simple

a. Tomar la preparación fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha tocado

b. Tomar el tiempo por 1 minuto

c. Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua

d. Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.

4.5 Tinción de Gram:

a. Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae, en el puente de coloración.

b. Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

d. Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.


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e. Lavar los frotis con agua de la llave.

f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).

g. Lavar inmediatamente con agua de la llave.

h. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos

i. Lavar los frotis con agua de la llave.

j. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)

Para demostrar cómo afecta la decoloración con el alcohol cetona (paso f, se realizarà la técnica de gran, pero danto un exceso al tiempo de decoloración (90 segundos).

4.6 Tinción de Gram (con exceso de decoloración):

a. Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración.

b. Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

d. Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.

e. Lavar los frotis con agua de la llave.

f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos.


h. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos

i. Lavar los frotis con agua de la llave.

j. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X.

4.7 Tinción de Gram de una mezcla de microorganismos:

a. Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

b. Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c. Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

d. Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.

e. Lavar el frotis con agua de la llave.

f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).


h. Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos

i. Lavar el frotis con agua de la llave.

j. Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X.

4.8 Tinción de Ziehl-Neelsen.

a. Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración

b. Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar


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a que se enfríe.

c. Enjuagar con agua de la llave.

d. Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto.

e. Enjuagar con agua de la llave.

f. Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto

g. Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión

4.9 Tinción de Shaeffer–Fulton

a. Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación.

b. Dejar que el frotis se enfríe.

c. Lavar con agua de la llave.

d. Cubrir el frotis con safranina por un minuto.

e. Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 Examen en fresco de una muestra de agua estancada

Realiza un esquema de lo observado en el microscopio

5.2 Preparación de una muestra en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol

Realiza un esquema de lo observado en el microscopio

5.3 Tinción simple

a) De la muestra que se te ha proporcionado anota el nombre de microorganismo (etiqueta) y realiza un esquema.

Resultados de la sección

Equipo / microorganismo Colorante a utilizar Color Agrupación

1 y 7 Azul de metileno

2 y 8 Safranina

3 y 9 Cristal violeta

4 y 10 Verde de malaquita


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5.4 Tinción de Gram:

a) Realiza un esquema de cada una de las preparaciones de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae. Escherichia coli Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 40x 100Xx 40X 100X Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real_______ Forma: __________ Agrupación_________ Forma: ____________ Agrupación_________ Micrococcus luteus Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus subtilis 40x 100X 40X 100X Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real________ Forma: __________ Agrupación_________ Forma: ____________ Agrupación_________ Saccharomyces cerevisiae 40x 100X Aumento real______ ________ Forma: __________ Agrupación_________ Resumen de la sección Microorganismos Gram Color Forma Agrupación Resultado del Gram

1.Bacillus subtilis

2. Escherichia coli

3.Staphylococcus aureus

4.Micrococus luteus

5 Saccharomyces cerevisiae

5.5 Tinción de Gram (con exceso de decoloración) Escherichia coli Bacillus subtilis 40x 100X 40X 100X Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real_______ Forma: __________ Agrupación_________ Forma: ____________ Agrupación_________ Tipo de Gram: ________________________ Tipo de Gram: _______________________________


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5.6 Tinción de Gram (mezcla de un Gram + y un Gram -) Mezcla de: _______________________________________________________________________ Aumento real (40X) _______ (100X) _______ a.- Forma: ________ Agrupación_______ Color adquirido_______ Gram ______ b.- Forma: ________ Agrupación_______ Color adquirido_______ Gram ______

5.7 Tinción de Ziehl-Neelsen. Agua residual Aumento real (40X) _______ (100X) ____________ Color de una BAAR positiva ____________ Color de una BAAR negativa ____________ 5.8 Tinción de Shaeffer - Fulton Bacillus sp. Aumento real (40X) _______ (100X)_______________ Color adquirido de la espora _________ Color adquirido de la célula vegetativa_____________

5.9 ¿Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?

5.10 ¿Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?

5.11 ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra en una preparación en fresco?

5.12 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis con calor?

5.13 ¿Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram?

5.14 ¿Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos?

5.15 ¿Cuándo es recomendable utilizar una preparación simple y que colorante utilizarías?

5.16 ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram, Ziehl Neelsen y Shaeffer y Fulton.

5.17 Por medio de un esquema representa la composición de la pared celular de bacterias Gram positivas, Gram negativas y bacterias acido alcohol resistentes (BAAR.

5.18 Dibuja una espora y menciona su composición química.

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir los cuidados que se tienen que tener al realizar una preparación en fresco y una fija, cuales son las ventajas de de cada una de ellas, el tiempo que dura dicha preparación para su correcta observación y los resultados obtenidos en cada tinción realizada.

7. CONCLUSIONES

7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la realización de preparaciones en fresco y fijas, así como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.

8 BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición. Interamericana. México. 1140 págs.


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PRÁCTICA No. 3 MÈTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y REDUCCIÒN DE LA CARGA MICROBIANA

UNIDAD I: Introducción y técnicas de aplicación en microbiología

1. OBJETIVOS


El alumno preparará material de uso común en un laboratorio de microbiología para su esterilización y analizará los diferentes métodos para seleccionar el más adecuado acorde a la naturaleza del material

1.2 Objetivo específicos

1.2.1 Preparará el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco y calor húmedo.

1.2.2 Esterilizará el material e preparado, por calor seco y calor húmedo, haciendo uso de controles de esterilización.

1.2.3 Realizará el proceso de filtración a través de membrana.

2. INTRODUCCIÓN

La esterilización se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie, existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización.

1 Métodos físicos

Calor húmedo:

La aplicación de calor húmedo es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que

no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas, pero no

las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15 libras de

presión en una autoclave. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas,

generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se

encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente

en todas las partes del recipiente.

Calor seco:

Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que

circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una

temperatura de 160 –170 °C durante una h.

El calor como método de esterilización actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la

célula y fragmentando las membranas celulares.

Flameo:

La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para

esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de

ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar”

diseminándose partículas infectantes.


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A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material

mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización

completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.

Radiaciones ionizante y no ionizante:

La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre

pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros

pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.

Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.

Filtración a través de Membranas

Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es

decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas

de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las

dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro).

Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado,

asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como

bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm

2 Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y propiolactona)

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos

carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la

industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos

electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y

además cancerígeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 %

de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad

de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C,

cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de oxido de etileno es

de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno

residual porque es muy tóxico.

La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva

después de varias horas y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más

rápidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser

cancerígena.

3 Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización (Pruebas de esterilidad).

En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que

manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril,

para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y

posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.

Método de la tira de papel

Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se presentan

en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha esterilizado

(testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca


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(problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual.

Luego las tiras se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 días a 55 °C en

caldo de soya y tripticaseína. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilización

no fue la correcta habrá desarrollo en la tira testigo.

Método de la ampolleta:

Son ampolletas que contiene una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo.

La temperatura óptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65°C; dentro

del medio líquido se encuentra un indicador que es el púrpura de bromocresol. Al utilizarla se debe

colocar la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el material, después de

terminar la esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, el

enturbamiento y la aparición de un color amarillo indica una esterilización defectuosa, en cambio si el

color permanece igual durante varios días de incubación el equipo está funcionando bien. Debe llevarse

el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas

condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

Métodos físicos para esterilizar:

A veces, para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se puede esterilizar el material

mojándolo con alcohol y encendiendo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización

completa. El método tiene la ventaja de ser rápido peor se produce carbonización y perdida de filo.

Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las

células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas

en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1 EQUIPO

Autoclave a 121° C

Autoclave a 110 ° C

Horno a 170 ° C

Incubadora a 35° C

Baño María a 55°C

Termómetros de 150 y 200 °C

3.2 MATERIAL (Material para demostración del profesor por sección)

Dos botes de lámina

Un cilindro pipetero

Un cilindro para cajas de Petri

Dos filtros estériles swinnex con empaque

Tres matraces de 125 ml con 50 ml de

Caldo nutritivo (CN) estéril

Una jeringa de 5 ml

Una pinza de disección

Una tijera de disección

Un matraz con 50 ml de suspensión de Escherichia coli (suspensión turbia)

Frasco con benzal

Contenedor para punzocortantes

Material por equipo

Tres cuadros de papel aluminio de 8X8 cm para tapón de tubo

Tres cuadros de papel aluminio de 20X20

Una tira de 3 X 0,5 cm impregnada con esporas de Geobacillus stearothermophilus

Dos tubos de 16 X 150 mm sin tapón.


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cm para envolver pinza o tijera

Tres cuadros de papel aluminio de 12X12 cm para tapón de matraz

Tres cuadros de papel Kraf de 18X14 cm para gorro de matraz

Tres cuadros de papel Kraf de 15X25 cm para gorro de matraz

Tres cuadros de papel Kraft de 20 X 20 cm para cubrir un bote de lámina.

Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm para envoltura de pipeta de 10 ml.

Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm para caja de Petri

Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm para envoltura de pinza o tijera.

Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm para tapón de matraz.

Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm para tapón de matraz.

Cuatro cajas de Petri limpias

Tres pipetas de 10 ml limpias

Un clip o aguja de disección

Cuatro matraces de 125 ml

Un matraz de 250 ml.

Algodón suficiente para tapones de matraces

Tres tubos de ensaye de 13 X 100 mm sin tapón

Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapón

Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar (se preparan el día de la práctica)

Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo estéril

Un frasco con alcohol

Tres matraces con 50 ml de caldo nutritivo estéril

Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para tapón de tubo

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Caldo nutritivo


Reactivos comerciales (esporas indicadoras de esterilización). Ampolletas con un disco con esporas.

Un matraz con 50 ml de una suspensión microbiana de Escherichia coli


PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN

.1 Lavado de material de vidrio e instrumental

a) Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el

material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando de

preferencia extran.

b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave

c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.

4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

4.2.1 TUBOS DE ENSAYO

a. Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor


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b. Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

4.2.2 CAJAS DE PETRI

a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.

4.2.3 PIPETAS

a. Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy

compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip

b. Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón

c. Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo

con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de

equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.

4.2.4 MATRACES

a. Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las

instrucciones del profesor.

b. Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.

c. En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No

anotar los datos sobre el gorro de papel.

4.2.5 PINZAS Y TIJERAS

a. Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.

b. Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

4.3.1 TUBOS DE ENSAYE

a. Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica.

b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.

c. Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.

4.3.2 CAJAS DE PETRI

a. Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición

invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL

CONTAMINADO)

b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.

4.3.3 PIPETAS

a. Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado.

b. Flamear las boquillas en la flama a fin de eliminar el exceso de algodón.

c. Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.


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d. Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la

tira entre la tapa del cilindro pipetero.

4.3.4 MATRACES

a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.

b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo

con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.

4.3.5 PINZAS Y TIJERAS

a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.

b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.

4.4. REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA (PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÒN POR CALOR HUMEDO)

a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril etiquetarlo. (Etiqueta con la

siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) y colocarle una tira de esporas de

Geobacillus stearothermophilus.

b. Someterlo a una presión de 10 libras por 10 minutos.

c. Sacar el tubo e incubar el tubo a 55 oC 2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente

durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la

aparición de turbidez.

4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

a) Tomar un tubo de de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo

b) En un tubo de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo colocar una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, cerrar el tubo y esterilizarlo a 121 °C, 15 min y 15 lb.

c) Sacar el tubo e incubarlo a 55 oC 2°C por 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en la bitácora cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.

Pasos para realizar una buena esterilización:

-Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave.

-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical

- -Observar que el manómetro registre la presión

-Si se está utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.

-Al terminar de esterilizar dejar el autoclave sin agua

4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

a. Encender el horno una hora antes y colocar el material para esterilizar por calor seco, cuando la

temperatura este a 170 oC tomar el tiempo de 1 h, verificando que la temperatura sea la indicada.

b. En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de

Bacillus subtilis var. niger, cubrir el tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material a esterilizar.

Esterilizar a 170 oC/1 h, etiqueta el tubo de preferencia con un marcador indeleble.


30

c. Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro

indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.

d. Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar la tira

de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 ml de

caldo nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55 2oC durante 5 días. Observar diario y anotar cualquier

cambio en cuanto a la aparición de turbidez.

4.7 CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO

a) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril con una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus como testigo positivo del procedimiento.

b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril sin tira de esporas, es el testigo (-).

4.8 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA

Sistema de filtración Swinnex marca Millipore

a. Colocar 10 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable, remover el swinnex estéril del

empaque de papel al que previamente se le ha colocado la membrana y ensamblar la jeringa.

b. Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un matraz con caldo nutritivo estéril, la jeringa y el filtro

colocarlo en un bote de lámina para su esterilización. Incubar el filtrado a 35 2 oC de 48 a 72 h.

c. Observar diariamente y anotar en la bitácora del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la

aparición de turbidez durante 3 días.

d. El bioindicador utilizado en la filtración a través de membrana es Pseudomonas diminuta, para

membranas con un diámetro de poro de 0,2 m

Esterilización de material de desecho

-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo,

nunca se esterilizan por calor seco

-5. CUESTIONARIO

5.1 ¿Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?

5.2. ¿Por qué utilizamos el papel Kraft para envolver el material?

5.3 Completa el siguiente cuadro, anotando la presencia o ausencia de turbidez en los tubos

Método Tratamiento 110°C/10´10 lb

Calor húmedo

121°C/15´/15lb

Calor seco

170°C/2 h

Filtración a través de membrana

Control

positivo

Control negativo

Resultado

(turbidez)

5.4 Explicar por qué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye

5.5 Qué explicación darías si después de la esterilización, el tubo que contiene la tira de esporas hay

crecimiento después de la incubación.

5.6 ¿Cómo afecta a la bacteria el proceso de esterilización por calor seco, calor húmedo y filtración?


31

5.7 Anota 10 productos que se puedan esterilizar por calor seco, calor húmedo y filtración.


6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel

Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo.

7. CONCLUSIONES

7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así

como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.

8. BIBLIOGRAFÍA

8.1 Enlistar la bibliografía consultada


32

PRÁCTICA No. 4

NUTRICIÒN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS AERÓBICOS

No. DE UNIDAD: III Nutrición y Cultivo Microbiano

1.- OBJETIVOS

1.1 Objetivo General.

El alumno preparará diferentes medios de cultivo en base a sus componentes, uso y consistencia, utilizando la NOM-065 SSA1-1993 Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo y los utilizará para cultivar microorganismos.


2.1 El alumno preparará medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y sintéticos de acuerdo a la NOM–065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un microorganismo, los esterilizará y vaciará para su uso.

2.2 Utilizará los medios de cultivo de acuerdo a su presentación final para cultivar microorganismos y comparará el crecimiento de acuerdo a la clasificación.

2.- INTRODUCCIÓN

Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones

inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas

grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos.

La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera

preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas

interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados.

Nutrición.

A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el

anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:

a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer.

b.- Nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son esenciales.

Algunos nutrientes son monómeros a partir de los cuales las células forman las macromoléculas y otras

estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de energía sin ser incorporados

directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempeñar ambas

funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes,

dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeñas respectivamente y factores de

crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se

requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporción. Frecuentemente los

micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible determinar cuánto se

requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté presente en el medio en

que un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales

micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes.

Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las

rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos

adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos

medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten crecer.


33

Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo,

formulado con un fin específico, y el cual deberá contener:

a) Fuente de carbono

b) Fuente de nitrógeno

c) Fuente de azufre

d) Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o vitaminas que no pueden sintetizar)

e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).

f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o metales pesados.

g) Indicadores de potencial oxido-reducción.

h) Agar como el agente gelificante o soporte.

Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.

Medios selectivos.

Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en

una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.

Medios selectivos de enriquecimiento.

Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben

la reproducción de otros.

Medios diferenciales.

Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el

medio o en las características típicas de las colonias.

Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.

Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de

microaerofilia.

Medios de transporte.

Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del

producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.

Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.

Medios para filtración a través de membrana.

Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el

crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.

Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del

medio de la membrana.

Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.

En el caso de los hongos, el medio de cultivo que más se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que

tiene un pH de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser

más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina;

para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se

llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de

bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico.


34

En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, y el

objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificación u obtención de masa celular.

Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los

medios de cultivo como son:

a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)

b. Los materiales que deben encontrase en condiciones de limpieza

c. Si se debe aplicar calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad,

desnaturalización, caramelización o pérdida de actividad nutricional.

d. pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante

e. Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación

comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.

Cultivo microbiano.

Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en raras

ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se

encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un

cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de

microorganismos se puede realizar en medio sólido, semisólido o líquido.

Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo

gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación de

estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura

(introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos.

Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo

proveniente de una placa.

Existen dos variedades de cultivo en tubo:

a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia

inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio

por la superficie inclinada del agar.

b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma

inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente.

La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce

en el medio líquido agitando suavemente el asa.

a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos con

agar inclinado

b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez, un

sedimento, una película superficial, o combinados.

c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo

Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede

hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario.

Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para

completar la identificación de los microorganismos, aunque cabe señalar que la identificación de

microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras

pruebas bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas.


35

Agar bacteriológico

El agar utilizado en bacteriología es un medio que está libre de metales, compuestos nitrogenados,

sales insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos.

El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas,

particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente el agar

es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como

polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es variable,

con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas utilizadas.

El agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua

hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus partículas,

que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no

cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la

solución disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 – 40 °C.

Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que:

a) Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.

b) Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estado sólido.

c) Su punto de fusión, superior a 80 °C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se incuban hasta temperaturas de 65 °C.

d) Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 °C, permite mezclarlos en forma líquida.

e) Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos.

f) Su empleo en concentraciones muy bajas permiten la obtención de medios semisólidos en los cuales se pueden realizar pruebas de movilidad.

Clasificación de medios de cultivo

I Los medios de cultivo por su estado de agregación pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos

a) Medios líquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de microorganismos o bien para la producción de algún metabolito.

b) Medios semisólidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad.

c) Medios sólidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos.

II.- Por su uso se clasifican en:

a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismos o grupo de microorganismos de interés.

b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicación de algún microorganismo.

c) Medios selectivos de enriquecimiento.- Son medios que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden la reproducción de otros.

d) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores ácido base y de redox para detectar cambios en el medio o en las características típicas de la colonia.


36

e) Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.- Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el caldo tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis.

III. Por su composición

a) Si a un medio se le conoce completamente su formulación química se denomina medio sintético como el caldo glucosa sales.

b) Si un medio de cultivo no conocemos su composición química se le denomina un medio complejo como el agar base sangre.

Acorde a la presentación de un medio, podemos tener cultivos líquidos en matraz, en tubo medios semisólidos y en placa medios sólidos.

IV.- Medios de cultivo para medir la actividad antimicrobiana (antibiograma).

Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibición de sustancias desinfectantes o antisépticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar Mueller Hinton, agar cuenta estándar y agar de soya y tripticaseína.

Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo para el Agar de papa y dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia.

Microorganismo Cepa Resultado

Candida albicans ATCC 10231 Bueno

Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno

Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno

Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son:

Microorganismos Cepa Resultado

Escherichia coli ATCC 25922 Colonias moradas con brillo metálico azul verdoso

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Colonias mucoides con centro oscuro por lo general sin brillo metálico

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias incoloras y transparentes

Shigella flexneri ATCC 12022 Colonias incoloras y transparentes

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes

Candida albicans ATCC 10231 Colonias plumosas de color rosa pálido.

Esto se realiza para garantizar que el medio de cultivo funciona adecuadamente y puede ser utilizado, además es parte del control de calidad de los medios de cultivo.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR GRUPO Sesión I

●Balanza granataria

●Autoclave

●Horno 170° C

Papel Kraf

●Potenciómetro

●Algodón

● Gasa

Refrigerador


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Incubadora a 28° C Incubadora a 37° C

3.2 MATERIAL POR EQUIPO (Sesión I)

●Un mechero Fisher

●Un espátula

●Seis matraces de 250 ml

●Siete tubos de ensaye de 16 x 150 mm

●Dos matraces de 125 ml

●Una pipeta de 10 ml

●Cinco tubos de ensaye de 13 x 100 mm

● ●Una probeta de 100 ml

●Un termómetro

Seis cajas Petri

Sesión II

Tres tubos con 3 ml de medio SIM

Tres cajas con agar EMB

Tres tubos con agar PDA

Tres cajas con agar nutritivo

3 tubos con 3 ml de caldo glucosa sales

Un matraz con 50 ml de caldo glucosa sales

Un matraz con 50 ml de caldo nutritivo

Tres tubos con agar nutritivo

Tres cajas con un medio enriquecido

3 tubos de caldo nutritivo

3.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

●Agar nutritivo (AN)

●Agar eosina azul de metileno (EMB)

●Agar de papa y dextrosa (PDA)

●Medio SIM

●Glucosa

Agar base sangre

●(NH4) 2SO4

●K2HPO4

●MgSO4 7H2O

●MnSO4 4H2O

●Agar bacteriológico

Agar rosa de bengala


Escherichia coli

Bacillus sp.

Penicillum sp.

Aspergillus sp.

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL

Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo.

a) Preparar el volumen de medio que se vaya a utilizar en el período recomendado para su

empleo.

b) Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.

c) Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)

d) El medio de cultivo en polvo debe de guardarse en su frasco y en un lugar fresco.

e) Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la

proyección en el momento de la ebullición.

f) Añadir una pequeña cantidad de agua para permitir la disolución y después completar el volumen.


38

g) En general los medios se mezclan hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse que

se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten.

h) El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y a una temperatura de 25° C.

i) Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la pérdida de materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.

j) Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4° C) y protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio de color o de consistencia etc.

k) Un medio contenido en un matraz y que ya contenga sustancias de enriquecimiento ó ácido tartárico

no puede ser esterilizado una segunda ocasión.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

4.2 MEDIO SINTÉTICO (glucosa-sales caldo y agar)

a) Preparar 100 ml de caldo o la cantidad que indique el profesor.

b) Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulación:

Reactivo Cantidad

Glucosa 5.0

(NH4) 2SO4 2.0

KH2PO4 0.05

K2HPO4 0.05

MgSO4 7H2O 0.25

MnSO4 4H2O 0.001

Agua destilada 100 ml

c) Disolver los componentes por separados y colocarlos en un matraz de 250 ml, adicionar en primer lugar los metales, luego los fosfatos, el amonio y finalmente la glucosa. Ajustar el pH a 7.0 ± - 0.2 si fuera necesario, para ello utilizar el potenciómetro.

d) Una vez disueltos los componentes transferir 30 ml a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, colocarle el tapón de algodón su gorro de papel Kraf y colocarlo en el autoclave.

e) Tomar 3 tubos y colocarles 3 ml de caldo glucosa sales, taparlos y colocarlo en un bote de lámina

f) Medir el volumen que sobra del caldo y realizar la operación matemática, de tal forma que la concentración de agar a adicionarle sea 1.5 g de agar bacteriológico/ 100ml de medio.

g) Calentar a ebullición hasta que se haya fundido completamente.

h) Tomar 3 tubos de ensaye y colocarle aproximadamente 3 ml, taparlos y colocarlos en el bote de lámina para su esterilización.

i) El medio que ha sobrado colocarle el tapón y su gorro e introducirlo a la autoclave.

j) Esterilizar todo el material anterior en autoclave a 110° C durante 15 minutos. Una vez que se ha llevado a cabo la esterilización, inclinar los tubos que tienen agar.

k) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.


39

l) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.

m) Dejar una muestra para control de esterilidad por 5 días y el resto de material conservarlo en refrigeración para su uso.

4.3.1 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para placas de Petri)

a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio indicada por el profesor.

b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.

c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.

e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.

f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.

4.3.2 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para preparar tubos de ensaye)




d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.

e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote

f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.

4.3.3 MEDIO COMPLEJO (caldo nutritivo en matraz y tubo de ensaye)

a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio.


c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente.

d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapón y gorro

e) Vaciar 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote de lámina.

f) Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeración.

4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique.


40

b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.

c) Calentar suavemente hasta disolución completa.

d) Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft.

e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco

f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.


4.5.1 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri)




d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.

e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.

f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.


4.5.2 MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye)




d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.

e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote

f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.

4.5.3 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml)

h) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio.

i) Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria.

j) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

k) Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.

l) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.


41

m) Este medio se utilizará para la realización de la técnica de vaciado en placa y para ello será necesario fundir el medio y cuando este a 45 °C se le adicionará 1.4 ml de ácido tartárico al 10% estéril por cada 100 ml de medio preparado y homogeneizar.

4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).

a) Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor.

b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.

c) Calentar suavemente hasta disolución completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.

d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase

e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posición vertical.

4.7a.-MEDIO ENRIQUECIDO AGAR SANGRE

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.

b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.

c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.

d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C.

e) Cuando este a esa temperatura, adicionar 5 % de sangre estéril desfibrinada.

f) Mezclar bien la sangre y vaciar rápidamente en las placas previamente esterilizadas y etiquetadas.

g) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y guardarlas en el refrigerador.

4.7.b.- MEDIO COMPLEJO Y ENRIQUECIDO (Agar Baird-Parker, medio que se utilizará en aislamiento)

Este medio de cultivo contiene cloruro de litio y telurio para la inhibición de la flora acompañante, en tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente el crecimiento de Estafilococos.Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de Estafilococos muestran dos características diagnosticas por la lipólisis y proteolisis, se producen halos y características y, debido a la reducción del telurio a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reacción con al yema de huevo y la reducción del telurio se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-positividad, y por tanto, pueden utilizarse como índice de esta última.

Formula

Ingredientes Cantidad

Medio base 95,0 ml

Solución de telurito de potasio 1,0 ml

Emulsión de yema de huevo 5,0 ml

Preparación

a.- Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar.

b.- Colocar de 15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar.

c.- Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC.


42

Preparación del medio base de Baird-Parker

a.- Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1 min. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min, enfriar y mantener el medio a 45ºC.

Preparación de la solución de telurito

a.- Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios meses a temperatura de 0 a 5ºC.

Preparación Emulsión de yema de huevo

a.- Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura de yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000). Enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril.

b.- En campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con solución salina isotónica.

c.- Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fuertemente para formar la emulsión y filtrar a través de gasa.

d.- En tanto que el medio de cultivo basal puede aguardarse de 1 a 2 meses a 4 º C, el medio de cultivo completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24 horas siguientes a su preparación.

4.8 AGAR ROSA DE BENGALA

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.

b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.

c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.

d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C y vaciar en placas estériles

e) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y guardarlas en el refrigerador.

4.9 CONTROL DE ESTERILIDAD

a) Tomar una muestra de cada uno de los medios preparados para el control de la esterilización e incubarlos a 35 °C durante 3 a 5 días.

b) Verificar que no presente crecimiento, cambio de color o precipitación.

NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIÓN QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS.

SESIÓN II

4.1 Revisar los medios de cultivo que se prepararon

4.2 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA (ESTRÍA CRUZADA, SIMPLE, POR PUNTO Y MASIVA)

Se utilizarán cajas con agar EMB o Agar sangre para la realización de la estría cruzada.

a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero.

b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.

c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.


43

d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.

e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se indica en el esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estría.

f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas.

g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.

4.3. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA SIMPLE EN PLACA

a) Tomar el asa y esterilizarla en la flama.

b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama.

c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.

d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.

e) Destapar la caja de Agar nutritivo y sembrar como se indica en el esquema

f) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 h.

g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.

4.4. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR PUNTO (generalmente para mohos)

a) Tomar la placa y dividirla en cuatro fracciones que corresponden una para cada alumno y testigo

b) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama.

c) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.

d) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar el inóculo.

e) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.

f) Destapar la caja de agar de papa y dextrosa y sembrar como se indica en el esquema.

g) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 28° C, de 3 a 5 días.

h) Observar el crecimiento a las 24h, 48h, 72h y 5 días, anotar las características del crecimiento.

4.5. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA MASIVA


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a) Tomar un hisopo estéril.

b) Destapar el tubo que contenga la suspensión del microorganismo y pasar la boca del tubo por la flama del mechero.

c) Tomar un hisopo estéril y humedecerlo en la suspensión.

d) Pasar la boca del tubo por la flama y colocarle el tapón.

e) Destapar la caja de agar de soya y tripticaseína y sembrar como se indica en el esquema

f) Colocar el hisopo en el benzal para su desinfección e incubar la caja sembrada a 37 °C/24 h, y observar el crecimiento.

4.6 CULTIVO EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO

a) Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS

b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estría en “S” la superficie del medio inclinado de agar nutritivo.

c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estría en “S” la superficie del medio inclinado de agar de papa y dextrosa.

d) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra e Incubar los tubos sembrados a 37° C para bacterias y a 28° C para hongos, durante 24 y 48 h respectivamente

e) Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características del cultivo.

4.7 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO (Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales)

a) Tomar el inóculo de bacterias con el asa y disgregar éste “agitándolo” en las paredes del tubo o matraz, evitar la formación de grumos.

b) Tomar el inóculo de hongos con el asa en forma de L y sembrarlo en el matraz o en tubo, procurando tomar esporas y micelio para disgregarlo en el medio.

c) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.

d) Incubar los tubos y matraz con bacterias a 35° C/24 h, y el matraz con hongos a 28° C/ 5 días en agitación a 120 rpm

e) Observar los cultivos a las 24 y 48 h y anotar las características observadas.

f) Los equipos designados por el profesor dejarán su matraz con moho o bacterias sin agitación.

4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO (Se emplearán tubos con medio SIM)

a) Tomar un inóculo de bacterias con el asa recta.

b) Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el fondo y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en el caso de que la bacteria sea no móvil, cuando es móvil el crecimiento se difunde a través del medio). Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.

c) Incubar los tubos a 37° C/ 24 h.

d) Observar los cultivos a las 24 h y anotar las características del cultivo.


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4.9 MORFOLOGÍA COLONIAL

Morfología colonial en placa para bacterias y levaduras

Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias SEPARADAS debe incluir:

a. Tamaño: Diámetro en mm, La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado al tiempo de incubación.

b. Forma: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser:

c.- Elevación: Que puede ser:

d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado, filamentoso o rizado.

e. Color: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc.

f. Aspecto: Húmedo o seco

g. Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta prueba se realizar con el asa.

Morfología colonial en placa para mohos:

Tiempo de crecimiento: Los mohos filamentosos, tienen colonias de 2-3 cm de diámetro y va de 3 a 5 días.

Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso.

Pigmentación: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del micelio y puede ser de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas.


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5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilización, el aspecto final del medio y cuál es su clasificación en base a su consistencia y composición.

Medio de cultivo Condiciones de

esterilización

Clasificación por su

consistencia

Clasificación por su

composición

Presentación del

medio

Caldo Glucosa sales Ejemplo

110°C /10 ´ Líquido Simple /sintético Tubo y matraz

Agar Glucosa sales

Agar Nutritivo

EMB

PDA

SIM

Agar sangre

Agar rosa de bengala

5.2 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de Petri?

5.3- De los siguientes medios, mencionar en qué consiste su capacidad diferencial o selectiva y qué tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa.

5.4 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?

5.5 De los medios usados indica cuáles son específicos para mohos y cuáles para bacterias y ¿por qué?

5.6 Cuando se siembran hongos en medio líquido, describe cómo es el crecimiento con y sin agitación.

5.7 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben tomar?

5.8 Anota la morfología colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste.

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificación de los medios y a las características de la morfología colonial (macroscópica) para cada especie microbiana.

7.- CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la bibliografía consultada y al objetivo de la práctica.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición. Interamericana. México. 140 p.

8.2 Manual de medios de cultivo Bioxon parte 1 y 2

8.3 NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.

8.4 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega. 1997. España. 654 p.


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PRACTICA No 5

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS

UNIDAD IV: Cultivo y crecimiento microbiano

1. OBJETIVOS:

El alumno practicará las técnicas de aislamiento y cuantificación de microorganismos de muestras biológicas siguiendo las recomendaciones de las Normas Oficiales Mexicanas.

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1.2.1 El alumno practicará las diferentes técnicas de aislamiento y recuento de microorganismos.

1.2.2 Aplicará la técnica de las diluciones para disminuir la carga microbiana de las muestras con base

en las normas oficiales, NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de

Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico y NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución

de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, 092 NOM-092-SSA-1994, Método para la

cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la

cuenta de mohos y levaduras en alimentos

2. INTRODUCCIÓN

Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes en

una muestra, forzándolos a crecer en medios de cultivos. No todos los microorganismos pueden

cultivarse en medios de cultivo como el caso de los organismos biotróficos y consorcios microbianos

difíciles de separar (parásitos obligados), los cuales se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante

(virus, rickettsias, hongos).

En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y

luego su posterior identificación (familia, género y especie).

-Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente

se ha obtenido a partir de una sola célula. En un cultivo puro, no necesariamente todas las células que

lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran

mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que componen una

especie se denomina cepa.

Las diferentes técnicas de aislamiento son la estría cruzada, el vaciado en placa y la extensión con

varilla, pero en ocasiones la muestra tiene gran cantidad de microorganismos que tenemos que recurrir

a la realización de:

Realización de diluciones (NOM-110-SSA1–1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico)

La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los

microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis.

La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el

número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la

observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.

Dilución primaria, es la suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del

producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.


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Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado

volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de

esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas

para la inoculación de medios de cultivo.

Estría cruzada en placa:

Esta técnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estrías cruzadas sobre

la superficie de un medio sólido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias

separadas que generalmente corresponden a un cultivo puro, aquí no se puede hacer un recuento.

TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA:

El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.

En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta en caso contrario seguir las indicaciones de la NOM 092

Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.

TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA CON VARILLA ACODADA

Esta técnica se utiliza para el aislamiento y recuento de microorganismos, donde el inóculo se distribuye con la varilla, previamente esterilizada. La cantidad de inóculo utilizado puede ser de 0,1 o 0,5 ml.

En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que

deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos

productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón.

El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna característica como hidrólisis o hemólisis.

3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

3.1 MATERIAL POR EQUIPO

Cuatro Cajas de Petri estériles

Cajas de Petri con EMB o medio selectivo

Matraz con 100 ml de ACS o PDA

Balanza granataria

Cuatro cajas de Petri con Agar Nutritivo

Cilindro con pipetas de un ml estériles

Seis frascos de dilución con 90 ml de solución salina al 0.85%

3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

3.2.1 Muestra de queso, agua de sabor, leche en punto de venta, helado, etc.


4.1 Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor y según el siguiente esquema.

4.1.1 DILUCIONES

a. Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).


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b. Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.

c. Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

d. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 10 ml de la muestra si es muestra líquida y 10 g si es muestra sólida y diluir con 90 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones de esterilidad).

e. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.

f) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

4.2 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA. Agar cuenta estándar (ACS) o agar de papa y dextrosa (PDA)

NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos

a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas

b) Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio

de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en la base de

la misma con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.

c) Se inocula un ml de las dos últimas diluciones según las diluciones que se hayan realizado en las

cajas Petri estériles, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado que es agar cuenta estándar,

mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj,

6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una

completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.

Dejar solidificar.


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d) Incluir una caja sin inóculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.

e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

f) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran.

g) Para bacterias y levaduras 37°C 24 a 48 horas.

h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias

i) Si se cuenta la última dilución y no tiene entre 25 y 250 sino más, y las colonias están bien distribuidas, dividir la placa en dos y contar solo una mitad, el resultado se multiplica por dos, si aún tenemos muchas colonias, dividir la placa en cuatro y solo contar un cuadrante y el resultado se multiplica por cuatro, y si todavía tenemos muchas contar 5 cm2, sumarlos y sacar un promedio, el resultado se multiplica por 65, cuando la placa utilizada sea de 100 X 15 mm.

j) Para el aislamiento y recuento de mohos es el mismo procedimiento solo que ahora hay que acidificar el PDA con 1.4 ml de acido tartárico al 10 % por cada 100 ml de medio, incubar a 28 °C de 3 a 5 días y contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 15 y 150 colonias.

4.3 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA (Agar Nutritivo)

a. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente.

b. Etiquetar las cajas en la base previamente a su inoculación y correr por duplicado.

c. Inocular 0.1 ml de las dos últimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del medio.

d. Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.

e. Enfriar la varilla, una vez fría extender el inoculo por toda la superficie del agar nutritivo.

f. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.

g. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

h. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.

i. Para bacterias 37°C 24 a 48 horas.

j. Se procede a contar el número de bacterias haciendo los cálculos como en la técnica de vaciado en placa.


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4.4 AISLAMIENTO POR ESTRIA CRUZADA (Medio selectivo)

a. Este sistema de siembra en estrías en placas de Petri con medios sólidos y es el procedimiento habitual para aislar microorganismos. (En caso de duda ver la práctica anterior.)

b. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de producto y/o microorganismo de que se trate.

c. Realizar la morfología colonial de las colonias que estén previamente aisladas.

5 CUESTIONARIO:

5.1 Informe de resultados de la técnica de Vaciado en placa:

Técnica Vaciado en placa ACE/PDA Extensión con varilla (AN)

No. de UFC/ml

5.2 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.

Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C.

5.3 Informe de resultados de la técnica de Extensión en con varilla.

5.4 ¿En qué casos aplicarías la técnica de estría cruzada?

5.5 ¿La técnica de estría cruzada permite contar el número de colonias?

5.6 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de vaciado en placa?

5.7 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de extensión en placa?

5.8 ¿En qué casos aplicarías utilizar diluciones?

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas de aislamiento y analizar los resultados obtenidos en cada una de las técnicas.


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7. CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los resultados obtenidos.

8. BIBLIOGRAFÍA

8.1 NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico

8.2 NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico

8.3 NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa

8.4NOM-111-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos

8.5 Koneman, Diagnóstico Microbiológico 3ra. Edición, Edit. Panamericana 2003.


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PRÁCTICA No. 6

CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

UNIDAD IV: Nutrición y cultivo microbiano.

1. OBJETIVOS:


1.1 El alumno diferenciará cada uno de los métodos de conservación de cepas de acuerdo a las características de este.


1.2.1 El alumno conocerá los métodos de conservación de cepas y conservará algunas cepas de interés eligiendo el método más adecuado.

1.2.2 El alumno realizará pruebas de viabilidad microbiana.

2. INTRODUCCIÓN

En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que preservar, teniéndose

varios métodos para su conservación, aunque necesario tomar en cuenta las características del

microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues

sucede que nuestra cepa de interés puede en un momento dado sufrir daños como la deshidratación,

cambios genéticos o perdida de la viabilidad.

Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un

laboratorio son:

Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el

proceso de conservación;

Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos del 70-80% de las células, y

Que estas células permanezcan genéticamente estables.

Las dos primeras condiciones no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica

microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios

métodos de conservación. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados,

que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos

restringidos.

A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.

Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han

muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones

sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método. Los métodos de

conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.

Conservación por congelación.

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a

temperaturas inferiores a 0°C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células

de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así

conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde

todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro


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factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método es la

edad de las células, velocidad en la congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento: y

empleo de agentes crioprotectores.

Conservación por liofilización.

Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado

el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero

a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de

las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla

mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la

viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores.

Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de

la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la

congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el

almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden

almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es fácil.

Los factores que debemos tener en cuenta para hacer una buena liofilización son los mismos que

influyen en la congelación, a los que hay que añadir otros que surgen como consecuencia de la

deshidratación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos

en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de

microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de

evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es

conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del

agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como

crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y

actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores,

como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas y mezclas de glucosa con caldo

hígado (sin carne) para bacterias anaerobias.

Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de

conservación son: el tipo de microorganismos, la concentración celular, el grado de deshidratación

alcanzado, la atmósfera de oxígeno en el tubo y las condiciones de almacenamiento.

B.- Métodos alternativos.

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los

equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por

estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino

que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

a).- Conservación por transferencia periódica.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin

embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir

activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y

muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el

peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una

alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán


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descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus

características. A veces se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con

esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que

podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los

microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en

tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es

que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del

tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.

b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.

Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de

microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en

suspender en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos,

en este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml en el caso de bacterias

y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de

agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en

agua de mar diluida.

C.- Métodos restringidos.

En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a

la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización

o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.

a).- Desecación en papel de filtro.

Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solución muy densa de células y se

deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se

llama desecación líquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación

previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un

vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado,

ocasionando la congelación incontrolada de las células.

b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.

Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos

productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es

barato y de fácil conservación.

c).- Desecación en bolitas de alginato.

Éste es un procedimiento eficaz, las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del

agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta

que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos

cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC

debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato.

Este es un método que se está utilizando para la conservación de algas y células vegetales.

Para demostrar la eficiencia de un método de conservación en cepas se tiene que determinar el

porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica,

bioquímica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva.


56


3.1. EQUIPO

Incubadora a 35 ° C

Congelador

Refrigerador

Autoclave

Horno

Balanza digital

3.2. MATERIAL

Cajas de Petri

Portaobjetos

Pipetas de un ml

Gasa y algodón para un tapón

Un tubo eppendorff de dos ml

Una espátula de acero inoxidable

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:

Dos tubos de 13 X 100 con TSA inclinado con tapón de baquelita

Un tubos con 4 g de arena estéril

Un matraz con 80 ml de ACS

Un tubo de 13 X 100 con TSA o agar base sangre con tapón de algodón

Cinco tubos con 9 ml de solución salina

Un matraz con 30 ml de BHI

Un matraz con 80 ml de PDA

Un matraz con 30 ml de caldo BHI

Un tubo de 16X150 mm con PDA inclinado en tubos con tapón de baquelita (Cosecha de esporas)

Dos tubos de 13 X 100 con PDA inclinado con tapón de baquelita

Un tubo de 13 X 100 con PDA con tapón de algodón.

Un tubo de 13 X 100 mm estéril con tapón de baquelita

3.4. REACTIVOS:

Glicerol al 60 % estéril

Acido tartárico

Colorantes para tinción de esporas

Aceite mineral

Colorantes para tinción de Gram

Azul de algodón lactofenol

3.5. CEPAS MICROBIANAS Y MEDIOS SELECTIVOS PARA SU IDENTIFICACIÓN COLONIAL

Escherichia coli Agar eosina azul de metileno

Rhizopus sp Agar de papa y dextrosa

Bacillus subtilis Agar nutritivo Aspergillus niger Agar de papa y dextrosa

Micrococcus luteus Agar nutritivo Penicillium sp Agar de papa y dextrosa

Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Pseudomonas. aeruginosa Agar cetrimida

Saccharomyces cerevisiae Agar cuenta estándar Lactobacillus delbrueckii Medio MRS


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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

Para la conservación de cepas la distribución será la siguiente:

Equipo Cepa a conservar Equipo Cepa a conservar

1,6 Escherichia coli 4,9 Saccharomyces cerevisiae

2,7 Bacillus subtilis 5,10 Aspergillus niger

3,8 Micrococcus luteus 11 y 12 Lactobacillus delbrueckii

PARA BACTERIASY LEVADURAS:

DÍA 1

1) Realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de la cepa, en caso de ser un microorganismo

esporulado, realizar la tinción de esporas.

2) Sembrar un matraz con 30 ml de caldo infusión cerebro y corazón (BHI) estéril con dos asadas del

microorganismo que te ha tocado según el número del equipo, incubarlo a 35 °C durante toda la noche

en agitación a 150 rpm.

DÍA 2

3) A partir del matraz sembrar por estría simple 3 tubos con agar de soya y tripticaseína, e incubarlo a

35 °C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapón de baquelita y uno con

tapón de algodón.

4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de

conservación y fecha en que se determinará la viabilidad.

DÍA 3 Después de la incubación realizar lo siguiente

Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente

Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C

Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 °C

Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te ha tocado

La suspensión es para obtener el número de células / ml

Del matraz realizar lo siguiente:

4) Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.


58

Conservación en congelación

5) Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene

arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente

6) Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión

microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas

diluciones. Incubar a 35 °C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos

cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.

En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a

continuación.

Nombre de la cepa

Fecha de siembra del matraz

Fecha de siembra de los tubos

Fecha de conservación

Determinación de viabilidad (1era. vez)

Determinación de viabilidad (2da.da vez)

% de Viabilidad

Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:

Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estría cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del

microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado según el tipo de microorganismos que se ha

conservado y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.

Cepa a conservar Medio de cultivo

Conservación a temperatura ambiente

Conservación a 4 °C

Conservación con aceite mineral y a 4 °C

Escherichia coli EMB

Bacillus subtilis AN

Micrococcus luteus AN

S. aureus ASM

S. cerevisiae ACS

P. aeruginosa Agar cetrimida

L. delbrueckii Medio MRS

Al tubo (eppendorff)

1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina

2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones

3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa

4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas

5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad


59

Al tubo con arena


2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones


4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas


PARA MOHOS: DÍA 1

1.- Realizar una preparación en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un microcultivo, pero en este momento aún no conoces la técnica).

2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodón

3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapón de baquelita

4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapón de baquelita

5.- Incubar los tubos por 5 días a 28 °C

DÍA 6 Después de la incubación realizar lo siguiente

Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón

Se conservará a temperatura ambiente

Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita

Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C

Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita

Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 °C

Tubo de 16 X 150 mm con tapón de baquelita

Realizar una suspensión, para ello colocarle aproximadamente 3 ml de solución salina y con la ayuda del asa resuspender para tener la cosecha de esporas y poder obtener el No de células / ml

Del tubo de 16 X 150 mm que tiene la suspensión de esporas realizar lo siguiente:

1.- Depositar la suspensión en un tubo estéril, para facilitar el trabajo

2.- Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente

etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.

3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene

arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente

4.- Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión

microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas

diluciones. Incubar a 28 °C durante 5 días y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos

cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.

En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a

continuación.

Nombre de la cepa

Fecha de siembra del matraz

Fecha de siembra de los tubos

Fecha de conservación

Determinación de viabilidad (1era. vez)

Determinación de viabilidad (2da.da vez)

% de Viabilidad


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Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:

Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar el agar de papa y dextrosa y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.

Cepa a conservar Medio de cultivo

Conservación a temperatura ambiente

Conservación a 4 °C

Conservación con aceite mineral y a 4 °C

Rhizopus sp PDA

Aspergillus niger PDA

Penicillium sp PDA

Al tubo (eppendorff)


2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones


4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C


Al tubo con arena


2.- Tomar un gramo de arena y realizar las cinco diluciones


4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C



Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservación

Método /cepa Temperatura ambiente

Refrigeración Crecimiento +

Refrigeración + Aceite Crecimiento +

Congelación UFC/ml

Arena UFC/g

E. coli

B. subtilis

M. luteus

S. aureus

S. cerevisiae

P. aeruginosa L. delbrueckii

Rhizopus sp

A. niger

Penicillium sp

+ Solo indicar si hay abundante o no.


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Después de la conservación

Método /cepa Temperatura ambiente

Refrigeración Crecimiento

Refrigeración + Aceite Crecimiento

Congelación UFC/ml

Arena UFC/g

Escherichia coli

B. subtilis

M. luteus

S. aureus

S. cerevisiae

P. aeruginosa L. delbrueckii

Rhizopus sp

Aspergillus niger

Penicillium sp

Determinar el % de reducción bacteriana del microorganismo (RBM)

5.1 Según el microorganismos que conservaste ¿Cuál es el mejor método para consérvalo?

5.1 Investiga otros métodos de conservación como la liofilización.

5.2 ¿Cual el papel del crioprotector?

5.3 Menciona el periodo máximo de conservación de cada uno de los métodos utilizados en la práctica

5.4 investiga la morfología colonial en la bibliografía del microorganismo que conservaste y el medio que utilizaste


Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los métodos de conservación

7. CONCLUSIONES

Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la

bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.


8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 10ª. Edición. Prentice-Hall.

España.

8.2 Prescott, H, Microbiología, Ed. McGraw-Hill, Interamericana, New York, 2004, 1005 p.

8.3 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª

Edición. Interamericana. México. 140 p.


62

8.4 NOM-181-SSA1-1998, salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios

que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo doméstico


63


64

PRÁCTICA No 7 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS (bacterias)

No. DE UNIDAD: V: Metabolismo

UNIDAD IV: Identificación Microbiana

1. OBJETIVOS:

Objetivo general

El alumno identificará bacterias de interés farmacéutico, a través de su metabolismo microbiano.


1.2.1 El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y sales orgánicas como principales fuentes de carbono.

1.2.2 El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para demostrar su actividad enzimática.

1.2.3 El alumno realizará pruebas para demostrar la actividad enzimática en los procesos de óxido-reducción.

2. INTRODUCCIÓN

El metabolismo es un proceso químico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de

compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los microorganismos son capaces de efectuar

reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a

este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según

su origen:

a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera).

b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea).

c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina).

d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios facultativos y

anaerobios estrictos).

La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias

y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en

género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada

especie.

En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a

una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que

detectan los cambios de pH o la presencia de un subproducto.

Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los

microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y

observar su morfología colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo

en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura óptima de

crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tinción de Gram para clasificarlo y

saber a qué grupo pertenece G+ ó G-. Además en la morfología microscópica permite conocer la forma

y agrupación del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.)


65

Recientes avances biotecnológicos son usados para el análisis microbiológicos. Las pruebas de

identificación bioquímica esta miniaturizada y automatizada haciéndose el análisis más rápido y

económico. Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen

enfermedades a cientos de personas causando daños económicos. Una vez aislados podemos medir

específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica aunque la

formulación de un producto con proteínas, aceites, ácidos grasos, conservadores hace que en un

momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano.

Algunos métodos utilizados para identificar grupos microbianos o microorgansimos (género y especie)

son:

Placa Petrifilm, Detección de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema

VITEK, Identificación por PCR, etc

En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioquímicas de manera

tradicional, ya que existen métodos “rápidos” que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el

fundamento.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Fermentación de carbohidratos (glc lac,

sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol,

sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base

CRF.

Fermentación de la glucosa, producción

de ácido sulfhídrico, producción de gas,

en el medio TSI

Descarboxilación de la lisina, en el

medio LIA

Movilidad, descarboxilación de la ornitina

y la producción de indo, en el medio MIO

Movilidad, producción H2S, producción de

indol, en el medio SIM

Prueba cuantitativa para la producción

de ácidos. Prueba de Rojo de metilo,

medio RM/VP

Producción de ureasa, en caldo urea

Producción de acetil metil carbinol.

Hidrólisis de la gelatina (licuefacción de

la gelatina), en el medio gelatina

Crecimiento en caldo nutritivo

Utilización de la esculina, medio de bilis

y esculina

Utilización del gluconato (oxidación),

medio caldo gluconato peptona

Requerimientos de oxígeno, condiciones

aerobias y anaerobias

Producción de Catalasa y oxidasa

Reducción de nitratos, en caldo nitrato.

Detección del metabolismo oxidativo

/Fermentativo, en el medio OF con

sacarosa

Utilización del citrato, en citrato de Sodio

Utilización de Malonato, en malonato

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Fermentación de carbohidratos (glc, lac, sac,

manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,

raf, ram, xilosa, etc.)

Fermentación de la glucosa, producción de

ácido sulfhídrico, producción de gas, medio

Crecimiento en bilis al 40 %

Coagulasa

Hidrólisis de gelatina (licuefacción de la

gelatina), en el medio gelatina


66

de TSI

Descarboxilación de la lisina, medio de LIA

Movilidad, descarboxilación de la ornitina y

la producción de indol, medio de MIO

Movilidad, producción de indol y producción

de ácido sulfhídrico, medio SIM

Producción Catalasa y oxidasa

Reducción de nitratos

Producción de hemólisis, en agar sangre

Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %

Sensibilidad a optoquina y bacitracina

Hidrólisis de la esculina, en caldo esculina

Producción de acetil metil carbinol, prueba

Voges – Proskauer, medio VP/RM

Producción de la fosfatasa, medio PDP

Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN

Crecimiento a 10 y 45 ª C

Reducción con azul de metileno en leche

Hidrólisis en caldo hipurato de sodio

Formación de cápsula

Hidrólisis de almidón,

Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura

para hacer una selección de pruebas recomendable y logras su identificación lo más rápido posible y sin

pérdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos

realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.

FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS

1 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de

almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.

2 PRUEBAS DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL

Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio,

produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene

rojo de fenol.

3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO (MedioTSI)

Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar

hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además

de la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como

sulfuro férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción

enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.

La fórmula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de

glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar está preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2

cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su

superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es

relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico

de flauta y el fondo, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a

fin de conservar este efecto de las dos cámaras. La técnica de inoculación es por picadura y por estría

en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y


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luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de

fenol y un pH ácido da una coloración amarilla y en un pH alcalino es rojo.

4. PRUEBA DE ROJO DE METILO

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es

cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos

láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen

muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos

organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h),

contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes

5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en

diacetilo por acción del KOH al 40 % y el O2 atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el -naftol

actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo, el indicador de pH es el Rojo de metilo.

Controles


Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp

UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS

6. PRUEBA DE CITRATO

Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de la fermentación o producción de

ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende

una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los

productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce

más acetato y formato con una disminución del lactato y CO2. Por encima del pH de 7 no hay

producción de lactato y los productos son CO2 ácido fórmico y ácido acético.

Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilización del

citrato. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas,

un organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono utiliza también las sales

de amonio como su única fuente de nitrógeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilización de

citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono

como fuente de carbono.

Controles


Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes


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7. PRUEBA DE MALONATO

Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono,

con la consiguiente alcalinidad.

El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido

fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso

de inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos

de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto

ocasiona un bloqueo en la oxidación del ácido succínico.

Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la

oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto

ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma

otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como

el ácido fumárico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, recurre al ciclo

del ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo.

Indicador de pH: Azul de bromotimol

Controles


Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis

8. PRUEBA DE UREASA

La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de

amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la

urea que está presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco

reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un

aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol.

Controles

Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli

HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:

9.- PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (MÉTODO DEL TUBO)

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son

detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Las proteínas que se producen son

demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas

a componentes más pequeños, las enzimas extracelulares de tipo proteolítico son secretadas por

ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El


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catabolismo de las proteínas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y

posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.

Controles


Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus

10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIÓN DE H2S E INDOL).

El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich,

para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la

turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de

sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del

tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA).

La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La

descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas

específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una

diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la

cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido

en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la

alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es

irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina

putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si

recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar

si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de indol nos sirve para

determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidación del aminoácido

triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos

indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuado por varias enzimas que en

conjunto se denomina “triptofanasa” y el indicador de pH es el púrpura de bromocresol.

Control

Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae

Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp

Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp

12. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR)

En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis.


70

La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La

descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas

específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una

diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa, la

cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido

en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la

alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es

irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina

cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si

recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se

deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3

cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, el inicador de pH es el púrpura de

bromocresol.

Controles:

Aminoácido Control positivo Control negativo

Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae

Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes

DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO

13. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS

La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada

para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos

biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.

Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar

nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo -

naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo -

- naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 s de añadir los reactivos y dado que los

reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es

necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn

reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la

presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.

Controles:

Prueba Control positivo Control negativo

Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus


71

14. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO

DE HUGH Y LEIFSON

Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa por vía fermentativa u oxidativa, los subproductos

de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de

fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son

sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación más sensible,

como el medio OF.

Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:

a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.

b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.

c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.

La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden

neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La

concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción

de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se

difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es

también apto para determinar la movilidad de un microorganismo.

La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden

no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas

pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación

final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se

inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm

desde el fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el

otro tubo “abierto al aire”, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o

más, el indicador de pH: Púrpura de bromocresol.

Interpretación.

Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto

Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde

Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo

No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde

Controles

Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp

15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO

Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga KCN.

La respiración es el conjunto de reacciones químicas en las que se libera energía. La transformación de

la energía puede ser aerobia o anaerobia. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación

– reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo


72

trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final

de electrones, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la

especie bacteriana y su sistema enzimático. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo

oxidasa a nivel del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con el O 2 y actúa como aceptor final

de electrones, bloqueando la respiración.

Controles


KCN Klebsiella Escherichia coli

16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA

Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena

respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema

citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la

prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son

anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser

enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de

Pseudomonas o Neisseria (positivas).

**Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de

electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en

presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.

La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:

1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las

colonias aisladas que se han desarrollado en la placa.

2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,

3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.

En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se

recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la

superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.

Controles:


Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli

17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA

Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias

aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se

descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una

hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno

de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja


73

acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido

de hidrógeno en agua y oxígeno en agua.

Controles


Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp

18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)

Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa.

Un resultado positivo constituye por lo común el criterio de diagnóstico de para la identificación de S.

aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida

por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 °C / 30 min. Esta enzima es una

proteína que es excretada al medio extracelular y se inactiva fácilmente por las enzimas proteolíticas.

19 HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)

La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la

fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran

variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración

final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. El medio

está libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas.

El tipo de hemólisis en agar sangre sirve para clasificar al género Streptococcus, la β hemólisis está

asociada con una completa lisis de la célula alrededor de la colonia, la hemólisis se asocia con una

hidrólisis parcial y se manifiesta por una coloración verde.

20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 %

Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentración de sales y se les

denomina halófilos, aunque existen otros que son denominados extremófilos ya que viven en

condiciones extremas y su hábitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal

hace que la célula se deshidrate debido a la ósmosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a

diversas adaptaciones fisiológicas que le permiten retener el agua para su metabolismo.


3.1. EQUIPO

Incubadora a 35 ° C

Microscopio

Autoclave

Horno

3.2. MATERIAL

Portaobjetos

Pipetas Pasteur

Gradilla metálica

Asas bacteriológicas

Colorantes para tinción de esporas

Colorantes para tinción de Gram

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:


74

Pruebas de cada uno para Gram positivos

Tinción de esporas

Hidrólisis de almidón

Hemólisis en agar sangre

Resistencia a polimixina de 300

Prueba de TSI

Prueba de SIM

Prueba de MIO

Licuefacción de la gelatina a 22 °C

Utilización del citrato

Prueba de oxidación –fermentación

Prueba de Voges Proskauer

Prueba de ureasa

Fermentación de glucosa

Fermentación de manitol

Fermentación de arabinosa

Fermentación de Xilosa

Fermentación de lactosa

Crecimiento en NaCl al 6.5 %

Prueba de reducción de nitratos

Prueba de catalasa

Prueba de oxidasa

Prueba de coagulasa

Pruebas de cada uno para Gram negativos

Hidrólisis de almidón.

Crecimiento en MacConkey.

Prueba de TSI.

Prueba de LIA

Prueba de citrato.

Prueba de MIO

Prueba de SIM.

Licuefacción de la gelatina

Prueba de oxidación-

fermentación.

Prueba de ureasa.

Prueba de reducción de nitratos.

Fermentación de glucosa.

Fermentación de lactosa.

Fermentación de sacarosa

Fermentación de manitol.

Fermentación Xilosa.

Rojo de metilo.

Prueba de Vogues Proakauer

Crecimiento en caldo KCN.

Prueba de malonato.

Prueba de catalasa y catalasa

3.4. REACTIVOS:

Solución de rojo de metilo

Solución de alfa-naftol

Solución de KOH

Reactivo de Kovac o Erlich

Solución de ácido sulfanílico

Solución de alfa naftilamina

Plasma de conejo

Tween 80 estéril

Plasma de conejo

Aceite mineral

Solución de peroxido de hidrogeno al 1 %

N,N,N,N-tetrametil-p-

fenilendiamina

Reactivos para tinción de Gram

Reactivos para tinción de esporas

Oxidasa

Catalasa

Jeringas de 10 ml

3.5. BACTERIAS:

Escherichia coli

Salmonella typhi

Proteus mirabilis

Pseudomonas aeruginosa

Shigella sp

Micrococcus luteus

Staphylococcus aureus

Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis

Corynebacterium glutamicum


75

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

A. Preparación del inoculo

a) Tomar un inoculo del cultivo para realizar una tinción de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la

morfología microscópica y determinar si esta puro, si es así continuar con la identificación, si no lo está

es necesario re-aislar.

b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solución salina estéril, colocar una asada del cultivo y

homogenizar perfectamente para obtener una suspensión microbiana.

c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioquímicas indicadas para Gram (+) o Gram (-)

d) Ordenar los tubos por la forma de inoculación y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores

Estría simple ( Citrato, placa con agar almidón, agar sangre)

Picadura y estría (TSI, LIA)

Picadura ( SIM, MIO, gelatina, OF )

Caldos (Fermentación de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reducción de NO3 ,KCN..)

e) De la suspensión microbiana sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa

o con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensión para que se estandarice un poco la cantidad

de inoculo.

f) Colocar una batería de bioquímicas como testigo

g) Incubar los tubos 24 horas y leer

h) La placa con agar almidón y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para

un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo.


76

B LECTURA DE PRUEBAS

PRUEBA

LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

RESULTADO

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

Hidrólisis de almidón

Agregar lugol sobre la estría

+ Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estría.

- Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estría.

Fermentación de manitol

+Positiva: El medio se torna amarillo con la producción de gas, la

campana está llena de gas

- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de lactosa

+ Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la

campana está llena de gas

- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de TSI Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa con producción de H2S

Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.

Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla

Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Producción de H2S positivo: Coloración negra en el medio.

Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado

del tubo ó desplazamiento del medio.

Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.

Producción de H2S ( - ): sin coloración.

Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.

Prueba de rojo de metilo

Agregar 2 gotas de rojo de metilo

+ Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo

(Producción de acetil-metil-carbinol).

-Negativa: No hay cambio en el color

Prueba de Voges-Proskauer

agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH

+Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.

- Negativa: El cultivo no cambia de color


77

PRUEBA


RESULTADO

UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS

Utilización de citrato de sodio

+ Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul

- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Utilización de malonato de sodio

Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).

Negativa: No hay desarrollo (medio de

Hidrólisis de urea Producción de ureasa

+ Positiva: Color rosa fucsia en el medio.

- Negativa: Sin cambio de color en el medio

HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

Licuefacción de la gelatina

Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco

minutos.

+ Positivo: licuefacción de la gelatina.

- Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar,

descartar la prueba negativa hasta los 14 días.

MIO (movilidad, indol y ornitina)

Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.

Descarboxilación de la ornitina:

+ Positiva: Color púrpura del medio.

- Negativa: Color amarillo del medio.

Después de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de kovacs y se observa:

- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo.

- Negativo: No se forma el anillo.

SIM (producción de H2S, indol y movilidad)

Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro

alrededor de la picadura o en todo el tubo

Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la

superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.

Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.

Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente negro.

LIA (Desaminación y descarboxilación de aminoácidos)

Desaminación de aminoácidos:

+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.

- Negativa: La superficie no tiene cambios.

Descarboxilación de aminoácidos

+ Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.

- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.


78

PRUEBA

LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO

METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO

Reducción de nitratos a nitritos

Agregar 3 gotas de naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico.

+ Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos

- Negativa: Sin cambio de color.

Prueba del cianuro de potasio

+ Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)

- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)

Prueba de citocromo oxidasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).

+ Positiva: aparición de un color azul violeta.

- Negativa: No hay cambio de color.

Determinación de metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa (OF)

TUBO SIN SELLO DE ACEITE

Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin

cambios.

TUBO CON SELLO DE ACEITE

Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin

cambios

Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin

cambios.

Prueba de la catalasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.

+ Positiva: Presencia de burbujas de oxígeno.

- Negativa: Ausencia de burbujas de oxígeno.


79

PRUEBA


RESULTADO

Prueba de la

coagulasa (Solo

para cocos Gram

positivos)

a) -Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo

con 0.5 ml de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC

durante 24 h.

b) Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus

y S. epidermidis como testigos positivo y negativo.

c) -En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior,

0.2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con

solución salina estéril.

d) -Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar

durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formación de

coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si

hay formación de coágulo.

e) Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo

se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de

plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-

15 s.

f) En caso de utilizar plasma de humano citratado o

heparina.

Positiva: Coagulación del plasma.

Negativa: El plasma esta líquido.

Hemólisis en

agar sangre (solo

para cocos Gram

positivos)

a) -En una placa con agar sangre estriar con la cepa

presuntiva de Streptococcus sp, al final de la estría enterrar el

asa en el medio, para crear un ambiente de microaerofilia.

b) Incubar durante 24 horas a 35 °C y determinar el tipo de

hemólisis que presenta.

Positiva: Hemólisis β transparente alrededor de la colonia.

Positiva: Hemólisis color verde tenue alrededor de la colonia.

Negativa: Sin cambio de color en el medio.

Crecimiento en

NaCl AL 7.5 %

Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h, después de este tiempo

registrar la turbidez.

Positiva: Turbidez del medio.

Negativa: Sin cambio de color en el medio.


80


Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografía y a la información obtenida durante el

desarrollo de la práctica menciona el género y si es posible la especie del microorganismo.

Nombre del microorganismo: ______________________________________________________

5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las

pruebas de hidrólisis del almidón.

5.2. Explicar por qué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se

emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad.

5.3. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares?

5.4. ¿Cuál es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilización de sales orgánicas y cuál

es su intervalo de sensibilidad?

5.5. Explicar cuál es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos

microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos?


Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el aislamiento de los microorganismos,

la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de

los microorganismos.

7. CONCLUSIONES

7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la


7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.


8.1 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica

Panamericana. 2001. México. 1432 p.

8.2 Mac Faddin. Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición.

Médica panamericana. Buenos Aires. 850 p.


81

Tablas de Cowan para la identificación de microorganismos

Tabla No. 1 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram positivas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Forma S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R

Acido resistencia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - w +

Esporas - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - -

Movilidad - - - - + - - + - - + - - - - - D D - - -

Crecimiento aerobio + + + + + + - + + + + + + - - - - + + + +

Crecimiento anaerobio - + w w + + + - + + + + - + + + + D - - x

Catalasa + + w - - - - + + + + - + + - - - + + + +

Oxidasa - - - - - - - - - - - - x x x x x d - - -

Glucosa (prod. acido) D + + + + + +/- - - + + + + + + - D D + + +

O / F O/- F F F F F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT

Micrococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Staphylococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Aerococcus + + · · · · · · · · · · · · · · ·

Streptococcus · · · + + · · · · · · · · · · · · · · ·

Pediococcus · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·

Gemella · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·

Cocos anaeróbicos* · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · ·

Kurthia · · · · · · · + · · · · · · · · · ·

Corynebacterium · · · · · · · + + · · · · · · · · · ·

Listeria · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Erysipelothrix · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Lactobacillus · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Arachnia · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Rothia · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Propionibacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Actinomyces · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Bifidobacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Eubacterium · · · · · · · · · · · + + · · · ·

Clostridium · · · · · · · · · · · · · · <> <> + · · · ·

Bacillus · · · · · · · · <> <> <> · <> · · · · + · · ·

Nocardia · · · · · · · · · · · · · · · · · · + +

Mycobacterium · · · · · · · · · · · · · · · · · · +


82

Tabla No. 2 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram negativas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Forma R S S S S/R R R R R R R R R R R R R R

Movilidad - - - - - - + + - + - - + D - - + -

Crecimiento aerobio - - + + + + + + + + + + + + + -* - +

Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - + + + + + + + - +

Catalasa d D + + + + + + + + + - + + D - D -

Oxidasa - x + + - + + + + + + + + - - + + -

Glucosa (prod. acido) D - + - + - + - + + + + + + D - - +

Carbohidratos [f/o/-] F/- - O - O - O - O O F F F F NT - - F

Bacteroides + · · · · · · · · · · · · · · · ·

Veillonella + · · · · · · · · · · · · ·

Neisseria · + · · · · · · · · · · · · ·

Branhamella · + · · · · · · · · · · · · ·

Acinobacter · + · · · · · · · · · · · ·

Moraxella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Brucella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Bortedella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Chromobacterium lividum · · · · · · + · · · · · · · · ·

Alvaligenes · · · · · · + · · · · · · · · ·

Flavobacterium · · · · · · + · · · · · · · · ·

Pseudomona · · · · · · · · · + · · · · · · · ·

Actinibacillus · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Pasteurella · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Necromonas · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Cardiobacterium · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Chromobacterium violaceum · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Benecktea · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Vibrio · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Plesiomonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Aeromonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Enterobacterias · · · · · · · · · · · · · + · · · ·

Haemophilus · · · · · · · · · · · · · · +

Eikenella · · · · · · · · · · · · · · +

Campylobacter · · · · · · · · · · · · · · +

Streptobacillus‡ · · · · · · · · · · · · · · +

Mycoplasmas · · · · · · · · · · · · · · +


83

Tabla No. 3. Equivalencias de los símbolos utilizados en las Tablas 1 y 2.

Significado Símbolo

Tabla No. 1

* Peptococcus, Peptostreptococcus (también Leuconostoc)

También Actinomyces odontolyticus

D Reacciones diferentes en distintas especies del género

d Reacciones diferentes en distintas cepas

F Fermentación

O Oxidación

w Reacción débil

x No se conoce

<> Variantes no esporágenas

Formas típicas

Presentan algunas características comunes

S Cocos

R Bacilos

NT No probada

Tabla No. 2

* Crecimiento en aire + CO2

Crecimiento en oxígeno 5-6%

‡ También Shigela dysenteriae

Forma típica

x No se conoce

Presentan algunas características comunes

NT No probada por métodos comunes

Para ambas tablas

+ Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte)

d Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas)

- Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas ó algunas)

( ) Reacción tardía en la prueba o crecimiento tardío

(d) Reacciones positivas tardías en diferentes cepas

(w) Reacción débil y tardía

w/- Reacciones débiles y crecimiento escaso en diferentes cepas

D Reacciones diferentes en distintos grupos (géneros, especies y variedades)

· No se conoce Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University 1974. pp167.


84

PRÁCTICA No 7 (parte b) IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

1. OBJETIVOS


El alumno identificará mohos filamentosos y levaduras de una muestra.


1.2.1 El alumno identificará un moho por medio de la técnica Ridell (microcultivo).

2.-INTRODUCCIÓN

Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscópicos, y la mayoría viven en el suelo

como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición, manteniendo así la fertilidad de los suelos.

Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies

causan enfermedades en las plantas, por las que se producen pérdidas económicas en la agricultura.

En la industria farmacéutica algunos mohos son utilizados para obtener antibióticos, como la penicilina a

partir del género Penicillium.

En el campo de la elaboración de alimentos y la biotecnología, los mohos microscópicos se utilizan para

elaboración de cerveza, vino, pan, maduración de quesos, producción de diversos ácidos orgánicos,

etc.

Los mohos también se pueden usar, por ejemplo, en la degradación de hidrocarburos en el caso de

derrames de petróleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina.

También es relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias tóxicas al crecer en alimentos.

MORFOLOGÍA DE LOS MOHOS

Se les llama también Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmóviles la mayor parte de ellos.

Los mohos mi8croscópicos pueden ser:

1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras.

2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas células.

Tanto las levaduras como los mohos presentan células eucariotes, es decir, con cromosomas múltiples,

membrana nuclear bien definida, mitocondrias, retículo endoplásmico y pared celular.

Son microorganismos que contienen paredes celulares rígidas hechas de glucógeno, de celulosa o de

quitina o mananas. Además la membrana celular fúngica, a diferencia de la bacteriana, presenta

esteroles. Estos microorganismos carecen de clorofila y son heterótrofos.

El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama

hifa, al conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto

que presentan las colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas

coloraciones que abarcan toda la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas

pueden tener septos o carecer de ellos con base en esta característica, se clasifican en:

1) Mohos con micelio cenocítico : son los que carecen de septos o tabicaciones

2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las células.


85

Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones más delgadas o anchas. El diámetro va desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta varios metros. En algunas formas superiores de mohos, las hifas están pegadas juntas para formar cuerpos fructiferos grandes, de estructura compleja, formado los llamados mohos carnosos o macroscópicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones, todos los mohos siguen siendo microorganismos “primitivos”, debido a su especialización en tejido es reversible.

En cuanto a su función, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:

1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.

2) Hifa o micelio aéreo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen estructuras de reproducción.

Muchos mohos patógenos presentan dimorfismo, desarrollándose como formas de aspecto de levadura o como micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37º C en el cuerpo humano, se pueden presentar como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25º C presenta forma de moho con micelio y esporas asexuales.

REPRODUCCIÓN

Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas

para la propagación del moho y están capacitados para soportar condiciones adversas del medio

ambiente, sin embargo son más sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas

fúngicas pueden formarse asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A

continuación se muestran la clasificación de estas esporas:

Esporas asexuales:

I.- Talosporas:

a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentación de hifas generalmente son rectangulares con doble pared gruesa.

b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemación a partir de una célula preexistente; una vez que la yema ha alcanzado su máximo desarrollo se separa de la célula madre y en este estado o todavía unida, produce un nuevo brote, pudiéndose formar un pseudomicelio.

c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células aumentan de tamaño y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que les confiere gran resistencia.

II.- Conidiosporas.

Son esporas producidas libremente, por segmentación de las puntas de unas hifas especializadas, llamadas conidioforos.


86

a) Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan diversidad de tamaños, formas y colores. Son producidas por los conidióforos, mediante el estrangulamiento sucesivo.

b) Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias pueden dividirse en dos o más células por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de clava. La forma de estas estructuras varía, según el género.

III.- Esporangiosporas.

Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangióforo.

Esporas sexuales

I.- Cigosporas o Zigosporas:

Espora que surge cuando dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genéticos, desarrollándose paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotálicas (ambas provenientes de la misma colonia o talo), o heterotálicas (provenientes de dos talos distintos).

II.- Ascosporas.

De la fusión de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las ascosporas se desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho ascosporas.

III.- Basidiosporas

De la fusión de los gameto masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior están las basidiosporas; se desarrollan en grupo de cuatro como carácter atípico a partir de los extremos de estructuras en forma de maza, que debido a su forma reciben el nombre de basidios.

IV.- Oosporas

Esporas que surgen de la unión de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio (gameto femenino), y que van a producir una sola oospora.

FISIOLOGÍA DE LOS MOHOS MICROSCÓPICOS.

Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son heterótrofos. Al faltarles la clorofila

lógicamente no llevan a cabo fotosíntesis, y comparándolos con las bacterias, los mohos en general

tienen requerimientos nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metabólicos y de

biosíntesis los llevan a cabo por las vías más comunes. Por lo tanto pueden vivir en condiciones más

severas que otros microorganismos, casi en cualquier sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos,

mermelada, frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.

El pH óptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad pero también resisten la

falta de agua. Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura óptimo de 22 a 30º C.

Algunos mohos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorando carne a 0º C

(mohos psicrófilos), o crecimiento a 62 ºC (mohos termófilos).

Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón o

celulosa. Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizar los mohos son: nitrógeno orgánico, nitrógeno

inorgánico y nitratos. Algunos iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.

De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no están pigmentadas o dematiáceas

cuando poseen con color café oscuro


87


3.1 MATERIAL

Pipetas de 1 ml

Bisturí

Mechero

Caja de Petri con Varilla en forma de “V” con porta y cubreobjetos estériles.

Asa micológica

3.2 EQUIPO

Autoclave

Incubadora a 28°C y 35 °C

Horno a 170°C

Microscopio

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Tubos con PDA inclinado

Caja de Petri con PDA (para microcultivo)

Matraz con 50 ml de glicerol al 10 % estéril

Matraz con 50 ml de formaldehído al 10 %

Rafinosa al 10 %

Tubos de ensaye de 13 X 100 con campana de Durham con los azucares siguientes

Glucosa 10 %

Lactosa al 10 %

Maltosa al 10 %

Sacarosa al 10

3.4 CEPAS DE MOHOS Placas con cultivo de:

Penicillium sp

Rhizopus sp

Aspergillus niger

S. cerevisiae


4.1 MORFOLOGÍA COLONIAL DE MOHOS

Observar la morfología colonial de los mohos que están en la placa y reportar tamaño, forma, aspecto, además de observar si hay pigmento difusible.

4.2 IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (microcultivo)

a) De una caja de Petri con PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 5 mm de espesor con un bisturí estéril.

b) Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en una caja de Petri (Todo esto previamente esterilizado).

c) Tomar con el asa el inóculo del moho al cual se quiere identificar.

d) Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.

e) Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera.

f) Adicionar a la caja 10 ml de glicerol al 10 %

g) Cerrar la caja de Petri e incubarla a 28 °C.

h) Realizar observaciones mínimo cada 24 horas para identificar los cuerpos fructíferos.

i) Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar las estructuras de

reproducción, quitar el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en el benzal.

j) Adicionar 10 ml de formaldehído al 40 % para inactivar el moho por 15 minutos.


88

k) Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo

sobre un portaobjetos que contenga una gota se azul de algodón lactofenol, sellar la preparación con

barniz de uñas transparente.

l) Desprender con cuidado el cuadro de agar y depositarlo en la caja de Petri, colocar una gota de

azul de algodón lactofenol donde estaba el cuadro de agar y colocar un cubreobjetos

m) Si re requiere la preparación con barniz

n) Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10 y 40 X.

o) Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras

reproductivas e identificar el moho.

4.3 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS

a. De la suspensión proporcionada realizar un frotis, fijarlo con calor y realizar una tinción simple.

b. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de 10 y 40 X

c. Dibujar la levadura que se observó.

4.4 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS POR ASIMILACIÓN O FERMENTACIÓN DE AZUCARES.

Se utiliza para identificar diversos géneros y especies fúngicas, principalmente levaduras y algunas

bacterias pertenecientes a los Actinomycetes, con base en sus capacidad de fermentar azucares.

a. De la suspensión a la que se le hizo la tinción simple y si resulto ser una levadura

b. Inocular una gota a cada tubo que contiene diferentes azucares.

c. Incubar de 24 – 48 h y observar la fermentación o asimilación del carbohidrato y comparar los

resultados que se buscarán en la bibliografía como la siguiente tabla.

d. Identificación de levaduras del género Candida.


89

Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa C. albicans + + - + - + C. tropicales + - + + - + C. glabrata + - - - - + C. guilliermondi + - + + - + C. parapsilosis + - - + - + C. krusei + - - - - - C. kefyr + - + + + + C. lipolitica + - - - - - C. zeylanoides +* - - - - - 4 RESULTADOS Y CUESTIONARIO.

5.1 Dibujar la levadura observada al microscopio

4.2 Dibujar las estructuras de reproducción del moho

5.5 +Anota el nombre del moho identificado ____________________________

5.6 Anotar la composición y utilidad de los medios de cultivo: Saboraud, agar de papa y dextrosa y agar rosa de bengala

5.7 Porqué es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos?

5.8 Cuál es la función del glicerol y el formaldehído en un microcultivo?

5.9 Cómo identificarías un moho contaminante en un producto biotecnológico?

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir las características de cada grupo de mohos, así como su importancia microscópica en la naturaleza.

7 CONCLUSIONES

7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada.

8. BIBLIOGRAFÍA

8.1 Koneman, E:W:& Morrison; Micología, Diagnóstico de Laboratorio, Edito.. Médico Panamericana 1991.

8.2 Tortora, J. Gerard; Introducción a la microbiología, Editorial Acribia, 1993


90

Esquemas de mohos y levaduras

RPS


91


92


93


94


95


96

PRACTICA No. 8

CRECIMIENTO MICROBIANO

UNIDAD V: Crecimiento y cinética microbiana.

I. OBJETIVOS

El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular.

1.2 Objetivos Específicos

1.2.1 El alumno llevará a cabo una proliferación de crecimiento celular de de Escherichia coli en cultivo sumergido y agitación (fermentación) a nivel matraz por 24 horas.

1.2.2 El alumno cuantificará el número de microorganismos viables a través del recuento por diluciones y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias (UFC).

1.2.3 El alumno estimará el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría.

1.2.4 El alumno cuantificará el número de microorganismos por cuenta directa con la técnica de conteo en cámara de Neubauer.

1.2.5. El alumno comparará los resultados obtenidos con CGS y caldo Luria, para determinar el mejor medio de cultivo en función de la cantidad de masa celular producida.

2. INTRODUCCIÓN

Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de microorganismos o poblaciones de miles de millones.

Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento.

Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células, la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente.

El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique, es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres horas.

Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido.

Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.

Los métodos recomendados para medir la población son:

Recuento en placa

Siembra por vaciado en placa.

Filtración

Diluciones seriadas.

Siembra por extensión con varilla

Método del número más probable


97

Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer).

Hay otros 3 métodos llamados indirectos.

1.- Turbidimetría. 2.- Actividad metabólica. 3.- Peso seco.

Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de conteo celular, por ejemplo la cámara de Neubauer, y un microscopio.

Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana.

Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares.

Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empieza a crecer y/o a producir algunos metabolitos.

Fase del crecimiento

En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH, concentración de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente.

Parámetros de la curva de crecimiento

Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multiplicación de la masa, nos interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.

La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = Xmax

- X0

La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X

0 y X

t en los tiempos t

0 y t, en la fase de

crecimiento exponencial según

Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido.

Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable por la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y por turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su extinción, en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro.


98

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1.- MATERIAL

Un matraz con 100 ml de caldo Luria estéril (matraz semilla)

Un Matraz de 500 ml con 100 ml de caldo Luria estéril y/o caldo glucosa sales

Dos celdas y un portaceldas

• Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles

Un matraz de 1 L con 600 ml de agar cuenta estándar (para el vaciado en placa)

120 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de solución salina (para las diluciones)

40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en placa)

Una pizeta con benzal

3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

NaCI ó peptona

Caldo Luria

Agar cuenta estándar

Caldo glucosa sales al 5 %

3.3.- EQUIPO

Espectrofotómetro

• Autoclave

• Horno

• Incubadora a 37° C

• Contador de colonias

• Cámaras de Neubauer

3.4.- CEPAS:

Suspensión de Escherichia coli Suspensión de Saccharomyces cerevisiae

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL

ENSAYO DE LOS MÉTODOS (PRIMERA SESIÓN)

4.1 TURBIDIMÉTRIA. Para este primer ensayo no es necesario trabajar en condiciones de esterilidad

De la suspensión de S. cerevisiae, seguir las indicaciones del profesor para leer la absorbencia en el espectrofotómetro.

a) Colocar en el espectrofotómetro una portacelda y bloquear el paso de luz

b) Encender el espectrofotómetro y dejarlo calentar por 5 minutos, seleccionar la longitud de onda (540 nm) y la región visible

c) Colocar en una celda espectrofotométrica 3 ml de caldo Luria, este tubo será el blanco

d) En la otra celda colocar aproximadamente 3 ml de la suspensión a leer

e) Limpiar con papel sanitario la celda, tomarlo con los dedos por la boca del tubo y colocar el blanco en el portacelda. Acomodar la portacelda para dejar pasar la luz y ajustar a cero de absorbencia.


99

f) Una vez ajustado a cero, bloquear el paso de luz e insertar la celda de la suspensión a leer, previamente limpiada con papel sanitario.

g) Cuando la lectura se estabilice más o menos 3 segundos, tomar la lectura.

h) Bloquear el paso de luz y retirar la celda, vaciar el contenido en un recipiente con benzal y enjuagar la celda dos o tres veces con benzal.

i) Una vez leída la muestra, apagar el espectro y retirar la portacelda.

Nota: Las celdas nunca se lavan con escobillón, no se colocan en una gradilla, para ello se entregaran en un vaso

4.3 CUENTA DIRECTA EN CÁMARA DE NEUBAUER

a) Tomar la cámara y limpiarla con una torunda impregnada con alcohol, con mucho cuidado, ya que el cuadriculado al frotarlo bruscamente se puede borrar.

b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el cubreobjetos (cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cámara.

c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cámara y el portaobjetos, para que por cohesión se llene la cámara, La cámara de Neubauer es una cámara de conteo. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada le corresponde a un mm2. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el volumen es de 0.1 mm3, es decir 0.1 µl.

d) Colocar la cámara en la platina y enfocar con 10 y 40 X

e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A,B.C y D, sumar los valores obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por 10 000 y las unidades son células/ml.

f) Retira la cámara, límpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de en medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el número de células, sumarlos y obtener el promedio, después multiplicar por 25 y luego por 10 000, obteniéndose No. de células/ml.

4.3 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA

a) La muestra se toma en condiciones de esterilidad, tomar 1 ml del matraz cinética y colócalo en

un tubo que contenga 9 ml de solución salina, para realizar la dilución 10-1

. Mezclar el tubo según las recomendaciones de la NOM 110 y tomar 1 ml, colocarlo en otro tubo con 9 ml de solución salina para

obtener la dilución 10-2

y así sucesivamente.

b) El número de diluciones que realices depende del crecimiento que encuentres por turbidimetría

o en el conteo directo, si el conteo es del orden de 1x106

, entonces realiza hasta las diluciones 10-6

y


100

10-7

. Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones, recordemos que debemos tener un intervalo de conteo

4.4 CUENTA VIABLE

a.- Recordar la técnica de vaciado en placa, según la NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.


101

SESIÓN II

Organización de las cinéticas: Se realizarán 4 cinéticas en todo el grupo con las siguientes consideraciones

Cinética A Cinética B Cinética C Cinética D

Equipos 1,2 y dos alumnos del equipo 5

Equipos 3 y 4 y un alumno del equipo 5

Equipos 6,7 y dos alumnos del equipo 10

Equipos 8 y 9 y un alumno del equipo 10

150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5%

Volumen del inóculo Si la As es de 0.8-0.9

10 ml 10 ml 10ml

4.5 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA (DIA 1 y generalmente lo hace el profesor) a) Inocular en condiciones de esterilidad un matraz conteniendo 50 ml de caldo Luria estéril con 2.5 ml de una suspensión de Escherichia coli de 18 horas de cultivo.

b) Incubar a 35° C por 18 h en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla.

4.6 PREPARACIÓN DEL MATRAZ CINETICA (DIA 2)

Trabajo para el profesor

a) El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez y de acuerdo a este valor indicará a los alumnos cuanto inocular en su matraz cinética

b) De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza.

4.7 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA

Trabajo para los alumnos

1.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo Luria o CGS del matraz de cinética y colocarlo en la celda espectrofotomérica y colocarle parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada lectura).

2.- Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar el volumen indicado por el profesor que puede ser 5 o 10 ml de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el matraz con caldo Luria o CGS para la cinética y mezclar perfectamente, anotar este tiempo (t0)

3.- Con una pipeta de 5 ml estéril tomar 5 ml inmediatamente y dar el matraz a un compañero para que lo lleve a incubar y agitar. El alumno que tiene la pipeta con la muestra realizará lo siguiente en este orden:

a.- Colocar 1 ml en un tubo de dilución y darle el tubo a otro compañero para que realice las

diluciones pertinentes, según el cuadro de diluciones, siguiendo las recomendaciones de la

NOM 110, sembrará las dos últimas diluciones por la técnica de vaciado en placa siguiendo las

recomendaciones de la NOM 092. Dejar solidificar e incubar.

Una vez depositado el ml en el tubo de dilución se puede apagar el mechero

b.- Tomar la otra celda espectrofotométrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda

en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dará a un compañero para que

realice la lectura en el espectrofotómetro. (Esta segunda celda no es necesaria sanitizarla)


102

d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cámara de Neubauer y dársela al

compañero que va a realizar el conteo en el microscopio.

e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla y

desechar la pipeta en el benzal.

f.- Este procedimiento se hace según el cuadro de tiempos de toma de muestra

g.- Incubar las placar a 35°/ 24 h y realizar el conteo


5.1 Anota los resultados obtenidos. As del matraz semilla: _________

Tiempo Tiempo real en min Absorbencia 540 nm Cuenta directa UFC / ml

To

T1

T2

T3

T4

T5

T7


103

5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de UFC/ ml.

Tiempo Conteo Promedio Resultado

To Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T1 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =


Placa 2 =

5.3.3 ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas? 5.3.4 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes zonas de crecimiento.

5.3.5 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo (horas).

5.3.6. Construye una gráfica del log del número de UFC/ml vs Absorbencia.

5.3.7 Determina la velocidad específica de crecimiento máxima.

5.3.8 Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada.

5.3.9 Define el término velocidad específica de crecimiento

5.3.10 Menciona los factores de que depende la fase de muerte

5.3.11 ¿Por qué es importante la cinética microbiana?


104


6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados.

6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los resultados obtenidos en esta práctica.

6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de

turbidimetría y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué

podrá servir.

7. CONCLUSIONES

Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la


8. BIBLIOGRÁFIA

8.1.- Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pág.

8.2.- Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss, USA. 715 pág.

8.3.- Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biología de los Microorganismos. Octava edición. Prentice Hall, España. 956 pág.

8.4.- Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall. 1998. Principles of Fermentation Technology. Second edition. Pergamon Press, Oxford. 376 págs.

8.5.- Reina, Manuel. 2003. Contaje de células: cámara de Neubauer. Departamento de Biología Celular. Universidad de Barcelona. Última actualización 20 de octubre de 2003.


105

PRACTICA No. 9

EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUÍMICOS SOBRE EL CRECIMEITNO MICROBIANO

1. OBJETIVOS

1.1. Objetivo general

Al término de la práctica el alumno determinará:

1.1.1 La influencia de algunos factores ambientales sobre el crecimiento de algunos microorganismos.

1.2. Objetivos específicos.

1.2.1 Determinar el PTM y TTM) de algunos microorganismos.

1.2.2 Determinar el efecto de la presión osmótica, pH, metales pesados y temperatura sobre el crecimiento de los microorganismos.

1.2.3 Determinará el efecto de un inhibidor sobre el crecimiento de un microorganismo.

1.2.4 Realizará una pasteurización como una aplicación de un proceso térmico.

2. INTRODUCCIÓN

Cada microorganismo tiene sus propias necesidades, características de su propio crecimiento en un medio ambiente por lo que determinado factor fisicoquímico lo afectara dentro de límites diferentes. Dentro de los principales factores fisicoquímicos que afectan el desarrollo microbiano se encuentran:

-Temperatura

-Presión osmótica

-Potencial de hidrógeno

-Potencial de oxido reducción

GRUPO TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO

Psicrófilas 5°C aproximadamente

Mesófilas de 20 a 45 °C

Termófilas 55°C y mayores

El calor es uno de los factores físicos más utilizados para esterilizar y desinfectar, como el calor es tan eficaz para destruir a los microorganismos, es esencial disponer de una medida precisa de su eficacia termodestructiva. Inicialmente, esta eficacia se expresaba con el punto de muerte térmica (PTM), la temperatura más baja a la que una suspensión microbiana se destruye en 10 minutos. En la actualidad se emplea más el término de tiempo de muerte térmica (TMT) el cual se define como el tiempo más corto necesario para destruir todos los organismos de una suspensión microbiana, a una temperatura especifica y en condiciones definidas. Sin embargo esta destrucción es logarítmica y en teoría no es posible destruir completamente los microorganismos de una muestra, incluso aumentando el tiempo de calentamiento, por ello de tiempo de reducción decimal (D) o valor D es más preciso.

Cabe señalar que el crecimiento es el resultado de un conjunto de actividades metabólicas del microorganismo, así que se puede estudiar el efecto de los factores fisicoquímicas sobre el crecimiento, o sobre alguna actividad microbiana.

Las bacterias móviles reaccionan frente a estímulos químicos y en algunos casos huyen de estos, a la respuesta frente a este estímulo se le llama quimiotaxis.

EFECTO DEL pH


106

Los iones H y OH son los iones más móviles, por ello pequeñas modificaciones en su concentración tiene consecuencias graves, la mayoría de los microorganismos tienen un pH cercano a la neutralidad, pero existen otros que están en el intervalo alcalino (microorganismos alcalinófilos) y otros en el intervalo ácido (microorganismos acidófilos)

EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

Los microorganismos osmófilos y Xerófilos pueden descomponer los alimentos, los microorganismos osmófilos crecen óptimamente en medios con una elevada concentración osmótica, mientras que los xerófilos prefieren un medio con baja Aw.

Los microorganismos halófilos se han adaptado bien a crecer a levados niveles de cloruro de sodio

ACTIVIDAD DE AGUA

Los microorganismos se diferencian entre sí por el contenido de agua, para poder comparar las disoluciones acuosas y las sustancias sólidas desde el punto de vista del agua disponible se recurre a la actividad acuosa Aw. Este parámetro hace referencia a la fase de vapor de agua que se encuentra en el equilibrio con un material sólido.

EFECTO DE LOS METALES PESADOS

Los iones metales como el Hg, Ag, Zn, y Cu se han empleado como germicidas, muchos metales pesados son utilizados como bacteriostáticos que bactericidas.

Los metales pesados se combinan con las proteínas, a menudo con los grupos sulfhidrilos, inactivándolas, también pueden precipitar las proteínas.

EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS.

El yodo y el cloro son los principales agentes antimicrobianos, el yodo se utiliza como antiséptico al oxidar los constituyentes celulares y formar compuestos de yodo con las proteínas celulares. El cloro es un desinfectante que se emplea ampliamente, puede aplicarse como gas cloro, hipoclorito sódico, o hipoclorito cálcico produciendo ácido hipocloroso (HClO) y posteriormente oxígeno.

EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS.

Los fenómenos de transferencia genética y la aparición de mutantes en las bacterias Gram + y -, han dado lugar a la aparición de cepas resistentes a uno o varios antimicrobianos, esto lleva a la necesidad de conocer un patrón de susceptibilidad de las cepas. La prueba se fundamenta en que al colocar un disco impregnado con determinada cantidad de antimicrobiano sobre un medio sólido inoculado con el microorganismo de prueba.

RADIACIONES

Las más utilizadas son los rayos UV, X y gamma, la luz Uv (260 nm) es absorbida por los ácidos nucleicos formando dímeros de timina, las otras dos radiaciones deben su acción a la formación de radicales OH que disocian a la mayoría de las moléculas, y se utilizan generalmente para esterilizar alimentos.

DETERGENTES

Son moléculas que actúan como agentes humectantes y emulsionantes porque poseen tanto extremos hidrófilos polares como hidrófobos no polares, debido a su naturaleza antipática solubilizan residuos insolubles y son agentes limpiadores muy eficaces.

3. EQUIPO, MATERIAL., MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS MICROBIANAS

3.1. MATERIAL

Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml estériles.

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo

Cajas Petri con Agar cuenta estándar

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivos pH 3,5

Tubos de 16 x l50 mm con 5 ml de caldo nutritivo


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Placas con agar nutritivo

20 ml de leche en punto de venta (establo)

Tubos con 9 rnl de agua peptonada al 0. 1%

Matraz de 150 ml con Agar bilis rojo violeta

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo con 1% de cloruro de sodio

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo con 5% de cloruro de sodio

Discos de papel filtro de 1 cm de diámetro

Cajas de Petri estériles

a pH 7,0

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo a pH 9,0

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo con 0,85 % de cloruro de sodio

Pinzas de disección

Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito de sodio

Discos de papel filtro impregnados con yodo

Antibiogramas para Gram positivos y Gram negativos

3.2. EQUIPO

Una estufa a 28°C

Un baño María a 28°C










Un termómetro

Un incubadora a 35°C

Un incubadora a 28°C

Una autoclave

Horno


Sacharomyces cerevisiae

Bacillus subtilis

Pseudomonas sp

Escherichia coli

Aspergillus. niger

Micrococcus luteus


4. 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO

a. Se emplearan los siguiente microorganismos: Pseudomonas sp, Escherichia coli y B. subtilis

b. Hacer una suspensión del microorganismo con el que se va a trabajar

c. Etiquetar una serie de 4 tubos conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo con las siguientes temperaturas. 5, 28, 35 y 55°C. Anotar también el nombre del microorganismo que se inoculará

d. Inocular cada uno de los tubos con 0,1 ml de la suspensión microbiana e incubar los tubos a la temperatura correspondiente durante 24 h. Dejar un tubo sin inocular que servirá como testigo negativo del medio.

e. Después de este tiempo observar si hay o no crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+) dependiendo de cuanto crecimiento se observe, si no hay crecimiento con un signo (-).

4.2. DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL (PTM)

a. Etiquetar una serie de 6 de 13 x l00 tubos conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo (CN), con las siguientes temperaturas: 35°C, 50°C, 60°C 70°C, 80°C y 92°C.


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b. Inocular cada tubo con 0,1 ml de la suspensión microbiana

c. Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos a baño María y colocar 0,1 ml del primer tubo sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y homogeneizar con una varilla de vidrio estéril

d. Realizar la misma operación con los otros tubos. Incubar las placas durante 24 h a 25°C para Pseudomonas sp, a 35°C para E. coli y B. subtilis. Al cabo de las cuales determinar el número de unidades formadoras de colonias

En caso de no requerir conocer las UFC, observar la turbidez del tubo y con cruces anotar de la menor turbidez a la mayor, posteriormente dividir una placa en 7 fracciones más o menos equidistantes y en cada una de las fracciones sembrar por estría simple para observar solo ausencia o presencia de crecimiento.

4.3. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO TÉRMICO MORTAL (TTM)

a. Etiquetar una serie de 7 tubos de 13 x 100 conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo con los siguientes tiempos 5, l0, 20 y 30 min.

b. Inocular cada tubo con 0, 1 ml de la suspensión microbiana

c. Calentar las suspensiones a 70°C en un baño María durante los tiempos indicados

d. Colocar 0,1 ml de cada tubo sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y homogeneizar con una varilla de vidrio estéril

e. Incubar las placas durante 24 h a 25°C para Pseudomonas sp y a 35°C para E. coli y B. subtilis.

f. Una vez pasado este tiempo determinar el número de unidades formadoras de colonias por ml.

En caso de no requerir conocer las UFC, observar la turbidez del tubo y con cruces anotar de la menor turbidez a la mayor, posteriormente dividir una placa en 7 fracciones más o menos equidistantes y en cada una de las fracciones sembrar por estría simple para observar solo ausencia o presencia de crecimiento.

4.4. PASTEURIZACIÓN

a. A) Determinación de organismos conformes y mesofílicos aeróbicos en leche sin pasteurizar De la leche sin pasteurizar realizar una dilución colocando 10 ml en 90 ml de agua peptonada al 0,1% y hacer diluciones en tubos con 9 ml con agua peptonada al 0,1% hasta la dilución 10 -2

b. Hacer determinación de Organismos conformes y mesofílicos aerobios como se indica en el esquema.

c. B) Pasteurizar la leche colocándola a una temperatura de 63°C durante 30 minutos después de este tiempo enfriar rápidamente en baño de hielo por cinco minutos y realizar determinación de microorganismos coliformes y mesofílicos aerobios como se indica en la figura


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d Determina el número de UFC según la NOM para leche en punto de venta y leche pasteurizada.

FACTORES FISICOQUÍMICOS.

4.5. EFECTO DEL pH

a. Se emplearan las cepas de Bacillus subtillis, Sacharomyces cerevisiae, y Escherichia coli

b. Hacer una suspensión del microorganismo que se va a trabajar en un tubo con agua destilada estéril

c. Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH

d. Marcar los tubos con el nombre de la cepa que se va a estudiar

e. Homogeneizar la suspensión e inocular con 0,1 ml cada uno de los tubos. Incubar los tubos a 35°C para bacterias y a 28° C para levaduras durante 3 a 5 días.

f. Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento según la turbidez para los diferentes pH.

4.6. EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA SOBRE EL CRECIMIENTO

a. Se emplearan las cepas de Bacillus subtillis, Sacharomyres cerevisiae, y Escherichia coli

b. Hacer una suspensión del microorganismo con el que se trabajará

c. Colocar en una gradilla una serie de tubos que contienen 5 ml de caldo nutritivo con diferentes concentraciones de cloruro de sodio (0,85 %, 1, 3 y 5 %)

d. Homogeneizar la suspensión e inocular con 0,1 ml cada uno de los tubos.

e. Incubar las bacterias a 35°C y las levaduras a 28° C durante 24 h

f. Después de transcurrido este tiempo observar turbidez en los tubos problema.

4.7. METALES PESADOS

a. Humedecer los discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, HgCl2 , CuSO4 y CH 3

COOPb.

b. Sembrar masivamente una caja con agar nutritivo con el microorganismo que se ya a estudiar


110

c. Dividir la placa en 3 y anotar el nombre de la cepa así como con el metal correspondiente.

d. Esterilizar las pinzas de disección y tomar uno de los discos ya impregnado con el metal a estudiar, y colocarla en el sitio correspondiente en la placa ya inoculada

e. Presionar ligeramente (con las pinzas) el disco de papel filtro e incubar a 35°C durante 24 h.

f. Observar el crecimiento de las cepas y medir el halo de inhibición con una regla graduada de cada uno.

4.8. COMPUESTOS HALOGENADOS

a. Humedecer los discos de papel filtro con una solución de hipoclorito de sodio y de yodo respectivamente

b. Sembrar masivamente una caja con agar nutritivo con el microorganismo que se va a estudiar

c. En condiciones de esterilidad colocar los discos en la caja ya inoculada

d. incubar las placas a 35°C durante 24 h.

e. observar el crecimiento y medir los halos de inhibición

4.9. EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBIÓTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

a. Sembrar las placas de agar nutritivo masivamente con un hisopo estéril y con la cepa correspondiente

b. Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas.

Nota: Determinar el tipo de Gram que es si no se sabe hay que investigarlo para no colocar un multidisco que no corresponda.

c. Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de disección para poner en contacto el antibiótico con la cepa

d. Incubar las placas a 35°C durante 24 h.

e. Después del tiempo de incubación medir el diámetro del los halos de inhibición del crecimiento producido por cada antibiótico estudiado y anotar los resultados.

Diferentes formas de observar la sensibilidad a los antimicrobianos.


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5. RESULTADOS

5. 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO

Temperatura 5 °C 28 °C 37 °C 55°C

Turbidez (en cruces)

5.2. DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL (PTM)

Temperatura 37 °C 50 °C 60 °C 70°C 80°C 92°C

Crecimiento en el tubo

(Cruces)

Crecimiento en la placa


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5.3. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO TÉRMICO MORTAL (TTM)

Temperatura 37 °C 50 °C 60 °C 70°C 80°C 92°C


(Cruces)

Crecimiento en la placa

5.4. PASTEURIZACIÓN

Determinación Leche en punto de venta

UFC/mL

Leche pasteurizada

UFC/mL

Organismos Mesofilicos aerobios

Organismos coliformes

5.5. EFECTO DEL pH

Efecto del pH 3.5 5.0 7.0 9.0


(Cruces)

5.6. EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA SOBRE EL CRECIMIENTO

Concentración de NaCl 1 % 3 5 5 %


(Cruces)

5.7. METALES PESADOS

Efecto del pH AgNO3 CuSO4 HgCl 2 CH 3-COOPb

Diámetro de inhibición

(mm)

5.8. COMPUESTOS HALOGENADOS O DESINFECTANTES

Halógeno o desinfectantes Cloro Yodo Benzal


(Cruces)


113

5.9. EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBIÓTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

ANTIBIÓTICO Gram positivo

Nombre: ______

Gram negativo

Nombre: ______

5.10 Cita tres ejemplos de microorganismos psicrofílicos, mesofílicos y termofílicos, indicando su importancia.

5.11 Define el término termodúrico y menciona un ejemplo.

5.12.-Escribe correctamente el nombre de un microroganismos acidofilo, alcalinofilo y uno neutrofilo.

5.13 Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriostático, fungicida y fungistático.

5.14 ¿Explica la diferencia como actúan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio.

5.15 ¿Qué acción tiene los halógenos sobre el crecimiento celular?

5.16 ¿Qué aplicación tienen los factores ambientales en la industria alimentaria?


6.1 Basándose en los resultados anteriores y a la bibliografía consultada, analizar y discutir los

resultados obtenidos en esta práctica, haciendo énfasis en el efecto causado a nivel molecular de los

factores estudiados y la importancia práctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los

microorganismos.

7.-CONCLUSIONES.

7.1 Elabora las conclusiones basándose en los resultados, al análisis y discusión que se hicieron de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.

8.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS RECOMENDADAS.

8.1 Brock, T.D, Biología de los microorganismos. 10a Edición, Pearson Prentice Hall. Madrid, España: 2004.


114

PRÁCTICA No. 10

MÉTODOS RÁPIDOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

UNIDAD VIII: Microorganismos de importancia alimentaria

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo general.

1.1.2 El alumno realizará pruebas de identificación rápida de microorganismos y grupos microbianos de importancia alimentaria.


Al término de la sesión el alumno:

1.2.1 Practicará la identificación de microorganismos utilizando el sistema API

1.2.2 Practicará la identificación de grupos microbianos de importancia alimentaria utilizando las placas Petrifilm

2. INTRODUCCIÓN

Los métodos tradicionales para la identificación de microorganismos se basan en la observación de los cambios metabólicos que se producen durante el crecimiento, sin embargo estos métodos son costosos y llevan mucho tiempo. Surge entonces la necesidad de obtener resultados rápidos y confiables, Los nuevos avances tecnológicos han llevado a diseñar nuevas técnicas para el análisis microbiológico de alimentos.

Los métodos rápidos y la automatización en microbiología es un campo de estudio que conjunta la utilización de métodos microbiológicos, bioquímicos, fisiológicos, inmunológicos y serológicos para el aislamiento más efectivo, la detección, caracterización y enumeración más rápida de microorganismos y sus productos en muestras clínicas, ambientales o de alimentos.

Un método rápido es aquel que es más rápido, sencillo o confiable que lo convencional. Sin embargo, siempre al hablar de metodologías rápidas estamos tratando subjetivamente, porque parten de un cultivo aislado. Sin embargo, en lo que todos concuerdan es que estos métodos han revolucionado y lo seguirán haciendo, la forma de realizar los análisis microbiológicos.

Las pruebas rápidas de identificación bioquímica están miniaturizadas y automatizadas, lo que hace al análisis más rápido y económico. A la fecha muchas compañías comercializan sus propios sistemas para la identificación rápida, generalmente estos sistemas están diseñados para ser usados en la identificación de enterobacterias, ya que habitualmente son los agentes etiológicos de las infecciones gastrointestinales. También están disponibles distintos kits para diversos grupos bacterianos e incluso para especies únicas, por ejemplo, se han desarrollado kits que contienen una batería de pruebas para Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzae y Mycobacterirum tuberculosis.

Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen enfermedades a cientos de personas, causando daños económicos a los productores de alimentos. Los métodos de diagnóstico rápido dependen del crecimiento bacteriano, es decir que tienen que ser aislados, para poder medir los cambios fisicoquímicos, resultado del crecimiento o actividad metabólica, el fundamento es entonces el mismo tanto en el método tradicional como en los métodos rápidos. Algunos ejemplos de bacterias productoras de enfermedad transmitidas por los alimentos son: Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Escherichia coli (enteroinvasiva y


115

enterotoxigénica), Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Yersinia enterocolítica, Listeria monocytogenes y Vibrio cholerae,

Algunos métodos rápidos utilizados para identificación de microorganismos son:

Sistemas de Cuantificación Microbiológica.

1.- Placa Petrifilm. Las placas Petrifilm ayudan a maximizar la productividad en el laboratorio. Estas placas listas para usarse reducen el tiempo y optimizan el espacio.

2.- Sistema Protocol es un sistema modular que abarca desde un sistema para la cuenta de las colonias, hasta el cálculo de las diluciones, pudiendo leer.

3.- Sistema Simplate. El sistema sirve para realizar recuento de organismos selectos: Cuenta total, coliformes totales y fecales, Hongos, levaduras y Campylobacter.

Sistemas de Identificación Microbiana

1.- El sistema API. Los sistemas de identificación API comprende celdillas con 20 pruebas bioquímicas en miniatura. Sistema Mirobac, también consiste de plaquitas con 16 pruebas bioquímicas. Ejemplos: API 20E, API NFT, API Campy, API Listeria, API Staph, API NH, etc.

2.- El sistema REMEL N/F

3.- El sistema rapid NF PLUS

4.- El sistema Biolog. El sistema es capaz de identificar por encima de 1400 especies de bacterias aerobias, anaerobias, hongos filamentosos y levaduras.

5.- El sistema VITEK. Sistema automático que identifica en 2 a 24 h y realiza también confirmación de patógenos. Los equipos son expandibles con 32, 60, 120, 240 ó 480 exámenes y además realiza el antibiograma y CMI.

6.- Los sistemas Microscan WALKAWAY-96 y 40

7.- El sistema sensititre AP80

8.- Detección de Salmonella por la técnica TECRA UNIQUE

9.- Detección de Vibrio cholerae por el método SMART

Sistemas de Identificación mediante Métodos Moleculares.

1.- Los sistemas BAX® utilizan el poder del PCR para lograr resultados rápidos y confiables. Cada prueba está diseñada para amplificar un segmento de DNA específico de cada organismo, produciendo en pocas horas niveles tales para ser detectados. Incluyen todos los primers requeridos, polimerasa y nucleótidos en una pastilla única, empaquetada dentro del tubo de muestra, evitando errores de manipulación

3. - The RiboPrinter® Microbial Characterization System. Este sistema detecta múltiples copias del gen RNAr 16 s logrando la identificación de cualquier bacteria en menos de 8 horas.

Métodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos.


116

1.- VIDAS® y mini VIDAS. Emplea la tecnología ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) que utiliza el principio de determinación que asocia el marcaje por una enzima y una medida por fluorescencia. Ejemplo detección de Salmonella por el sistema VIDAS.

2.- Sistemas VIP. Es un ensayo de inmuno-precipitación, de fácil lectura y de alta reproducibilidad.

Dada la amplia diversidad de métodos, mencionaremos los más utilizados en el área de alimentos.

Placas Petrifilm. Las placas Petrifilm han respondido a las necesidades de la industria de alimentos y bebidas con soluciones innovadoras para el laboratorio, constituyen un conjunto de placas listas para usarse que están listas para usarse, y que están diseñadas para ahorrar tiempo, costos, espacio de trabajo, incrementar la productividad, confiabilidad y eficiencia de las operaciones. Contrariamente a los métodos tradicionales están listas para usarse y utilizar en forma directa para muestras de tipo ambiental, son además de fácil uso e interpretación. Se requiere solo de 3 pasos: Inocular, las muestras se inoculan fácilmente con placas Petrifilm. Incubar, se maximiza el uso de la incubadora con el diseño de ahorro de espacio. Contar, el diseño de cuadrículas hace el conteo de las colonias rápido y fácil.

Las placas Petrifilm están disponibles para la mayoría de las necesidades de pruebas microbiológicas, incluyendo:

1.- Cuenta Aerobia.

2.- Cuenta de Coliformes

3.- Cuenta de Escherichia coli /Coliformes

4.- Cuenta de Enterobacterias

5.- Cuenta de Alta Sensibilidad de Coliformes

6.- Cuenta Rápida de Coliformes

7.- Cuenta Rápida de Staphylococcus aureus

8.- Cuenta Express de Staphylococcus aureus

9.- Cuenta de Mohos y Levaduras

10.- Para monitoreo de Listeria en ambientes (incluye Listeria monocytogenes, L. innocua, L. grayi,

L. murrayi y L. welshimeri)

11.- Para muestreo ambiental y muestreo de superficies.

Las placas Petrifilm están recubiertas con nutrientes gelatinosos e indicadores especiales que tiñen a las colonias, dándoles contraste para su fácil identificación, en general la placa Petrifilm consta de: a) una base que contiene papel laminado con polietileno impreso con cuadricula, los nutrientes mezclados con gel soluble en agua fría y adhesivo, b) una película de prolipropileno, un adhesivo con indicador, gel soluble en agua fría. Diferentes placas Petrifilm

El sistema API Es un método de identificación que combina una galería de reacciones bioquímicas, una base de datos y un sistema automatizado de interpretación. El sistema API 20E, diseñado originalmente para la identificación de la familia Enterobacteriaceae, ha sido ampliado para incluir bacilos no fermentadores como el género Pseudomonas.


117

El API NFT, es utilizado ampliamente para identificar a los microorganismos no fermentadores. El sistema API incluye todos los reactivos para la identificación, los cuales se encuentran listos para su uso y para que podamos identificar a enterobacterias, no enterobacterias, Campylobacter, Staphylococcus, Streptococcus, Lysteria, Neisseria, Haemophilus, levaduras, bacterias anaerobias estrictas, entre otros. SISTEMA API 20E. Pruebas bioquímicas que incluye. Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

ONPG beta-galactosidasa sin color amarillo ADH arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja

LDC lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja ODC ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja

CIT utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa

H2S producción de H2S sin precipitado negro

precipitado negro

URE ureasa amarillo rojo o naranja TDA triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo

IND producción de indol amarillo color rosa o anillo rosa-rojo

VP producción de acetoína (Voges-Proskauer)

sin color rosa-rojo

GEL gelatinasa sin difusión difusión de pigmento

GLU fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo MAN fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo

INO fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo SOR fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo

RHA fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo SAC fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo

MEL fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo AMY fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo

ARA fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo

OX citocromo oxidasa

3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1. MATERIAL

Contador de colonias

Mechero

Asa bacteriológica

Incubadora a 37º C

Pipeta automática

Portaobjetos y cubreobjetos

Gradilla metálica

Tubos de ensaye

Frascos para dilución

3.2 REACTIVOS

Agua peptonada

Tiras reactivas API 20E

Placas Petrifilm para cuenta de aerobios

Placas Petrifilm para cuenta de organismos coniformes

Placas Petrifilm para cuenta de Escherichia coli


118

Solución salina Placas Petrifilm para cuenta de hongos y levaduras

● 3.3 CEPAS

*Escherichia coli Salmonella sp 3.4 MUESTRAS Jugo de zanahoria, chocolate en polvo, harina, queso, jamón


Placas Petrifilm

INSTRUCCIONES

1.- La preparación de la muestra se realiza tal y como se indica en la técnica y las diluciones son la que se elija el analista dependiendo del tipo de muestra.

2.- Para la inoculación levantar la superficie superior con cuidado y con la pipeta automática inocular 1 mL en el círculo delimitado.

3.- Con cuidado dejar caer la película superior evitando la formación de burbujas.

4.- Con el difusor, extender la muestra por toda la superficie delimitada presionando con precaución. Esperar a que la muestra difunda por un minuto.

5.- Incubar a 35 ± 2 °C durante 24 horas

6.- Leer las placas Petrifilm con el contador de colonias o en forma visual.

RESULTADOS. (Interpretación de placas Petrifilm)

Placa de recuento aeróbico. Se presentan colonias rojas en la superficie de la placa, si el número es mayor a 250 UFC, se procede a contar las colonias en 1 cm2 y multiplicar por 20 para obtener el número total, esto es porque el área total de una placa es de 20 cm2.

Placa para recuento de Coliformes. El indicador rojo en la placa colorea las colonias fermentadoras de lactosa, la película superior atrapa el gas producido por los microorganismos coliformes.

Placa para recuento de Escherichia coli. Tiene el indicador β-glucoronidasa para la detección de coniformes, en particular Escherichia coli. Las colonias de Escherichia coli producen la enzima glucoronidasa, reaccionando con el indicador, lo que da como resultado un precipitado azul alrededor de la colonia, muchas de ellas producen gas, quedando atrapado en la película. Las colonias que no son de Escherichia coli muestran u color rojo.

Placa para recuento de Hongos y Levaduras. No se requiere de la adición de antibióticos o de ácido tartárico. Este método requiere de la diferenciación de hongos y levaduras. Hongos: son colonias filamentosas, difusas, el color es variable por los pigmentos, usualmente un “foco” en el centro de la colonia. Levaduras: colonias pequeñas, bien definidas y de colores tenues. En el caso de tener cuentas incontables, contar en 1 cm2 y multiplicar por 30.

Los tiempos de incubación y temperatura son similares a los métodos convencionales.

Sistema API E20

Los microorganismos deben ser aislados y después identificados, una vez aislados podemos medir

específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, para ello

se han desarrollado diversos métodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como

el sistema API

El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de enterobacterias y otros

bacilos Gram negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicas mimiaturizadas.


119

Principio: La galería del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos

deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana

Reactivos complementarios: API OF

Es un método de identificación que emplea reacciones bioquímicas y el que vamos a utilizar es el API

20 E y el API STAPH.

INSTRUCCIONES

1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un

caldo nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticaseína, de tal forma que el cultivo sea de 18 h.

2) Sacar la tira API (galería) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S,

URE, TDA, IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA.

3) Preparación de la galería: Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir

aproximadamente 5 ml de agua destilada en los alveolos para crqar una atmosfera humeda. Etiquetar

en la lengüeta lateral.

4) Sacar la galería de su envase y colocarla en la cámara de incubación

5) Preparación del inoculo Preparar la suspensión microbiana en 5 ml de solución salina fisiológica y

a una turbidez del nefelómetro de Mac Farland de 2.

6) Inoculación de la galería. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda

de una pipeta, evitando la formación de burbujas en el fondo de los tubos.

7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cúpula

8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cúpula con

aceite de parafina.

9) Cerrar la cámara de incubación

10) Incubar 36 h ± 2 °C durante 18-24h.+

Lectura de interpretación:

11) Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrón rojizo indica una reacción (+)

12) Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la

cúpula indica una reacción (+)

13) Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reacción (+), una

débil coloración rosa que aparece después de 10 minutos en (-).

14) Interpretación: Determinar el perfil numérico, donde las pruebas están separadas en grupos de 3,

como la galería API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que

corresponden a las reacciones positivas y se obtiene el bionúmero de 7 cifras.

15) Identificación: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de

identificación.

16) En algunas ocasiones es necesario la realización de pruebas adicionales como la reducción de

Nitratos a nitritos, para ello añadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de

2 a 5 minutos y una coloración roja indica una reacción (+)

17) Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli


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ONPG ADH LCD ODC

H2s URE TDA IND

GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2

- - - + v + + + - - v + - - - - v - - - + -

+ - + + - - - - + - - + + - + + - + - + + -

Tabla de lectura

Prueba Componerntes activos Cantidad Reacciones-enzimas Resultados

Negativo positivo

ONPG 2 nitro fenilβD-

galactopiranosido

0.223 Β galactyosidasa (Orto Nitrofenil

βD galactopiranosido

Incoloro Amarillo (1)

ADH L-arginina 1.9 Arginina DiHidrolasa Amarillo Anaranjado(2)

LCD L- lisina 1.9 Lisina Descarboxilasa Amarillo Anaranjado

ODC L- ornitina 1.9 Ornitina DesCarboxilasa Amarillo Anaranjado (2)

CIT Citrato de sodio 0.756 Utilización del CITrato Verde palido- amarillo Azul-verde azu (3)l

H2S Tiosulfato de sodio 0.075 Producción de H2S Incoloro grisáceo Depósito negro

URE urea 0.76 UREasa Amarillo Rojo anaranjado(2)

TDA L- triptófano 0.38 Triptofano DesAminasa amarillo Marrón rojizo

IND L-triptófano 0.19 Producción de InDol Verde pálido amarillo rosa

VP Piruvato de sodio 1.9 Producción de acetoina Rosa pálido Rosa –rojo(5)

GEL Gelatina bovina 0.6 GELatinasa No difusión Difusión del pigmento negro

GLU D- glucosa 1,9 GLUcosa Oxidación-

fermentación

Azul-azul verdoso Amarillo/amarillo

MAN D-manitol 1.9 MANitol Fermentación-

Oxidación

Azul-azul verdoso amarillo

INO Inositol 1.9 Fermentación-Oxidación INOsitol


SOR D-sorbitol 1.9 Fermentación-Oxidación

SORbitol


RHA L-rammnosa 1.9 Fermentación Oxidación

RHAmnosa


SAC D-sacarosa 1.9 Fermentación-Oxidación

SACarosa


MEL D-Melobiosa 1.9 Ferm,entación-oxidación

MELobiosa


AMY Amigdalina 0.57 AMYgdalina Fermentación –

Oxidación


ARA L-arabinosa 1.9 ARAbinosa Fermentación Oxidación


1.- La aparición de un color amarillo ligero implica un resultado +

2.- La aparición de un color naranja tras 36 h de incubación debe considerarse negativa

3.- Lectura en la cúpula (zona aerobia)

4.- La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en

la cúpula

5.- Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leída como negativa


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INSTRUCCIONES

1.- De la suspensión bacteriana, inocular las tiras API proporcionadas

3.- Sacar la tira API que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT. H2 S, URE, TDA, IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY Y ARA.

4.- Para la inoculación de los pozos se llenan de diferente forma, el CIT, VP Y GEL, se llenan completamente, lo que están subrayados se llenan solo la base y se le adiciona una gota de aceite mineral y los que no lo están se llena únicamente la base.

5.- En la base de la tira API se colocan 10 mL de agua destilada para que el sistema este húmedo.

6.- Incubar a 35 ± 2 o C durante 24 horas.

7.- Después de la incubación, leer los resultados adicionando los reactivos correspondientes.

5. RESULTADOS

En base a los resultados obtenidos en las placas Petrifilm, anota el alimento, el grupo bacteriano encontrado y la cuenta que realizaste.

Alimento Cuenta total aerobia

OMA

Organismos Coliformes

Escherichia coli Mohos y Levaduras

Con base a los resultados obtenidos en el sistema API E20, verifica que se trata de la cepa proporcionada comparando con las tablas de pruebas bioquímicas.

Prueba Resultado Prueba Resultado

ONPG GLU

ADH MAN

LDC INO

ODC SOR

CIT RHA

H2S SAC

URE MEL

TDA AMY

IND ARA

VP OX

GEL

Cepa identificada_____________________________


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5.1.- Investiga cómo se utilizan las placas Petrifilm para muestreo ambiental y de superficies

5.2.- ¿Qué otros métodos rápidos conoces?

5.3.- ¿Qué muestras se pueden manejar con las placas Petrifilm?

5.4.- ¿Qué método elegirías para trabajar si tuvieras una demanda grande de trabajo, pero también tienes que cumplir con las normas establecidas?

5.5- ¿Qué enzima se detecta al hacer la cuantificación de Escherichia coli?

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

6.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de los métodos utilizados, en comparación con los métodos convencionales.

7. CONCLUSIONES.

7.1 Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los objetivos de la práctica, los resultados y la bibliografía consultada.

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/LabV/API/api.html

http://cms.3m.com/cms/MX/es/0-253/kReiiFN/view.jhtml

8. BIBLIOGRAFIA.

Brock,T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice- Hall. España. 956 págs.

Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica Panamericana. 2001. México. 1432 págs.

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/LabV/API/api.html

http://cms.3m.com/cms/MX/es/0-253/kReiiFN/view.jhtml


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AGARES

1. AGAR BACTERIOLÓGICO

El agar bacteriológico Bioxon se usa en la preparación de medios de cultivo microbiológicos sólidos y semisólidos. También puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la penetración del oxígeno en medios líquidos, la cantidad utilizada es de 15 g/l

2. AGAR NUTRITIVO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g Agar 15 g

pH final = 6,8 0,2

Método de preparación:

Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos. Calentar a ebullición de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Determinar la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos típicos.

3. AGAR PARA MÉTODOS ESTÁNDAR

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de caseína 5 g Extracto de levadura 2.5 g Glucosa 1 g Agar 15 g

pH final = 7,0 0,1


Suspender 23,5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, vaciar en placas estériles

4. AGAR CITRATO DE SIMMONS

Fórmula en g/l de agua destilada: Fosfato dehidrogenado de amonio 1,0 g Fosfato dipotásico 1,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Citrato de sodio 2,0 g Sulfato de magnesio 0,2 g Agar 15,0 g Azul bromotimol 0,06 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,9 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Los tubos se dejan enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1 a 1,5 cm. Se puede emplear también como medio en placas.

5. AGAR DE HIERRO TRIPLE AZÚCAR

Fórmula en g/l de agua destilada:


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Mezcla de peptonas 20,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Dextrosa 1,0 g Sulfato de amonio férrico 0,2 g Rojo fenol 0,025 g Agar 13,0 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,3 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 118ºC durante 15 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1,5 a 2,0 cm.

6. AGAR HIERRO Y LISINA (LIA)

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de levadura 3 g Glucosa 1 g L-lisina 10 g Citrato férrico de amonio 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,4 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 13,5 g

pH final = 6,7 0,2


Suspender 33 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando con frecuencia hasta el punto de ebullición para disolver el medio por completo. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 1000 mm y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.

7. AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO)

Fórmula en g/l de agua destilada: Digerido pancreático de gelatina 10,0 g Fosfato dibásico de potasio 2,0 g Agar 15,0 g Lactosa 10,0 g Eosina "Y" 0,4 g Azul de metileno (Metiltionina) 0,065 g Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,1 ± 0,2

Disolver el digerido pancreático de gelatina, el fosfato dibásico de potasio y el agar en el agua. Esterilizar, dejar enfriar y antes de utilizar, agregar las siguientes soluciones a cada 100 ml de agar líquido: 5 ml de solución 1:5 de lactosa, 2 ml de solución 1:50 de eosina "Y" y 2 ml de solución 1:300 de azul de metileno. Mezclar.

8. AGAR PDA (AGAR DE PAPA Y DEXTROSA)

Fórmula en g/l de agua destilada: Infusión de papa (sólidos) 4 g


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Dextrosa 20 g Agar 15 g

pH final = 5,6 0,1 Método de preparación:

Suspender 39 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente, calentar con agitación frecuente y hervir durante un minuto hasta disolución completa, distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

9. AGAR LISINA HIERRO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Dextrosa 1,0 g L-lisina 10,0 g Citrato férrico-amónico 0,5 g Trisulfato de sodio (anhidro) 0,04 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 15,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,7 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado, remojar unos 15 minutos, calentar para disolver los ingredientes agitando con frecuencia y hervir durante un minuto o hasta disolución completa. Distribuir en porciones de 4 ml en tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC. Dejar solidificar en posición inclinada a tener 4 cm de un extremo y 2,5 cm sesgado. Cerrar con cuidado las tapas a fin de evitar pérdidas de agua por evaporación.


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CALDOS

1. CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona especial No. 1 7,0 g Dextrosa 5,0 g Fosfato dipotásico 5,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,9 ± 0,2

Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.

2. CALDO NUTRITIVO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g


Suspender el almidón en 100 ml de agua destilada. Disolver los demás ingredientes en 900 ml de agua destilada con calentamiento y agitación continua, mezclar ambas suspensiones y esterilizar a 115 °C por 15 minutos en autoclave.

3. CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO

Formula en g/l de agua destilada: Extracto de levadura 1 g Sulfato de amonio 2 g Fosfato dipotásico 0,6 g Fosfato monopotásico 0,4 g Cloruro de sodio 2 g Malonato de sodio 3 g Dextrosa 0,25 g Azul de bromotimol 0,025 g


Disolver 9,3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y esterilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos.

4. CALDO DE INFUSIÓN DE CEREBRO Y CORAZÓN

Fórmula en g/l de agua destilada: Infusión de cerebro de ternera200 g Infusión de corazón de res 250 g Peptona de gelatina 10 g Cloruro de sodio 5 g Fosfato disódico 2,5 g Dextrosa 2 g


Disolver 37 g de polvo en un litro de agua destilada. Si es necesario calentar suavemente para disolverlo.


127

Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, para obtener buenos resultados el medio debe utilizarse el mismo día de su preparación.

5. CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de caseína 10 g Cloruro de sodio 5 g Rojo de fenol 0,018 g Lactosa 5 g


Disolver 20 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta su ebullición y completa disolución. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 °C durante 15 minutos.

6. CALDO UREA

Fórmula en g/l de agua destilada: Urea 20 g Fosfato monopotásico 9,1 g Fosfato dipotásico 9,5 g Extracto de levadura 0,1 g Rojo de fenol 0,01 g


Disolver 3,87 g en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Distribuir en cantidades de 0,1 a 1 ml en tubo estériles. En lugar de esterilizarse por filtración puede esterilizarse en autoclave a 108 °C de 7 a 10 minutos.

7. CALDO NITRATO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g Nitrato de potasio 1 g


Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta disolución total. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

8. CALDO KCN

Fórmula en g/l de agua destilada:

MEDIO BÁSICO

Peptona 3 g Cloruro de sodio 5 g Fosfato de potasio monobásico (KH2 PO4) 0,225 g Fosfato dibásico de sodio (Na2 HPO4.2H2O) 5,64 g


Pesar exactamente las cantidades y rehidratar con agua destilada, calentar suavemente si es necesario hasta su disolución. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm con tapón de rosca y


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esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

CIANURO DE POTASIO

Preparar un tubo con tapón de rosca, estéril KCN 0.5 g Agua destilada 100 ml

No absorber la solución de KCN con la pipeta por la boca, usar una pipeta de jeringa o bulbo. El cianuro es sumamente venenoso y puede causar la muerte.

A los 5 ml del medio básico frió agregar 1 ml de KCN al 0,5 % utilizando una pipeta de bulbo y mezclar bien.

9. MEDIO ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona especial No. 1 7,0 g Dextrosa 5,0 g Fosfato dipotásico 5,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,9 ± 0,2

Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos

10. CALDO UREA

Fórmula en g/l de agua destilada: Urea 20,0 g Fosfato monopotásico 9,1 g Fosfato de sodio 9,5 g Extracto de levadura 0,1 g Rojo de fenol 0,01 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,8 ± 0,2

Disolver 38,61 g en 1 000 ml de agua, calentando en caso necesario a 60ºC como máximo. Esterilizar por filtración o tras distribución a razón de 3 ml por tubo; o bien esterilizar con cuidado en marmita de vapor durante 5 minutos. No esterilizar en autoclave.


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MEDIOS SEMISÓLIDOS

1. MEDIO PARA PRUEBA DE MOVILIDAD (SIM)

Fórmula en g/l de agua destilada: Medio SIM Peptona de caseína 20,0 g Peptona de carne 6,1 g Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Agar 3,5 g Agua 1000,0 ml pH final 7,3 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, agitando frecuentemente. Remojar durante 10 minutos y hervir a ebullición durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo a una altura de unos 4 cm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2. MEDIO BASAL OF o MEDIO DE HUGH Y LEIFSON

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona Caseína 2,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Fosfato dipotásico 0,3 g Azul bromotimol 0,03 g Agar 2,5 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,1 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia, hasta disolver el agar. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración (o del azúcar apropiado) por cada 100 ml del medio fluido, mezclar y distribuir asépticamente 5 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 118°C durante 10 minutos a fin de evitar la degradación del azúcar. El medio tiene un color verde.

3. MEDIO INDOL ORNITINA (MIO)

Fórmula en g/l de agua destilada: Extracto de levadura 3,0 g Peptona 10,0 g Triptona 10,0 g L-ornitina 5,0 g Dextrosa 1,0 g Agar 2,0 g Bromocresol púrpura 0,02 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,5 ± 0,2

Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, remojar unos 5 minutos, calentar a ebullición. Distribuir porciones de 4 ml en tubos de 10 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

4. GELATINA NUTRITIVA

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g Gelatina 120 g


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Suspender 128 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar ligeramente para disolver y distribuir en tubos. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.


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SOLUCIONES Y REACTIVOS

1. Aceite mineral

Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2. Solución de rojo de metilo

Formula: Rojo de metilo 0.1 g Alcohol etílico 300 ml Agua destilada 200 ml

Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema.

Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta como prueba Negativa.

3. Solución de ácido tartárico al 10% p/v

Formula: Acido tartárico 10,0 g Agua c.b.p. 100,0 ml

Disolver el ácido tartárico en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por membrana

4. Solución de -Naftil amina

Fórmula: Dimetil alfa naftil amina 5,0 g Ácido acético 5 N 1,0

5. SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 40 %

Fórmula: Hidróxido de potasio 40 g Agua destilada 100 ml

6. SOLUCIÓN DE ALFA NAFTOL

Fórmula: Alfa naftol 5 g Etanol 100 ml

8) Reactivo de Kovacs y Ehrlich

Para-dimetil-amino-benzaldehído 5,0 g Alcohol amílico o butílico 75,0 ml Acido clorhídrico (37%) QP 25,0 ml

Disuelva el para-dimetil-amino-benzaldehído en el alcohol. Caliente suavemente la solución en un baño de agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el ácido clorhídrico con cuidado.

9) Prueba de Vogues Proskauer

Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

Formula: Alfa naftol 5 g Alcohol etílico absoluto 100 ml


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Añadir 0,6 ml de la solución de alfa naftol y 0,2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo.

Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva.

10) Reacción de Indol (reactivo de Kovac)

Formula: P-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g Alcohol amílico.o alcohol isoamílico750 ml Acido clorhídrico concentrado 25 ml

Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va del amarillo al café claro. Se debe conservar a 4 ºC.

Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta completa disolución. Enfriar a 60 ºC y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1.

11) Solución de ácido sulfanilico

Formula: Ácido sulfanílico 8,0 g Ácido acético 5N

(Una parte de ácido acético glacial a 2.5 partes de agua) 1,0 L

12) Solución de agua oxigenada 1:10

Preparación:

Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.

13) Solución de telurito de potasio al 1% p/v

Telurito de potasio 1,0 g Agua c.b.p. 100,0 ml

Disolver el telurito en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por membrana.

14) Solución salina al 0,85%

Cloruro de sodio 8,5 g Agua c.b.p. 1 000,0 ml

Disolver el cloruro de sodio en 500 ml de agua, aforar a 1 000 ml, ajustar el pH a 7,2 ± 0,1 filtrar, envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

15) Solución de agua oxigenada al 3% v/v

Peróxido de Hidrógeno 3,0 ml Agua c.b.p. 100,0 ml

Mezclar el peróxido en agua, aforar a 100 ml y envasar.

16) Solución indicadora rojo de metilo

Rojo de metilo 0,1 g Alcohol al 95% 300,0 ml Agua c.b.p. 500,0 ml

Mezclar el rojo de metilo en el alcohol y diluir con agua a 500 ml.


133

17) Solución yodo-yodurada

Yoduro de potasio 2,0 g Yodo 1,0 g Agua 100,0 ml

Triturar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio, adicionar el agua necesaria para que se disuelva el yodo, agregar agua hasta un volumen de 100 ml. Conservar protegido de la luz.

18) Solución safranina

Safranina "O" 2,5 g Alcohol etílico al 95% 100,0 ml

Disolver la safranina "O" en el alcohol etílico.Tomar 10 ml de esta solución y llevar a 100 ml con agua. Agitar.

19) Solución alcohol-acetona

Partes iguales de acetona y alcohol etílico al 95%.

20) Reactivo de Ehrlich

Fórmula:

Para-dimetil amino benzaldehído 2 g Alcohol etílico absoluto 190 ml Ácido clorhídrico concentrado40 ml


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COLORANTES, DECOLORANTES Y MORDENTE

1) Cristal violeta Formulación en g/100 ml: Cristal violeta 2 Agua destilada 80 Etanol al 95% 20 Oxalato de amonio 0,8 Preparación: Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%. Posteriormente disolver 0,8 g de oxalato de amonio en 80 ml de agua. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.

2) Yodo (lugol-Mordente)

Formulación en g/100 ml: Yoduro de potasio 2 Yodo 1 Agua destilada 100 Preparación: Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada. Agregar el gramo de yodo metálico y disolver. Aforar a 100 ml con agua destilada y colocarlo en un frasco ámbar.

3) Alcohol cetona

Formulación en g/100 ml: Acetona 50 Alcohol etílico 100 Preparación: Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado. Guardar en frasco herméticamente cerrado, hasta su uso.

4) Safranina

Formulación en g/100 ml: Agua destilada 100 Safranina 0,5 Preparación: Disolver los 0,5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Después aforar a 100 ml con agua destilada.

5) Fucsina fenicada

Formulación: Solución A Fucsina básica 0,3 Alcohol etílico al 95% 10 Mezclar hasta disolución completa Solución B Cristales de fenol 5 Agua destilada 95 Preparación: Combinar las dos soluciones A y B. Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2. Mantener la

solución en un frasco ámbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.

6) Azul de metileno

Formulación: Azul de Metileno 1 g


135

Agua destilada 100 ml Preparación: Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml. de agua destilada.

7) Verde de malaquita

Formulación: Verde de malaquita 10 g Agua destilada 100 ml Preparación:

Disolver el colorante en el agua. Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 2. Guardar el colorante en frasco ámbar.


136

ESTÁNDARES NEFELOMÉTRICOS DE McFARLAND

1.- Preparación de estándares: Sulfato de bario

Reactivos:

BaCl2, solución acuosa al 1 %

H2SO4 QP al 1 %

BaCl2, + H2SO4 BaSO4 + 2 HCl

2.- Preparar 10 tubos nuevos con tapa de rosca de igual tamaño, mismos diámetro, limpios y enjuagados con agua destilada.

3.- Agregar los reactivos a los tubos rotulados de la siguiente manera en las cantidades que se indican a continuación:

Estándares de sulfato de bario

Tubo número 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BaCl2, al 1 % (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

H2SO4 al 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0

Densidad aprox. De células (X 108/ml)

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Densidad aprox. de células en millones /ml

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

4.- Tapar los tubos y rotulas

5.- El precipitado de BaSO4 suspendido corresponde aproximadamente a la densidad de células homogéneas de E. coli por ml.

Precauciones:

Si el caldo de cultivo es claro, o si es coloreado.

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