2013 carrillo et al. - salmonella

7/23/2019 2013 Carrillo Et Al. - Salmonella

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IDENTIFICACIN FENOTPICA Y

MOLECULAR DE SALMONELLA SPP.EN CARNE MOLIDA

Autores:

MARA LUISA CARRILLO INUNGARAYROCO CRYSTABEL LPEZ GONZLEZ

BRENDA ALVARADO SNCHEZ

LIBORIO MARTNEZ CRUZ

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SAN LUIS POTOSSAN LUIS POTOS - MXICO

2013


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GRUPOS DE INVESTIGACI N DESTACADOS

ReCiTeIA - v.13 n.1 18

Informacin de los Autores

Mara Luisa Carrillo InungarayDoctora en Ciencias en Alimentos

Unidad Acadmica Multidisciplinaria Zona Huasteca de la Universidad Autnoma de SanLuis Potos. Romualdo del Campo No. 501. Fracc. Rafael Curiel. C.P. 79060. CiudadValles, S. L. P., Mxico.Autor para correspondencia: e-mail:[email protected]

Roco Crystabel Lpez GonzlezBioqumicaUnidad Acadmica Multidisciplinaria Zona Huasteca de la Universidad Autnoma de SanLuis Potos.

Brenda Alvarado SnchezDoctora en Ciencias BiomdicasUnidad Acadmica Multidisciplinaria Zona Huasteca de la Universidad Autnoma de SanLuis Potos.

Liborio Martnez CruzMaestro en Ciencias BiomdicasUnidad Acadmica Multidisciplinaria Zona Huasteca de la Universidad Autnoma de SanLuis Potos.

Las opiniones expresadas en este documento no son necesariamente opiniones de la RevistaReCiTeIA, de sus rganos o de sus funcionarios. ReCiTeIA no se hace responsable de

materiales con derecho de autor tomados sin autorizacin por los propios autores.

Edicin:2013 ReCiTeIA.ISSN 2027-6850CaliValleColombiae-mail:[email protected]:http://revistareciteia.es.tl/
mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]://revistareciteia.es.tl/http://revistareciteia.es.tl/http://revistareciteia.es.tl/http://revistareciteia.es.tl/mailto:[email protected]:[email protected]


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Identificacin fenotpica y molecular de Salmonellaspp. en carne molida

Mara Luisa Carrillo Inungaray, Roco Crystabel Lpez Gonzlez,Brenda Alvarado Snchez, Liborio Martnez Cruz

Unidad Acadmica Multidisciplinaria Zona Huasteca,Universidad Autnoma de San Luis PotosMxico

CONTENIDO

Lista de Tablas .............................................................................................................................. 19Lista de Figuras ............................................................................................................................. 20Resumen........................................................................................................................................ 21Abstract ......................................................................................................................................... 21

1 Introduccin ......................................................................................................................... 222 Materiales y mtodos ........................................................................................................... 23

2.1 Muestreo ........................................................................................................................................ 23

2.2

Cepa control .................................................................................................................................. 232.3 Mtodo tradicional de identificacin para Salmonella .................................................................. 23

2.4 Mtodo molecular de identificacin de Salmonella...................................................................... 232.4.1 Tratamiento trmico ............................................................................................................. 242.4.2 Extraccin de ADN (Kit PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Protocol) ............. 242.4.3 Amplificacin de ADN ........................................................................................................ 24

3 Resultados y discusin ......................................................................................................... 253.1 Mtodo tradicional ........................................................................................................................ 253.2 Mtodo Molecular ......................................................................................................................... 263.3 Muestreo ........................................................................................................................................ 27

3.3.1 Resultados de pruebas bioqumicas de los cinco muestreos ................................................ 284 Conclusiones ........................................................................................................................ 335

Agradecimientos .................................................................................................................. 34

6

Referencias bibliogrficas .................................................................................................... 34

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Caractersticas de los oligonuclotidos ST11 y ST15 para Salmonella. ............................. 25Tabla 2. Resultados de pruebas bioqumicas del mtodo tradicional de identificacin de Salmonella ........................................................................................................................................................... 26

Tabla 3. Sensibilidad y especificidad del mtodo tradicional y molecular en la identificacin deSalmonella. ........................................................................................................................................ 27Tabla 4. Primer muestreo .................................................................................................................. 28Tabla 5. Segundo muestreo ............................................................................................................... 28

Tabla 6. Tercer muestreo ................................................................................................................... 28

Tabla 7. Cuarto muestreo .................................................................................................................. 29Tabla 8. Quinto muestreo .................................................................................................................. 29Tabla 9. Resultados del mtodo tradicional y mtodo molecular ..................................................... 32Tabla 10. Prevalencias obtenidas mediante mtodo tradicional y molecular .................................... 33


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Secuencia del gen JEO402-1 de S. typhimurium. .............................................................. 24Figura 2. Visualizacin mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCRamplificados. ..................................................................................................................................... 26Figura 3. Primer muestreo ................................................................................................................. 30

Figura 4. Segundo muestreo .............................................................................................................. 30Figura 5. Tercer muestreo ................................................................................................................. 30

Figura 6. Cuarto muestreo ................................................................................................................. 30Figura 7. Quinto muestreo ................................................................................................................. 31


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Identificacin fenotpica y molecular de Salmonellaspp. en carne molida

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de Salmonella spp. en carnemolida de res en puntos de venta de carne en Ciudad Valles, San Luis Potos, Mxico. Lasmuestras fueron recolectadas durante el periodo de febrero a abril de 2012. Laidentificacin de Salmonella se realiz mediante el mtodo tradicional descrito por laNorma Oficial Mexicana (NOM-114-SSA1-1994) y por el mtodo molecular, usando lareaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Las muestras de carne molida de res seinocularon en medios de enriquecimiento y aislamiento especficos para Salmonella, y sehizo la identificacin bioqumica correspondiente a esta bacteria. Las cepas sospechosas deSalmonella se analizaron mediante PCR utilizando los oligonucletidos ST11 y ST15. Lasensibilidad del mtodo tradicional fue de un 80% y una especificidad de un 50%, mientrasque la sensibilidad y especificidad del mtodo molecular fue del 100%. Tal sensibilidad

permiti determinar una prevalencia de Salmonella de 14%. Determinar esta prevalenciacon confiabilidad fue posible debido al uso de mtodos moleculares, los cuales permitieronidentificar Salmonellaa pesar de que algunos de los resultados obtenidos al usar el mtodotradicional fueron negativos. La sustitucin gradual de las tcnicas tradicionales para losanlisis de alimentos por las tcnicas moleculares permitir una mayor confiabilidad en losresultados en los anlisis de alimentos.

Palabras clave: Salmonellaspp., identificacin fenotpica, identificacin molecular.

ABSTRACT

The aim of this study was to determine the prevalence of Salmonella spp. in ground beef inmeat outlets in Ciudad Valles, San Luis Potosi, Mexico. The samples were collected duringthe period February to April 2012. Identification of Salmonellawas performed using thetraditional method described by the Official Mexican Norm (NOM-114-SSA1-1994) andthe molecular method, using the chain reaction (PCR). The samples of ground beef wereinoculated into enrichment media and specific for Salmonella isolation, and biochemicalidentification was made for this bacterium. The suspected strains of salmonella wereanalyzed by PCR using the oligonucleotides ST11 and ST15. The traditional method'ssensitivity was 80% and specificity of 50%, while the sensitivity and specificity ofmolecular method was 100%. This sensitivity allowed determining Salmonellaprevalenceof 14%. Determine this prevalence was possible due to the use of molecular methods that

allowed the identification of Salmonellawhich although some of the results obtained usingthe traditional method were negative. The gradual replacement of traditional techniques forfood analysis by molecular techniques allows greater confidence in the results in foodanalysis.

Keywords: Salmonellaspp., fenotipical identification, fenotipical molecular.


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1 INTRODUCCIN

La mayora de las infecciones transmitidas por los alimentos, comnmente reconocidas, son

las causadas por las bacterias Salmonella,E. coliO157: H7, Vibrio choleraey por un grupode virus llamados calicivirus [CDC, 2009]. Varios estudios han tenido como objetivo ladeteccin de estos microorganismos. Roldn et al. [2007] describieron la presencia de Ecoli O157:H7 en productos crnicos y leche. As mismo, en Argentina se identific lapresencia de E. coli O157:H7 en muestras de carne picada fresca y hamburguesascongeladas [Marzocca et al., 2006]. Otros estudios realizados detectaron la presencia devarias especies de Salmonella en diversos alimentos: en frutas y vegetales, en comidasrpidas callejeras, en carne de res, embutidos, queso y carne de cerdo [Durangoet al., 2004;Espinalet al., 2006; Liming y Bhagwat, 2004].

La deteccin e identificacin de microorganismos patgenos, puede realizarse mediantetcnicas de cultivo tradicional. stas sirven para la determinacin del contenido totalbacteriano o la deteccin de un patgeno particular. En medios selectivos pueden seridentificadas y seleccionadas las bacterias mediante sus propiedades fenotpicas ybioqumicas. Sin embargo, estas tcnicas requieren de 3 a 5 das para obtener resultados yla identificacin est limitada por las pruebas bioqumicas que no permiten unadeterminacin precisa de la identidad de la microbiota [Durangoet al., 2004].

Actualmente, para obtener la identidad especfica de la microbiota presente en alimentos, sehan usado los mtodos basados en el anlisis de cidos nucleicos, principalmente del ADN.Las principales ventajas que ofrecen estos mtodos son una disminucin en el tiempo derealizacin y confiabilidad de los resultados [Crociet al., 2004]. Las nuevas tcnicas, talescomo la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), han sido introducidas con granimpacto en la deteccin de patgenos en alimentos.

Aunque los mtodos tradicionales son los mtodos oficiales en la normatividad mexicanapara establecer la identificacin de Salmonellaen alimentos, a nivel internacional se estnutilizando cada vez ms los mtodos moleculares para la identificacin de patgenos, yaque stos han permitido detectarlos en muestras en donde aparentemente no estabanpresentes. De ello surge la necesidad de sustituir gradual y paulatinamente las tcnicastradicionales que se usan actualmente, por tcnicas de vanguardia en biologa molecularpara la identificacin de patgenos en alimentos. Esto implicara una fuerte inversineconmica inicial, sin embargo, en poco tiempo, esto se vera recompensado en una mayorespecificidad en la identificacin de patgenos como Salmonella spp. Por lo anterior, elobjetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de Salmonellaspp. en carne molidade res que se expende en carniceras de Ciudad Valles, San Luis Potos, en Mxico,mediante el uso de tcnicas tradicionales y moleculares, con la finalidad de demostrar lasensibilidad y especificidad de los mtodos tradicional y molecular para la identificacin deSalmonella.


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2 MATERIALES Y MTODOS

2.1 MUESTREO

Para el presente trabajo se sigui un diseo factorial completo, realizndose cincomuestreos de carne molida de res obtenidos de dos establecimientos de venta, localizados alnorte, sur, este, oeste y centro de la ciudad, dando un total de 50 muestras en el periodo defebrero a abril de 2012. Se recolectaron aproximadamente 200 g de muestra y se mantuvouna cadena de fro durante el transporte de las muestras (10C) hasta la llegada allaboratorio para la identificacin de Salmonella mediante el mtodo tradicional y elmolecular.

2.2 CEPA CONTROL

Como cepas control se usaron Salmonella tiphy y Salmonella typhimurium, las cualesfueron proporcionadas por el cepario del Laboratorio de Investigacin en Alimentos de laUniversidad Autnoma de San Luis Potos. Las cepas se revitalizaron en caldo nutritivo a37C por 24 horas. Pasado este tiempo se sembraron en el medio selectivo Salmonella-Shigella (S-S)a 37C por 24 horas.

2.3 MTODO TRADICIONAL DE IDENTIFICACIN PARA SALMONELLA

El mtodo tradicional para la identificacin de Salmonellaspp., se llev a cabo de acuerdoa la tcnica especificada en laNOM-114-SSA1 [1994], actualmente vigente en el pas. Sepesaron aspticamente 25 g de la muestra, se colocaron en 225 mL de caldo tetrationato, elcual se incub de 18 a 24 horas a 35C. Pasado el tiempo de incubacin, se inocularonmedios selectivos, agar xilosa lisina y agar entrico Hektoen. A las colonias tpicas deSalmonella se les realizaron las pruebas bioqumicas: rojo de metilo, Vogues-Proskauer,produccin de indol, produccin de H2S, motilidad, lisina descarboxilasa, glucosa, lactosa,sacarosa y citrato.

2.4 MTODO MOLECULAR DE IDENTIFICACIN DE SALMONELLA

Para la identificacin de Salmonella por el mtodo molecular, se parti de las coloniasaisladas por el mtodo tradicional, se extrajo y se amplific el ADN. Las colonias seobtuvieron mediante las dos primeras etapas del mtodo tradicional, es decir, elenriquecimiento y el aislamiento de colonias.

Las colonias sospechosas de Salmonella se sometieron a extraccin de ADN, para esteproceso se utilizaron dos mtodos: mtodo por tratamiento trmico [Crociet al., 2004]ymtodo de extraccin de ADN mediante el Kit PrepMan Ultra Sample PreparationReagent Protocol, [Applied-Biosystems., 2010] esto con la finalidad de seleccionar elmtodo con el mejor rendimiento en la obtencin de ADN.


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2.4.1 Tratamiento trmico

Este mtodo, propuesto por Croci et al. [2004], consisti en la obtencin de ADN ensolucin mediante lisis celular por tratamiento trmico con una desnaturalizacin de

protenas.2.4.2 Extraccin de ADN (Kit PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent

Protocol)

Este este mtodo sigui el protocolo indicado por PrepManUltra [Applied-Biosystems.,2010]. Con esta tcnica se liber el ADN en solucin y se inactiv cualquier inhibidor de laamplificacin del mismo presente en la muestra, produciendo un ADN de cadena moldeadecuado para la PCR.

2.4.3 Amplificacin de ADN

La amplificacin del ADN se realiz mediante la tcnica de PCR. Para la identificacin deSalmonellase amplific una parte del gen especfico del gnero de SalmonelladenominadoJEO402-1 (nmero de acceso en GenBank) (Figura 1). Se utilizaron los oligonucletidos:sentido ST11 (5 AGC CAA CCA TTG CTA AAT TGG CGCA 3) y antisentido el ST15(5 GGT AGA AAT TCC CAG CGG GTA CTG 3), descritos porAaboet al.[1993]paraobtener un fragmento de 429 pb correspondiente al gen especifico de Salmonella(Tabla 1).Se evalu la especificidad de los oligonucletidos mediante el alineamiento especfico.Estos oligonucletidos fueron positivos para 146 subespecies y 116 serovariedades deSalmonella y tambin han sido probados para 40 especies de entorobacterias, dandonegativo en la amplificacin [Aabo et al., 1993]. Adems han sido utilizados y hanmostrado ser especficos para la identificacin de Salmonella en alimentos [Croci et al.,2004;Piknovet al., 2002; Trkovet al., 1999].

Figura 1. Secuencia del gen JEO402-1 de S. typhimur ium.


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Tabla 1. Caractersticas de los oligonuclotidos ST11 y ST15 para Salmonella.Gen Oligonucletido Longitud (pb) Secuencia 5- 3 Amplicn

JEO402-1ST11 23 AGCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA

429 pbST15 22 GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTG

Se llevaron a cabo reacciones de PCR con los oligonucletidos especficos. Las reaccionesse realizaron con aproximadamente 100 ng de ADN genmico, 800 nM de cada uno de losoligonucletidos, 200 uM de cada uno de los desoxinucletidos trifosfatos, 2.0 mM deMgCl2, y 0.02 UI/L de Taq Polimerasa en un volumen final de 12.5 L. Se us comocontrol positivo de metilacin ADN genmico obtenido de cepas control.

Las condiciones de la PCR para el gen JEO402-1 fueron las siguientes: desnaturalizacininicial 95 C por 1 min, seguido de 35 ciclos de amplificacin (15 s a 95 C, 15 s a 57 C y30 s a 72 C), una elongacin final de 7 minutos a 72 C y finalmente 5 minutos a 4 C.

Los productos de PCR, fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%,utilizando TBE 1X como amortiguador de electroforesis, las condiciones de voltaje fueronlas siguientes: 70 volts por 80 minutos. Posteriormente los geles se tieron con bromuro deetidio y se visualizaron bajo luz UV. Las imgenes que se obtuvieron de cada gel, seanalizaron con el sistemaKodak Image Analysis Software,en el cual el amplicn de 429pbfue encontrado y seleccionado por elsoftware en cada muestra analizada.

3 RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1 MTODO TRADICIONAL

Con la finalidad de comprobar la viabilidad de las cepas, el buen estado de los reactivos yla especificidad de la tcnica, se identificaron bioqumicamente las cepas control, el controlnegativo (colonia aislada de una muestra de alimento proporcionado al Laboratorio deInvestigacin en Alimentos negativa para Salmonella). As mismo, intencionalmente seinocularon muestras de alimentos con 0.1 mL de una suspensin bacteriana cuyaconcentracin correspondi al tubo 3 de la Escala de McFarland (9x108 clulas/mL). Sesigui la tcnica descrita en la NOM-114-SSA1 [1994], y se obtuvieron los resultadospresentados en laTabla 2.

Con los resultados obtenidos se comprob que el mtodo tradicional que se lleva a cabo en

el laboratorio de investigacin de alimentos es confiable para la identificacin deSalmonella, que las cepas control de Salmonella tiphy y Salmonella typhimurium sonviables para su utilizacin y que el proceso tradicional no fue 100% confiable, debido a queen la muestra inoculada artificialmente de chorizo se obtuvo un resultado negativo paraSalmonella. Esto puede ser debido a que aunque la muestra fue inoculada artificialmente, elalimento como tal, ya contena su carga microbiana, la cual dio lugar al crecimiento demicroorganismos que producen H2S en medio S-S (Proteus). Y debido a que para el


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anlisis de las pruebas bioqumicas se toma slo una colonia morfolgicamente sospechosadel medio S-S, esta puede ser o no Salmonella. Lo anterior pudo tener como resultado unfalso negativo. Este tipo de errores se disminuyen con el mtodo molecular ya que, en estemtodo se pueden tomar ms de una colonia sospechosa para el mismo anlisis,

aumentando as las probabilidades de encontrar Salmonellaan en presencia de crecimientode colonias morfolgicamente parecidas en el medio de crecimiento.

Tabla 2. Resultados de pruebas bioqumicas del mtodo tradicional de identificacin deSalmonella

Muestra Pruebas bioqumicasCepa de Salmonella tiphy Positivo para Salmonella

Cepa de Salmonella typhimurium Positivo para SalmonellaQueso Positivo para Salmonella

Chorizo Negativo para SalmonellaCarne molida Positivo para Salmonella

Control negativo Negativo para Salmonella

3.2 MTODO MOLECULAR

Las mismas muestras analizadas en la forma tradicional, se procesaron mediante un mtodomolecular. A su vez, al usar el mtodo molecular, para la extraccin del ADN, se siguierondos protocolos: el mtodo de tratamiento trmico y el de preparacin del ADN. En laFigura 2 se observan los productos de PCR amplificados a partir del mtodo (A)Preparacin del ADN (KitPrepman) y (B) Tratamiento trmico [Crociet al., 2004]: (1) S.typhi, (2) S. typhimurium, (3) muestra de queso inoculada artificialmente, (4) muestra dechorizo inoculada artificialmente, (5) muestra de carne molida de res inoculadaartificialmente, (6) muestra de chorizo sospechosa de Salmonella.

Figura 2. Visualizacin mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos dePCR amplificados.


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Al analizar los resultados del mtodo molecular se comprob que las formas de extraccinde ADN: tratamiento trmico y preparacin del ADN, el programa de PCR y las tcnicas devisualizacin de los productos de PCR utilizados, son adecuados para la identificacin deSalmonella. Tambin se observ que el mtodo de tratamiento trmico, muestra mejores

bandas que el mtodo de preparacin de ADN, lo que indica que hubo una extraccinmayor de ADN, las cepas de Salmonella tiphy y Salmonella typhimurium son factiblescomo cepas control y que el mtodo si es selectivo para Salmonella, ya que no amplificpara la colonia de control negativo (muestra 6). Esto coincidi con el mtodo tradicional,donde las pruebas bioqumicas resultaron negativas para este control negativo. En laamplificacin del ADN de las muestras inoculadas intencionalmente con Salmonella tiphy(muestras 3, 4 y 5), se aprecian las bandas de amplificacin de ADN correspondientes algen especfico de Salmonella.

La Tabla 3 muestra los datos estadsticos de sensibilidad y especificidad, que se puedenresumir con el anlisis de los resultados arrojados por el mtodo tradicional y molecularpara la deteccin de Salmonella. La sensibilidad y especificidad del mtodo molecular fuedel 100 %. La sensibilidad del mtodo tradicional fue de un 80 % y una especificidad del50%. Esto se debi a que se obtuvo un falso negativo con este mtodo (muestra de chorizoinoculada artificialmente).

Tabla 3. Sensibilidad y especificidad del mtodo tradicional y molecular en la identificacin deSalmonella.

PCR Pruebas bioqumicasPositivos 5 4

Negativos 1 2Sensibilidad (%) 100 80Especificidad (%) 100 50

3.3 MUESTREO

Una vez probados los mtodos tradicional y molecular, se procedi a analizar las muestrasde carne molida obtenidas en diferentes carniceras de Ciudad Valles, S. L. P.

Los resultados de las pruebas bioqumicas realizados en el muestreo se presentan en lasTablas 4 a la 8. En el primer, tercer y cuarto muestreo ninguna muestra fue positiva enpruebas bioqumicas para Salmonella. En el segundo muestreo las muestras 6, 8 y 10 fueronpositivas en pruebas bioqumicas para Salmonella typhi al igual las muestras 3 y 4 delquinto muestreo.


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3.3.1 Resultados de pruebas bioqumicas de los cinco muestreos

Tabla 4. Primer muestreoUbicacin geogrfica Norte Este Centro Oeste Sur

Prueba bioqumica

Cepa

control

Muestra

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Rojo de metilo + + + + + + + + + + +

Vogues-Proskauer - - - - - - - - - - -Indol - - - - - - - - - - -H2S + + + + + + + + + + +

Motilidad * * * * * * * * * * *Lisina descarboxilasa + - - - - - - - - - +

Glucosa * + + + + + + + + + +Lactosa - + + + + + + + - + +Sacarosa - + + + + + + + - + +Citrato + + + + + - - + + + +

+ = Positivo, - = Negativo, * = No se puede

Tabla 5. Segundo muestreoUbicacin geogrfica Norte Este Centro Oeste Sur

Prueba bioqumicaCepa

controlMuestra

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Rojo de metilo + + + + + + + + + + +

Vogues-Proskauer - - - - - - - - - - -Indol - + - + - - - - - + -H2S + + + + + + + + + + +

Motilidad * * * * * * * * * * *Lisina descarboxilasa + - + - + - + - + - +

Glucosa * + + + + + * + * + *Lactosa - + + + + + - + - + -

Sacarosa - + + + + + - + - + -Citrato + + + + + + + + + - +


Tabla 6. Tercer muestreoUbicacin geogrfica Norte Este Centro Oeste Sur


controlMuestra

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Rojo de metilo + - + + + + + - + - -

Vogues-Proskauer - + - - - - - + - + +Indol - - + + - - - - - - -H2S + - + + + + + - + - -

Motilidad * * * * * * * + * + +Lisina descarboxilasa + - + + - - - + - + -

Glucosa * + + + + + + + + + +Lactosa - + - + + + + + + + -Sacarosa - + - + + + + + + + -Citrato + + + + + + + - + + -



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Tabla 7. Cuarto muestreoUbicacin geogrfica Norte Este Centro Oeste Sur


controlMuestra

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Rojo de metilo + + + +

Noseencontrcolonia

sospechosa

+

Noseencontrcolonia

sospechosa

Noseencontrcolonia

sospechosa

+ + +

Vogues-Proskauer - - - - - - - -Indol - - + - + - + -H2S + + + + + + + +

Motilidad * * * * * * * *Lisina descarboxilasa + - - + - - + -

Glucosa * + + + - + + +Lactosa - - + + - + + +Sacarosa - - + + - + + +Citrato + + + + + + - -


Tabla 8. Quinto muestreo

Ubicacin geogrfica Norte Este Centro Oeste SurPrueba bioqumica

Cepacontrol

Muestra1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Rojo de metilo + + + + + + + + + + +Vogues-Proskauer - - - - - - - - - - -

Indol - - - - - - + + - + +H2S + - - + + + + + + + +

Motilidad * + + * * * * * * * *Lisina descarboxilasa + + + + + - + - + - -

Glucosa * - + + + + * * * * *Lactosa - - - - - + + + + + -Sacarosa - - - - - + + + + + -Citrato + + + + + + + - + + -


Respecto a los resultados del muestreo por el mtodo molecular, en las Figuras 3 a la 7 seobservan los productos de la amplificacin del ADN (Visualizacin mediante electroforesisen gel de agarosa al 1%de los productos de PCR de ADN de Salmonella). En el primer yquinto muestreo no hubo producto de PCR positivo para Salmonellaen ninguna muestra.En el segundo muestreo las muestras 2, 6, 8 y 10 amplificaron ADN positivo paraSalmonella. Amplificacin por PCR de muestras sospechosas de Salmonella.


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Figura 3. Primer muestreo Figura 4. Segundo muestreo

Figura 5. Tercer muestreo Figura 6. Cuarto muestreo


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Figura 7. Quinto muestreo

La Tabla 9 muestra una comparacin entre los resultados obtenidos mediante el mtodotradicional y el molecular, a partir de la cual se concluye lo siguiente: En la identificacinde la misma muestra positiva para Salmonellacoinciden 3 veces el mtodo tradicional y elmtodo molecular (amarillo) y difieren en la identificacin de la misma muestra positiva deSalmonellaen 6 ocasiones (azul). Esto indica que:

a) Al interpretar las pruebas bioqumicas pueden tomarse como positivas algunas de ellas,sin serlo (muestreo 5, muestras 3 y 4). Esto se debe a la formacin de H 2S en variaspruebas bioqumicas (SIM, TSI y LIA), lo cual impide tener certeza de la lectura y a suvez de la identificacin de la bacteria.

b) Las pruebas bioqumicas pueden dar falsos negativos (muestreo 2, muestra 2; muestreo3, muestra 2 y 7; muestreo 4, muestra 9). Como ya se explic anteriormente para elanlisis de la pruebas bioqumicas se toma solamente una colonia sospechosa deSalmonella del medio de crecimiento. Esto disminuye la probabilidad de tomar unacolonia verdadera de Salmonella aunque tenga las caractersticas morfolgicas. Alcontrario de las pruebas bioqumicas el mtodo molecular no dio este tipo de falsos

positivos y negativos. Esto es porque, el mtodo de PCR tiene una gran sensibilidad yespecificidad. Existen trabajos que sustentan los resultados que se obtuvieron en estetrabajo. Salmonellaspp. Se encontr en huevos mediante PCR y tcnicas tradicionales,obteniendo de 40 muestras 7 positivas mediante PCR y ninguna mediante el mtodotradicional dando como resultado 7 falsos negativos por este mtodo [Espinozaet al.,2001].Castaedaet al.[2004]compararon la tcnica de PCR con el mtodo tradicionalpara la identificacin de Salmonella spp. en 104 muestras de alimentos de las cuales, 5


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muestras dieron positivo mediante la PCR y slo 1 muestra de stas dio positivo en elmtodo tradicional, dando como resultado 4 falsos negativos.

c) El mes con mayor prevalencia de muestras positivas a Salmonella fue febrero. Unaposible explicacin del incremento de muestras positivas a Salmonellaprovenientes de

diferentes establecimientos puede ser la relacin que mantienen estos localescomerciales con un mismo proveedor.

Tabla 9. Resultados del mtodo tradicional y mtodo molecular

Muestreo MuestraPositivo para Salmonella

Mtodo tradicional Mtodo molecular

1) Febrero

1 No No2 No No3 No No4 No No5 No No6 No No7 No No

8 No No9 No No10 No No

2) Febrero

1 No No2 No Si3 No No4 No No5 No No6 Si Si7 No No8 Si Si9 No No

10 Si Si

3) Marzo

1 No No2 No Si3 No No4 No No5 No No6 No No7 No Si8 No No9 No No

10No No

4) Marzo

1 No No2 No No

3 No No4 No se encontr colonia sospechosa de Salmonella5 No No6 No se encontr colonia sospechosa de Salmonella7 No se encontr colonia sospechosa de Salmonella8 No No9 No Si

10 No No


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Muestreo MuestraPositivo para Salmonella

Mtodo tradicional Mtodo molecular

5) Abril

1 No No2 No No3 Si No

4 Si No5 No No6 No No7 No No8 No No9 No No

10 No No

La prevalencia de Salmonellamediante el mtodo molecular y tradicional se muestra en laTabla 10. La prevalencia que se obtuvo mediante el mtodo tradicional fue de 10%. Laprevalencia mediante el mtodo molecular fue de 14%. La diferencia del 4% que muestranestas dos metodologas es de importancia debido a que la informacin generada es de

relevancia epidemiolgica, por lo cual debe ser de lo ms precisa y confiable.Tabla 10. Prevalencias obtenidas mediante mtodo tradicional y molecular

Mtodo tradicional(Pruebas bioqumicas)

Mtodo molecular(PCR)

Muestras Positivas 5 7Muestras totales 50 50Prevalencia (%) 10 14

La prevalencia de Salmonella obtenida mediante el mtodo molecular de las muestrasanalizadas en este trabajo, se acerca a lo reportado por Bayona [2009] quien en carnemolida obtuvo una prevalencia de Salmonella spp. de 12.5%, y por Ynez et al. [2008]

quienes reportaron una prevalencia de 15.6 % de Salmonella spp. en carne molida. Estosdos autores confirman la validez de este trabajo debido a que los dos utilizaronmetodologas moleculares (PCR) y fueron realizados en Colombia, en regiones concondiciones climticas, sociales y culturales parecidas a las de Mxico, por lo que seesperaban resultados similares.

4 CONCLUSIONES

La sensibilidad y especificidad del mtodo molecular fue del 100%. La sensibilidad delmtodo tradicional fue de un 80% y una especificidad de un 50%.

La prevalencia de Salmonella en carne molida de res que se expende en carniceras deCiudad Valles, S. L. P., mediante el mtodo molecular fue de 14%. La prevalencia obtenidamediante el mtodo tradicional fue de 10%. La diferencia de estas prevalencias confirmalos resultados obtenidos en la validacin de los mtodos mediante la sensibilidad yespecificidad de cada uno, as como la importancia del mtodo molecular en laidentificacin especfica de patgenos en alimentos.


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5 AGRADECIMIENTOS

A la Secretara de Investigacin y Posgrado de la Universidad Autnoma de San Luis

Potos. A la BQ. Mayra Aguilar Zrate por su apoyo para la realizacin de este trabajo.

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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Hoja en Blanco

2013 carrillo et al. - salmonella

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