Péptidos . .

Vicior W. Rodwell, PhD

La polimerización de los L-alfa-aminoácidos por enlaces peptidicos constituye el marco estructural para las proteínas. Este capitulo describe las características de estos enlaces, las propiedades de los péptidos, los m&- todos para deteminar la estructura primaria de los mismos y de las proteínas así como las tdcnicas para la sintesis de péptidos.

Idos pdptidos tienen un enorme inteds biornédico, en particular para endocrinologia. Muchas de las hormonas son péptidos y pueden suminislrarse a los pacientes para corregir deficiencias (como la administración de insulina a pacientes con diabetes sacarina). Ciertos antibibticos son peptidos (por ejemplo, la valinomi- cina y la gsamicidina A), igual que algunos agentes antitumorales (como la bleomicina). Por su parte, el dipéptido aspartame se utiliza como edulcorante en muchas bebidas. La dpida síntesis quirnica y la tec- nologia de recombinacibn del DNA facilitan la pro- ducción de cantidades sustanciales de hormonas peptídicas que en el cuerpo existen solo en concentra- ciones rninimas, por lo cual son dificiles de aislar en cantidad suficiente para usarse en teraptutica. La misma tecnologia permite la slntesis de otras pépti- dos, también disponibles de fuentes naturales, pero solo en cantidades pequeilas (es eE caso de ciertos peptidos y proteínas viralec), para usarse en vacunas.

LOS L-ALFA-AMINOACIDOS SE UNEN MEDIANTE ENLACES PEPT~DICOS PARA FORMAR LOS PEPTIDOS

En la figura 5-1 se muestra un tripkpcido constituido por alanina, cisteina y valina. Advierta que un tripdp- tido es aquél formado con tres residuos. no con tres enlaces peptidicos. Por convencion, las estructuras peptidicas se escriben con el residuo amino-terminal (el residuo con un gmpo de alfa amino libre) a ta izquierda y con el residuo carboxiío terminal (et residuo con un gmpo alfacarboxiIo libre) a laderecha. Este péptido tiene un solo grupo alfa amino libre y un solo grupo a3fa carboxilo libre. Sin embargo, en al- gunos péptidos, los grupos terminales arnino o car- boxilo pueden derivarse (por ejemplo, una amina N-fomilo o una amida del gmpo carboxilo) y por tanto no están libres.

Alanil Cisteinil Valloa

Figura 5-1. Fbrmula estructural de un tripkptido. Los enlaces peptídicos están sombreados para enfatizarlos.

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Las estructuras de los péptidos son fáciles de representar

Por conveniencia, los peptidos se representan con su terminal amino a la izquierda y la terminal carboxilo a la derecha de la página. Para mostrar las estructuras de los péptidos, primero se dibuja la cadena principal o esqueleto y en seguida se agregan los grupos R apropiados. Escriba un zig-zag formado a partir de la secuencia de Atomos que se repite en el esqueleto o cadena principal: alfa-nitrbgeno, alfa-carbono, carbiin carbonilo.

Después, se completan las terminales atnino y carbo- xilo, se agrega un hidrogeno a cada uno de los alfa- carbonos y a cada nitrógeno del pbptido; ademhs se añade oxígeno a los carbonos carbonilos.

Por ultimo, se incluyen los grupos R apropiados (con sombra) a cada átomo de alfa-carbono.

lC\ /c\ /N \ / COQ-

/ c\ N C H

Ci-h l H /C\cY / O I

La secuencia de aminoácidos determina la estructura primaria de un péptido

Cuando el número, estructura y orden de todos los residuos de aminoácidos en un polipéptido se cono- cen, su estructura primaria ha sido determinada. Los aminoácidos cuyos grupos alfa-carboxilo participan en la formacibn de los enjaces del péptido se designan "residuos aminoacilo". Estos se denominan mediante la sustitucibn de las terminaciones -ato o -ina de los arninohcidos libres, por la terminación -ilo (como

alanilo, aspartilo, tirosilo). Los ptptidos reciben su nombre como derivados de la terminal carboxilo del residuo aminoacilo. Por ejemplo, el tmapéptido Lis- Leu-Tir-Gln se denomina como derivado de la glu- tamina y se le llama lisil-leucil-tirosil-glutamina. La terminación -ina en la glutmina indica que su grupo atfa-carboxilo no participa en la formación del enlace del péptido.

La estructura primaria afecta la actividad biológica

La mutación del DNA que altera codones puede pro- ducir la inserción de grupos aminoacilo inapropiados en un polipkptido o proteina. Aunque a menudo no tiene el mayor efecto biolbgico, en ocasiones incluso una sola sustitución puede reducir o abolir la actividad bioE6gica con efectos resultantes leves (es el caso de la intolerancia al alcohol en muchos asihtiticos) o mhs serios {como la enfermedad de ckluIas falciformes). Muchos errores metab6licos hereditarios comprenden un cambio sencillo de este tipo. Ai respeczo. b s nuevos mdtodos para determinar la estructura proteinica y del DNA han incrementado de manera notable la com- prensión de la bioquimica de numerosas enfer- medades metabolicas hereditarias.

Para dar nombre a los aminoácidos existentes en los péptidos se utilizan abreviaturas

Se utilizan las abreviaturas de 3 y de 1 letras de los aminolicidos (cuadro 4-1) para representar las esmc- turas primarias (figura 5-2). Las abreviaturas de tres letras ligadas por líneas rectas, qresentan una estructura primaria conocida e inequlvoca. Estas líneas se omiten para las abreviaturas de una sola l&a. Cuando hay incertidumbre acerca del orden preciso de una porción de un polipkptido, los residuos en duda se encierran en parentesis y separados por comas (figura 5-3).

Numerosos péptidos tienen actividad fisielogica

Las cklulas animales, vegetales y bacterianas con- tienen diversos polipkptidos de peso molecular bajo

Glu-Ala-Lis-Gli-Tir-Ala E A K G Y A

Figura 5-2. Representacibn de 3 y 1 letra de un hexa- pbptido.

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Figura 53. Heptapeptido que contiene una regidn de estruci tura primaria incierta (en el parbntesis)

(3 a 100 residuos aminoacilos) que tienen actividad fisioldgica importante. Algunos, incluyendo la mayo- ría de las hormonas polipeptidicas de tos marniferos, contienen solo enlaces peptidicos formados entre los grupos alfa-amino y alfa-carboxilo de los L-aifa-ami- nohcidos de las protelnas. Sin embargo, en los polipéptidos también pueden existir aminoacidos o derivados de aminohcidos proteinicas adicionales.

El glutatihn (figura 541, en el cual el glutamato amino-terminal estB enlazado a la cisteína por un enlace alfa no peptidico, es requerido por varias enzi- mas. El glutatión y la enzima glutatibn reductasa participan en la forrnacibn de los puentes disulfuro correctos de numerosas hormonas proteinicas y poli- peptidicas así como tarnbidn en el metabolismo de los xenobióticos (capitulo 6 1).

Los antibióticos polipeptidicos elaborados por hongos contienen aminohcidos D y L así como otros no presentes en las proteinas. Ejemplos son la tiroci- dina y la gramicidina S, polipkptidos clcIicos que contienen n-fenilalanina y e[ aminohcido no pro- teinico ornitina.

La hormona liberadora de tirotropina (TRH, del inglds, flyrotropin-releming hormone} (figura 5-5) ejemplifica otra variante más. El glutamato amino-ter- mina1 experimenta ciclizaci6n a hcido pirogluthmico y el carboxilo del propilo carboxilo terminal se arnida.

Un polipéprido de mamífero puede contener más de wn +pido con actividad fisiol6gica potente. Denm de la estructura primaria de la beta-lipotropina (hor- mona hipofisaria que estimula la liberación de hcidos grasos del tejido adiposo) hay secuencias de ami- nohcjdos que son comunes a otras hormonas polipep-

O II

CH, H I 1

/C\N/CH\C/N\CH, CHz 1 I

H II O

I 7% COO - H-C-NH~+

I COO -

Figura 6 4 . Glutatibn (gamma-giutarnilcisteinil-glicha). Ob- sérvese el enlace ara no peptldiw que une a la Glu con Cis

Flgura 5-5. TRH (pir~lutamilhistidiIprolinamida).

tidicas con actividades fisioldgicas diversas (figura 54). El poli@ptido grande es un precursor de los poIipkptidos menores.

Los peptidoc con polielectrólitos

El enlace peptidico (mida) no estA cargado a cual- quier pH de interés fisiolligico. Por tanto, la forrnacibn de péptidos a partir de arninohcidos a pH de 7.4 se acompafia de una pérdida neta de una carga positiva y una negativa, por cada en!ace peptidico formado. No obstante, a pH 5siolbgico los peptidos son maléculas con carga debido a sus grupos R ácidos o básicos.

El enlace peptidico tiene carácter de enlace doble parcial

Aunque los péptidos se representan con un enlace sencillo que conecta los htomos alfa-carboxilo y alfa- nitrdgeno, este enlace tiene en realidad un caracter de doble ligadura parcial (figura 5-7). No posee libertad de rotación alrededor de[ enlace que conecta a los htomos C y N. En consecuencia, los cuatro iitornos mostrados en la figura 5-7yacen en el mismo plano, esto es, son coplanares. Esta semirrigidez tiene con- secuencias importantes para órdenes de estructura proteínica superiores al primer nivel. Por el contrario, hay plena libertad de rotacibn alrededor de los enlaces remanentes del esqueleto polipeptidico. En la figura 5-8, que resume estos conceptos, los enlaces que tienen rotación libre estan circundados por flechas y los átomos coplanares se han sombreado.

Las fuenas no covalentes restringen la conformación de los péptidos

Un polipkptido puede tener un gran número de con- formaciones (disposiciones espaciales). Sin embargo, en solución tiende a predominar un número mucho menor de conformaciones. Estas conformaciones fa- vorecidas resultan de factores como bloqueo espacial,

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42 a Biogulmica de Har~er (Capitulo 5)

Metionina- encefalina

Figura 54. Estructura primaria de la beta-lipotropina. Los residuos 41 a 58 son la hormona estimulante de los melanocitoc (0-MSH). Los residuos 61 a 91 mntienen las estructuras primarias de las endorfinas sefíaladas.

interacciones coulómbicas, puentes de hidrhgeno e in- El m g o de variacibn de los residuos no consewados teracciones hidrbfobas. Tmto para que las proteinas, de una proteína entre especies indica la divergencia de como para que los poli@ptidos (capítulo 6) tengan actividad fisiológica se reqviercn ~onformaciones específicas.

SECUENCIACI~N PROTE~NICA: DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA

La comparación de las secuencias de los peptidos muestra residuos clave e interrelaciones filogenéticas

La comparacibn de las estructuras primarias de una proteína determinada entre organismos con reIacibn distante, proporciona indicios vitales respecto al modo en que una proteína puede servir como compo- nente del citoesqueleto, transportador de electrones o catalizador.

Ffgun 5-7. La estabilrzacibn por resonancia del enlace peptidico le confiere un cardcter de doble enlace parcial, de ahi la rigidez en el enlace C-N.

Ftgura 5 4 . Dimensiones de una cadena polipeptidica com- pletamente extendidas. Los cuatro $tomos que se encuen- tran en las áreas sombreadas, las cuales son coplanares, comprenden al enlace polipeptidico Los átomos en las áreas no sombreadas son los átomos alfa carbono, alfa hidrbgeno y el grupo alfa R de un aminofiado en particular. La libre rotacibn puede producirse alrededor de los enlaces que unen el alfa carbono con el alfa nitrbgeno y las funciones del alfa carbonilo (flechas azules). La cadena de polipéptido ex- tendida es asi una estructura semirrigida con dos teroeras partes de los Btomos de la estructura unidos en una relación planar fijada La distancia entre los Btomos alfa carbono adyacentes es de 0.36 nm (3.6 A) También se muestra la distancia interatbmica y los Angulos de enlace, los cuales no son equivalentes (Redibujada y reproducida con autori- racibn de Pauling L, Corey LP. Branson HR, The structure o€ proteins Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci USA 1957;37:205.)

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las mismas durante la evolucibn. Las relaciones evolu- tivas estrechas se vinculan con un alto grado de seme- janza de las secuencias. mientras que las relaciones mas distantes corresponden a más diferencias en las secuencias. Esta interrelacibn, que primero se docu- mentb en el iibicuo residuo 104 a 1 11 del polipeptido transportador de electrones citocromo c, se mantiene como verdadera en un número cada vez mayor de proteinas.

Los peptidos se purifican antes del análisis

Los datos de secuenciacion de los pdptidos serlan ininterpretables a menos que la homogeneidad pep- tídica. valorada por EGPASDS. excediera de 95 por ciento. Por tanto, los pkptidos deben purificarse primero mediante tkcnicas convencionales de purifi- cacibn de proteínas (capitulo 8).

Por lo general primero se determina la composición de los aminoácidos

1,a determinación de los aminoácidos que componen un péptído, por lo general, se lleva a cabo antes de iniciar la secuenciacion, para identificar los posibles escollos y, de manera subsiguiente verificar los datos de secuenciacidn. Primero se rompen los enlaces peptldi- cos que unen a los aminohcidos por hidrólisis. Luego, los aminoicidos liberados se separan e identifican por LLAR o cromatografia de intercambio i6nico.

Ningun procedimiento hidroliza pkpcidos de manera total sin algunas pdrdidas. El mdtodo de: eIec- cibn es la hidrdlisis de muestras repetidas en HCI 6N a 110 "C en tubos de vidrio sellados al vacío por 24, 48,72 y 96 horas. Esto destruye todos los Tri y Cis, y si estan presentes iones rnetblicos, se pierde algo de Met y Tir. I,a recuperacibn de Ser y Tre es incompleta. Los enlaces Val-Val, Ile-[le, Val-Ile e Ile-Val, son muy resistentes a la hidrdlisis, en tanto que Gln y Asn son desarninados a GIu y dsp .

¿Cómo se superan estas dificultades? Antes de la hidrdlisis, la Cis se convierte en hcido cisteico, un derivado ácido estable. El Tri se mide desputs de la hidrdlisis bhsica, proceso que destruye a la Ser, Tre, Arg y Cis. Los datos de Ser y Tre se extrapolan al tiempo cero de la hidrdlisis. La Val y la t e u se determinan de datos obtenidos a las 96 horas. Sobre los hcidos dicarboxilicos y sus arnidas se informan de manera colectiva como "Glx" o "Asx". Por ultimo, dado que las proporciones relativas de cada ami- nohcido deben expresarse en números enteros, las fracciones decimales se redondean al nhrnero entero más próximo.

Sanger fue el primero en secuenciar un polipéptido

Casi cuatro ddcadas han transcurrido desde que Sanger detenni116 la estructura primaria completa de la hormona polipeptidica insulina. La idea de Sanger h e separar primero las dos cadenas polipeptídicas, A y 0, de la insulina y entonces convertirlas, mediante separación enzimhtica especifica, en péptidos más pequeílos que contuvieran regiones de secuencia so- brepuesta. Utilizando el reactivo l -fluoro-2,4-din i - trobenceno (figura 5-9), entonces removio e identificó, uno en cada ocasibn, los residuos amino- terminales de los aminokcidos de estos pkptidos. Por medio de la comparación de las secuencias de pépti- dos sobrepuestas. fue capaz de deducir una estructura primaria inequívoca para ambas cadenas, A y B.

Las siguientes dos tkcnicas han revolucionado la determinación de las estructuras primarias de los polipkptidos (proteínas). La primera fue la introduc- ci6n por Edman, en 1967, de un procedimiento para la separacion e identificación automfitica de residuos ítmino terminales de aminoácidos asi como sus deri- vados feniltiohidantoinicos. La segunda fue la intro- ducción independiente por Sanger y por Maxm y Gilbert de tkcnicas para la secuenciación rápida del DNA. En la actualidad, la estrategia óptima consiste en utili7ar ambas técnicas de manera simulthnea.

Las estructuras primarias de los polipéptidos se determinan por la técnica automatizada de Edman

Dado que numerosas protelnas están constituidas por más de una cadena polipeptidica ligada por fuerzas no covalentes o pos puentes disulfuro, es posible que el primer paso sea disociar y separar las cadenas poli-

Figura 5-9. Reacción de un arnino~cido con 1-fluoro-2,4- dinitrobsnmno (reactivo de Sanger). El reactivo recibe ese nombre en honor del bioqulmico Frederick Sanger, laureado con el premio Nobel en 1958. quien lo us6 para determinar la estructura primarta de la insulina.

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peptídicas individuales. Los agentes desnaturalizantes como ta urea o el clorhidrato de guanidina destruyen los puentes de hidrógeno, y disocian polipéptidos unidos de modo no covalente. Por su parte, los agentes oxídantes y reductores rompen los puentes disulfuro (figura 5-1 0). Entonces los polipCptidos son separa- dos pos cromatografia.

Los polipéptidos largos se fraccionan antes de su secuenciación

[,os instrumentos automáticos mas eficaces para Ia obtencibn de secuencias (secuenciadores) operan so- bre polipéptidos de 20 a 60 residuos de longitud. Por tanto, es deseable una partición especifica y completa en sitios relativamente raros. Los reactivos siguientes cumplen con este requerimiento.

A. Bromuro de cianógeno (CNBr) Inicialmente, los residuos de cisteina son modificados con ácido yodoacético. Despuks, el CNBr rompe en el lado COOH de la Met. Puesto que la metionina es comparativamente escasa en los polipéptidos, por lo general se producen fragmentos peptidicos dentro de los limites de tamafio deseado.

B. Tripsina La tripsina rompe el lado COOH de los residuos Lis y Arg. Si los residuos de lisina son obtenidos con

Figura 5-10. Separacibn oxidativa de cadenas polipeptldi- cas adyacentes enlazadas por puentes disulfuro (sombre- ado) por Bcido perfbrmrco (lzqulerda) o la separacidn reductiva con beta-mercaptoetanal (derecha) forman dos pbptidos que incorporan residuos de Acido eisteico o de cisteinilo, respectivamente.

anhidrido citracbnico (una reacción reversible) para cambiar su carga de positiva a negativa, ahora la tripsina se separa solo despues de Arg. La obtención de residuos de arginina es menos útil, debido a la abundancia relativa de residuos de lisina. No obstante, resulta de utilidad en la divisihn subsecuente de frap- rnentos obtenidos con CNBr.

C. o-Yodosobenceno El o-yodosobenceno fracciona los relativamente esca- sos residuos de Trí-X. No se requiere una proteccibn previa de los demas residuos.

D. Hidroxiiamina La hidrox i larn ina separa los enlaces comparati- vamente raros de Asn-Gli, aunque por 10 general no da resultados cuantitativos.

E. Proteasa V8 La proteasa V8 de Staphylococcus aureus separa los residuos Glu-X-pdptido con preferencia por condicio- nes en que X es hidrdfobo. La uni6n Glu-Lis resiste el fraccionamiento. Esta reaccibn es útil para la de- gadacibn subsecuente de fragmentos obtenidos con bromuro de cianógeno.

F. Hidróiisis con ácidos moderadamente débiles Esta separa el enlace raro ~sp-!+o.

La secuenciación requiere de múltiples digestiones

Las 2 o 3 digestiones del polipdptido original, normal- mente en Me[, Tri, Arg y Asn-Gli, combinadas con subdigestiones apropiadas de los fragmentos resultan- tes, por lo general permitir& la determinacibn de la estructura primaria completa del polipeptido. Excep- tuando algunas dificultades extraordinarias en la pu- rificacibn de los fragmentos, ksta puede efectuarse con unos pocos micromoles del polipéptido.

LAS MEZCLAS DE PÉPTIDOS DEBEN SEPARARSE ANTES DE LA SECUENCIACI~N

La purificación de fragmentos se logra principalmente por filt~aci6n en gel en iicido acético o fbmico por cromatografia liquida de alto rendimiento de fase invertida (CLAR) o por cromatografía de intercambio i6nico en fosfocelulosa o en sulfofenil-Sephadex en soluciones de k i d o fosfbrico.

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A. Cromatografia de intercambio iónico y electro foresis de alto voltaje (EA Estas técnicas (capitulo 4), que separan con base en la carga, se adican a polipkptidos de peso molecular bajo y también a aminoácidos. El valor de pK para el grupo carboxilo-terminal del hcido alfa-carboxilico de un polipéptido es más alto que el del grupo alfa- carboxilo en el aminoAcido correspondiente (es decir, el COOH peptídico es un hcido mas dkbil). De manep inversa, el grupo amino-terminal es un ácido rnhs fuerte (tiene un pK menor) que el aminoacido del cual proviene.

B. Filtracibn en gel La secuenciación automatizada utiliza cantidades pequeiias de polipéptidos grandestde 30 a 100 residuos). Sin embargo, muchos polipkptidos de peso molecular alto desnaturalizados pueden ser insofubles debido a la exposicibn de residuos hidrófobos antes escondidos durante la desnaturalimciiin. Aunque la insolubilidad puede resolverse con urea, alcoholes, hcidos orgánicos o bases, estos restringen el uso subsiguiente de tCcni- cas de intercambio ibnico para la purificacibn de péptidos. Sin embargo, la filtración en gel de ptptidos hidrbfobos grandes puede llevarse a cabo entre hcido formico o acético, I y 4 molar. Esta tkcnica separa moliculas de tamaflos diferentes con base en su ex- clusión o inclusión en los poros de un filtro molccular como Sephadex.

C. CLAR de fase invedida Una tdcnica potente para la purificación de péptidos no polares de peso molecular grande es la cromato- grafia líquida de alto rendimiento en material no polar con elucibn mediante solventes polares (CLAR de fase invertida). La filtracibn en gel y la CLAR de fase invertida se emplean juntas para purificar las mezclas complejas de péptidos obtenidas por digestibn parciai de proteinas.

D. EA V en filtros moleculares La filtracirin molecular puede usarse junto con la separacibn por carga para facilitar la particibn. Aunque es posible emplear almidbn y agarosa, el soporte mhs común es un polimero de enlaces cruzados de acrilarnida (CHi=CN-CONH2). Para la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA), las soluciones de pro- teínas se vacian en tubos o se aplican en placas que contienen un amortiguador de poliacrilamida can 2 a 10% de enlaces cruzados por inclusibn de bisacrilamida de metileno (bis) (CHZ=CH-CONH~)~-CH~ o reactivos con enlaces cruzados similares. Luego se aplica corriente directa. La visualizacián se logra por tincibn con azul de Coornassie o Ag". Una variante popular es la EGPA bajo condiciones de desnaturali- zacihn. Las proteinas se hierven y a continuacibn se

someten a etectroforesic en presencia del compuesto desnaturalizante dodecilsulfato sbdico (SDS). Ea molécula con carga negativa CH3-(CH2)ii-S012- recubre a los pkptidos en la proporcibn aproximada de un SDS por cada dos enlaces peptidicos. Esto "sumerge*' la carga original de la proteina, volvien- dola fuertemente negativa. Así, las separaciones sub- siguientes se basan de manera primaria en el tamaflo molecular. El EGPA-SDS se usa de manera extensa para determinar los pesos moleculares de péptidos por comparación de sus movilidades con la de esthdares de pesos moleculares conocidos.

Para la secuenciación se utiliza la reacción de Edman

La secuenciación automatizada utiliza el reactivo de Edman, fenilisotiocianato. La reaccion de secuencia (figura 5-1 1) libera el aminohcido arnino-terminal como un derivado de la feniltiohidantoina, el cual se identifica mediante C LAR. E! prbximo arninoálcido por secuenciar entonces se deriva y se elimina; luego se repite el proceso. Una secuencia de 30 a 40, o, en ocasiones, 60 a 80, residuos aminoácidos se determina en una operación continua. Las reacciones de Edman se llevan a cabo en una pelicula delgada sobre la pared de una cámara de reaccibn giratoria o en una matriz s61ida a la cual el carboxilo terminal del pdptido se ha acoplado de manera covalente. La secuenciación en fase gaseosa, una técnica en fase sblida, emplea reactivos gaseosos y facilita la remoción de productos gaseosos. Los metodos de secuenciacibn en fase sólida son aplicables a cantidades muy pequefias de péptidos, en algunos de hasta 1 pg.

Deben secuenciarse varios péptidos sobrepuestos

Conocer la secuencia de todos los peptidos CNBr de una proteina no proporciona, por si mismo, su estruc- tura primaria completa ya que no se sabe el orden en que estos péptidos se encuentran en la proteína. Para deducir una estructura primaria inequívoca tambikn deben prepararse y cecuenciarse péptidos adicionales cuyas teminaies m i n o y carboxilo se sobrepongan con los de los peptidos CNBr. Estos ptrptidos adicio- nales se producen por tecnicas (por ejemplo, digestion con quimiotripsina) que dividen la proteina en otros lugares distintos aresiduos Met. Luego, La deduccibn de una estructura primaria inequivoca por comparación de secuencias peptidicas se efectiia por un proceso aniilogo al ensamblaje de un rompecabezas (figura 5-12).

Para localizar los puentes disulfuro, los péptidos de protelna sin tratar y de proteina reducida u oxidada

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46 0 Bioquímica de H q e r (Capítulo 5j

Fenilisotrocianato (reactivo de Edrnan) y un peptido

metano

Una feniltiohidantolna y un peptido mds corto en un residuo

Figura 5-71. Reaccidn de Edman. El fenilisotiocianato reac- ciona con el amino-terminal de un residuo de un peptido para dar acido feniltiohidantotw El tratamiento con acido en un solvente hidroxilim libera una feniltiohidantoína la cual es identificada posteriormente mediante su movilidad crorna- togrhfica y un phptido mas corto en un residuo. Entonces el proceso se repite

se separan por cromatografía bidimensional o por electroforesis y cromatografía (huellas dactilares). La visualizacidn con ninhidrina revela los piptidos mhs escasos en la digestión de protelna sin tratar y un pkptido adicional en la digestibn de proteina tratada. Con el conocimiento de la estructura primaria de estos péptidos, es posible inferir las posiciones de los puen- tes disulfuro.

Pomi6n C-terminal del peptido X

Porcibn N-terminal del pbptido Y

Figura 5-32. Uso del peptido Z sobrepuesto para deducir que los pépttdos X y Y ectbn presentes en la proteina original e n e l o m ' e n X ~ Y , n o Y t X .

La secuenciación de péptidos y de DNA son técnicas complementarias

Aunque la simplicidad y velocidad de la técnica de secuenciacibn del DNA (capítulo 42) ha revolucionado la forma en que se determinan las estructuras peptidi- cas; la secuenciación de péptidos y DNA son tecnicas complementarias más que mutuamente exclusivas, cada una con ciertas ventajas.

En tanto que las estructuras primarias de las pro- teínas se pueden deducir mediante la secuenciación de los genes que Eas codifican, la secuenciacibn directa de las proteínas continúa siendo esencial para el anhlisis de su estructura. La secuenciación del DNA no puede mostrar la posición de los puentes disulfuro o la presencia de otras muchas modificaciones pos- traslacionales. Los codones triples y tas moléculas apropiadas de tRNA solo se encuentran disponibles para Eos 20 arninoacidos más comunes. Por tanto, la secuenciacjbn del DNA no puede revelar la presencia de propilo, hidroxilisil o un hutsped metilado, iso- prentilado, fosforitado, esterifjcado u otros residuos aminoacilo postraslacionales modificados que efecttian funciones esenciales en proteinas especificas. Así, la técnica de Edman continuarii siendo fundamental para demostrar la determinación esrruct~ral de pkptidos y proteínas.

Aunque la secuenciacibn de péptidos no presenta estas desventajas, muchos de ellos experimentan una o más modificaciones postraslación por procesamiento proteolítico. Por tanto, la secuenciacibn de DNA es una ayuda valiosa para detectar prepéptidos y pre- propkptidos Ilibiles importantes en la cathlisis (capitulo 10) o en la sefializacibn de péptidos dirigidos a organelos subcelulares específicos.

La espectometria de masas puede utilizarse para secuenciar péptidos

El bombardeo rápido de fitomos (BRA) unido a la espectrometria de masas (EM), en dos espectrómetros

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de masa integrados. proporciona un camino alterna- tivo para secuenciar péptidos con longitud de alrededor de 25 residuos. El bombardeo rápido por átomos de argon o xenbn, de los htomos de un péptido disuelto en glicerol forma un ibn pkptido con carga positiva. El primer espectt-ografo de masa limpia el ion gkptido de iones contaminantes, y luego lo transfiere a una celdilta en donde colisiona con atomos de helio. Debido a la energía que absorbe, el ion pkptido se fragmenta a partir de sus dos terminales con lo cual forma mlilti- ples iones de tamafío decreciente. Entoncw, en el segundo espectrómetro de masa se determina la masa molecu- lar de estos fragmentos del ion.

La comparacion de los iones de acuerdo con los incrementos sucesivos de masa, permite la identificación de todos los fragmentes aminoacilo y de la secuencia del péptido completo. La tkcnica BRA dirigida por computadora es muy rápida, no requiere pkptidos al- tamente purificados, identifica residuos modificados por traslacibn y, a diferencia de la tdcnica de Edman, puede cecuenciar péptidos cuyas terminales amino están bloqueadas (por ejemplo, aciladas). En compa- ración con los secuenciadores avanzados de Edman, las principales desventajas del BRA-EM son su alto costo y menor sensibilidad.

LOS PÉPTIDOS PUEDEN SINTETIZARSE MEDIANTE TECNICAS AUTOMATIZADAS

Las péptidos que se obtienen mediante síntesis qulmica sirven como fArmacos o aditivos alimentarios. La capacidad para sintetizar conjuntos de peptidos simi- lares, cuyas estnicturas primarias difieren sblo un poco, permite profundim en el conocimiento de la relacibn entre la estructura del péptido y la actividad bioldgica.

La qufmica básica de la sintesis de los péptidos, desarrollada a fines del decenio de 1800 por el químico a lemh Emil Fisisher, proporciona los elementos para la activaci6n de los grupos carboxilo y para la adición y eliminación de los grupos bloqueados, que evita reacciones colaterales indeseables. Muchos aAos des- pues, las tkcnicas de sintesis de los pbptidos fueron evolucionados por Bmce MerrifieEd (Premio Nobel 19841, quien desarrollb la síntesis en fase dlida. La tdcnica automeica de síntesis de Merrifield que pro- duce ptptidos largos sintkticos en periodos cortos, inicib un renacimiento en la química de los péptidos.

Síntesis de peptidos en fase sólida

Figura 5-13, Representaubn sirnbblica de la sintesis de un dipéptido genérico por la técnica de fase s6Fida iniciada por MernReld Véase el texto para explicación de los simbolos.

la termina carboxito del residuo aminoacilo), rne- diante la tkcnica en fase s6lida de Merrifield y resume las reacciones que se requieren para sintetizar un ptptido de cualquier tamaño deseado. Estos pasos son como sigue:

1) Proteger las terminales amino del aminohcido A (en blanco) y del arninoiicido B (en negro) con el grupo t-butiloxicnrboniIo (t-BOC) (m):

famando t-BOC-A y t-BOC-B. 2) Activar el gmpo carboxilo de t-BOC-B con dici-

clohexilcarbodiimida (DCC) (b): La figura 5-1 3-muestra la sintesic de un dipéptido A-B representativo (en el cual A es la terminal m i n o y E

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48 Bioquimica de Hurper (Capítulo 5)

3) Hacer reaccionar al grupo carboxilo del ami- noácido A (que se convertírh en el residuo carboxilo- terminal del peptido) con una resina activada de poliestireno insoluble @I

4) Eliminar al grupo protector de r-BOC-A con ácido tnfluoroac&tico (TFA, F 3 C 4 0 0 N ) a la temperatura ambiente.

(Nota: En la prhctica, es posible omitir los pasos 3 y 4 puesto que ya se dispone en el comercio de resinas con cualquier aminoácido f-BOC conectado por un enlace éster a una moltcula "enlazadora" de fenilacetamidometilo, PAM, del inglks, p h e ~ - lucetamidometkyí), adherida al pol iest ireno.

5 ) Condensar el grupo carboxilo activado de t-BOC- R con el grupo amino libre del inmovilizado A.

6) Eliminar el grupo protector (d-BOC) con TFA (véase paso 4).

7) Liberar el dipéptido A-13 de la particula de resina por tratamiento a -2 "C con hcido hidroflubico (HF) en diclorometano.

Los logros iniciales de la técnica de Merrifield fueron la síntesis de las cadenas A y B de inculina y de la enzima pancrektica ribonucleasa. Mejoras subsecuen- tes han reducido el tiempo para la sintesis y han incrementado el rendimiento de manera significativa. Esto ha abierto el campo para producir vacunas y hormonas polipeptldicas y aun puede pensarse en tratar errores congénitos del metabolismo selec- cionados.

RESUMEN

Los pkptidos, formados por la pérdida de agua entre los grupos carboxilo y amino de los aminohcidos, se designan de acuerdo al numero de aminoicidos pre- sentes. Sus estructuras primarias (orden de aminoácidos listados desde la amino-terminal) determinan la ac- tividad biológica y las conformaciones. Los péptidos

REFERENCIAS

Allen G: Sequencing of proteins and peptides. In: Labora- tory Techniques rn Biochemistry rvnd Molecular Riul- o&, 2nd edl Burdon RH, Knippenberg PH. Elsevier, 3989.

Bhwon AS: ProieidPeptide Sequence Analysis: Current Meihodologies. CRC Press. 1988.

Bienmann K: Mass spectrometry of peptides and proteins. Annu Rev Biochem 1992;61:977.

Deutscher MP (editor): Guide bo Protern PuriJicabron. Methods in Enzymology, vol 182, 1990.

Doolittle RF (editor): Makcular Evolirtion: Campufer A nalys~s ofProlein nnd Nucleic AcidSeguences Meth- ods in Enzymology, vol 183, 1990.

pequefios pueden contener enlaces diferentes a alfa-pep- tidilo y aminolcidos poco comunes. Como poiielec- trblitos, los pkptidos se separan por crornatografia de intercambio iónico y técnicas electrofor&ticas.

El carácter de doble ligadura parcial del enlace que une al carbono del COOH y al N de un péptido, hace que cuatro Iitomos del enlace peptidiw sean coplanares. Esto limita el numero de conformaciones peptidicas posibles. En solucibn. estas conformaciones son res- tringidas aún m8s por fuerzas no covalentes.

Despuks de la hidrblisis Acida es posible detemi- nar la composición de los péptidos purificados, pero se requiere correccihn por perdida de ciertos ami- nolcidos. La determinacibn de la estructura primaria emplea tkcnicas de Edman automatizadas, que pueden realizar la secuenciacibn en cantidades tan pequefias de hasta microgramos de phptido purificado. Primero se oxidan o reducen los enlaces disuffuro. Las pépti- dos grandes se escinden en sitios raros con reactivos como CNBry los pkptidos resultantes se purifican por filtración en gel y CLAR. Luego pueden enlazarse por su terminal carboxilo a un soporte sólido para facilitar la secuenciacibn. Lar operaciones automáticas subsiguien- tes comprenden quimica de líquidos o reactivos y productos gaseosos que facilitan la recuperación y puri- ficacibn de la muestra. Por lo general pueden secuen- ciarse hasta 40 residuos mino-tem inales sucesivos. Para definir el orden de ensamblaje de los ptptidos secuen- ciados en el polipéptido original. se determina la secuencia de péptidos sobrepuestos generados por diferentes ttcnicas de partición. De manera alterna, los enlaces entre péptidos pueden inferirse de la secuencia de DNA del gen apropiado. Por tanto, las tkcnicas de secuenciacion de DNA y péptidos son complementarias, no mutuamente excluyentes. Ademis, las tkcnicas automáticas permiten la síntesis inequívoca de pdptidos de estructura primaria cono- cida y actividad biol6gica completa..

Doolittle RF: Reconstructing history with mino acid se- quences. Protein Sci 1992; 1: E 91.

Fenselau C: Beyond gene sequencing: Analysis of proteín structure with mass spectrometry. Annu Rev Biophys Biophys Chem 1991;20:205.

Hunkapiller m, Strickler JE, Wibon KJ: Contempo- rary methodology fos protein structure determination. Science 1984;226:304.

Karger BL, Chy YH, Foret P: Capillary electrophoresis of proteins and nucleic acids. Annu Rev Biophys Bio- mol Struct 1995;24:579.

Kent SBH: Chemical synthesis of peptides and proteins. Annu Rev Biochem 1988;57:957.

www.Libro

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m

MerrifieEd RB: Sol id phasc synthec i s . Science 19&6:232:341.

Ozols J : Amino acid analysis. Methods Enzymol 1990; 182 587

Regnier FE, Gooding KM: High performance liquid chro- matography of proteins. Anal Biochem 1980.103: 1 .

Sanger F: Sequences, sequences. and sequences. Annu Rev Hiochem 1988;57: 1 .

Senko MW, McLafferty FW: Mass svctrometry of mac- romolecules Has its time come now? Annu Rev Rio- phys Riomol Struct 1994:23.763.

Stellwagen E: Gel fi ltration. Methods Enzymol 1990:182:317

Stoscheck CM: Quanlilation of proteins. Methods Enzy- mol 1990,182:50.

Strickler JE, Hunkapiller MW, Wilson KJ: Utility of the gas-phase sequencer for both liquid- and solid-phse degradaiion of proteins and peptides al law picomole levels. Anal Biochem 1984: 140:553.

Wilson KJ: Micro-leve1 protein and peptide separations. Trends Biol Sci 1989; 14:252.

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