10-investigacion en biodeterioro

BIMA-Biodeterioro y Biodegradación de Materiales. ETSII-UPM. Diego A. Moreno y Ana M. García Pág. 1 de 35

UNIDAD 10

INVESTIGACIÓN EN BIODETERIORO Y BIODEGRADACIÓN

Introducción y Objetivos de la Unidad La última Unidad de la Asignatura está dedicada a la Investigación del

Biodeterioro y la Biodegradación de los materiales. Una vez que hemos estudiado los

materiales susceptibles de sufrir Biodeterioro, los agentes biodeterioradores y las causas

de su desarrollo sobre los materiales, debemos conocer cómo abordar el estudio de estos

procesos para, posteriormente poder aplicar los mecanismos de prevención y control

que ya tratamos en la unidad anterior. Los objetivos de la Unidad son:

Conocer el funcionamiento y desarrollo de una auditoría.

Identificar las etapas de una investigación en Biodeterioro y las medidas

a realizar en cada una de ellas.

Aprender las diferentes técnicas de ensayo de Biodeterioro, así como de

detección de los microorganismos implicados.

Índice de la Unidad

1. La Auditoría de la Fábrica

1.1. Evaluación de Estrategias de Control

1.2. Instauración del Sistema de Control

1.3. Monitorización de la Eficacia del Sistema

2. Técnicas de Detección de Microorganismos Causantes de Biodeterioro

2.1. Muestreo

2.2. Detección y Enumeración

3. Técnicas de Ensayo de Biodeterioro

3.1. La Selección Preliminar

3.2. El Ensayo de Simulación Medioambiental

3.3. El Ensayo de Campo

3.4. Ensayos Normalizados en Biodeterioro

4. Técnicas Recientes de Investigación en Biodeterioro

4.1. Técnicas de Análisis de Ácidos Nucleicos

Unidad 10. Investigación en Biodeterioro y Biodegradación


4.2. Análisis de Comunidades

4.3. Proteómica

4.4. Técnicas de Análisis de Superficies

4.5. Microsensores

5. El Futuro



La prevención y el control de un problema de Biodeterioro requieren el

conocimiento de la composición del producto, de los detalles del proceso y la

fabricación, información sobre la cadena de suministro y la aplicación para poder

recomendar la solución más justa para todas las partes implicadas. Ya que los materiales

involucrados tienen un valor, puede ser necesario establecer o repartir la responsabilidad

para abordar un problema y, por tanto, en algunos casos se puede necesitar un “enfoque

forense”.

En las dos últimas décadas, la experiencia en esta área ha sido recogida por los

fabricantes y formuladores de los productos de conservación como parte del servicio de

atención al cliente. Han desarrollado metodologías y construido bancos de datos con su

experiencia y han revisado minuciosamente las normas nacionales e internacionales

para la evaluación de la eficacia de los productos de conservación y la durabilidad de

los materiales para los que se requiere resistencia microbiana. En ciertas áreas, como la

de la madera, la piedra y la alimentación, todavía existen agencias gubernamentales y

algunas consultorías que pueden proporcionar una visión independiente.

Para la investigación de un problema de Biodeterioro, es necesario considerar

cuatro etapas:

Determinar la causa.

Valorar posibles sistemas de control.

Establecer el sistema de control más apropiado.

Monitorizar el éxito (o lo contrario).

1. La Auditoría de la Fábrica Muchos problemas de Biodeterioro tienen su origen en los procesos industriales

y es imposible apreciar todos los factores involucrados a menos que se haga una visita

al lugar de manufactura y se efectúe una inspección completa de la situación. De esta

manera, se puede recoger información acerca del almacenamiento y manipulación de las

materias primas, configuración del equipo de fabricación, fases del proceso de

fabricación y almacenamiento final o sistemas de distribución. Los problemas de

Biodeterioro en las fábricas son, a menudo, complejos y suponen la interacción de

varios factores de naturaleza interdisciplinar. Uno de los principales factores de esta

complejidad es la participación de personas que tienen un conocimiento muy escaso de



este campo y poca o ninguna formación en biología. Por lo tanto, el técnico no solo

tiene que ser experto y competente en los problemas técnicos, sino que además también

debe de ser perito en detección y en saber buscar compromisos con diplomacia. Antes

de que un problema de Biodeterioro se pueda resolver, hay que reconocerlo. Los

problemas no microbianos pueden ser relativamente fáciles de diagnosticar. Varios

centímetros roídos por ratas en la parte inferior de una puerta, marcas de dientes de

roedores en el cableado de un equipo de radio junto con sus excrementos, ejércitos de

cucarachas en marcha en una sala de un hospital, todos son signos bastante claros de un

problema biológico y la mayoría de la gente sería capaz de reconocerlos como tal. Lo

que ocurre con los microorganismos es completamente diferente. Por definición, estos

organismos son difíciles de ver y se encuentran inmersos en el material que está siendo

atacado. Donde los efectos son tales como para proporcionar alguna evidencia sobre la

superficie, la apariencia real, para un inexperto, no es necesariamente distinta de la que

produciría la acumulación de suciedad o materia prima desecada. El menú microbiano

también supone una dificultad añadida. Las ratas, los ratones y las cucarachas se

alimentan de materiales que constituyen comida real, pero ¿es razonable esperar que un

trabajador de una fábrica se dé cuenta de las actividades de las bacterias en un fluido de

corte, una pintura o un plástico? Por todo esto, algunas compañías realizan seminarios

para explicar a sus empleados la actividad de los microorganismos, cómo reconocer sus

efectos y las medidas de control a tomar.

Cuando se recurre a un técnico para pedirle consejo, éste debe hablar con todo el

personal involucrado en el proceso, incluso si el contacto inicial, que probablemente

será la dirección, le da todas las garantías de que no es necesario. El técnico debe ser

diplomático, ya que la dirección no siempre está al corriente de todo lo que realmente

ocurre en los talleres, incluso aunque los procedimientos estén detallados por escrito. La

adición de un biocida en la cantidad adecuada en la fábrica es un buen ejemplo de este

problema. La dosificación de materias primas suele estar automatizada en las fábricas

modernas y cuenta con sistemas de seguridad que evitan que el producto sea

manufacturado hasta que todos los ingredientes o premezclas hayan sido incorporados.

Sin embargo, se pueden producir adiciones manuales, especialmente tratándose de

cantidades pequeñas (los biocidas se pueden añadir en una cantidad tan pequeña como



del 0,1% del total de la mezcla) y, entonces, surge la duda de si se le añadió el biocida o

no.

El siguiente paso es llevar a cabo una bioauditoría de la fábrica. Esto conlleva la

toma de muestras de las materias primas en diferentes estados a lo largo de su paso por

la planta (no se deben olvidar los tanques de agua que a menudo son un depósito para el

desarrollo de biopelículas), identificando y muestreando las etapas críticas en la

fabricación en las que se puede desarrollar o introducir contaminación, sin olvidar

ningún envase usado para contener el producto (las líneas de llenado suelen ser fuentes

de contaminación). El técnico debe ir equipado con una bolsa de “herramientas”

apropiada para cubrir todas las situaciones posibles. Envases estériles, una

cuchilla/bisturí, fórceps, lupas, hisopos, un rotulador y recursos para esterilizar las

herramientas son algunos de los materiales necesarios. Suele ser bastante útil que, en

esta fase, se encuentren involucrados más de un técnico - uno para mantener ocupado al

representante de la empresa, mientras que el otro hace un examen más exhaustivo. El

técnico debe realizar la toma de muestras metódicamente, rechazando, de forma

educada, las ofertas de ayuda y de muestras de fecha y origen desconocido. Es

importante que el técnico quede satisfecho de que las muestras que ha recogido son

representativas del problema. Ponemos énfasis en este punto ya que es muy fácil que

traten de persuadirle para que acepte una muestra de buena fe y así ahorrar tiempo o los

inconvenientes asociados con la visita al lugar de muestreo. El siguiente relato puede

servir de ejemplo.

Se requería una muestra de agua de río para establecer la susceptibilidad

microbiológica de un material en dicho ambiente. Se iba a recoger la muestra del río en

un lugar donde había trabajos de construcción y se había llegado a un acuerdo con el

ingeniero de la obra para acceder al lugar durante las horas de trabajo. Al llegar, el

técnico fue pasado de uno en uno por la cadena de mando mientras que alguien le quitó

de sus propias manos uno de los envases que había llevado para rellenarlo en una

tubería cercana. Cuando explicó que necesitaba agua del río, ¡le preguntaron que por

qué quería agua contaminada y sucia cuando había un montón de agua potable limpia

disponible! ¡Imagínense el resultado si se hubieran enviado los envases al lugar de la

obra!



Al finalizar la visita, se le puede pedir al técnico que presente un breve informe

de forma oral a las partes interesadas mientras aún está en las instalaciones.

Seguramente le pedirán una solución o mitigación del problema a corto plazo. Solo si

tiene experiencia previa en resolver tales problemas podrá recomendar esas soluciones.

Se debería establecer un buen contacto con al menos un miembro de la empresa que

pueda actuar como enlace para agilizar la solución del problema. Finalizada la visita, el

laboratorio de investigación examinará las muestras de la bioauditoría para determinar

los niveles de contaminación, diferenciando el crecimiento bacteriano y fúngico. La

identificación a nivel de especie no es recomendable en esta fase, puesto que consume

mucho tiempo, es costoso y, a menudo, no es necesario a largo plazo. Se aprecia que se

dé una respuesta rápida, pero creíble, y que se transmita al cliente una idea del tiempo

necesario para resolverlo. Cualquier informe debe redactarse de forma que se entienda

claramente por personas que no sean biólogos y teniendo en cuenta, además, que el

informe puede pasar a terceras personas para su revisión. Nosotros hemos establecido

un banco de conocimientos en el que los problemas se pueden clasificar en cinco tipos:

1. Causa única.

2. Causa múltiple.

3. Pista falsa.

4. Inherentemente insoluble.

5. Desaparecido desde hace tiempo.

Estas categorías nos han ayudado a usar los casos prácticos en la enseñanza del

Biodeterioro y, de hecho, a concebir métodos selectivos para investigar las diferentes

categorías una vez que se hayan definido. Las categorías, con los casos prácticos

apropiados se repasan brevemente a continuación.

El problema de causa única se detecta rápidamente, y una acción correctora

proporciona una solución eficaz.

El problema de causa múltiple es el que se encuentra con más frecuencia y se

trata de un gran número de factores interrelacionados. Cada uno de ellos debe ser

valorado antes de que se pueda recomendar un régimen eficaz de acciones correctoras.

Es necesaria la monitorización de los efectos de dichas acciones.



De vez en cuando el técnico debe aceptar que el problema no es biológico y a

esto lo llamamos pista falsa.

La falta de información disponible para el técnico es, a menudo, un factor

añadido. El problema inherentemente insoluble surge de la incapacidad de soportar las

condiciones medioambientales y proteger al material del deterioro a medio plazo; por

ejemplo, la rápida lixiviación de biocida bajo condiciones severas (como la inmersión

repetida en agua o en detergente líquido) deja un material desprotegido que puede ser

posteriormente atacado por agentes causantes de Biodeterioro.

En la última categoría, el problema desaparecido desde hace tiempo, no se suele

consultar con un técnico hasta mucho después de que el ataque inicial haya ocurrido,

quizás años. Normalmente, es el resultado de un litigio prolongado o de reclamaciones

del seguro en el que una o ambas partes no han pedido consejo biológico en su

momento. Se presenta el producto para su evaluación después de que el organismo

causante del problema haya desaparecido hace mucho tiempo. El resultado es que las

conclusiones son, a menudo, circunstanciales.

1.1. Evaluación de Estrategias de Control

Es casi inevitable que en la fabricación de productos industriales haya una

necesidad de mejorar la higiene de la fábrica y el uso de conservantes químicos

adecuados. No podemos esperar que un conservante moderno haga frente a una

contaminación continua por problemas en la fabricación por dos razones: la

concentración del conservante en el producto está limitada por reglamentación y hay un

riesgo de desarrollo de tolerancia microbiana al conservante. Un buen mantenimiento e

higiene de la fábrica son la clave para un sistema de control integrado. Una vez que la

bioauditoría haya identificado los puntos débiles en la higiene de la fábrica, se podrán

entonces recomendar las medidas de mantenimiento.

El conocimiento de la composición del producto y su aplicación servirá de ayuda

en la recomendación de sistemas de conservación adecuados. También es importante el

tipo de contaminación, ya que muchos conservantes son parcialmente específicos para

el control de bacterias, hongos o algas. El laboratorio de investigación podrá llevar a

cabo un ensayo de resistencia para evaluar la capacidad del producto (que lleva el

conservante candidato) para resistir la contaminación por organismos estándares únicos,



inóculos mixtos, u organismos cultivados procedentes de la fábrica (denominados con

frecuencia “organismos de la casa”). Se pueden emplear diferentes condiciones para

evaluar la resistencia del conservante, las cuales se describen con detalle más abajo, en

esta Unidad.

1.2. Instauración del Sistema de Control

Las recomendaciones de higiene para la fábrica suponen la introducción de

procedimientos de limpieza, tratamientos de agua, eliminación de puntos muertos y el

uso de sistemas desinfectantes en las entradas para controlar la contaminación del aire.

En muchas situaciones se acordará la realización de una prueba industrial del nuevo

sistema conservante. Esto conlleva evaluar el conservante y/o las medidas de higiene de

la fábrica durante la fabricación del producto. Como se trata de una operación

comercial, se deben tomar medidas para asegurarse de que el producto no sale de la

fábrica en condiciones inadecuadas. El propósito de este ejercicio es establecer que las

estrategias de control recomendadas funcionan en la práctica. Se debe establecer un

programa de bioauditoría detallado de forma que se tomen muestras de todas las etapas

críticas. Si hay indicaciones de que el sistema está fallando, entonces habrá que tomar

medidas correctoras para limitar la pérdida del producto o permitir que sea reprocesado.

1.3. Monitorización de la Eficacia del Sistema

Una vez establecido un sistema de control mejorado, es aconsejable que se

hagan bioauditorías de forma periódica por parte del proveedor del conservante o del

laboratorio asesor para que se detecten cuanto antes los problemas potenciales y se

puedan iniciar acciones correctoras. Se puede usar un semáforo (verde, amarillo, rojo) o

un sistema de alarma numérico para evitar el pánico innecesario al primer signo de una

colonia bacteriana aislada de una muestra. Dependiendo del proceso, se puede aceptar

cierto nivel de contaminación bacteriana, mientras no cause efectos desfavorables en la

integridad del producto. Un incremento sobre este nivel aconsejaría iniciar una segunda

evaluación. Si esta segunda evaluación confirma el primer resultado, entonces se

iniciaría una acción específica. Si esta deja el problema bajo control, comenzaría de

nuevo la monitorización normal. El cliente y el laboratorio de investigación deben



determinar conjuntamente un sistema de monitorización que sea apropiado para ambas

partes.

2. Técnicas de Detección de Microorganismos Causantes de

Biodeterioro Los métodos normalizados de detección e identificación de microorganismos se

utilizan también en el Biodeterioro. Los libros de texto y los manuales que cubren esta

área son útiles, especialmente si tratan de organismos medioambientales y no solo de

cepas puramente clínicas. A menudo no interesa tanto la identidad o el nombre del

organismo como su actividad deterioradora específica, y algunos de los ensayos más

recientes se basan simplemente en la identificación de enzimas o sus productos

específicos. Un ejemplo es la prueba de la hidrogenasa para las bacterias

sulfatorreductoras que puede ser especialmente relevante, ya que la enzima hidrogenasa

es importante en la biocorrosión.

2.1. Muestreo

Esta es la etapa más importante en cualquier análisis microbiológico. Si no se

dispone de muestras representativas y apropiadas ni siquiera la técnica de detección más

sensible funcionará. Basta con imaginar un silo lleno de grano almacenado que debe ser

analizado para la detección de micotoxinas para darse cuenta de la importancia

fundamental de esta etapa. Puede que sólo un puñado de grano esté contaminado y que

esté en la primera muestra o que no se detecte. Si no hay métodos normalizados

establecidos, se debe solicitar el consejo de un experto.

Como hemos visto a lo largo del curso, los agentes microbianos causantes de

Biodeterioro viven en estrecho contacto con los materiales que deterioran, generalmente

formando biopelículas sobre la superficie y, a menudo, penetrando en el material. Por

ello, resulta imprescindible que cualquier investigación sobre Biodeterioro conlleve el

muestreo de biopelículas. No existe ningún método normalizado para este

procedimiento. En la Tabla 1 se muestran algunas de las técnicas empleadas, con sus

ventajas y desventajas.



Tabla 1. Métodos utilizados para el muestreo de biopelículas Método Ejemplos Comentarios

Hisopo Superficies para la preparación de alimentos

Simple, pero difícil de estandarizar; solo se recoge una fracción del total de los organismos. Algunos hisopos son inhibitorios.

Raspado Tuberías, minerales Más eficaz que el uso de hisopos, pero también se pueden recoger materiales ajenos (que pueden ser inhibitorios).

Lavado (agitación en líquido)

Telas, muestras pequeñas, muestras insolubles

En el agua de lavado se puede incluir un surfactante que no sea antimicrobiano.

Placas de contacto Superficies de edificios, papel

Permite mantener la distribución espacial de la biopelícula; solo es útil para biopelículas delgadas.

Cinta adhesiva Vidrio, materiales de construcción

Como las placas de contacto, pero más eficaz en la recogida de células de la superficie; el adhesivo no debe ser inhibitorio si las células se van a cultivar.

Recogida del sustrato (material) con la biopelícula intacta

Capas de pintura, secciones de tubería, grano almacenado

La mejor de todas las opciones para un microbiólogo, pero puede dañar el material. La planificación durante la etapa de diseño de un sistema permite la incorporación de probetas que se puedan retirar fácilmente.

La monitorización de un material o de un ambiente para evaluar el riesgo de

Biodeterioro conlleva, generalmente, el análisis de muestras tomadas a lo largo de un

periodo de tiempo. En este caso, es importante usar una técnica de muestreo bien

normalizada para que los resultados puedan ser fácilmente comparables y se pueda

detectar rápidamente un incremento en el número de microorganismos causantes de

deterioro. Los organismos que causan deterioro son habitantes habituales del medio

ambiente y es lógico encontrar un pequeño número en situaciones “seguras”, por lo que

solo deben tomarse medidas cuando este número comienza a aumentar. De forma

similar, cuando el objetivo del muestreo es evaluar la eficacia de los biocidas puede

usarse cualquier método siempre que esté estandarizado. Por ejemplo, la toma de

muestras con un hisopo es casi imposible de normalizar; la humedad del hisopo y la

presión aplicada durante el muestreo son difíciles de mantener constantes.

Más recientemente se han desarrollado métodos para medir el número o la

actividad de los microorganismos relevantes directamente en una biopelícula. Estos

análisis en tiempo real e in situ pueden usar técnicas sofisticadas o carecer de

sensibilidad, pero cuando se optimizan, ofrecen una herramienta excelente para el

investigador en Biodeterioro. Un ejemplo sencillo es el uso de una reacción de óxido-

reducción para medir la respiración microbiana. El cambio de color que se produce en el



sustrato se ha utilizado para estimar la actividad microbiana general en biopelículas

sobre superficies de piedra. Las sondas fluorescentes, como el naranja de acridina y el

4´,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), se pueden utilizar para teñir células microbianas de

una biopelícula delgada y así contarlas directamente usando un microscopio de

epifluorescencia. Las células vivas se pueden contar mediante el empleo de sondas que

emiten fluorescencia solo cuando son activadas por enzimas microbianas; la

2´7´diclorodihidrofluoresceína (DCFH), por ejemplo, se suministra en forma oxidada y

sólo produce fluorescencia verde cuando es reducida por células vivas. Más sofisticados

son los métodos modernos de microscopía; el microscopio de fuerza atómica tiene una

resolución capaz de distinguir átomos sobre una superficie, el microscopio electrónico

de barrido ambiental, que evita los artefactos inducidos por la preparación de las

muestras en el SEM tradicional, y el microscopio de barrido láser confocal, que permite

tomar secciones ópticas a través de las capas superficiales de un material y que fue

indispensable para construir el modelo actual de biopelícula en 3-D, con sus montañas,

poros y canales. Todos ellos se utilizan actualmente en investigación, más como

herramienta analítica que de rutina. Lo mismo sucede con los microsensores, que se

pueden usar para medir el pH, la concentración de oxígeno y así sucesivamente, en

secciones micrométricas de una biopelícula. En la sección de investigación de este

capítulo se darán otros ejemplos.

A pesar de la importancia de las biopelículas, muchos ensayos de Biodeterioro

todavía se basan en la detección de los microorganismos planctónicos. Este es el

método tradicional para identificar un ambiente agresivo y evaluar la eficacia de los

biocidas.

2.2. Detección y Enumeración

Los métodos microbiológicos normalizados de microscopía y de cultivo se

utilizan mucho en los estudios de Biodeterioro. Cualquier manual práctico de

microbiología contiene los principios y las técnicas básicas que se usan.

En el mercado hay disponibles una serie de kits útiles para la detección rápida y

aproximada de los microorganismos causantes de deterioro de mayor importancia

económica. Los contaminantes de combustible y las SRB son buenos ejemplos. Algunos

de ellos son simples “placas de contacto”, láminas de plástico cubiertas con el medio de



cultivo adecuado que se pueden sumergir en una muestra líquida o presionar sobre una

superficie sólida antes de ser incubados para permitir el desarrollo de colonias a partir

de las células capturadas durante la fase de muestreo. Estos métodos no requieren

experiencia ni instalaciones de laboratorio, pero por lo general tienen menor

sensibilidad. Pueden ser selectivos para un grupo particular de microorganismos

mediante el uso de medios específicos apropiados.

Los métodos basados en la detección de biomoléculas, como el adenosín

trifosfato (ATP), los fosfolípidos y el ergosterol, se pueden utilizar para la detección

rápida y cuantitativa de contaminación microbiana general o específica. La detección de

ATP mediante la medida de su bioluminiscencia se ha utilizado desde hace tiempo en la

industria alimentaria para determinar la contaminación microbiana de las superficies

donde se preparan los alimentos. El principio de la técnica se describe en la Figura 1.

Cuanto mayor es el número de células vivas (o que estaban vivas hasta hace poco

tiempo) mayor es la cantidad de ATP y mayor la luz emitida y detectada en el

luminómetro.

Figura 1. Principio de la técnica de bioluminiscencia para la determinación de ATP

La medida de ergosterol es una forma rápida y útil de medir biomasa fúngica,

como se comenta en esta Unidad más adelante en la sección de ensayos de simulación

medioambiental. El ergosterol es un componente estructural de las membranas de

hongos y no aparece, o lo hace en cantidades muy pequeñas, en otros organismos.

Aunque la técnica tiene sus inconvenientes [el uso de cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) y la dificultad para relacionar la concentración de ergosterol

directamente con la biomasa fúngica] es, no obstante, un indicador útil y, desde luego,

no menos seguro que las técnicas de cultivo en placa. La determinación de fosfolípidos,

aunque es un método rápido para la cuantificación de biomasa, no se utiliza



habitualmente de forma rutinaria y se comenta más a fondo en la sección de

investigación de esta Unidad.

Se ha examinado la utilidad de los kits disponibles en el mercado para la

detección de contaminación en gasóleo marino y se ha encontrado que la mayoría de los

resultados obtenidos se correlacionaban bien con los recuentos en placa estándar. Se

detectaron <50-103 bacterias/mL de combustible en los tanques de combustible de los

barcos y 102-106 bacterias/mL en el agua de mar usada como lastre, con recuentos

fúngicos de 0-10 y 20-102 respectivamente. Un método de detección “rápido” para

analizar el queroseno en Brasil es el Boron Microbe Monitor Test, en el que las

muestras de combustible se incuban sobre una capa acuosa de sales minerales con o sin

biocida. Un resultado positivo es aquel en el que se observa un cambio en la interfase

(crecimiento fúngico) en el matraz que no contiene biocida. Aunque es un método

sencillo de realizar y de interpretar, los resultados no se obtienen hasta pasadas una o

dos semanas, lo que constituye demasiado tiempo para que un avión permanezca sin

volar. Se ha descrito un método inmunofluorescente rápido diseñado para detectar

Hormoconis resinae de forma específica (véase la Figura 2), pero aún no se ha

adoptado de forma rutinaria, probablemente debido a la necesidad de un equipo un tanto

caro (un microscopio de epifluorescencia) y personal formado. Esta técnica altamente

sensible da resultados en una hora, una mejora bastante considerable respecto de las

metodologías estándar.

Figura 2. (a) Principio de la técnica de inmunofluorescencia, (b) Hormoconis resinae en una biopelícula sobre un metal, marcado mediante inmunofluorescencia. Fotografía: Dra. Christine Gaylarde.

a) b



Un método inmunológico alternativo, el ensayo de inmunoadsorción enzimática

(ELISA), que es muy utilizado en clínica para la detección microbiana rápida y su

recuento, también se ha adaptado para su aplicación con Hormoconis resinae. El

principio de la técnica es similar al método de inmunofluorescencia, pero se usa una

enzima como molécula marcadora en vez de un compuesto fluorescente. No se requiere

microscopio de epifluorescencia; se observa una reacción positiva, como un cambio de

color en el sustrato de la enzima, y el proceso completo se automatiza fácilmente dando

resultados cuantitativos rápidos. Algunas técnicas inmunológicas se han desarrollado en

forma de kits para la detección de microorganismos causantes de deterioro. Un ejemplo

es el RapidCheck para la detección de SRB; es un método ELISA que mide la enzima

adenosina fosfosulfato reductasa, específica de SRB.

Aunque los métodos inmunológicos son muy sensibles y específicos, dependen

de medios biológicos para la producción de los reactivos más importantes - los

anticuerpos. El uso de la tecnología de los anticuerpos monoclonales ha facilitado la

producción de reactivos de inmunoglobulina estándar, pero todavía se producen

variaciones, y esto limita, hasta cierto punto, el uso de estos métodos. Parece probable

que en el futuro sean sustituidos por técnicas de biología molecular, que impliquen el

análisis de los ácidos nucleicos. Esta es un área de intensa investigación en la actualidad

y en la sección de investigación de esta Unidad se presenta una introducción al respecto.

3. Técnicas de Ensayo de Biodeterioro La evaluación de la susceptibilidad biológica de los materiales se puede

clasificar en tres categorías principales: la selección preliminar, el ensayo de simulación

medioambiental controlada y el ensayo de campo o exposición a largo plazo. Cada

categoría tiene sus ventajas e inconvenientes y, a menudo, dos o más categorías se

combinan o se llevan a cabo de forma secuencial. Se debería mencionar también una

cuarta categoría: el uso de ensayos que cumplen con la normativa vigente. Estos

ensayos se pueden considerar incluidos dentro de la primera o de la segunda categoría,

pero tienen un papel especial garantizando los niveles de calidad en materiales y

productos. Se consideran en una sección aparte.



3.1. La Selección Preliminar

En las primeras etapas de desarrollo de un producto puede haber un número

prometedor de formulaciones que merezcan una investigación más a fondo. Por

ejemplo, se puede haber sintetizado una nueva clase de productos químicos con una

actividad biocida prevista o se puede necesitar estudiar la eficacia de una variedad de

conservantes en un producto nuevo antes de que el más adecuado sea propuesto para

futuras evaluaciones. Para eliminar candidatos inútiles que, en la práctica, no

demuestren actividad o no funcionen adecuadamente, se puede emplear una técnica de

cribado en el laboratorio. Estos cribados son muy atractivos ya que se pueden efectuar

rápidamente mediante técnicas de microbiología tradicional y un gran número de

réplicas. Pero son limitados, porque no simulan el uso final del producto y, a menudo,

no tienen en consideración las consecuencias ecológicas. Los cribados también están

sujetos a interpretaciones erróneas y exageraciones.

Estos cribados suelen realizarse en matraces o en placas Petri que contienen

medios de cultivo diseñados para crear las condiciones óptimas para el crecimiento

microbiano. El conservante se incorpora al medio de cultivo después de su esterilización

o, en el caso de un medio sólido, se puede poner en un pocillo recortado en el agar.

Después los organismos de ensayo se inoculan en el medio como caldos de cultivo o

suspensiones que se dispersan sobre la superficie del medio sólido. En los medios

líquidos, el punto final puede ser una gran reducción logarítmica (en 4 unidades) y, en

los medios sólidos, un halo de inhibición alrededor del pocillo. Alternativamente, se

coloca una alícuota del producto que contiene el biocida sobre la superficie del agar

inoculado (Figura 3). Después se mide el halo de inhibición de crecimiento alrededor

del pocillo o del producto. Los resultados se interpretan asumiendo que cuanto mayor es

este halo, mayor es la potencia del biocida. Sin embargo, se podría argumentar que

cuando mayor es el halo de inhibición, mayor es la tasa de lixiviación, una cualidad

indeseable en un biocida que debe tener una vida larga. Los componentes del medio

también pueden afectar a la movilidad del biocida, así como el diluyente.

Los cribados se suelen realizar a las temperaturas en las que la tasa de

crecimiento es máxima (25-30 ºC). Las cepas bacterianas y fúngicas de laboratorio se

usan como cultivos puros. Estas cepas se eligen por su naturaleza ubicua (por ejemplo

Pseudomonas), la facilidad con que se cultivan en el laboratorio (por ejemplo



Escherichia coli), o su llamativa morfología en el cultivo (las masas de esporas marrón

oscuro de Aspergillus niger).

Figura 3. Halos producidos en ensayos de inhibición para (a) bacterias y (b) hongos. Fotografías: Dr. Kenneth J. Seal.

Algunas veces, se elige una colección de microorganismos por sus diferencias

taxonómicas, o se usa una cepa “favorita” que exhibe una propiedad particular. En el

último caso, se puede utilizar un hongo celulolítico que crezca bien en medios de

laboratorio para evaluar la eficacia de un biocida que se usará para proteger productos

de celulosa o que contengan derivados de la celulosa. Dicho hongo puede que no sea

reconocido como colonizador de estos productos y, por tanto, cualquier extrapolación

debe hacerse con cuidado. También existe peligro en la validez de los resultados para un

microorganismo en un cribado. Por ejemplo, se sabe que Aureobasidium pullulans y

Aspergillus niger son tolerantes al cobre. El uso exclusivo de cualquiera de estos dos

hongos en la evaluación de un biocida que implique una formulación que contenga

cobre puede provocar el rechazo de un biocida adecuado para aplicar en un lugar en el

que no sería probable encontrar a estos dos hongos como agentes causantes de

Biodeterioro. La otra posibilidad es que se recomendasen cantidades innecesariamente

elevadas de biocida para aplicaciones prácticas.

La ecología de la comunidad microbiana asociada con el Biodeterioro de un

material no se puede contemplar exclusivamente en una placa Petri. Se debe tener en

cuenta que se pueden producir interacciones que aumenten la tasa de descomposición en

el material o afecten negativamente a la potencia de un biocida a una concentración que

se sabe es eficaz sobre un cultivo puro. A menudo, encontramos ejemplos de esta última



posibilidad cuando se pasa del cribado inicial al uso de cultivos mixtos o de un inóculo

aislado de un sistema contaminado (a menudo denominado “organismos de la casa”). La

influencia del biocida sobre una biopelícula adherida a la luz de una tubería no se puede

establecer con métodos normales. Es necesario idear una técnica que simule el

ambiente, o al menos, usar probetas metálicas en el medio que se puedan extraer a

intervalos concretos para su estudio.

La técnica que, con diferencia, se utiliza con mayor frecuencia cuando se tiene

que evaluar la eficacia de conservantes en un material o un producto en particular es el

ensayo de resistencia. El principio de la técnica consiste en añadir un inóculo en

cantidad conocida de un solo organismo o de una mezcla a muestras de producto, por

ejemplo, una pintura líquida que contiene varias concentraciones del conservante bajo

análisis. Las muestras inoculadas se incuban, junto con un control blanco (sin

conservante) y un sistema de referencia con un punto final conocido (control positivo), a

una temperatura dada (normalmente 25-30 ºC) y se recogen alícuotas cada cierto tiempo

(habitualmente hasta siete días). Estas se siembran en placas de agar, directamente

desde el recipiente que contiene la muestra o después de hacer una serie de diluciones

en solución de Ringer y se estiman los supervivientes mediante un esquema de

cuantificación subjetivo o contando en una dilución adecuada (normalmente entre 30 y

300 colonias). Después de siete días (o más si el conservante muestra una tasa de

mortalidad más lenta), las muestras se vuelven a poner en contacto con el mismo

inóculo y se repite el proceso de detección de supervivientes. Este ensayo de resistencia

se puede repetir muchas veces, pero lo normal son tres. Un conservante capaz de matar

tres réplicas (o desafíos), se considera adecuado para continuar con los ensayos,

normalmente en la fábrica (es decir, ensayos en campo). Existe polémica, especialmente

entre los microbiólogos de cosméticos, acerca de la utilidad de un ensayo de resistencia

reiterado comparado con un ensayo único, si el propósito del ensayo es evaluar la

eficacia. Después de todo, tres ensayos de una concentración bacteriana de 108 se

pueden considerar igual que uno de 3 por 108 bacterias, si se está evaluando la

capacidad del conservante. Sin embargo, el ensayo de resistencia se acepta como buen

vaticinador de éxito en el campo.

Ahora que se han enumerado las limitaciones de las técnicas de selección,

debería observarse que proporcionan una idea rápida del efecto aproximado que ocurre



en el sistema. Los ensayos de cribado en Biodeterioro normalmente utilizan el criterio

de crecimiento/no crecimiento. Algunos sistemas de clasificación intentan cuantificar el

crecimiento de forma subjetiva como excelente, bueno, moderado o pobre. A menudo se

utiliza como indicativo de la eficacia del conservante la cantidad de cobertura de la

muestra o de la estría dejada por el microorganismo en una escala del 0 al 100%, de 0 a

5, o en un incremento del número de signos positivos (- a +++). Este enfoque ha sido

criticado para los inóculos fúngicos, ya que no se considera el grado de esporulación,

que es un indicador importante de la capacidad reproductiva de los hongos sobre los

materiales.

Varios métodos de ensayo se basan en el uso de un medio de agar con sales

minerales, en el que se introduce el material como única fuente de carbono. Esto puede

ser un protocolo eficaz para algunos materiales, por ejemplo, textiles y cuero, pero

algunos plásticos como los poliuretanos, requieren la presencia de nutrientes

suplementarios como los azúcares para iniciar su crecimiento. En ausencia de

suplementos, no se produce el ataque hasta pasados veintiocho días. El pH del medio

puede afectar la actividad del biocida que se está evaluando; por ejemplo, se ha

descubierto que una reducción del pH de 4,5 a 3,3 es suficiente como para reducir la

toxicidad del ión cobre sobre las cepas sensibles a cobre de Aureobasidium pullulans.

Por ello es importante que los resultados se interpreten con cuidado y moderación.

3.2. El Ensayo de Simulación Medioambiental

Estos ensayos se diseñan teniendo en cuenta el uso final del material

manteniendo un control razonable de las condiciones medioambientales. Para lograr

estos propósitos, el biocida candidato se puede incorporar en el material que se supone

que va a proteger, o se puede exponer un material al tipo de ambiente con el que

probablemente se encontrará en servicio. El material, con o sin biocida, puede ser

sometido posteriormente a desgaste o envejecimiento artificial simulando los efectos de

la lluvia, ciclos de temperatura y luz solar. Los equipos para producir climas artificiales,

por ejemplo, las lámparas de arco de xenón o de UV, están especialmente diseñados

para llevar a cabo ciclos de tiempo (por ejemplo, 100, 200 y 400 horas). También es

posible simular una atmósfera industrial mediante la introducción de dióxido de azufre

y ozono. La muestra se puede exponer a ciclos de tiempo de temperatura y humedad



relativa (RH) para simular un ambiente tropical. Tales condiciones no suelen aparecer

en las publicaciones, pero merecen una seria consideración. Los productos a base de

cemento que pueden requerir una evaluación directa, o el ensayo de un recubrimiento

superficial se pueden carbonatar antes del ensayo para reducir las condiciones alcalinas

(pH 10-11) del producto fresco, lo que daría lugar a resultados erróneos. Los materiales

casi siempre presentan alguna forma de contaminación, que puede actuar como

nutriente para cualquier colonizador potencial. Para considerar este factor, el material se

puede rociar o sumergir en una solución nutritiva mineral apropiada para estimular el

crecimiento. Cuando se hace esto, la valoración visual por sí sola no es suficiente a

menos que el material contenga un biocida candidato y se utilice la inhibición del

crecimiento como criterio de evaluación. Se debe utilizar alguna forma de ensayo físico

para examinar cambios desfavorables en las propiedades del material. Este aspecto se

discutirá más adelante.

Se utilizan dos ambientes como representantes de la amplia variedad del uso

final de los materiales, que son el suelo y una atmósfera húmeda. Ambas condiciones se

pueden conseguir en el laboratorio con un mínimo equipamiento. El suelo se puede

obtener del jardín, o en forma de un compost premezclado como el John Innes nº 1

(nótese que cuando la etiqueta dice “esterilizado” en estos tipos de suelo, se refiere a

semillas de malas hierbas e insectos y no a los microorganismos). El suelo debe tener

una flora microbiana activa, un pH entre 5,5 y 7, ser de composición arcillosa y tener

una humedad de 25-35%, o del 60% de su capacidad máxima de retención de agua. Para

eliminar las piedras, se recomienda tamizar el suelo con un tamiz de jardín. El suelo

suele colocarse en cubetas de 15-24 cm de profundidad y mantenerse a temperatura

constante. Las cubetas de suelo se denominan a menudo lechos para ensayos en tierra

(Figura 4).

Figura 4. Materiales sometidos a un ensayo de enterramiento en suelo. Obsérvese la pieza de tejido de algodón degradado que se ha utilizado para evaluar la actividad del suelo. Fotografía: Dr. Kenneth J. Seal.



Estos pueden ser muy grandes, ocupando un laboratorio construido

especialmente para dicho propósito, con un ambiente controlado. Los lechos se pueden

mantener durante varios años si se utilizan regularmente. Puede ser necesaria la adición

ocasional de materia orgánica o fertilizante si la actividad comienza a decrecer. Para un

uso más a corto plazo, se pueden utilizar vasos de precipitados grandes, cubos, o

recipientes herméticos de plástico, pero es necesario tener en cuenta sus limitaciones,

pues solo representan una fuente limitada de microorganismos y no un medio ambiente

complejo como el del suelo natural. Como sugiere el nombre de lechos, los materiales

para los ensayos se entierran en el suelo por periodos de tiempo predefinidos. Se suelen

prever tres meses, pero es importante permitir la extracción de muestras adicionales que

se puedan recuperar a tiempos más cortos y más largos de exposición. El suelo es

considerado como un ambiente severo o agresivo y su uso se justifica para materiales y

sistemas de conservación que estarán en contacto con el suelo durante su vida en

servicio. Microbiológicamente hablando, es un sistema mal definido, pero

sorprendentemente, si se lleva a cabo de forma adecuada, las técnicas de enterramiento

en suelo proporcionan resultados comparables y se emplean en varias normas

nacionales en Europa y en los Estados Unidos.

Muchos materiales se colocan distantes al contacto directo con el suelo, pero

sujetos a la colonización por la microflora del suelo y del aire. En estas situaciones, es la

humedad de la atmósfera la que juega un papel importante en el desarrollo y el

crecimiento “sostenido” de los potenciales agentes causantes de Biodeterioro. Hay

muchas situaciones industriales y domésticas en las que se pueden dar condiciones de

alta humedad localizada. En estas situaciones, las algas y los hongos son los

colonizadores predominantes y el mayor efecto que producen es el desconchado. Esto se

puede simular en el laboratorio usando cámaras que, o bien contienen agua, para

proporcionar una atmósfera saturada del 100% RH, o bien un rango de soluciones

salinas saturadas para humedades controladas por debajo de la saturación. Los

materiales sometidos a ensayo se suspenden en la atmósfera o se colocan en un lecho de

vermiculita mojada (Figura 5), donde se rocían con un inóculo mixto de hongos y/o

algas y se incuban a una temperatura constante. Después de un tiempo predeterminado

(a menudo veintiocho días), los materiales se examinan para evaluar la presencia de

crecimiento activo sobre su superficie. La extensión del crecimiento se mide en



términos de porcentaje de cobertura o densidad, como se ha descrito anteriormente. Un

estudio reciente sugiere el análisis de ergosterol mediante HPLC para dar una medida

cuantitativa del crecimiento fúngico sobre capas de pintura. Este método,

extremadamente rápido y sencillo, muestra la eficacia relativa de los fungicidas

incorporados a la capa de pintura.

Figura 5. Lecho de vermiculita para evaluar la eficacia de alguicidas en capas de pintura. Fotografía: Dr. Kenneth J. Seal.

Se pueden utilizar modificaciones de este sistema para resolver situaciones

particulares. Uno de estos sistemas se utiliza para evaluar pinturas fungicidas una vez

aplicadas. Una superficie pintada puede estar expuesta a la condensación como

resultado de un gradiente de temperatura a través de una pared y esto puede

desencadenar el crecimiento de moho (típico en cuartos de baño y cocinas mal

ventiladas). Para simular esta situación, los paneles pintados se suspenden en una

cámara con agua caliente en el suelo a 5 ºC por encima de la temperatura ambiente. Esto

induce la condensación del agua en la capa. Se aplica un inóculo mixto sobre la capa y

se incuba durante al menos tres meses. Los lechos de vermiculita húmeda se utilizan

actualmente de forma rutinaria como técnica para simular una superficie que se

encuentra continuamente expuesta a condiciones de humedad. Esta técnica es

particularmente útil para ensayar alguicidas. Los paneles planos (tableros de base

mineral o de madera blanda), a menudo previamente expuestos a la humedad como se

ha descrito anteriormente, con la capa de pintura en estudio aplicada en la superficie

superior, se exponen horizontalmente sobre la vermiculita húmeda en un recipiente

hermético de plástico transparente. Se aplica el inóculo de una mezcla de algas (con

brocha o mediante rociado) y se evalúa de acuerdo a la cantidad de crecimiento presente

durante un periodo de hasta tres meses. Se utilizan ciclos determinados de luz y



oscuridad para simular el ciclo día-noche y se pueden añadir nutrientes minerales de

forma periódica rociándolos sobre los paneles inoculados.

Cuando se ha definido claramente un tipo particular de Biodeterioro y se han

identificado los organismos responsables, por ejemplo, descomposición de la madera,

una simulación aceptable es usar esos organismos junto con especies de madera

susceptibles con el fin de evaluar la eficacia de los conservantes de la madera, midiendo

la pérdida de peso de bloques de madera impregnados (comparados con los controles)

después de tres meses de exposición a cultivos puros de hongos que degradan la

madera. El acondicionamiento de los bloques mediante el uso de un paso de lixiviado

elimina aquellos biocidas con probabilidad de tener periodos cortos de residencia y, por

lo tanto, un rendimiento limitado como conservantes. El valor de los ensayos de

simulación reside principalmente en una predicción más realista de cómo se comportará

el material en servicio mientras el ambiente se mantiene bajo estricto control, lo que

permite que se puedan comparar los resultados de los ensayos llevados a cabo en

distintos laboratorios y en diferentes momentos.

3.3. El Ensayo de Campo

El ensayo de campo es, por lo general, un ensayo a largo plazo (mayor de un

año), en el que el material es expuesto a una o más situaciones de servicio o una

variedad de climas diferentes en los que es probable que se vaya a encontrar cuando esté

en servicio. Los ensayos de campo pueden durar hasta diez años y abarcar ambientes

que vayan desde condiciones de humedad tropical hasta situaciones de

congelación/descongelación. En el diseño de un ensayo de campo es de suma

importancia decidir los lugares de exposición, la mejor forma de presentar el material al

ambiente, el número de muestras, la frecuencia del análisis de las muestras, las

propiedades que se van a evaluar, qué organismos va a ser necesarios monitorizar, si

pueden resultar útiles datos fotográficos, qué datos históricos son necesarios (registros

meteorológicos del lugar, temperaturas en la superficie), quién va a administrar,

coordinar y asegurar la continuidad a lo largo de todo el ensayo y si habrá un registro

principal o manual de procedimientos que describa el ensayo de campo completo para

garantizar su trazabilidad, y dónde debe estar ubicado para su custodia. Es importante

mantener la seguridad en los lugares seleccionados para evitar la pérdida de muestras.



Se deben considerar planes de contingencia en caso de que un lugar sea cerrado o

transferido. También se deben establecer los acuerdos necesarios para el transporte de

las muestras desde el lugar de muestreo hasta el punto donde serán examinadas, si no lo

puede hacer el técnico. La organización y puesta en marcha de un ensayo de campo

pueden ser muy laboriosas y costosas, especialmente en el caso de materiales que se van

a usar en una variedad de situaciones para las que son probables interacciones entre

factores físicos y biológicos. No es posible generalizar en el diseño experimental de un

ensayo de campo. Sin embargo, sirva de ejemplo una breve descripción del tipo de

ensayo que se utiliza a menudo para evaluar los efectos del medio ambiente tanto sobre

los materiales de construcción usados en el exterior como sobre recubrimientos de

superficie.

La industria de recubrimientos de superficies y aquellas industrias que producen

tableros compuestos de base mineral que se usan para revestimientos exteriores y

cubiertas de tejado utilizan bastidores en los que se pueden montar los paneles de

ensayos. A la hora de montar los paneles es importante tener en cuenta su ángulo con el

plano horizontal, la dirección en la que se orienta y la distancia al suelo. Los paneles se

inclinan normalmente 45º o 90º hacia el plano horizontal y mirando al norte o al sur

(Figura 6).

Figura 6. Paneles pintados expuestos a 45º orientados hacia el sur siendo examinados por Dennis Allsopp. Fotografía: Dr. Kenneth J. Seal.

Un panel a 45º será el que se encuentre expuesto a condiciones más severas, ya

que la contaminación que cae sobre él permanecerá en su superficie por un periodo de

tiempo mayor que aquel que esté en posición vertical y, si además también está

orientado al sur en el Hemisferio Norte, captará más luz solar. Se han diseñado métodos

elaborados para rotar los paneles continuamente y mantenerlos expuestos al sol. Sin

embargo, las medidas de UV muestran que las concentraciones de luz reflejada e



incidente sobre paneles estáticos a 45º hacen que los métodos rotacionales sean un lujo

innecesario. Un panel orientado al norte, en el Hemisferio Norte, no recibe luz solar

directamente y es probable que se mantenga más frío y húmedo que una muestra

orientada al sur. Esto suele provocar el crecimiento de algas y hongos, que pueden

afectar algunas de las propiedades de las muestras con el tiempo. Estas orientaciones se

invierten en el Hemisferio Sur. La altura a la que se colocan los paneles desde el nivel

del suelo puede influir en la contaminación. Para simular una situación en la que no hay

contacto con el suelo, los paneles se deben colocar a una distancia del suelo de al menos

1 m para evitar salpicaduras. Por supuesto, los paneles se pueden colocar a distancias

menores para permitir la contaminación desde el suelo. Los paneles también se pueden

proteger con un techo que cubra todo el bastidor, si se pretende simular una aplicación

de menor exposición.

El diseño del bastidor es muy importante ya que debe soportar de forma segura

todos los paneles que se vayan a exponer, no se debe pudrir o corroer significativamente

mientras dure el ensayo, su diseño no debe contribuir a los cambios observados en los

paneles a menos que se haya incorporado deliberadamente y se debe diseñar para que su

mantenimiento sea fácil. Debe estar hecho de madera tratada o de metal resistente a la

corrosión y tener soportes que permitan fijaciones a 45º y verticales en dos direcciones

opuestas. Los paneles se ajustan al bastidor mediante sujeciones que no afecten al

material, por ejemplo, aumentando la corrosión de un panel de metal que se esté

evaluando; en este caso, las sujeciones se deben pintar para prevenir la corrosión. La

retirada periódica de los paneles es seguida por la observación de las superficies e

identificación de los microorganismos presentes; se requieren ensayos mecánicos o

químicos adecuados para determinar cualquier cambio en el material expuesto.

El análisis estadístico es importante en la interpretación de estos ensayos. Para

asegurar su viabilidad hay que preparar suficientes réplicas y el análisis estadístico no

paramétrico es probablemente el más adecuado. En ausencia de un método normalizado

se debe pedir consejo a un experto. Un artículo reciente sobre el Biodeterioro de capas

de pintura exterior con y sin biocidas sugiere el uso de análisis de regresión logística

con datos acumulados para evitar la necesidad de un gran número de réplicas durante un

periodo de tiempo. El conocimiento de la estadística es extremadamente importante



cuando se están planeando estudios comparativos de este tipo para asegurar que los

resultados sean significativos.

3.4. Ensayos Normalizados en Biodeterioro

Existe un pequeño número de normas nacionales e internacionales que contienen

procedimientos para evaluar los efectos de los organismos sobre los materiales o los

sistemas de conservación usados en estos materiales. En las Tablas 2 y 3 se puede

encontrar una lista de estas normas actualmente en uso, de las que se deduce que se

agrupan en la categoría de cribado o simulación medioambiental.

Tabla 2. Normas británicas y europeas de evaluación del Biodeterioro

Número: Año Título

BS1982:1990 Métodos de ensayo para evaluar la resistencia fúngica de paneles fabricados de materiales de origen orgánico o que los contienen

BS2011:1989 Evaluación medioambiental de componentes y equipos electrónicos. Parte 2.1, Ensayo J. Crecimiento de hongos

BS2087:1992 Tratamientos de conservación de tejidos

BS3046:1981 Especificación para adhesivos de recubrimientos de pared. Apéndice G. Ensayos de susceptibilidad al crecimiento de hongos

BS3900:1989 Métodos de ensayo para pinturas. Ensayo G6. Evaluación de la resistencia al crecimiento de hongos

BS4249:1989 Especificación para papel y corcho. Sección 5.7. Resistencia al crecimiento de hongos

BS5763:1996 Métodos para el análisis microbiológico de alimentos y productos de alimentación animal

BS5980:1980 Especificación para adhesivos de uso en azulejos cerámicos y mosaicos. Sección 7. Resistencia al crecimiento de hongos

BS6068:1988 Calidad del agua. Guía para el recuento de microorganismos mediante cultivo BS6085:1992 Métodos para la determinación de la resistencia de tejidos al deterioro microbiológico

BS6920:2000 Idoneidad de productos no metálicos para su uso en contacto con agua prevista para el consumo humano con respecto a su efecto sobre la calidad del agua. Parte 2.4. Crecimiento de microorganismos acuáticos

BS7066:1990 Conservantes de la madera. Eficacia frente al manchado azul

BS7874:1998 Método para evaluar el deterioro microbiológico de sellos elastoméricos para uniones en fontanería y canalizaciones

BSEN 113:1997 Método de ensayo para determinar la eficacia protectora contra basidiomicetos que degradan la madera

BSEN 152:1988 Método de laboratorio para determinar la eficacia protectora en servicio de un tratamiento conservador contra el manchado azul. Parte 1. Procedimiento de cepillado. Parte 2. Métodos distintos al cepillado

BSEN1040:1997 Desinfectantes químicos. Actividad bactericida básica. (Véase también BSEN 1275, 1276 y 1650)

BSENISO846:1997 Plásticos: Evaluación de la acción de microorganismos DDEN839:2002 Conservantes de la madera. Eficacia contra basidiomicetos que destruyen la madera

BSISO14851:1999 Determinación de la biodegradabilidad de materiales plásticos en un medio acuoso. (Véase también BSISO 14852 y 14855)

BS, Norma Británica; EN, Norma Europea; DD, Proyecto de Norma; ISO, Organización Internacional para la Normalización.



Tabla 3. Normas estadounidenses de evaluación del Biodeterioro

Número Título

ASTM D5274-00 Método de ensayo normalizado para evaluar la resistencia al ataque por microorganismos de pinturas envasadas

ASTM D3273-00 Método de ensayo normalizado para evaluar la resistencia al crecimiento de hongos sobre la superficie de cubiertas interiores en una cámara ambiental

ASTM D3274-95 Método de ensayo normalizado para evaluar el grado de deterioro de capas de pintura por crecimiento microbiano (fúngico o de algas) o por acumulación de tierra y suciedad

ASTM D4300-01 Método de ensayo normalizado para evaluar la capacidad de las películas adhesivas para soportar o resistir el crecimiento de hongos

ASTM G21-96 Método normalizado para determinar la resistencia de materiales poliméricos sintéticos a los hongos

ASTM G29-96 Método normalizado para determinar la resistencia de materiales poliméricos sintéticos a las algas

MIL STD 810E Métodos de ensayo medioambientales. Método 508.2. Hongos ASTM, Sociedad Americana de Ensayos y Materiales; MIL STD, Normas Militares.

Para la evaluación de la resistencia o susceptibilidad biológica de los materiales

se coloca la muestra en agar nutritivo, donde el material a menudo la “única” fuente de

carbono, y se rocía con un cultivo único o mixto de bacterias u hongos. Las cepas

utilizadas se encuentran especificadas mediante un número de catálogo de una colección

de cultivos tipo, aunque la norma suele permitir el empleo de otras cepas si existe un

acuerdo entre las partes implicadas. La susceptibilidad se establece por la cantidad de

crecimiento sobre la muestra después de un periodo de incubación adecuado o, en el

caso de los conservantes, por la ausencia de crecimiento sobre la muestra o un halo de

inhibición alrededor de la misma. La pérdida de peso en bloques de madera o muestras

de plástico acondicionadas y previamente pesadas también se utiliza como indicativo de

la eficacia de un conservante o de la susceptibilidad del material ensayado a la

utilización microbiana. La información proporcionada por este tipo de normas se refiere

únicamente al potencial Biodeterioro de materias primas y no a un ensayo de simulación

en servicio en el que se evalúan productos completos o componentes que comprendan

una serie de materias primas. En el último caso, los componentes son suspendidos en

una cámara donde la humedad es alta o son enterrados en el suelo, como se ha descrito

anteriormente, y se realiza una evaluación de la extensión de crecimiento sobre la

superficie. Al terminar el ensayo microbiológico se suele llevar a cabo un ensayo de

prestaciones.

Por tanto, es importante que en la redacción de las especificaciones de los

ensayos que contemplen los ensayos biológicos se incluya la norma adecuada para



identificar el grado del Biodeterioro. Por ejemplo, si los componentes de un tablero de

construcción hecho con pasta de celulosa, mica y cemento fueran evaluados, el

componente de celulosa siempre fallaría, pero como compuesto puede que supere un

ensayo de enterramiento en suelo o de alta humedad por el pH alcalino del medio. Se

requiere perfeccionar y actualizar las normas que abordan el Biodeterioro de materiales.

Algunas pueden dar resultados erróneos, mientras que otras emplean una serie de

organismos que son difíciles de justificar como agentes directos del Biodeterioro de los

materiales seleccionados para su evaluación. El requisito de la Directiva de Productos

Biocidas (Directive on Biocidal Products) para demostrar la eficacia de los

conservantes, supondrá la introducción de métodos de ensayo mejor enfocados.

Los procesos de acreditación de laboratorios nacionales establecidos para

asegurar la calidad de los ensayos de los laboratorios se están implementando en

muchos países. De ellos, solo un pequeño número lleva a cabo ensayos de Biodeterioro

en la actualidad; la mayoría de los ensayos se realizan como parte de servicios de apoyo

técnico que proporcionan las compañías de conservantes/biocidas.

4. Técnicas Recientes de Investigación en Biodeterioro Los ensayos normalizados y los métodos de tratamiento descritos en la sección

anterior están sujetos a constantes revisiones y actualizaciones. La investigación en los

aspectos teóricos y prácticos del Biodeterioro es fundamental para este proceso. La

investigación dirigida específicamente al deterioro microbiano de materiales se refiere

fundamentalmente a la aclaración de los mecanismos implicados y la identificación y

fisiología de los organismos involucrados, siendo el control o prevención del daño el

propósito final. Áreas particularmente activas en la actualidad son las biopelículas y el

desarrollo de técnicas moleculares para el estudio de los agentes causantes de deterioro

microbiano.

4.1. Técnicas de Análisis de Ácidos Nucleicos

El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a principios de los

años ochenta (véase la Figura 7) ha revolucionado la investigación biológica. Los

cebadores (o primers) 1 y 2 en la Figura 7 son oligonucleótidos sintéticos que se unen

específicamente a sitios seleccionados en el DNA permitiendo a la enzima Taq



comenzar la replicación. Dado que la replicación se realiza siempre en la misma

dirección en la cadena de DNA (de 5´ a 3´) se requiere un cebador diferente para cada

cadena. Estos se conocen como cebadores “Forward” (F) (que significa ir hacia

delante) y “Reverse” (R) (ir marcha atrás).

Figura 7. Principio de la PCR. dNTPs, desoxinucleótidos trifosfato. Paso 1. Desnaturalización de la doble cadena de DNA (ds) mediante el aumento de la temperatura a 90-95 ºC. Paso 2. Hibridación de los cebadores y las cadenas de DNA separadas. La temperatura puede variar entre 40 y 70 ºC. Paso 3. Extensión de las cadenas de DNA en formación por medio de la enzima Taq polimerasa (temperatura habitual 72 ºC). Paso 4. Repetición de los ciclos (alrededor de 35) para producir múltiples copias de DNA de doble cadena.

La capacidad para amplificar específicamente partes del genoma posibilita la

producción de “sondas génicas” para detectar géneros y especies microbianas y sus

actividades. La manipulación de la secuencia de los cebadores y/o de las condiciones

del paso de hibridación en la PCR nos permite cambiar su especificidad, disminuirla

para permitir la detección simultánea de un grupo general de organismos (por ejemplo,

hongos en general) o aumentarla para limitar los tipos de organismos/actividades

detectados. Se pueden identificar los genes de la lipasa para detectar organismos

capaces de degradar grasas, genes de celulasa para células celulolíticas y así

sucesivamente. La detección de mRNA en las células, en lugar de DNA, nos permite



determinar si los genes están activos. Esto se realiza por medio de la PCR de

transcripción inversa (RT-PCR).

La PCR, junto con los métodos de análisis del DNA amplificado, tales como el

análisis de restricción del gen ribosomal 16S amplificado (ARDRA), el polimorfismo

de conformación de cadena sencilla (SSCP) y la electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante (DGGE), han demostrado la presencia de microorganismos

desconocidos hasta la fecha en materiales deteriorados. Hoy se considera como

axiomático que sólo entre el 1 y el 10% de todos los microorganismos se han cultivado

en medios artificiales. Cuando se utilizan como cebadores secuencias de DNA del gen

de la subunidad pequeña (SSU) del RNA ribosómico (16S rDNA en procariotas y 17S ó

18S rDNA en eucariotas), los microorganismos se pueden detectar e identificar rápida y

específicamente sin necesidad de cultivo. Una vez que se haya identificado una región

específica del DNA (sonda) para un “nuevo” organismo se puede aplicar la hibridación

in situ con sondas fluorescentes (FISH) para visualizar las células en su hábitat natural.

La tecnología está bien desarrollada para las bacterias, pero la investigación sobre otros

microorganismos es aún escasa. En la Tabla 4 se presentan algunos de los cebadores

que se han utilizado para amplificar varios tipos de DNA.

Tabla 4. Ejemplos de cebadores específicos utilizados en la PCR

Cebadores SSU rDNA Especificidad Secuencia de bases

ITS1F Hongos CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA ITS4 (R) Universal de hongos TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS4-A (R) Ascomicetos CGCCGTTACTGGGGCAATCCCTG ITS4-B (R) Basidiomicetos CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG 27F1 Universal de bacterias AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

408R Cianobacterias TTACAA(CT)CCAA(AG)(AG)(AG) (AG)CCTTCCTCCC

1492R Universal de bacterias GGTTACCTTGTTACGACTT 63F Espiroquetas CATGTCGACGTYTTAAGCATGCAAGT NSM156 (F) Nitrosomonas spp. TATTAGCACATCTTTCGAT Ejemplos de pares de cebadores para genes implicados en el Biodeterioro

opl1 Lipasas GAATTTTTTTAGGAGGACACTATGAGTC(F) CCCTGCAGCTTATTTACCC CCATTATAAGTGGTTTGATTTTAGGCC(R)

catA Catecol-1,2-dioxigenasa (degradación de hidrocarburos)

GAAGGACCGCTATATGTTGCAGGTGC(F) TAGTGAATATGCGCAGGGCG(R)

F, cebador forward (hacia adelante); R cebador reverse (hacia atrás).



La identificación a nivel de género o de especie se puede lograr idealmente

mediante la determinación de la secuencia de bases del DNA amplificado. Después, esta

secuencia se envía a las bases de datos disponibles (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

para ser comparada con secuencias conocidas que han sido depositadas previamente por

otros investigadores. Uno de los problemas es que estas bases de datos son limitadas,

especialmente en el caso de hongos y cianobacterias, y muchas de las secuencias que se

envían pueden tener problemas de emparejamiento y permanecer sin identificar. Uno de

los esfuerzos más importantes en la investigación actual debe ser la secuenciación del

DNA de más microorganismos, tanto cultivables como no cultivables. La secuenciación

del genoma completo es importante, pero incluso el depósito de secuencias parciales,

determinadas mediante el empleo de sólo un pequeño número de cebadores, permitirá

una mejora en los servicios ofrecidos por los bancos de datos. Se puede encontrar una

lista constantemente actualizada de las secuencias completas de genomas microbianos

en la dirección http://www.tigr.org/tdb.shtml.

4.2. Análisis de Comunidades

El Biodeterioro se refiere sobre todo a las interacciones entre los organismos

vivos y los materiales inertes en ambientes naturales. Debido a que los organismos no se

encuentran normalmente en cultivos puros en la naturaleza, es importante examinar la

comunidad viva al completo y su relación con el deterioro. Esto se ha hecho en el

pasado mediante el uso de técnicas como el análisis de ácidos grasos de fosfolípidos. La

determinación de los ácidos grasos específicos mediante cromatografía de gases y

espectrometría de masas (GC-MS) puede indicar no sólo las cantidades, sino también

los tipos de microorganismos presentes. Las llamadas “huellas de ácidos grasos”,

algunas de las cuales se muestran en la Tabla 5, permiten la detección cuantitativa de

grupos específicos de microorganismos en una muestra ambiental. Sin embargo, se

requieren técnicas de extracción y separación bastante prolijas y especializadas y aún no

se han identificado los marcadores de ácidos grasos de fosfolípidos (PLFAs) para todos

los grupos de organismos causantes de deterioro; por tanto, las nuevas técnicas de

biología molecular hacen que la detección simultánea de microorganismos de una

comunidad sea un propósito mucho más factible.



Tabla 5. Algunos patrones de fosfolípidos de ácidos grasos (PLFA) utilizados para detectar grupos específicos de microorganismos

Patrón lipídico Grupo microbiano 18:2ω6, 18:3 Eucariotas 18:2ω6,9 Hongos 20:5ω3, 18:3ω3 Algas 10Me18:0 Actinomicetos PLFAs saturados con ramificaciones terminales (por ejemplo, i15:0, i17:0) Bacterias anaerobias Gram-negativas

10Me16:0, i17:1ω7 Bacterias sulfatorreductoras i17:1ω7c Desulfovibrio

Las poblaciones microbianas de cualquier nicho medioambiental se pueden

estudiar más fácil, precisa y rápidamente que en los viejos tiempos “pre-PCR” mediante

el empleo de métodos de análisis de comunidades como la DGGE y la electroforesis en

gel con gradiente de temperatura (TGGE) del DNA amplificado. Estas dos técnicas

permiten la separación de fragmentos de DNA con diferente secuencia de bases en un

gel de poliacrilamida. La temperatura o concentración de reactivos desnaturalizantes

(formamida, urea) a la que las dos hebras de DNA se separan depende de la secuencia

de bases. Se evita la separación completa de las dos hebras (y su salida del gel)

mediante una “cola GC” que se fija a uno de los extremos. Esta ristra de bases de

guanina y citosina mantiene a las dos hebras de DNA unidas incluso a altas

temperaturas o concentraciones desnaturalizantes. Así el DNA total de una población

mixta se puede amplificar con un par de cebadores generales (para eubacterias, por

ejemplo) y el DNA amplificado de las diferentes bacterias, que serán fragmentos de

tamaño similar, indistinguibles en un gel corriente de agarosa, se pueden separar en un

gel DGGE/TGGE (Figura 8). Las bandas separadas se pueden cortar y clonar o

amplificarse para su secuenciación, permitiendo una determinación rápida de la

diversidad (y, si es posible, de las identidades) de los microorganismos de la muestra. El

análisis filogenético, basado en las secuencias determinadas experimentalmente junto

con aquellas previamente depositadas, puede indicar el grado de relación entre los

microorganismos presentes y aquellos que ya se conocen.



Figura 8. Técnica de electroforesis en gel de gradiente para separar fragmentos de DNA con diferente secuencia de bases: (a) diagrama que muestra los pasos necesarios (basado en Amann y Ludwig, 2000).

Figura 8 (continuación) (b) productos de PCR de diferentes hongos separados mediante DGGE. Número de línea (de izquierda a derecha): 1, mezcla de hongos; 2, Penicillium; 3, Cladosporium; 4, Alternaria; 5, Aspergillus; 6, Acremonium. Fotografía: Dra. Denise Saad.

Esta aproximación se ha utilizado para mostrar que la biodiversidad en suelos

árticos aumenta en respuesta a la contaminación por petróleo y que la mayoría de los

miembros de la comunidad pertenecen al grupo de las bacterias Gram-positivas con alto

contenido en G+C. Las diversas actividades en la comunidad se pueden investigar

mediante el aislamiento y la amplificación del mRNA presente (o, de forma más

sencilla, del RNA total). En este caso, el uso de microarrays de DNA (chips) es

probable que tenga gran utilidad. Los microarrays son conjuntos ordenados de múltiples

sondas de DNA fijadas a una superficie pequeña (el microchip). Se pueden fijar



alrededor de 90.000 sondas a un único chip. En la Figura 9 se muestra de forma

esquemática cómo se puede diseñar y utilizar un array. Se están utilizando para

caracterizar la estructura y función de comunidades complejas. Por ejemplo, para

monitorizar la biodegradación potencial in situ en ambientes contaminados se está

empleando un array básico de genes catabólicos derivados de genes microbianos para la

degradación de contaminantes orgánicos y genes implicados en ciclos geoquímicos.

También se han desarrollado chips de proteínas, pero todavía no se utilizan mucho.

Figura 9. (a) Producción y (b) uso de microarrays.

4.3. Proteómica

La comparación de secuencias de proteínas, en vez de DNA, es un enfoque

alternativo para la identificación de actividades relevantes en los organismos causantes

de deterioro. La proteómica comprende la identificación de proteínas, elucidando su

estructura tridimensional y determinando cómo interaccionan. El proteoma es mucho

más complicado que el genoma y ofrece mayores posibilidades a los científicos, ¡al

igual que mayores desafíos! Un único gen puede producir múltiples productos génicos,

permitiendo reunir más información sobre un sistema particular.



Una vez que el DNA genómico de un organismo se ha secuenciado completa o

sustancialmente, se pueden calcular las proteínas que se podrían producir, basándonos

en nuestro conocimiento del funcionamiento del genoma bacteriano. Estas secuencias

de proteínas se pueden comparar posteriormente con bases de datos de secuencias de

enzimas para determinar si la bacteria que se está investigando tiene la capacidad de

producir una proteína de estructura similar a una enzima conocida. Solo se necesita

conocer la secuencia del sitio activo de la enzima para llevar a cabo este proceso y

obtener un resultado apasionante, indicando que un organismo aislado de una muestra

particular tiene la información genética necesaria para degradar ese sustrato. Los COGs

(conjuntos de grupos ortólogos de proteínas) codificados en los genomas de varios

microorganismos representan rutas o sistemas funcionales, tales como los de reparación

del DNA y transporte de iones y se pueden encontrar en la dirección

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG.

4.4. Técnicas de Análisis de Superficies

En la actualidad, se utilizan en Biodeterioro un número de técnicas

instrumentales extremadamente sensibles para el análisis de superficies. Estas incluyen

los microscopios mencionados en la sección anterior sobre técnicas de detección, o los

microscopios ópticos normales, cuyo uso, en combinación con instrumentos que

realizan el análisis químico de las superficies a nivel de microescala, nos permiten

correlacionar áreas de material dañado con la presencia de células o sus productos

metabólicos y, por consiguiente, relacionar las actividades microbianas directamente

con el deterioro. Las técnicas que se han usado de esta forma incluyen el análisis de

energía dispersiva de rayos X, espectroscopia de infrarrojos, espectroscopia de

infrarrojos por transformada de Fourier, difracción de rayos X, espectrometría de rayos

X, fluorescencia de rayos X, espectroscopia de reflectancia infrarroja de absorción

intensificada superficialmente y espectroscopia de masas de ionización secundaria de

tiempo de vuelo.

4.5. Microsensores

El desarrollo de sensores de unas pocas micras de diámetro ha permitido obtener

medidas de pH y de diversos iones dentro de la biopelícula. Obviamente, esta tecnología



será de inmensa importancia a la hora de relacionar actividades microbianas con el

deterioro de materiales y su prevención. Ya se han utilizado, por ejemplo, para

determinar la concentración de cloro en una biopelícula artificial de Pseudomonas

aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. La concentración de cloro medida en la

biopelícula era típicamente del 20% o menos que la concentración en el líquido. Se han

utilizado microsensores de oxígeno, pH, sulfuro de hidrógeno, ión amonio, ión nitrato e

ión nitrito para examinar la dinámica de nitrificación y de fotosíntesis en las

biopelículas. Sin embargo, incluso estos pequeños sensores son considerablemente más

grandes que una célula bacteriana típica y su introducción dentro de la biopelícula

puede causar algunas alteraciones; por tanto, la técnica es invasiva y se pueden producir

artefactos. Esto debe tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados en relación

con el Biodeterioro de la superficie subyacente.

5. El Futuro Muchas de las tecnologías descritas en esta Unidad constituyen técnicas de

rutina en la investigación del Biodeterioro. Otras requieren aún un desarrollo

considerable antes de ser aplicadas. Las técnicas de PCR basadas en DNA y RNA ya se

han desarrollado en forma de kits para la identificación de especies y actividades y es

probable que los microarrays sean utilizados cada vez más. La proteómica está aún en

pañales, pero creciendo rápidamente. Ofrece oportunidades apasionantes para el estudio

de los mecanismos de Biodeterioro y será, sin duda, utilizada en el futuro. Sin embargo,

siempre habrá en la investigación y en los ensayos de rutina un lugar para los métodos

clásicos de microbiología.

Adaptado del Libro “Introducción al Biodeterioro”, Dennis Allsopp, Kenneth Seal, Christine Gaylarde. Editorial Acribia. 2008.

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