10. analisis microbiologico de aguas de consumo

7/24/2019 10. Analisis Microbiologico de Aguas de Consumo

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ANDALUCIA POLIVALENTES CETECALAuxiliar de Laboratorio de Industrias Alimentarias

CONTROLES ANALITICOS DE AGUAS DE CONSUMO(Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero)

ANLISIS NORMAL

- Olor y sabor (cualitativo)- Conductividad elctrica!- "#!- $urbide%!- &'oniaco!- itratos!- itritos!- Oidabilidad al "er'an*anato!- Cloro residual libre!

- +acterias aerobias a 37 C y a 22C!- Colifor'es totales

- Colifor'es fecales- -stre"tococos fecales!- Cl! .ulfitorreductores!

ANLISIS MICRO!IOLOGICOPARAMETRO VALOR O!TENIDO VALOR LIMITE

Re"uento "olonias aerobiasmes#$ilas a %& '() *+C *, u$"( ml

Re"uento "olonias aerobias-si"rotr#$i"as a

.. '() *+C

*,, u$"( ml

Coli$ormes totales/ * u$"(ml

Coli$ormes $e"ales / * u$"(ml

Estre-to"o"os $e"ales/ * u$"(ml

Clostridium sul$ito)redu"tores Ausen"ia(., ml

Nota0el cloro residual, olor y sabor, sern "ar'etros 'edidos in situ "or la "ersonaencar*ada de la reco*ida de 'uestras!

!I!LIOGRA12A0

- del Rosario ascual &nderson, 5icente Calder6n ascual! icrobiolo*a &naltica "araali'entos y bebidas! -diciones Da% de .antos! 2 -dici6n, 2000!

- anual +sico de 'icrobiolo*ia Culti'ed! -ditado "or anreac 8u'ica .!&! 2 -dici6n, 199:!

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERO!IOS 3%& 4 ..+C5

* DE1INICI6N

-n *eneral, el recuento de la flora aerobio 'es6fila es una "rueba "ara conocer las condicionesde calidad sanitaria del a*ua anali%ada!

. MATERIAL 4 MEDIOS DE CULTIVO

- i"etas estriles de 1 'l!- lacas etri estriles de 90 '' de di'etro!- -stufa de incubaci6n, 37 y 22 ;/< 1C- &*ar nutritivo de recuento (todos -stndar &*ar, &)

% 1UNDAMENTO DEL METODO

=a co'"osici6n del 'edio basada en la "e"tona de caseina co'o a"ortaci6n nutritiva, eletracto de levadura co'o sustrato vita'nico y la *lucosa co'o fuente ener*tica, favorece elcreci'iento de la 'ayor "arte de los 'icroor*anis'os, sin "recisar de otros aditivos!

-ste 'edio es e'"leado "ara el recuento bacteriano en lec>es, carnes, a*uas, "roductosali'enticios en *eneral, "roductos far'acuticos, "roductos cos'ticos y cual?uier ti"o de'uestra!

7 PROCEDIMIENTO DE RE1ERENCIA0 METODO DE RECUENTO EN PLACA

.e utili%a "ara deter'inar el n@'ero de 'icroor*anis'os "or 'ililitro del a*ua en estudio,'ediante el e'"leo de tcnicas en "lacas de a*ar!

$ACBC&

Paso *!< & "artir de la 'uestra (o de diluciones de la 'is'a) y "or du"licado, de"ositar con"i"eta estril, 1 'l en "lacas de etri estriles de 90 '' de di'etro!

Paso .!< &adir a cada "laca unos 1E 'l de a*ar de & "revia'ente licuado y ate'"eradoa 47C!

-l tie'"o transcurrido entre de"ositar la 'uestra en la "laca y el "osterior vertido del 'ediode cultivo sobre las 'is'as, no debe de eceder de 10 'inutos!

Paso %8) e%clar "erfecta'ente 'edio e in6culo, lo cual se consi*ue 'oviendo la "laca sobrela su"erficie de la 'esa en crculos y en for'a de cru%, evitando ?ue el 'edio lle*ue a

i'"re*nar la ta"a de la "laca! DeFar solidificar el a*ar en las "lacas sobre una su"erficie>ori%ontal!

Gna ve% solidificado el a*ar, las "lacas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a unaT9 de %& : .. '() *+C; durante &.


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INVESTIGACION 4 RECUENTO DE COLI1ORMES TOTALES 4COLI1ORMES 1ECALES 3ESC=ERIC=IA COLI5

* DE1INICION

=as -nterobacteriaceae lactosa "ositivas o *ru"o coli y con una te'"eratura deincubaci6n co'"rendida entre 30o'bre y de los ani'ales de san*re caliente!Debido a su es"ecificidad, es considerado un buen ndice de conta'inaci6n fecal! or elcontrario, vive "oco tie'"o en un a'biente etraentrico, "or lo ?ue su "resencia en losali'entos es indicativa de una contaminacin reciente!

.e destruye a te'"eratura de "asteuri%aci6n y ta'bin durante su al'acena'iento en fro,sobre todo a te'"eratura de con*elaci6n!

.u escasa resistencia >ace ?ue no sea un buen indicador de flora "at6*ena, ya ?ue en al*unoscasos co'o la .al'onella, es 'uc>o 'enos resistente a las condiciones a'bientales y a laacci6n del fro!

ertenecen a la fa'ilia de las enterobacteriaceae y dentro de ellas al *ru"o de los colifor'esya ?ue son ca"aces de fer'entar la lactosa en "resencia de sales biliares con for'aci6n de *asy cido a $ de 30 C y >asta 's de 44 C! Otra caracterstica bio?u'ica de -! coli, es suca"acidad "ara "roducir Bndol en &*ua de tri"tona incubada a 44!EC durante 4:>!


- i"etas estriles de 1 'l con divisiones de 0!1 'l!- i"etas estriles de 10 'l con divisiones de 1 'l!- lacas de etri estriles de 90 '' de di'etro!- -stufas de incubaci6n de 30 y 44!E ;/< 1C- +ao 'ara- &sas de sie'bra

- $ubos de ensayo- Ca'"anas Dur>a'- Caldo =actosado biliado verde brillante (+H+=)- Caldo -C- &*ar de =evine (-osina &%ul de etileno, &*ar)- Reactivo de Iovacs- edio Ili*er

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% 1UNDAMENTO DEL METODO

Caldo =actosado +iliado 5erde +rillante el obFetivo de este 'edio es el de "oder in>ibir elcreci'iento de los 'icroor*anis'os distintos de los colifor'es, al tie'"o ?ue stos "uedancrecer sin restricci6n! Con la "resencia de la +ilis de +uey y del 5erde +rillante (verco'"osici6n del 'edio de cultivo), se consi*ue la in>ibici6n de casi la totalidad de los'icroor*anis'os *ra'iben "arcial'ente elcreci'iento de 'icroor*anis'os Hra' "ositivos, entre ellos los -stre"tococos fecales! &de's

la co'binaci6n de a'bos co'"onentes, "er'ite la diferenciaci6n entre los 'icroor*anis'oslactosa "ositivos de los lactosa ne*ativos!

Los "oli$ormes dan "olonias >ioleta os"uro; "on "entro m?s os"uro8 E8 "oli; -resentaunas "olonias mu: "ara"ter@sti"as :a ue >an del -Br-ura al >erde; "on brillomet?li"o8

#ierro de Ili*ler, &*ar a travs de este 'edio se diferencian los bacilos entricos *ra' (idr6*enosulfuro! =a acidificaci6n del 'edio a causa del "roceso fer'entativo se "one de 'anifiesto conun ca'bio de color del roFo de fenol ?ue "asa de roFi%o a a'arillo! =os 'icroor*anis'os ?ues6lo fer'entan *lucosa co'o .al'onella y .>i*ella, ?ue se encuentra en una concentraci6n 10

veces inferior a la lactosa, aun?ue a"arece el color a'arillo, s6lo lo >ace en la colu'na verticaldel 'edio (base del tubo), 'ientras ?ue en la su"erficie inclinada se restablece el color roFo"or oidaci6n del cido! Cuando el color a'arillo obtenido en la acidificaci6n del 'edio, es"roducido "or la fer'entaci6n de la lactosa, es "ersistente de 'anera ?ue la su"erficieinclinada se 'antiene a'arilla! =os cultivos ?ue contienen 'icroor*anis'os ca"aces de for'ar#ierro BBB .ulfuro, "resentan el caracterstico "reci"itado ne*ro! =a "roducci6n de *as seobserva "or la a"arici6n de burbuFas de aire e incluso "or rotura del "ro"io *el!

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7 PROCEDIMIENTO DE RE1ERENCIA0 METODO NMP

Paso *8) Siembra en medio !G!L

& "artir de la 'uestra a anali%ar, to'ar 10'l, y aadirlo en los "ri'eros tres tubos de la seriede nueve tubos con 10 'l de 'edio +H+=!, a los tres se*undos aadi'os 1'l y a los tres@lti'os 0!1'l! Co'"robar ?ue cada uno de los tubos contiene una ca'"ana Dur>a'!

Bncubar a 30C durante 4: >!

&l cabo del tie'"o de incubaci6n, co'"robar la "resencia de tubos "ositivos turbide% del'edio con leve viraFe a a'arillo y "roducci6n de *as en la ca'"ana! Co'"robar el en lastablas y anotarlo, este sera el resultado de Colifor'es totales en 100 'l de 'uestra!

Paso .8) Siembra en Caldo EC

De cada tubo "ositivo en +H+=, to'ar 1'l y aadirlo en un tubo con 10 'l de Caldo -C yca'"ana!

Bncubar a 4E C durante 24!

=os tubos "ositivos "resentan turbide% y *as en la ca'"ana! #acer recuento de los 'is'os,co'"robar el y anotarlo! -ste sera el resultado de Colifor'es fecales "or 100 'l de'uestra!

Paso %8) Con$irma"i#n de los tubos -ositi>os

.ie'bra en &*ar de =evine.e'brar de cada tubo "ositivo en Caldo -C, dos "lacas con &*arde =evine! =a sie'bra se >ar con asa de "latino "rocurando evitar el ac@'ulo de colonias ?ueno nos "er'ita observar el caracterstico color verde 'etlico de las 'is'as!

rueba del Bndol de cada 1 a 44!E C! $ranscurrido este tie'"o adicionar 0!E 'l de reactivo deIovacs y se observa la a"arici6n de un anillo roFo ber'ell6n en la su"erficie del 'edio ("rueba"ositiva) o a'arillento ("rueba ne*ativa)!

Paso 78) Otras -ruebas "on$irmati>as0

.ie'bra de colonias en 'edio Ili*er to'ar una colonia bien diferenciada de cada "laca yse'brarla en "icadura sobre el 'edio, de 'anera ?ue ta'bin se sie'bre el "ico de flauta! -!coli va a "resentar las si*uientes caractersticas

Su-er$i"ie in"linada0 amarilla

!ase0 amarillaGas0 '=.S0 )


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INVESTIGACION DE ESTREPTOCOCOS 1ECALES

* DE1INICI6N

De acuerdo con el es?ue'a de =ancefiel, los estre"tococos, se a*ru"an anti*nica'ente'ediante las letras &, +, C, D, etc! &l *ru"o D de =ancefield, "ertenecen los estre"tococos

fecales, "or ser su >bitat nor'al el tubo di*estivo de ani'ales de san*re caliente! -ntre suscaractersticas "eculiares, est el "oder crecer a $ de 4EC, y en 'edios con un 4J de bilis!

Dentro de los estre"tococos fecales estn los enterococos (.tre"tococcus faecalis y susvariedades) ?ue viven *eneral'ente en el intestino >u'ano! Otros estre"tococos fecales vivenen los ani'ales!

=os estre"tococos son considerados indicadores de conta'inaci6n fecal y su "resencia en losali'entos indica falta de >i*iene o condiciones de al'acena'iento defectuosas, ece"to en losali'entos en los ?ue intervienen co'o flora >abitual de "rocesos fer'entativos!

.on 'uy resistentes a las condiciones adversas (con*elaci6n, desecaci6n, trata'iento tr'ico,etc), "or lo ?ue se consideran buenos indicadores "ara valorar, las condiciones >i*inicas y deconservaci6n de ali'entos con*elados y desecados cuando a"arecen en cifras elevadas!

referente'ente, se utili%an co'o indicadores fecales en el a*ua!


- i"etas estriles de 1 'l con divisiones de 0!1 'l!- i"etas estriles de 10 'l con divisiones de 1 'l!- lacas de etri estriles de 90 '' de di'etro!- -stufas de incubaci6n de 37 ;/< 1C- &sas de sie'bra- $ubos de ensayo

- Caldo "resuntivo Iana'icina


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7 PROCEDIMIENTO DE RE1ERENCIA0 METODO NMP

Paso *8) Siembra en "aldo AA

& "artir de la 'uestra, se'brar en una batera de nueve tubos con 10 'l de caldo I&& cadauno, 10 'l en los tres "ri'eros, 1 'l en los tres se*undos y 0!1 'l en los tres @lti'os!

Bncubar los tubos a 37C durante 24 >!

=os tubos "ositivos "resentarn un enne*reci'iento!

Paso .8) Siembra en aFar AA

& "artir de cada tubo "ositivo, se'brar con asa de sie'bra, 0!1 'l en dos "lacas con a*arI&&!

Bncubar a 37C durante 24 >!

=as colonias rodeadas de un >alo ne*ro, corres"ondern a estre"tococos fecales!

-l n@'ero de .tre"tococos D de =ancefield "or 100 'l de 'uestra se obtiene "or lectura en latabla del de tres series de tres tubos de acuerdo con los tubos "ositivos en caldo I&& yconfir'ados en a*ar I&&!

Paso %8) Pruebas "on$irmati>as

Catalasa se deter'ina la "resencia de catalasa aadiendo 1 'l de a*ua oi*enada de 10vol@'enes en un cultivo reciente del 'icroor*anis'o "roble'a en caldo +#B, "ero nunca en'edios ?ue conten*an a%ida s6dica! -n caso "ositivo, se "roducen burbuFas "ordes"rendi'iento de o*eno!

-l *ru"o .tre"tococos D de =ancefield es "atalasa neFati>o8

Creci'iento en "resencia de cloruro s6dico al K!EJ los enterococos, dentro del *ru"o.tre"tococus D de =ancefield, crecen en caldo +#B con K!EJ de cloruro s6dico "reviaincubaci6n a 37 C durante 72 >!

.t! -?ui y .t! +ovis no crecen en este 'edio!

Creci'iento a 4EC to'ar un cultivo reciente del 'icroor*anis'o a estudiar en caldo +#B eincubar a 4E C durante 24 L 4: >!

$odo el *ru"o crece a 4E C!

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RECUENTO DE CLOSTRIDIUM SUL1ITO)REDUCTORES 31ORMASESPORULADAS5

* DE1INICI6N

-ste *ru"o de 'icroor*anis'os se suele utili%ar "ara a"reciar la calidad >i*inica del a*ua y

"roductos ani'ales o de ori*en ani'al! .u n@'ero es escaso en "roductos frescos! =aca"acidad de es"orular les confiere una *ran resistencia!

-l *ru"o bacteriano de los sulfitosierro! =a"resencia del sulfuro de >ierro se "one de 'anifiesto "or el color ne*ro ?ue "resentan lascolonias!

7 PROCEDIMIENTO DE RE1ERENCIA0 RECUENTO EN TU!OS

ara obtener @nica'ente las for'as es"oruladas, se a"rovec>a su ter'orresistenciacalentando a :0C la 'uestra! De esta 'anera se destruyen las for'as ve*etativas!

Paso *8) Destru""i#n de las $ormas >eFetati>as

.e to'an 100 'l de 'uestra y se calientan en bao 'ara re*ulado a :0C durante E 'inutos!-nfriar in'ediata'ente baFo el *rifo!

Paso .8) ReFenera"i#n del medio de "ulti>o

-l 'edio a*ar .. (tubo con 20 'l de 'edio), se funde y re*enera calentndolo en a*ua

>irviendo durante 10 'inutos "ara e"ulsar el o*eno! Des"us se enfra >asta alcan%ar 47LE0C, baFo un c>orro de a*ua fra!

Paso %8) TH"ni"a

.e'brar 20 'l de 'uestra (en cinco tubos con ..), "revia'ente calentada co'o en "aso 1,en el 'edio .., "revia'ente re*enerado, co'o en "aso 2! ara la sie'bra, se introduce la"i"eta con cada diluci6n >asta el fondo de a*ar y se va de"ositando el in6culo lenta'ente deabaFo a arriba! Cubrir la su"erficie con una ca"a de "arafina estril! .olidificado el 'edio,incubar en estufa a 4KC, en anaerobiosis (Farra de anaerobiosis), durante 24L4: >!

Contar el n de colonias ne*ras crecidas en el a*ar y 'ulti"licarlo "or el factor de diluci6n del

tubo (si es ?ue fuera necesario)! -sta cifra dar el n de es"oras de Clostridiu' sulfito


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