1. estructura de los ácidos nucleicos
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Introducción al estudio de los ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos son heteropolímeros, polianionicos y de alto peso molecular,
que tienen por función almacenar y transmitir la información genética, proceso que es la
base para poder mantener la identidad de los organismos, sus características como especie,
y las variaciones entre los individuos de la misma especie.
La complejidad estructural y funcional de una célula implica el uso de una enorme
cantidad de información, presente a lo largo de su ciclo vital y repetido con absoluta
identidad en todas y cada una de las células de un organismo pluricelular. Se comprende
pues la importante presencia celular de ADN, como portador de información genética,
constituyendo cadena extraordinariamente largas, que superan con mucho la propia
dimensión de la célula que lo contiene. Ello plantea un importante problema de ubicación,
resuelto mediante un empaquetamiento terciario del ADN que produce como resultado la
estructura cromosómica. Armando Garrido Pertierra, Jose Maria Teijon
Rivera, Fundamentos de Bioquímica Metabólica. 3ª edicion.
Editorial Tebar. 2009.
Esta molécula polimérica, el ADN, es la base química de la herencia y está
organizada en genes, unidades fundamentales de la información genética. Los genes
controlan la síntesis de varios tipos de ARN, que en su mayor parte están involucrados en la
síntesis de proteínas. Los genes no funcionan de manera autónoma; su actividad y
replicación son controladas de manera vagamente todavía comprendidas por circuitos de
retroacción en que los mismos productos genéticos desempeñan un papel crítico. El
conocimiento de la estructura y función de los ácidos nucleicos, es esencial para
comprender la genética y proporciona la base para la investigación futura.
La importancia biomédica radica en que la base química de la herencia y de las
enfermedades genéticas se encuentra en la estructura del ADN. Se ha dilucidado la vía de
información básica (esto es, el ADN dirige la síntesis de ARN, que a su vez regula la
síntesis de proteínas). Este conocimiento se está usando para definir la fisiología celular
normal y la fisiopatología de la enfermedad a nivel molecular. Robert Murray,
Daryl Granner, Peter mayes, Victor Rodwell, Bioquimica de
Harper. 11va Edicion. Editorial El manual moderno, S.A. 1988.
Diferencias fundamentales entre ARN y ADN
Existen dos clases de Ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el
acido Ribonucleico (ARN). El ADN es la molécula de la herencia en todas las formas de
vida celulares, así como en muchos virus. Solo tiene dos funciones:
1. Dirigir su propia replicación durante la división celular.
2. Dirigir la transcripción de moléculas de ARN complementarias.
El ARN en cambio, realiza funciones biológicas más variadas:
1. Los transcritos de ARN a partir de secuencias de ADN que especifican
polipéptidos, o ARN mensajero (mRNA), dirigen la síntesis ribosómica de dichos
polipéptidos en un proceso conocido como traducción.
2. Los ARNs de los ribosomás, que están constituidos por cerca de dos terceras
partes de ARN y una tercera parte de proteína, desempeñan probablemente papeles
tanto funcionales como estructurales.
3. Durante la síntesis de proteínas, los aminoácidos son transportados al
ribosoma por moléculas de ARN de transferencia (RNA).
4. Ciertos ARNs están asociados con proteínas especificas formando
ribonúcleoproteínas que participan en el proceso postranscripcional de otros RNAs.
5. En muchos virus, el RNA, no el DNA, es el portador de la información
hereditaria.
Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt.
Fundamentos de Bioquímica. Editorial Panamericana. 2007.
Diferencias entre ADN y ARN
ADN ARN
ESTRUCTURAL
2-desoxi D-ribosa D-ribosa
Timina Uracilo
Doble Hélice (Bicatenario) Hebra sencilla (monocatenario)
Estable frente a los álcalis diluidos Es hidrolizado por un álcali diluido
LOCALIZACIÓN
Se localiza fundamentalmente en el
núcleo
Se localiza en el citoplasma
FUNCION
Dirige la síntesis de ARN y división
celular
Dirige la síntesis de proteínas
Robert Murray, Daryl Granner, Peter mayes, Victor
Rodwell, Bioquimica de Harper. 11va Edicion. Editorial El manual
moderno, S.A. 1988.
Antecedentes:
La bacteria NEUMOCOCCOS revelo que los genes están formados por ADN, esta bacteria
puede ser patógena (forma S, posee una capa con polisacáridos) o no patógena ( forma R,
mutante desprovistos de polisacáridos) en 1928, FREUD GRIFFITH descubrió que un
mutante R podría ser transformado por la forma S, este realizo un experimentos con ratones
inyectándoles R vivos y S muertos por calor, esto se dio por la adición de sus extremos
libres.
Después que analizaron las imágenes por difraccion de rayos X, se llego a la conclusión de
que las manchas centrales en forma de aspa indican una estructura en forma de hélice y las
bandas intensas en la parte superior e inferior indican la repetición de estas estructuras, con
esto se concluyo que el ADN estaba formado por dos cadenas, con una disposición
helicoidal.
Primero que nada para poder hablar del modelo de Watson y Crick, tenemos que definir lo
que son las reglas de CHARGAFF y quien es.
En un principio se creía que el ADN estaba formado por cantidades iguales de los 4
nucleotidos, esto fue deducido por, un bioquímico ruso-estadounidense Phoebus A. Levene,
supuso que estas moléculas debían estar agrupadas en ramilletes de cuatro, un
tetranucleótido ( como unidad fundamental ), según lo llamó, que se repetía una y otra vez a
lo largo de la molécula; hasta que ERWIN CHARGRAFF observo distintas proporciones
de los 4 nucleotidos en diferentes organismos de una misma especie, por lo que llego a la
conclusión de que las características del ADN es diferente en cada especie, este tipo hizo
unas reglas o generalizaciones cuantitativas sobre la composición de las bases del ADN
(estas fueron clave para deducir la estructura de doble hebra) las reglas son:
1. Relación entre bases: en casi todas las especies el contenido de A se se aproxima al
de T y el de C se aproxima a G. ( esta regla fue clave para que W. Y CRICK
postularan la complementaridad de las bases.
2. Relación entre purinas y pirimidinas; hay un 50% de ambas bases.
3. Relación entre aminobase y oxobases. (regla poco conocida)
Estructura del ADN:
Cada molécula de ADN está constituida por
dos cadenas o bandas formadas por un
elevado número de compuestos químicos
llamados nucleótidos. Estas cadenas forman
una especie de escalera retorcida que se
llama doble hélice. Cada nucleótido está
formado por tres unidades: una molécula de
azúcar llamada desoxirribosa, un grupo
fosfato y uno de cuatro posibles compuestos
nitrogenados llamados bases: adenina
(abreviada como A), guanina (G), timina
(T) y citosina (C).
La molécula de desoxirribosa ocupa el centro del nucleótido y está flanqueada por un grupo
fosfato a un lado y una base al otro. El grupo fosfato está a su vez unido a la desoxirribosa
del nucleótido adyacente de la cadena. Estas subunidades enlazadas desoxirribosa-fosfato
forman los lados de la escalera; las bases están enfrentadas por parejas, mirando hacia el
interior, y forman los travesaños.
Los nucleótidos de cada una de las dos cadenas que forman el ADN establecen una
asociación específica con los correspondientes de la otra cadena. Debido a la
afinidad química entre las bases, los nucleótidos que contienen adenina se acoplan siempre
con los que contienen timina, y los que contienen citosina con los que contienen
guanina. Las bases complementarias se unen entre sí por enlaces químicos débiles llamados
enlaces de hidrógeno.
La molécula de ADN es hidrofílica, esto hace que sea polianionica. Es una molécula ácida, necesita sustancias que la estabilicen. Las histonas, le otorgan esa carga positiva. Puede interactuar con agua.
En 1953, el bioquímico estadounidense James Watson y el biofísico británico Francis Crick
publicaron la primera descripción de la estructura del ADN. Su modelo adquirió tal
importancia para comprender la síntesis proteica, la replicación del ADN y las mutaciones,
que los científicos obtuvieron en 1962 el Premio Nobel de Medicina por su trabajo.
Ellos analizaron fotografías por difracción de rayos X de fibras de ADN y descubrieron la
estructura tridimensional del ADN la cual postularon como la forma B del ADN.
Modelo de Watson y Crick: Postulaciones:
4. Dos cadenas de polinucleotidos están enrolladas a lo largo de un eje común. Las
cadenas corren en direcciones opuestas.
5. Las bases de purina y pirimidina están en el interior de la hélice, mientras que las
unidades de fosfatos y desoxirribosa están en el exterior. Los planos que contienen
las bases son perpendiculares al eje de la hélice, los planos que contienen los
azucares están formados por angulos rectos con los de las bases.
6. El diámetro de la hélice es de 20 Ӑ. Las bases adyacentes están separadas 3,4 a lo
largo del eje de la hélice y relacionadas por una rotación de 36 grados. Por lo tanto
la estructura helicoidal se repite después de 10 residuos.
7. Las dos cadenas permanecen unidas por puentes de hidrogeno entre los pares de
bases. La adenina esta apareada con la timina y la citosina con la guanina.
8. La secuencia de bases a lo largo de la cadena del polinucleotido no está restringida
en modo alguno. La secuencia precisa de bases transporta la inf. Genética.
La estabilidad de la estructura del ADN estará dada por fuerzas no covalentes:
Fuerzas de van der walls. Interacciones hidrofóbicas. Puentes de hidrógeno.
Distintas conformaciones del ADN: A, B y Z.
Primero debemos hablar sobre la estructura de la molécula de ADN. Estas son muy
parecidas a los niveles estructurales de los polipéptidos:
Está la estructura primaria, que es principalmente la unión de numerosos
nucleótidos mediante enlaces covalentes fosfodiéster, dando lugar a un polímero lineal.
La estructura secundaria, es la asociación de dos cadenas polinucleótidas a
través de las bases nitrogenadas que sobresalen del esqueleto azúcar-fosfato.
Las estructuras de orden superior, son todas aquellas estructuras
tridimensionales que surgen a partir de los niveles primario y secundario, como son el
superenrrollamiento y la formación de cromatina. Sin embargo, a diferencia de las
proteínas, esta estructura no viene determinada por los niveles inferiores
En este caso no se observa una estructura cuaternaria, ya que dicho plegamiento
sólo afecta a una molécula y no a varias asociadas entre sí, como en las proteínas.
Biología Molecular e Ingeniería Genética – Luque y Herráez
Existen tres formas/tipos de ADN:
La forma A, tiene las siguientes características:
Se encuentra en condiciones de deshidratación de la célula.
Su forma general es corta y alargada.
Es dextrógira, gracias a la conformación anti que tiene los enlaces
glucosídicos de sus nucleótidos.
Un solo giro alrededor del eje largo de la molécula de doble hélice
contiene 11 pares de bases.
Su surco mayor es extremadamente angosta pero muy profunda
Su surco menor es muy ancho pero llano.
El eje de la doble hélice está localizada en el surco mayor.
La forma B, tiene las siguientes características:
Por lo general se encuentra en condiciones fisiológicas (baja
salinidad, alto grado de hidratación).
En general, esta forma de la molécula tiene una forma larga y es
más delgada.
Tiene una concentración de A=T casí igual que de C≡G.
Es dextrógira, gracias a la conformación anti que tiene los
enlaces glucosídicos de sus nucleótidos.
Un solo giro alrededor del eje largo de la molécula de doble
hélice contiene 10 pares de bases.
Su surco mayor es ancho y de profundidad intermedia
Su surco menor es angosto y de profundidad intermedia
El eje de la doble hélice se localiza a través de los pares de
bases.
La forma Z, tiene las siguientes características:
Por lo general se encuentra en la transmisión hereditaria
Tiene una concentración más elevada de C≡G
Es levógira, gracias a la conformación anti que tiene los enlaces
glucosídicos de sus cisteínas y a la conformación syn que tiene los
enlaces de sus guaninas.
Un solo giro alrededor del eje largo de la molécula de doble hélice
contiene 12 pares de bases.
Su surco mayor es muy ancho pero llano.
Su surco menor es extremadamente angosta pero muy profunda.
El eje de la doble hélice se localiza en el surco menor.
Molecular
Biology of the
Gene 7ª edición
– Watson, Baker,
Bell, Gann,
Levine y Losick.
Explicar el significado
de los términos
siguientes:
Extremos 3’ y 5’. Las estructuras químicas están enumeradas de manera que puedas
seguir en dónde, los átomos, puentes, uniones y anillos aparecen. En los azúcares de ribosa,
los números son seguidos de un apóstrofe (’) para indicar la designación “prima”. La
adición de “prima” previene confusiones con sitios enumerados en otras moléculas que no
sea una unión con la ribosa.
Como los nucleótidos de una cadena de ADN se unen de manera lineal, con enlaces
fosfodiéster 5’→3’, el ADN tiene “extremos” enumerados. El extremo fosfato es referido
como extremo 5’ (5-prima), y el azúcar es referido como extremo 3’ (3-prima). La unión
entre un fosfato y dos azúcares en un nucleótido, se le conoce como enlace fosfodiéster.
Esto lo hicieron relacionándose con las configuración de las proteínas, grupo amino
proximal, y carboxilo terminal.
Genetics for Dummies 2ª edición – Robinson (2010)
Biología Molecular e Ingeniería Genética – Luque y Herráez
Antiparalelismo de las cadenas. Las dos cadenas de la doble hélice, cada una posee
una polaridad, estas son antiparalelas; esto es, una cadena corre en la dirección de 5'→3', y
la otra en la dirección de 3'→5'. HARPER Bioquímica Ilustrada 28ª edición
– Murray, Bender, Bothman, Kennelly, Rodwell y Weil
Biología Molecular e Ingeniería Genética – Luque y Herráez.
Complementariedad de bases . La estructura química de las bases nitrogenadas
permite la formación de enlaces por puentes de hidrógeno, Por ende, dos nucleótidos
pueden formar interacciones de formás específicas con estos enlaces.
Estas interacciones específicas se forman entre G y C (tres puentes de hidrógeno) y
entre A y T (dos puentes de hidrógeno). El par G≡ es una interacción más fuerte que el par
A=T. Biología Molecular e Ingeniería Genética – Luque y Herráez.
Molecular Biology of the Gene 7ª edición – Watson, Baker, Bell,
Gann, Levine y Losick.
Factores que determinan la estructura del ADN:
La estructura helicoidal del ADN se mantiene gracias a interacciones no covalentes.
Por un lado, el apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece
interacciones hidrofóbicas entre éstas, y por otro lado, cada base está unida a su pareja
mediante puentes de hidrógeno. La energía libre de las interacciones no covalentes que
mantienen la estructura helicoidal del ADN no es muy superior a la energía de los
movimientos térmicos a temperatura ambiente, por lo que es posible desestabilizar la
estructura tridimensional del ADN mediante un simple aumento de la temperatura.
Cuando se calienta un ADN de doble hebra (forma nativa) se rompen las fuerzas de
unión entre las dos hebras y acaban por separarse. Por tanto, el ADN desnaturalizado es de
una sola hebra. La transición entre el estado nativo y el desnaturalizado se conoce como
desnaturalización. En determinadas condiciones, una disolución de ADN monocatenario
(desnaturalizado), puede volver a formar el ADN nativo (de doble hebra). Este proceso
recibe el nombre de renaturalización del ADN. Cuando el ADN renaturalizado se forma a
partir de moléculas de ADN de distinto origen, o entre una molécula de ADN y otra de
RNA, la renaturalización se conoce como hibridación.
Propiedades físico químicas del ADN
Desnaturalización
Cuando se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras del ADN, éstas acaban
por separarse. Por tanto, el ADN desnaturalizado es de una sola hebra. La transición entre
el estado nativo y el desnaturalizado se conoce como desnaturalización.
La forma más corriente de desnaturalizar el ADN es por calentamiento. Otro agente
desnaturalizante es el pH elevado porque cambia la carga de algunos grupos que forman
parte de los puentes de hidrógeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy reducida)
se produce la separación de las hebras. Este fenomeno se debe a que en agua muy pura, la
fuerte repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfato no es contrarrestada por los
correspondientes contraiones (Na+, Mg+2).
Temperatura de fusión (T m) (la “m” es del inglés melting=fusión)
Las cadenas de una molécula de ADN dada se separan en un rango de temperatura.
El punto medio se denomina la temperatura de fusión, esta dependerá de su porción de G-C
y de A-T, esto debido a que cada par de base G-C forma entre ellos tres enlaces de
hidrogeno (uniones más estables) y por cada A-T forman solo dos, concluyendo, a mayor
unión G-C se necesita más energía (calor) para separar estos enlaces, que las uniones A-T,
en la siguiente grafica se muestra de relación G-T (mol %) con el aumento directamente
proporcional de la temperatura.
Punto donde la molécula de ADN al desnaturalizarse se desapareada. Al 50% de separarse o no. Punto de la temperatura en el que el ADN esta al 50% de desnaturalizarse.
Además de estar influenciada por la composición de sus bases, también influye la
concentración de sales de la solución. Un aumento de 10 veces las cifras de cationes
monovalentes (K+ NA+) incrementa la Tm en 16,6 °C.
Temperatura de fusión se ve influenciada por:
1. Numero de enlaces A-T (más débiles=menor energía para romperse) y C-G
(mas fuertes= mayor energía para romperse).
2. Concentración de sales en la solución (aumento de cationes=aumento de la
temperatura).
Revisen el Mathews, el Voet (que dice casí lo mismo que el
Mathews), el Harper, y el Luque.
La gráfica que representa la medida de A260 en función de la temperatura se llama curva de fusión del ADN. Esta curva presenta las siguientes características:
1.- La A260 permanece constante hasta temperaturas bien por encima de las fisiológicas. En este intervalo, la molécula está en forma de doble hebra.
2.- El aumento de A260 tiene lugar en un estrecho rango de temperaturas (6-8 ºC). La A260 empieza a aumentar cuando comienzan a romperse las uniones entre las bases en varios segmentos de la molécula. El número de puentes que se rompen aumenta con la temperatura, y con ella la A260. Al final del tramo ascendente, las dos hebras se mantienen juntas por unos cuantos puentes.
3.- La A260 máxima es aproximadamente un 37% mayor que el valor inicial, y corresponde
al estado en que las dos hebras están completamente separadas.
A bsorción de luz UV
Las nucleótidos debido a su carácter aromático, son capaces de absorber luz UV.
A pH= 7 estas pueden absorber un máx. De UV en una longitud de onda de 260 nm.
Ocurre un efecto muy simpaticón en los ácidos nucleicos y es el hipercromismo.
(Del griego: hiper exceso, cromo color) deben tener en cuenta que los ácidos nucleicos
dúplex los cuales, su capacidad de absorber luz UV es del 40% del total de su capacidad,
¿por qué? Esto es porque las bases nitrogenadas que los conforman cuando están
emparejadas (por así decirlo) pierden un poco la propiedad de la absorción de luz UV por
estar formando los enlaces de hidrogeno y su apilamiento en la cadena (suele llamarse a
este efecto de las bases nitrogenadas en los ácidos nativos hipocromismo), entonces ¿en qué
consiste el hipercromismo? Es el efecto del ácido que al elevar la temperatura aumenta la
absorbencia UV 260 nm, si analizamos lo anterior, si aumentamos la temperatura estamos
rompiendo los enlaces de hidrogeno, con ella, vuelve la capacidad de la absorción de las
bases nitrogenadas y a mayor temperatura mayor A260
Vean el grafico, la parte azul indica la
estructura nativa del ADN (por ejemplo)
que es bicatenaria o dúplex, y la roja o rosada
es la desnaturalizada que indica que este ADN
esta monocatenario, en el eje ´Y´ esta la A260 en el eje ´X´ la temperatura, ahora bien, nótese
que la ADN nativa la A260 es la unidad porque está en su forma nativa o porque así se
encuentra normalmente y no puede tener un número mayor o inferior a 1, a medida que
aumenta la temperatura aumenta la A260 hasta que se encuentra con una meseta
describiendo una curva sigmoidea, esta meseta que se encuentra en el área roja o rosada
corresponde al efecto del hipercromatismo donde el ácido posee su máxima capacidad de
absorber UV, cabe destacar que el Tm es el punto medio de la curva sigmoidea, así sabemos
a qué temperatura pasa de dúplex a una cadena simple, y la relación A260/temperatura.
Nivel de absorbancia mayor cuando esta desnaturalizado debido a que las bases
están expuestas. Las bases nitrogenadas están en pilas de monedas, así se separen en
monocatenario , el efecto hipercromático no será tan fuerte como estando separadas los
nucleótidos.
Temperatura de fusión del ADN (Tm)Dependencia de Tm con el contenido en G+C del ADN
Renaturalización
Una disolución de ADN desnaturalizado puede ser tratada de forma que recupere su
configuración nativa. El proceso se llama renaturalización, y se obtiene un ADN
renaturalizado,
Para que tenga lugar la renaturalización deben cumplirse dos requisitos:
La concentración salina debe ser alta ([NaCl] entre 0,15 y 0,5 M) para eliminar la
repulsión entre los grupos fosfato de las dos hebras.
La temperatura deber ser lo suficientemente elevada como para romper los puentes
de hidrógeno intracatenarios producidos al azar en el ADN monocatenario, y lo
suficientemente baja como para estabilizar los apareamientos correctos entre las bases de
hebras distintas. La temperatura óptima de renaturalización es de unos 20 a 25 ºC por
debajo de la Tm.
La renaturalización es un fenómeno de unión al azar, y por tanto la molécula de
ADN renaturalizada no contiene las hebras originales. Si mezclamos un ADN marcado con
el isótopo 15N con otro que contenga el isótopo normal 14N y los desnaturalizamos,
durante la renaturalización se forman 3 tipos de moléculas de doble hebra: un 25% con 14N
en las dos hebras, un 25% con 15N en las dos hebras y un 50% con una hebra 14N y otra
15N.
Hibridación
(Hibrido, del griego sig. mestizo)
Es el fenómeno de renaturalización de dos hebras sencillas de ácidos nucleicos de
origen nativo distinto, estas pueden ser híbridos: ADN-ADN; ARN-ARN (estas se
denominan homo-dúplex) o ARN-ADN (hetero-dúplex).
Esta depende de la complementariedad de la secuencia de las cadenas, el hecho de
que cadenas sencillas de especies diferentes se complementen, da indicios de que
comparten en cierto grado una línea evolutiva en común, esto permite decir que a mayor
complementariedad, mayor conexión evolutiva entre especies y viceversa.
Principio básico (artificial para el diagnóstico clínico)
se utiliza una sonda que no es más que una secuencia de nucleótidos conocida que
puede ser creada en un laboratorio lo cual se marca, se emplea esta sonda para buscar
moléculas con las secuencias complementaria dentro de compuestos formados por ácidos
nucleicos, una vez encontrada la secuencia complementaria se localiza la sonda y con ella
la hebra complementaria.