1. ANTECEDENTES

Los colorantes aninicos (cidos), catinicos (bsicos) y noinicos que son liberados por la industria textil y de alimentos, representan una amenaza latente para el ambiente ya que son sustancias orgnicas complejas con varios anillos aromticos de carcter recalcitrante (Mishra y Tripathy, 1993).

Para reducir la contaminacin por colorantes se han empleado mtodos fsicos, qumicos y biolgicos. Los dos primeros mtodos son caros y no especficos, por lo que los mtodos biolgicos utilizando bacterias, hongos y algunas algas, han adquirido mayor importancia (Kaushik y Malik, 2009).

Entre los hongos ms utilizados para ese fin se encuentran Coriolus versicolor, Trametes versicolor, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, P. chrysosporium, Rhizopus arrhizus, Ganoderma applanatum y Pleurotus ostreatus por mencionar algunos (Kapdan et al., 2000; Fu y Viraraghavan, 2001; Aksu, 2003; Pazarlioglu et al., 2005; Aksu y Cagatay, 2006; Aksu et al., 2007; Matos et al., 2007; Zhao y Hardin, 2007).

En lo que respecta a Trichoderma Sadhasivam y colaboradores (2007) utilizaron al micelio de T. harzianum como adsorbente para remover rodamina 6G en un sistema por lotes. En dicho trabajo, la cantidad de colorante adsorbida (mg g1) aument al incrementar el tiempo de agitacin, hasta alcanzar un equilibrio a los 120 minutos para concentraciones de 10 a 50 mg L1. De esta forma, la mxima remocin del colorante se obtuvo en la dosis de 1.0 g en 50 mL con pH de 8.0. Este estudio sugiere el uso de la biomasa de T. harzianum para la remocin de colorantes.La Tartrazina es un colorante ampliamente utilizado desde 1916 en productos de repostera, derivados crnicos, sopas preparadas, conservas vegetales, salsas, helados, postres, caramelos y otras golosinas; tambin se utiliza para colorear bebidas refrescantes de naranja y limn; por ser uno de los colorantes ms empleados, ms de sesenta pases del mundo lo utilizan, incluyendo Estados Unidos y la Unin Europea (Arroyave et al., 2008)

En investigaciones recientes se ha tratado de generar productos sustitutos para dicho colorante buscando reducir el consumo de dicho producto, debido a que ste se ha ido desfavoreciendo por algunos posibles efectos segundarios en su consumo, como son la produccin de reacciones alrgicas, tipo de angioedema, asma, urticaria y shock anafilctico.

Los miembros del gnero Trichoderma tienen el potencial de sintetizar y liberar enzimas como polisacarasas, celulasas, xilanasas y quitinasas, las cuales se han aprovechado en procesos industriales (Kubicek y Harman, 1998; Verma et al., 2007).

La explotacin comercial de estas enzimas es diversa, ya que se emplean para producir detergente de ropa, aceite de oliva, vino, cerveza, jugos, alimentos para animales y en la produccin de algunos combustibles (Reese y Mandels, 1989; Galante et al., 1993; Walsh et al., 1993; Verma et al., 2007). Por ejemplo, las celulasas de T. reesei se utilizan en el blanqueo de pulpa de papel, y son una alternativa amigable al convencional blanqueo con cloro, evitando el problema ambiental del cloro generado por dicho proceso (Buchert et al., 1994).

Adems pueden producir diversos metabolitos secundarios dentro de los que se encuentran algunas toxinas como la gliotoxina (Brian, 1944; Di Pietro et al., 1993) y hormonas de crecimiento como auxinas y giberelinas (Kleifeld y Chet, 1992). As, T. harzianum y otras especies del gnero son capaces de incrementar el crecimiento de plantas de lechuga (Latuca sativa L.) (Lynch et al., 1991; Ousley et al., 1994). Gravel y colaboradores (2007) probaron la capacidad de T. atroviride para promover el crecimiento de plantas de jitomate (Lycopersiconesculentum Mill.). Por otra parte, Trichoderma sp. ha sido utilizada en la industria de los aromatizantes porque es capaz de producir el metabolito 6pentil pirona que proporciona el aroma de coco al utilizar aceites vegetales comerciales (resino, avellana, uva y linaza) como sustrato (Bonnarme et al., 1997).

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El color es el principal contaminante en ser reconocido en el agua, concentraciones menores a 1 mg/L son altamente visibles para algunos colorantes, afectando as la esttica de los cuerpos acuticos (Banat et al., 1996). Estas aguas residuales son difciles de tratar debido a que los tintes contienen estructuras moleculares aromticas complejas, que los hacen estables en el ambiente y difciles de degradar. (Kim et al., 2004). Sus caractersticas qumicas, los hacen muy resistentes a la luz, temperatura, al ataque microbiano y por consiguiente son compuestos altamente recalcitrantes (Levin et al., 2004; Blnquez et al., 2004).

Uno de los principales efectos adversos de su liberacin al ecosistema acutico, est asociado con la reduccin de la concentracin del oxgeno disuelto, generando condiciones anxicas, que pueden afectar organismos a diferentes niveles trficos (Chander y Arora, 2007; Nilsson et al., 2006). Para el tratamiento de colorantes sintticos se utilizan diversas tcnicas fsicas y qumicas, como coagulacin y floculacin combinadas con filtracin y flotacin, precipitacin-floculacin, oxidacin con ozono, filtracin por membrana, smosis inversa, entre otras, las cuales producen efluentes de buena calidad (Zille et al., 2005).

No obstante, la mayora de estas tcnicas son costosas, razn por la cual se buscan otras alternativas de tratamiento, como la utilizacin de hongos de podredumbre blanca como Trametes versicolor, Phanerochaete chrysosporiumy Pleurotus ostreatus, que son considerados mtodos biolgicos no convencionales de alta eficiencia (Rodrguez et al., 2002; Blnquez et al., 2004; Radha et al., 2005).

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Evaluar la capacidad de decoloracin del hongo Trichoderma sp. para la decoloracin de la Tartrazina, tambin denominado amarillo 5.

3.2 Objetivos especficos

Seleccionar la cepa adecuada de Trichoderma sp.

Evaluar el crecimiento del hongo seleccionado ya sea en medio slido o lquido para su mejor desarrollo.

Evaluar la capacidad de decoloracin del amarillo 5 con el hongo Trichoderma sp.

4. HIPTESIS

Bajo condiciones controladas de temperatura y nutrientes, el hongo Trichoderma sp. es capaz de decolorar soluciones acuosas que contienen al colorante tartrazina a diferentes concentraciones.

5. JUSTIFICACIN

Los hongos de la podredumbre blanca de la madera han mostrado ser potencialmente tiles en biorremediacin, debido a que su crecimiento filamentoso permite una colonizacin y una exploracin ms eficiente en suelos contaminados, adems estos microorganismos poseen un importante grupo de enzimas con capacidad para oxidar diversos sustratos entre ellos una amplia variedad de contaminantes ambientales (Pointing, 2001).

El mecanismo principal de biodegradacin empleado por este grupo de hongos, es el sistema enzimtico de degradacin de la lignina, compuesto por las enzimas Manganeso Peroxidasa dependientes de Mn+2 (MnP), Lignino peroxidasas (LiP) y lacasas (Lac) (Mester y Tien, 2000). Estas enzimas extracelulares poseen una baja especificidad y producen ataques oxidativos a una amplia gama de contaminantes ambientales con potenciales de ionizacin menores de 8,0 electro voltios (Dvila, 2006). Se ha realizado un importante nmero de investigaciones sobre la decoloracin de colorantes sintticos para uso no industrial (Bayramoglu et al., 2006; Moreira et al., 2000) y en menor proporcin se observan trabajos con colorantes industriales (Chander et al., 2004; Lpez et al., 2006).

Los colorantes sintticos no industriales se emplean principalmente como indicadores de cambios ambientales, por ejemplo: pH, redox, presencia de oxgeno, etc., y se han empleado como modelos para evaluar el potencial del sistema ligninoltico de los hongos de la pudricin blanca de la madera frente a otros colorantes con la misma estructura qumica. En estudios de degradacin de colorantes industriales o hidrocarburos poliaromticos entre otros, la degradacin de este tipo de colorantes se realiza principalmente como control de la presencia o no de actividad ligninoltica.6. FUNDAMENTACIN INICIAL

6.1 Colorantes

Los colorantes son sustancias orgnicas fluorescentes o de color intenso que imparten color a una sustancia incolora, o bien, a un sustrato por medio de una absorcin selectiva de luz (Moeller y Garzn, 2003).

El color depende de los grupos cromforos, que son la parte visible de la molcula coloreada, responsable de la absorcin de luz en un determinado rango de longitud de onda, la afinidad por las fibras es dada por el grupo auxocrmico, conformado por un grupo de tomos ligados al cromforo que modifica la habilidad de este para absorber la luz, y por ltimo la solubilidad en agua o solventes est dada por iones -SO3, Na+; NH3+ Cl-; -SO2-NH2+; -O-Na+ (Marcano, 1990).

Los colorantes sintticos son extensamente usados en industrias textileras, papeleras, farmacuticas, alimentarias, cosmticas, entre otras. Aproximadamente 10.000 diferentes colorantes y pigmentos son utilizados industrialmente y cerca de 0.7 millones de toneladas son producidas anualmente, de las cuales un 70 % corresponde a colorantes de tipo azo (Padmavathy et al., 2003). Estas sustancias son muy persistentes en aguas residuales papeleras, textileras y cosmticas, principalmente porque son muy solubles en agua y por la resistencia a la degradacin, la cual est determinada por la complejidad en la estructura del mismo (Quezada et al., 1999; Van der Zee et al., 1999; Bishop, 1996).

6.1.1 Clasificacin de los colorantes sintticos

En el mercado se encuentran aproximadamente 80000 colorantes que difieren en su composicin, propiedades qumicas y fsicas. Su clasificacin se basa en la estructura o composicin qumica del colorante, esta clasificacin agrupa a los compuestos segn la naturaleza del cromforo de la molcula. Adems, existe otra clasificacin que toma en cuenta el uso y los materiales a los que estn destinados. Este criterio se aplica para lo que se conoce como clasificacin tintrea (Christie, 2001).

Segn la constitucin qumica del cromforo, se pueden dividir en tres grandes grupos; Azoicos, Antraquinonicos y derivados del Trifenilmetano, tambin existen otros de tipo aznico y xantnico, poco importantes en nmero (Puente et al., 1981).

Los colorantes antraquinnicos son tinturas mordientes, con diferentes compuestos que producen colores diferentes. Los colorantes trifenilmetnicos no son resistentes a la luz ni al lavado, excepto si se aplican sobre fibras acrlicas, son colorantes que tienen como mordiente el cido tnico (Christie, 2001).

Segn su disolucin en soluciones acuosas pueden clasificarse en cidos (aninicos), bsicos (catinicos) y colorantes dispersos que no son inicos (Sathiya et al., 2006). En la Tabla 6.1.1 se observan los principales tipos de colorantes segn su aplicacin y algunas de sus caractersticas ms importantes.

Tabla 6.1.1 Clases de colorantes de acuerdo a su aplicacin. CLASECARACTERISTICASTEJIDOS SOBRELOS QUE PUEDENSER APLICADOS

cidosCompuestos solubles en agua. En su mayora contienen grupos cido sulfnico (-SO3H) o carboxilo (-COOH).Lana y seda

Bsicos

Compuestos solubles en agua que forman especies catinicas que contienen grupos aminos (-NH3).Acrlicos, nylon ypolister

Directos

Compuestos solubles en agua. Se aplican en presencia de electrolitos adicionales (cloruro sdico o sulfato sdico). Se une a la tela porinteracciones tales como fuerzas de Van Der Waals y puentes de hidrogeno.Algodn y lino

Dispersos

Compuestos no inicos insolubles en agua. Para teir se aplican finamente dispersos en agua sobre fibras hidrofbicas en las que quedan atrapados.Nylon , polister yacrlicos

Reactivos

Reaccionan en presencia de electrolitos, con la fibra firmando enlaces covalentes. Poseen en su estructura grupos derivados de la Triclorotriazina.Algodn, nylon ylana

Tabla 6.1.1 Clases de colorantes de acuerdo a su aplicacin (Continuacin)

Colorantesde Tina

Compuesto que en su forma oxidada son insolubles en agua y que al ser reducidos dan origen a una especie soluble que es usada para teir.Algodn, lana

MordientesCompuestos que forman complejos con metales. La tela es tratada con una solucin bsica de metales que se precipitan sobre la tela como un hidrxido metlico.

Lana y seda

6.1.2 Colorantes tipo azo

Los colorantes tipo azo son los colorantes sintticos ms utilizados en el mercado aproximadamente 50 % y se forman a partir de la anilina. La frmula general de los azos presenta el grupo N=N en medio de los anillos aromticos Ar- N=N Ar. El doble enlace es la parte de la molcula del colorante que imparte el color al producto, este grupo funcional se denomina grupo cromforo y puede estar presente una o varias veces dentro de la estructura molecular del compuesto (Moeller y Garzn, 2003).

Los colorantes de tipo azo son particularmente difciles de degradar, para su tratamiento se han utilizado varias metodologas tales como adsorcin, neutralizacin, coagulacin, degradacin qumica, degradacin fotocataltica, ozonacin, filtracin por membranas e intercambio inico. A pesar de que estos procesos fsicos y qumicos producen efluentes de buena calidad, en la mayora de las ocasiones generan un alto costo mientras que el tratamiento biolgico resulta ms econmico (Zille et al., 2005).

De la gran gama de colorantes azo sintticos, se distinguen cuatro familias: los monoazoicos, con un grupo azo; los di-azoicos, con dos grupos azo; los tri-azoicos, con tres grupos azo y los poli-azoicos, con cuatro o ms grupos azo (Figura 6.1.1). Asimismo, segn su estructura molecular y propiedades especficas pueden ser colorantes azo cidos, bsicos, dispersos, directos y reactivos (Christie, 2001).

Figura 6.1.1 Estructura qumica de colorantes tipo azo (A) Naranja cido 7, (B) Naranja cido 6, (C) Rojo Congo, (D) Amarillo disperso 3, (E) Amarillo cido 6 (F) Azul directo 1. Fuente. (Stolz., 2001).

Estos colorantes son deficientes en el contenido de carbono por ello la decoloracin solo es posible bajo condiciones de cometabolismo (Quiroz, 2002). Son generalmente persistentes en aerobiosis mientras que en anaerobiosis, este tipo de colorantes sufren una reduccin produciendo aminas aromticas, las cuales son recalcitrantes y requieren condiciones aerbicas para su degradacin y una posible mineralizacin (Moeller y Garzn, 2003).

6.1.3 Tartrazina

La Tartrazina es uno de los colorantes artificiales ms utilizados en la industria de alimentos y pertenece a la familia de los colorantes azoicos; dicho colorante le confiere a los alimentos y bebidas un tono amarillo, ms o menos anaranjado, dependiendo de la cantidad aadida, adicionalmente se emplea para obtener colores verdes al mezclarlo con colorantes azules (Arroyave et al., 2008).

Dicho colorante es ampliamente utilizado desde 1916 en productos de repostera, derivados crnicos, sopas preparadas, conservas vegetales, salsas, helados, postres, caramelos y otras golosinas; tambin se utiliza para colorear bebidas refrescantes de naranja y limn; por ser uno de los colorantes ms empleados, ms de sesenta pases del mundo lo utilizan, incluyendo Estados Unidos y la Unin Europea.

Caractersticas:

Color ndex: 19140

CEE No. : E102

Solubilidad: Soluble en Agua (14.0 g / 100 mL)Estabilidad: Estable en la mayora de los medios cidos como ctrico, actico, mlico y tartrico. Estable en medios bsicos como bicarbonato de sodio, carbonato de sodio e hidrxido de amonio con excepcin del hidrxido de sodio en donde presenta una decoloracin considerable.

Figura 6.1.3 Tartrazina

6.2 Impacto ambiental de los colorantes

Los colorantes son compuestos qumicos xenobiticos, los cuales no se encuentran en forma natural en la biosfera, sino que han sido sintetizados por el hombre (Moeller y Garzon, 2003). Por la complejidad estructural que presentan, las plantas de tratamiento convencionales tienen un bajo porcentaje de remocin de estos, razn por la cual son vertidos sin ser tratados (Alatorre y Moeller, 2006).

De esta forma los dichos efluentes provocan diferentes impactos sobre el medio ambiente, encontrando as variaciones en las aguas en cuanto a solidos suspendidos, carga inica, toxicidad, concentracin de oxgeno disuelto y color (Rodrguez et al., 2003).

Adicionalmente, estudios anteriores han reportado que estos colorantes pueden contener sustancias como cido benzoico y cido acetilsaliclico, las cuales pueden inducir alergias y reacciones asintomticas en personas sensibles (Pereira y Regina, 2001) De igual forma encontramos que algunos de estos productos pueden ser carcinognicos. (Nilsson et al., 2006; Kim et al., 2008).

Representando esto un problema muy grave de contaminacin, ya que an despus de un tratamiento convencional (qumico o fsico) estos algunas veces no disminuyen y pueden sufrir diferentes reacciones como alteraciones en la estructura qumica que genera nuevos componentes xenobiticos que pueden ser ms o menos txicos que el componente principal (Moeller y Garzn, 2003).

El color pocas veces es considerado un contaminante, pese a que puede estar asociado a presencia de compuestos txicos y grupos cromforos o polmeros de alto peso molecular como la lignina (Rodrguez et al., 2003). Estos efluentes coloreados, poseen una alta capacidad de bioacumulacin, y una baja velocidad de despolimerizacin, permitiendo que a largo plazo se acumule en lugares como lagos y bahas, provocando una disminucin del poder absorbente del agua y por ende una disminucin en la actividad fotosinttica de los organismos presentes en dichos ecosistemas, disminuyendo el oxgeno disuelto (DO) en el agua (Rodrguez et al., 2006).

Las descargas de efluentes con altas concentraciones de colorantes sintticos pueden causar graves daos a los cuerpos de agua receptores como la inhibicin de la fotosntesis de las plantas acuticas, el poder txico y carcinognico de los colorantes y sus productos de degradacin (Leena et al., 2008), impiden la penetracin de la luz, imposibilitan la actividad biolgica y afectan aguas subterrneas por lixiviacin del suelo. Adems, reduce la germinacin y crecimiento de cultivos e impide la fijacin del nitrgeno. Colorantes como el rojo congo tiene efectos patolgicos y fisiolgicos en los seres humanos como un decremento de los eritrocitos y cantidad de hemoglobina en el humano, y otros colorantes pueden causar dermatitis alrgica, irritacin de la piel, cncer y mutaciones (Manikandan et al., 2009).

Pese a que las concentraciones de metales no son tan altas, las concentraciones involucradas pueden producir acumulacin en los tejidos de los organismos acuticos, que a largo plazo llegan a ser txicos. Las descargas tambin pueden aumentar la poblacin de peces y algas debido a su alto contenido de nitrgeno, y contribuir al agotamiento del oxgeno disuelto en el agua.

Los colorantes disueltos en las aguas residuales, representan un serio problema de contaminacin; cuyo efecto no slo se refleja en el cuerpo receptor final, al interferir en los procesos de vida acutica impidiendo el libre paso de la luz, sino que, afecta tambin de manera perjudicial la operacin de plantas de tratamiento de aguas residuales de tipo municipal (Moreno, 1995). De los aproximadamente 100,000 colorantes que existen actualmente (Seshadri y Bishop, 1994), 3000 son azo, los cuales son utilizados ampliamente en las industrias textil, alimenticia, farmacutica y cosmetolgica (Ilangovan, 1995). La caracterstica distintiva de estos compuestos es su doble enlace nitrgeno-nitrgeno (-N=N-), la molcula de estos colorantes puede tener uno o ms enlaces de este tipo. El color de estos tintes catalogados como compuestos xenobiticos, se debe a los enlaces azo y a sus cromforos.

La mayora de los colorantes azo no pueden ser decolorados en condiciones aerobias, sin embargo, en ambientes anaerobios muchas bacterias pueden degradar estos compuestos hasta sus aminas correspondientes. Normalmente estos colorantes no poseen efectos citotxicos, carcinognicos o mutagnicos, pero si sus aminas (FitzGerald y Bishop, 1995). Existen evidencias que sugieren que las aminas aromticas, resultado de la degradacin parcial de los colorantes tipos azo son recalcitrantes bajo condiciones anaerobias (Field et al., 1995).

6.3 Tratamiento de colorantes tipo azo

Para la remocin de los colorantes en los efluentes de agua se han planteado diversas tcnicas las cuales abarcan desde tratamientos fisicoqumicos como son: filtracin con membrana, coagulacin, floculacin, precipitacin, flotacin, absorcin, intercambio inico, extraccin por par inico, mineralizacin ultrasnica, electrlisis, oxidacin fotocataltica y reduccin qumica hasta tcnicas biolgicas que incluyen la biosorcin, biodegradacin bacteriana y fngica en tratamientos aerobios y anaerobios, donde la materia orgnica es degradada a dixido de carbono, agua o hidrcidos, xido o sales minerales de otros elementos existentes, que se da por la accin de los microorganismos degradadores de los ecosistemas (Gutirrez, 2007).

A pesar de que los procesos fsicos y qumicos producen efluentes de buena calidad, en la mayora de las ocasiones generan un alto costo mientras que el tratamiento biolgico resulta ms econmico, debido a que se requiere materia prima menos costosa y se trabaja con recursos que en muchos casos resultan ser residuos de otras actividades (Moeller y Garzn, 2003).

6.3.1 Tratamientos fngicos

La capacidad que poseen los hongos para degradar compuestos aromticos complejos, como parte de su metabolismo natural, ha permitido que sean usados en la degradacin de diversos compuestos xenobioticos, incluyendo los colorantes sintticos usados en la industria. Muchos basidiomicetes y ascomicetos han sido usados en la decoloracin de colorantes. Esto puede deberse a que los filamentos fngicos, son menos sensibles a variaciones en temperatura, pH, nutrientes y aireacin (Pant et al., 2007) adicionalmente gracias a su alta tasa metablica y a su rpida colonizacin de superficies que permite un crecimiento rpido sobre un soporte si se desea inmovilizar.

La lignina es un biopolmero aromtico complejo; es el segundo polmero en abundancia despus de la celulosa, constituye cerca del 15 % de la biomasa terrestre y su fuente natural es la madera, donde se encuentra en una proporcin del 20 al 35 %. Solamente un pequeo nmero de microorganismos son responsables de la biodegradacin de la lignina, de los cuales los hongos de la podredumbre blanca constituyen el grupo ms importante.

El sistema enzimtico extracelular de estos organismos, se basa fundamentalmente en la produccin de radicales libres, permitiendo que las enzimas sean catalticamente activas sobre diversos sustratos orgnicos. La enzimas ms significativas son las Lacasas, lignino peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP), y veratril peroxidasa (VP), que tienen una potente capacidad oxidante (Robinson et al., 2001; Moredo et al., 2003; Quintero et al., 2006; Dvila y Vzquez 2006). Gracias a la gran cantidad de compuestos xenobioticos que pueden ser degradados por estos hongos, se les ha dado un muy importante lugar en procesos de biorremediacin.Estos hongos tienen la capacidad de degradar sustancias como dioxinas, biofenilos policlorinados (PCBs), hidrocarburos policclicos aromticos, plaguicidas clorados y organofosfatados, entre otras (Robinson et., al 2001). La accin de estos hongos sobre los colorantes se basa en la no especificidad del sistema enzimtico para depolimerizar y mineralizar la lignina. Pleurotus ostreatus utiliza, por ejemplo, la enzima Mn-peroxidasa (MnP), y otros hongos utilizan la lacasa y una aril-alcohol oxidasa productora de perxido de hidrogeno, entre otras (Moeller y Garzon, 2003).

6.4 Trichoderma sp.

6.4.1 Generalidades

Trichoderma se ubica taxonmicamente en:

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Reino: Fungi.Divisin: MycotaSubdivisin: EumycotaClase: Hyphomycetes.Orden: Moniliales.Familia: Moniliaceae.Gnero: Trichoderma

6.4.2 Condiciones de crecimiento

Dentro de los factores que afectan el crecimiento Trichoderma se encuentran los de tipo fsico y de tipo nutricional como:

Fototrofa: La mayora de especies del gnero Trichoderma son fotosensibles, puesto que presentan una mayor esporulacin al ser expuestas a la luz. Sin embargo, cuando se someten a perodos alternados de luz y oscuridad, se favorece la colonizacin del hongo sobre diferentes sustratos slidos (Domsch et al., 1980).

Esporulacin: Trichoderma esporla fcilmente sobre muchos sustratos naturales y artificiales en un patrn concntrico circular en respuesta a la alternacin de luz diurna y oscuridad, donde los conidios se producen durante el perodo de luz. La exposicin de los cultivos en agar durante 20 a 30 segundos a la luz es suficiente para inducir la esporulacin. La mayor foto induccin de la conidiognesis se obtiene con la exposicin a la luz del da por 3 minutos o cerca de la radiacin ultravioleta tipo A (366 nm) de 10 a 30 segundos (Fonseca, 1998). Adems, el nmero total de conidios producidos es inversamente proporcional a la concentracin de la fuente de carbono. Cuando la concentracin de carbono es inferior a 50 g/L, la produccin de conidios se eleva; por el contrario, cuando la concentracin de carbono supera este valor, la esporulacin tiende a disminuir (Astudillo, 1999). De igual manera, las sales minerales en general (NaCl, KCl, CaCl2) en una concentracin elevada (20-70 g/L) inhiben la esporulacin. Los iones de sodio y potasio producen una disminucin de la presin osmtica de las clulas inhibiendo la esporulacin. Una baja concentracin de iones calcio (1-10 g/L), aumenta la presin osmtica dentro de las clulas fngicas induciendo as la esporulacin (Astudillo, 1999).

Germinacin: La germinacin de los conidios de Trichoderma depende del tipo de enlace que presenta la fuente de carbono, la cual puede ser un disacrido o un polisacrido. Para su aprovechamiento el hongo emplea enzimas como amilasas, -glucosidasas, endo y exocelulasas que realizan la hidrlisis de los azcares simples para dar inicio a la germinacin en los diferentes medios de cultivo; mientras que para iniciar el proceso de infeccin, se debe tener en cuenta la composicin qumica de la pared celular de los conidios (Astudillo, 1999).

Salinidad: Trichoderma se ve inhibido en su crecimiento con altas concentraciones de cloruro de sodio (80 g/L aproximadamente), aunque tolera hasta una concentracin de 60 g/L de cloruro de sodio, stas condiciones pueden ocasionar mutaciones perjudicando el proceso de conidiognesis, al disminuir notablemente la produccin de esporas (Moore, 1996).

pH: Trichoderma tiene un rango de pH relativamente amplio para su crecimiento. Presenta crecimiento a valores de pH comprendidos entre 2.0 y 9.0, con un pH ptimo que se encuentra entre 4.0 y 7.0. A pH cido, la asimilacin de nutrientes como glucosa ejerce una influencia importante sobre el crecimiento del hongo y su posterior esporulacin. Adems, procesos como la germinacin, se ven afectados por la escasez de nutrientes y por niveles de pH por encima de 9.0 (Domsch et al., 1980).

Temperatura: el rango de temperatura para el crecimiento de Trichoderma se encuentra entre los 10 C a los 40 C, considerndose una ptima de 25 C (Alexopoulos, 1996). Segn otros estudios, se ha demostrado que el crecimiento saprfito en suelo de Trichoderma koningii, se presenta a una temperatura que oscila entre los 20 C y los 30 C, con una temperatura ptima de 25 C.

Humedad: el contenido de humedad que favorece el crecimiento saprfito de T. koningii se encuentra alrededor del 70% y el 80% (Wakelin et al., 1999).

Necesidades nutricionales: Trichoderma es capaz de degradar sustratos muy complejos tales como almidn, pectina y celulosa entre otros, y emplearlos como fuente de carbono para su crecimiento gracias a la variada maquinaria enzimtica que posee (enzimas hidrolticas tales como amilasas, pectinasas, celulasas y quitinasas, entre otras), aunque puede emplear tambin cidos orgnicos y monosacridos como fuente de carbono. As mismo, Trichoderma asimila como fuente de nitrgeno compuestos tales como aminocidos, urea, nitritos, amoniaco y sulfato de amonio (Moore, 1996). Adicionalmente, se ha demostrado que la adicin de nitrgeno en forma de sulfato de amonio al medio estimula e incrementa el crecimiento de este hongo, mientras que la adicin de nitrgeno como nitrato de calcio genera un efecto supresivo en el crecimiento de T. koningii (Danielson y Davey, 1973; Wakelin et al., 1999).

Por otra parte, los microelementos, sales y vitaminas en grandes cantidades no son indispensables para el desarrollo de Trichoderma (Papavizas, 1985). Los elementos traza requeridos para el crecimiento de hongos en general incluyen hierro, zinc, cobre, manganeso y molibdeno en concentraciones muy pequeas cercanas a 10-9M. Dentro de las vitaminas necesarias se encuentran tiamina (B1), biotina (B7), piridoxina (B6), acido nicotnico (B3), cido pantotnico (B5), riboflavina (B2), cianocobalamina (B12) y cido aminobenzoico (Moore, 1996).

6.4.3 Taxonoma de Trichoderma

El gnero Trichoderma lo propuso Person en 1794 con 4 especies, Rifai en 1969 agrega 9 especies ms; posteriormente, Bisset eleva algunas de las especies agregadas por Rifai a rango de seccin, agrupndolas en 4 secciones: Longibrachiatum, Pachybasium, Trichoderma y Hypocreanum.

Actualmente se tienen alrededor de 75 especies descritas (Samuels, 1996; Kuhls et al, 1997). Determinar cuntas especies hay realmente depender de la definicin de especie, si se considera que la mayora de las especies del gnero Hypocrea, representan especies de Trichoderma, por lo tanto habr ms de 100 especies (Samuels, 1996). Sin embargo, al utilizar tcnicas moleculares, la frontera morfolgica que define las especies con anlisis ribosomal del DNA desaparecer muchas de ellas y quedarn un pequeo nmero de especies reales que formen el gnero (Lieckfeldt et al., 1998).

La mayora de las colonias de Trichoderma en su inicio tienen color blanco, que se tornan a verde oscuro o amarillento, con esporulacin densa. El micelio es ralo en su mayora, y visto al microscopio es fino, los conidiforos son ramificados, parecen un rbol pequeo. Los mismos se presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas irregular de manera piramidal.

Estos terminan en filides donde se forman las esporas asexuales o conidios, de gran importancia para la identificacin taxonmica a nivel de especies. Los conidios aseguran las generaciones del hongo durante gran parte del perodo vegetativo de las plantas. Son haploides y su pared est compuesta por quitina y glucanos. Adems de los conidiforos, estas se pueden producir sobre filides que emergen directamente del micelio.

La mayora de las especies de Trichoderma presentan clamidosporas, las cuales pueden ser intercalares y en ocasiones terminales. Las clamidosporas toleran condiciones ambientales adversas, son estructuras de sobrevivencia y permiten que el hongo pueda perdurar a travs del tiempo.

Para el control de enfermedades fngicas y tambin para nemtodos se encuentra Trichoderma sp. donde sobresalen T. harzianum, T. viride, T. virens, T. pseudokoningii. Todos ellos presentan una estabilidad gentica y fenotpica aceptable para el escalado en procesos de produccin, son seguros al hombre y otras especies no diana del ecosistema y su rango de hospedante no es tan estrecho para hacerlos demasiado especficos en su uso. Es en este ltimo aspecto donde los virus fallan para controlar varias plagas pues son altamente especie-especficos conjuntamente con la necesidad de replicacin in vivo (necesitan hospedantes para reproducirse). Sin embargo, su impacto en los agroecosistemas es muy bajo y son fciles de registrar (Elsegui, 2006).

6.4.4 Trichoderma harzianum rifai

Es un hongo filamentoso que habita en suelos, posee una amplia gama de enzimas hidrolticas y quitinolticas que le confieren gran capacidad para establecer relaciones de parasitismo y simbiosis con microorganismos y plantas. De ah que estas cepas se empleen en la agricultura para el control de enfermedades fngicas, as como bioestimulantes de plantas y biofertilizantes (Harman et al., 2004; Lorito, 2006; Martnez, 2007).

Son colonias de rpido crecimiento en PDA, 7-9 cm dimetro despus de 3 das, micelio areo flucoso, blanco a ligeramente gris o raramente amarillo, conidiacin que cubre con frecuencia toda la superficie de la placa que produce pstulas aplanadas hasta de 8 mm en dimetro, concntricas o cerca de las mrgenes de la placa, polvorienta o granular y de varios tonos verdes incluso en el mismo cultivo, con frecuencia rodeado por micelio blanco estril. Al reverso colonias incoloras o amarillas, pardas, ocrceas o en algunos aislados ferruginosas.

Pocos aislados producen abundantes cristales amarillos. Exudados incoloros a mbar o amarillo verdoso. Hifas hialinas. Clamidosporas abundantes, solitarias, subhialinas a amarillo plido o carmelitoso con la edad, subglobosas a elipsoidales o piriformes. Conidiforos hialinos, paredes lisas, rectos o doblados, muy ramificados, primeras ramas nacen formando ngulos rectos o dobladas un poco hacia el pice, en grupos de 2 o 3 que se vuelven ms largos hacia la base, complejos con ramas secundarias en grupos de 2-4, la estructura completa es ms o menos piramidal con un pice estril cuando est creciendo an el hongo. La conidiacin comienza por la base de este patrn de conidiforo y las ramas jvenes son estriles. Filides ampuliformes a subglobosas; muy constreidas en la base, muy hinchadas en el medio y abruptamente estrechas en el pice en nmero hasta de 6. Conidios subglobosos a ovoides o ligeramente elipsoidales con pice ampliamente redondeado, pared lisa o ligeramente rugosa, subhialinas a verde plido.

Figura 6.3.4 Caractersticas microculturales de Trichoderma.Tomado de: Can. J. Bot. Bol. Vol. 69, 1991.Trichoderma secreta enzimas que actan como un complejo con accin sinrgica sobre el patgeno debilitando la pared y permitiendo la difusin de los antibiticos hacia este. Despus del contacto fsico microscpicamente se observa la presencia de haustorios, enrollamiento de la hifa del biocontrol sobre la del patgeno, vacuolizacin, formacin de grnulos, desintegracin del citoplasma y lisis celular.

Este gnero actualmente se estudia a profundidad por la respuesta sistmica inducida al ataque de otros patgenos y por ser fuente de genes que codifican para protenas (enzimas como glucanasas, proteasas) y metabolitos (fitohormonas) con accin estimuladora y defensiva en la planta, los que se estn usando en protocolos de transgnesis en especies de plantas de importancia econmica con resultados muy alentadores.

6.3.5 Trichoderma koningii

La clasificacin taxonmica del hongo Trichoderma koningii Th003 es la siguiente:

Sper reino: EucariotReino: FungiFilum: AscomycotaSubfilum: PezizomycotinaClase: SordariomycetesSubclase: HypocreomycetidaeOrden: HypocrealesFamilia: HypocreaceaeGnero: Trichoderma Especie: Trichoderma koningii

Trichoderma koningii se distingue por sus colonias, inicialmente se ven como una superficie lisa, pero la formacin de esporas areas a travs del tiempo, permite observarlas ligeramente algodonosas (Rifai, 1969). El color de las colonias cambia gradualmente de blanco a blanco verdoso por la formacin de fialosporas que en ltima instancia se tornan de un color verde oscuro opaco (Domsch et al., 1980). Adicionalmente, las colonias de T. koningii no producen pigmentos en el medio de cultivo donde se desarrollan, por lo cual el reverso de la colonia es incoloro (Rifai, 1969). As mismo, las colonias de T. koningii crecen rpidamente bajo condiciones favorables de temperatura (de 20 a 25 C) con una temperatura ptima de 25 C y un perodo de incubacin de 5 das con luz constante y un pH entre 3.7 y 6.0 (Domsch et al., 1980).

Trichoderma koningii es un hongo imperfecto que posee hifas hialinas septadas y ramificadas a ambos lados sin ser paralelas, conidiforos, filides, y conidios; aunque tambin pueden producir clamidosporas. Sus estructuras de reproduccin son los conidios, mientras que sus estructuras de resistencia son las clamidosporas. Estas ltimas son similares a las de otros hongos formadores de clamidosporas, siendo de 5 a 10 veces ms grandes que los conidios por sus voluminosas reservas de lpidos; son intercalares o terminales, de forma cilndrica o globosa.

Los conidiforos son hialinos, al inicio de su desarrollo se observan ramificados pero cuando maduran comienzan a separarse por su formacin area, son rectos y pueden llegar a presentar un aspecto piramidal. Las filides son hialinas, en forma de frasco o botella, e infladas en la base y estn unidas a los conidiforos en ngulo recto. Los conidios tienen de 2 m a 3 m de dimetro en promedio, son redondeados o de forma ovoide, lisos y se observan hialinos o de color verde brillante al microscopio (Rifai, 1969).

7. BOSQUEJO DEL MTODO

Las etapas a desarrollarse en este proyecto se presentan en la figura 7.1.

Seleccin de la cepa

2. Crecimiento del hongo

3. Decoloracin de la tartrazina.

Figura 7.1 Decoloracin del amarillo 5

7.1 Seleccin de la Cepa

De acuerdo con las investigaciones que se han realizado con hongos de pudredumbre blanca del gnero Trichoderma, se seleccionar una cepa de acuerdo a las disponibles en el Cepario de Hongos, Laboratorio de Micologa del Centro de Investigaciones Biolgicas, UAM, o de donde se encuentren disponibles y se tomar la cepa que haya en mayor cantidad (Gonzlez, 2010).

7.2 Crecimiento del hongo

El gnero Trichodema es un grupo de hongos aislados comnmente del suelo que se reproducen asexualmente. Es un hongo filamentoso anamrfico, hetertrofo, aerobio, con una pared celular compuesta de quitina, de rpido crecimiento que puede utilizar una gran variedad de sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidn como fuente de carbono. Muchas cepas crecen eficientemente en medios slidos o lquidos y en un amplio rango de temperaturas, adems son relativamente tolerantes a humedades bajas y tienden a crecer en suelos cidos (Harman et al., 1981).

La poblacin de Trichoderma decrece especialmente cuando la humedad del ambiente desciende por largos perodos de tiempo. Otros estudios han determinado que el pH, la concentracin de CO2, HCO3, sales y el contenido de materia orgnica son factores fsicos y qumicos determinantes para la variacin de la poblacional de Trichoderma, adems de la presencia o ausencia de otros microorganismos en el ambiente (Fonseca, 1998).

Las 4 formas de produccin fundamentales para hongos son:

1- Cultivos bifsicos, donde se desarrolla el inculo en cultivo lquido agitado (de forma rpida) o lquido esttico (ms lento) y luego se pasa al soporte slido. En los sistemas bifsicos siempre se debe optimizar el cultivo de la fase lquida para que promueva un rpido crecimiento del aislado. Es el ms usado a nivel mundial por obtenerse estructuras infectivas de alta calidad y acortarse el tiempo cuando la fase lquida se hace por cultivo lquido agitado. Son semiartesanales.

2- Cultivos sobre soporte slido, siendo una forma de produccin donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones altas. Son artesanales.

3- Cultivos lquidos agitados o fermentaciones lquidas con un grado de automatizacin del proceso que puede ser muy alto, son muy rpidos, pero tienen como desventaja el que muchos aislados tienden a crecer como pellets miceliales discretos y/o forman abundantes blastosporas (esporas formadas propagadas por gemacin a partir de fragmentos de micelio originalmente), propgalos estos que no son apropiados por la baja estabilidad intrnseca y poseer bajo o nulo poder infectivo. En estos sistemas se logra un ptimo aprovechamiento de los nutrientes. Pueden llegar hasta niveles industriales.

4- Cultivos lquidos estticos, los que constituyen una forma de produccin donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones bajas pues solamente hay formacin de estructuras deseadas en la interface lquido- gaseosa. Son artesanales.

7.3 Evaluacin de la decoloracin en soluciones acuosas

La degradacin se llevar a cabo poniendo en contacto al Trichoderma sp. con soluciones acuosas del colorante. Despus de cierto tiempo se cuantificaran las concentraciones del colorante amarillo 5, con lo cual se determinar el porcentaje de decoloracin.

Este proceso se analizar en dos vas: la bioadsocion y la bioadsorcion- biodegradacin registrndose la cantidad de biomasa generada en ambos casos. En la bioadsorcin se observara el comportamiento del hongo a diferentes temperaturas y con concentraciones de glucosa variadas. En la bioadsorcin biodegradacin se controlara el pH, se promover la produccin de enzimas en el hongo a travs del empleo de medios slidos y lquidos (Gonzlez, 2010)

8. CRONOGRAMA

Tabla 8.1 CronogramaActividadMes

123456789101112

Bsqueda de informacinxxxxxxxxxxxx

Seleccin de la cepaxxx

Crecimiento del hongoxxxxxx

Decoloracin de la tartrazinaxxx

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