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EVALUACION DEL EXTRACTO DE EUCAUPTO (Euca/iptus g/obu/us
/abi/l) EN EL CONTROL DE Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
EN CLAVEL (Dianthus carvophvllus).
WILKIEN ANTONIO RAMIREZ ESPINOSA
ARCENIO RODRIGUEZ AVENDAÑO
Director
I.A. MsC. JORGE VELANDIA
Codirector
lA HECTOR INFANTE
TUNJA
UNIVERSIDAD PEDAGOGICA y TECNOLOGICA DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE AGRONOMIA
1995
,J,-.
/fl3f
/EVALUACION DEL EXTRACTO DE EUCAUPTO (Eucaliptus q/obulus.
labill) EN EL CONTROL DE Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
EN CLAVEL (Dianthus carvophvnus).
/ WILKIEN ANTONIO RAMIREZ ESPINOSA
ARCENIO RODRIGUEZ AVENDAÑO
Proyecto de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Ingeniero Agrónomo
Director
lA MsC. JORGE VELANDIA
Codirector
lA HECTOR INFANTE
TUNJA
UNIVERSIDAD PEDAGOGICA y TECNOLOGICA DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE AGRONOMIA
1995
RESPONSABLES:
-!?cmio?OJ,c;a Il _.c.!..~~ ______ ... ______ ; _____ _ ARCENIO RODRIGUEZ A.
DIRECTOR:
/;
I ,. sC. JORGE VELANDIA
\
CODIRECTOR:
lA HECTOR INFANTE
JURADOS:
lA GUILLERMO LEO N CRUZ
lA Ms lA RUBEN ORTIZ
DECANO F CIAT SECRETARIO FACIAT
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a:
Mis Padres por el esfuerzo de toda una vida.
Martha Emperatriz mi esposa por su amor, apoyo y estímulo.
Cristian Alexander mi hijo, por la felicidad que trajo a mi vida.
ARCENIO
Mis sobrinos.
Diana, mis respetos, gran amiga. Eliana, la igualdad de carácter nos distancia, el inmenso y cariño el respeto nos une, llegarás. Sergio Fernando, mi preocupación por creerte reencarnado. Su inocencia al tiempo le llevará a un mejor final, ola entre el mar turbio, hoy le llamo.
Juan Daniel, única vela que alumbra su hogar, pero que luz.
Alejandra, niña inteligente y bella, la vida le ha regalado un gran padre.
Daniela, eres el silencio responsable.
A mis primos: Margarita, más vale tarde; Maurício, las vivencias son las coordenadas para abrirnos un mejor futuro; Paola y Alejandra que será de sus vidas; Carlos, Rocio y Memo, tres son la e/ave.
A mis amigos: Jaime Be/tran, Beta y Puro Antolinez, Gabriel Ordoñez, Pedro Gomez, Carlos Sepú/veda, Federico Malina, Fernando Cortez, Victor Barreta, Henry Eljure, Carlos Londoño, Alberto Velazquez, Vilma Blanco, Cesar Madero, Heberth Ebratt, Arcenio Rodriguez, Hernando Leguizamon, Hebert Suárez, Jairo Morales, Vita Viasus, Zoilo Torres, Juan Umaña, Ivan Alvarez, Helmunth Vargas, Germen Ibarra, Fanor Casierra, Alonso Gomez y Juan C. Castañeda.
Cordialidad a la señora Beatriz Agudelo de Verdugo sin su ayuda no hubiese tenido el placer de conocerla.
Clemencia Avi/a de Moreno y Hector Lozano, profesores y amigos.
y a los lectores del presente trabajo por sus críticas aportes y consideraciones.
WILKIEN
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCION 1
1 REVISION DE LITERATURA 3
1.1 EL CLAVEL 3
1.1.1 Historia en Colombia 3
1.1.2 Aspectos generales 3
1.1.3 Clavel estándar 4
1.1.4 Marchitamiento vascular del clavel 5
1.1.4.1 Síntomas visuales de la enfermedad 5
~ 1.1.4.2 Ciclo de la enfermedad 6
1.1.4.3 Manejo y control de la enfermedad 7
1.2 DESCRIPCION DEL PATOGENO 8
1.3 GENERALIDADES SOBRE EUCALIPTO COMUN 10
1.4 EXTRACTOS VEGETALES 13
1.4.1 Antecedentes 14
2 METODOLOGIA 18
2.1 EXTRACTO DE HOJAS DE EUCALIPTO 18
Pág.
2.1.1 Preparación 18
2.2 EL PATOGENO 19
2.2.1 Obtención 19
2.2.2 Propagación 20
2.3 PRUEBAS DE LABORATORIO 20
2.3.1 Prueba de antibiosis: hongo-extracto de eucalipto 20
2.3.2 Prueba de germinación de conidias 23
2.4 PRUEBA DE INVERNADERO 23
j 2.5 DISEÑO EXPERIMENTAL 24
2.5.1 Diseño experimental en prueba de laboratorio 24
2.5.2 Diseño experimental en prueba de invernadero 24
2.6 EVALUACION 25
2.6.1 Evaluación en laboratorio 25
2.6.1.1 Prueba de antibiosis hongo-extracto de eucalipto 25
2.6.1.1.1 Tasa de crecimiento micelial 25
2.6.1.1.2 Tasa de esporulación del hongo 25
2.6.1.2 Prueba de germinación de conidias 26
• 2.6.2 Evaluación de invernadero 26
2.6.2.1 Evaluación de la incidencia de Fusarium oxvsporum f. sp. dianthi en los esquejes de clavel 26
3 RESULTADOS y DISCUSIONES 29
3.1 PRUEBAS DE LABORATORIO 29
3.1.1 Prueba de antibiosis hongo-extracto de eucalipto 29
3.1.1.1 Tasa de crecimiento micelial 30
3.1.1.2 Tasa de esporulación 38
Pág.
3.1.2 Prueba de germinación de conidias 43
3.2 PRUEBA DE INVERNADERO 50
3.2.1 Efecto del extracto de eucalipto en el control de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 50
4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 68
4.1 CONCLUSIONES 68
4.2 RECOMENDACIONES 69
BIBLlORAFIA 70
ANEXOS 73 -
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f
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
CLEMENCIA AVILA DE MORENO, Ingeniero Agrónomo MsC. Profesora titular FACIAT.
FLAVIO RIOS, Lic. en Biología. Director del laboratorio de histología, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.
GERMAN ARBELAEZ TORRES, Profesor Titular. Departamento de Sanidad Vegetal. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional de Colombia. Santa Fe de Bogotá.
GUILLERMO LEON CRUZ, Ingeniero Agrónomo, Jurado Calificador.
HECTOR INFANTE, Ingeniero Agrónomo, Codirector de la Investigación.
JORGE BLANCO, Lic. Biólogía MsC., Jurado Calificador.
JORGE VELANDIA, Ingeniero Agrónomo MsC. y Director de la Investigación.
LUIS FELIPE RODRIGUEZ, Ingeniero Agrónomo Ph. D. Y Profesor Titular, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia. Santa Fe de Bogotá.
MARISOL CESPEDES, Lic. Biología. Laboratorio de Bioplasma.
PATRICIA DEL PILAR PACHECO, Laboratorio de Control Biológico del Postrado de Agronomía, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.
ti
LISTA DE TABLAS
Pág.
TABLA 1. Lista de tratamientos 21
TABLA 2. Escala de índice de la enfermedad 27
TABLA 3. Análisis de varianza para el crecimiento micelial 30
TABLA 4. Efecto del extracto de eucalipto en el crecimiento micelial de Fusarium oxvsporum f. sp. díanthi 33
TABLA 5. Efecto de cinco concentraciones de extracto de eucalipto en la inhibición del crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. díanthí 35
TABLA 6. Análisis de varianza para esporulación 39
TABLA 7. Efecto del extracto de eucalipto en la esporulación 40
TABLA 8. Análisis de varianza para germinación de conidias 46
TABLA 9. Efecto del extracto de eucalipto en la germinación de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. díanthí 47
TABLA 10. Efecto del extracto de eucalipto sobre el porcentaje de infección y número de plantas con flor y con rebrotes
en clavel 55
Pág.
TABLA 11. Análisis de varianza para longitud del tallo 59
TABLA 12. Efecto del extracto de eucalipto en la longitud del tallo y la raíz de esquejes de clavel 60
TABLA 13. Análisis de varianza para la longitud de la raíz 62
TABLA 14. Análisis de varianza para peso fresco 65
TABLA 15. Efecto del extracto de eucalipto en el peso fresco de los esquejes de clavel 66
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LISTA DE FOTOGRAFIAS
FOTOGRAFIA 1. Inicio prueba de antibiosis: Hongo- extracto de eucalipto
FOTOGRAFIA 2. Efecto del extracto de eucalipto en el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
FOTOGRAFIA 3. Efecto tóxico del eucalipto en concentraciones altas en los esquejes de clavel
FOTOGRAFIA 4. Efecto del extracto de eucalipto en la prueba de invernadero
FOTOGRAFIA 5. Testigo con ataque severo por Fusarium oxysporum
Pág.
22
32
51
53
f. sp. dianthi 56
FOTOGRAFIA 6. Corte longitudinal de plantas mostrando los síntomas a nivel vascular en el testigo (izquierda), en comparación con una planta sana tratada con el extracto al 10% (derecha) 57
FOTOGRAFIA 7. Efecto del extracto de eucalipto en la longitud del tallo en los esquejes de clavel (de izquierda a derecha TO, T1, T2, T3, T4 Y T5) 61
LISTA DE FIGURAS
• Pág.
FIGURA 1. Efecto del extracto de eucalipto sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxvsporum f. sp. dianthi 34
FIGURA 2. Regresión para la variable crecimiento micelial 37
FIGURA 3. Efecto del extracto de eucalipto en la esporulación del hongo Fusarium oxYsporum f. sp. dianthi 41
FIGURA 4. Regresión para la variable esporulación 44
FIGURA 5. Efecto del extracto de eucalipto en la germinación de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 45
FIGURA 6. Regresión para la variable germinación de conidi~s 49
FIGURA 7. Efecto del extracto de eucalipto sobre el porcentaje de infección en las plantas de clavel 54
FIGURAS. Efecto del extracto de eucalipto sobre la longitud del tallo y raiz en las plantas de clavel 63
FIGURA 9. Efecto del extracto de eucalipto en el peso fresco de las plantas de clavel 67
'.
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A. Plano de campo del diseño experimental en laboratorio
ANEXO B. Plano de campo del diseño experimental en invemadero
ANEXO C. Tablas de ANOVA para los modelos de regresión
ANEXO D. Análisis de regresión para las variables dependientes
Pág.
74
75
76
crecimiento micelial, esporulación y germinación de conidias 77
•
•
RESUMEN
Con el objeto de evaluar la posibilidad de aplicación de los extractos. acuosos de plantas para el control de Fusarium oxYsporum f. sp dianthi, se determinó desarrollar ensayos en los laboratorios de control biológico y. fitotrón del postgrado .de Agronomía de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.
El extracto acuoso de Eucaliptus globulus labill fue llevado a disoluciones del 5, 10, 15, 20 y 100% los cuales se probaron por el método de antibiosis, para medir el crecimiento micelial de la colonia y su esporulación .
Igualmente en portaobjetos fueron adicionados alícuotas de la suspensión conidial y del extracto a la concentración según su tratamiento en relación 1: 1, se llevaron a cámara húmeda e incubaron en mufla a 25 ac para determinar la capacidad de germinación de las conidias.
A nivel de invernadero las plantas se llevaron a imbibición de raíz en la concentración del extracto segun tratamiento, luego inoculados por el método de inmersión de raíz en una suspensión conidial de un millón de conidias/ml durante 15 segundos.
Se encontró que el extracto de eucalipto en sus diferentes concentraciones tuvo un efecto fungistático contra Fusarium oxysporum f. sp. dianthi inhibiendo su crecimiento micelial, esporulación y germinación de conidias; igualmente mostrando un efecto control en la incidencia de la enfermedad en los esquejes de clavel. El mejor tratamiento observado fue el extracto de eucalipto a la concentración del 10%. .
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•
1
INTRODUCCION
El mercado internacional de flores en Colombia nace a mediados de los
años 60 estableciéndose inicialmente en la Sabana de Bogotá por sus
condiciones climáticas y la fuerza laboral; hoy día ocupa el tercer puesto de
las exportaciones agropecuarias después del café y el banano; para 1965 el
valor de las exportaciones pasó de 20.000 dólares y para 1993 superó los
375 millones de dólares.
Existen aproximadamente 450 empresas dedicadas a la producción y
exportación de flores, en un área de 4200 hectáreas; generando cerca de
75.000 empleos directos y 50.000 indirectos, beneficiando en total a más de
600.000 colombianos que derivan su sustento de las flores.
El cultivo del clavel (Dianfhus carvophyllus) fue pionero en la explotación
tecnificada y hasta entonces ocupa el primer puesto en participación a las
exportaciones de flores Colombianas. Para 1981 se exportó en clavel el
•
2
57% de la producción total de flores, para 1991 solo se exportó el 37%, lo
que representó un decrecimiento en su exportación: sea por poca
producción, por el rechazo de este tipo de flor en el mercado o simplemente
por el deficiente manejo fitosanitario; éstas situaciones han ocasionado a los
floricultores grandes pérdidas económicas.
En . Colombia, el problema fitosanitario más importante del clavel es el
marchitamiento vascular causado por el hongo Fusarium oxysporum f. sp.
dianthi, problema adjunto a la depresión en las exportaciones y pérdidas
económicas. Los métodos de control tales como: material de propagación
libre de la enfermedad, la aplicación al suelo de vapor, fumigantes y
fungicidas sistémicos, el uso de algunas prácticas culturales y sanitar~as, la
siembra de variedades resistentes y en los últimos años, la aplicación de
biocontroladores; métodos que no han dado resultados satisfactorios, de ahí
la necesidad de prescindir del cultivo o en su defecto continuarlo en suelos
nuevos.
El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar otro método de control, más
eficiente, de bajo costo y que no presente riesgos en el deterioro del medio
ambiente, utilizando el extracto de hojas de eucalipto.
•
3
1 REVISION DE LITERATURA
1.1· EL CLAVEL
1.1.1 Historia en Colombia. El mercado internacional de flores en
Colombia nace desde mediados de los alios 60, cuando se llevaron a cabo
experimentos entre universidades norteamericanas y empresarios
colombianos; de estos estudios se estableció que en la Sabana de Bogotá
existían las condiciones climáticas apropiadas para su desarrollo y la fuerza
laboral que, por costos era la adecuada para cultivar la flor (10) .
1.1.2 Aspectos generales. El clavel pertenece a la familia de las
Caryofiláceas y al género Dianthus; originario de la cuenca del
mediterráneo; presenta las siguientes características taxonómicas: es una
planta herbácea, de tallos articulados, hojas lineales rígidas paralelinervias y
de color verde glauco, revestidas de una capa cerosa denominada pruina,
•
4
están ubicadas en disposición opuesta al tallo, con flores hermafroditas con
pétalos de diferentes colores fuertemente sujetos al cáliz; su propagación se
realiza por esqueje para garantizar la obtención de caracteres originales (7).
Las especies hoy existentes son obtenidas fundamentalmente por
cruzamiento. Ya en los años 300 y 350 a.c. es citado por Teofrasto en su
escrito "Historia de la planta", pero sólo a finales de este siglo se hace la
primera clasificación de claveles silvestres y cultivados (12).
El clavel cultivado a escala comercial se distingue de las otras formas de
jardín por su hábito de crecimiento erecto, tallo floral más largo y producción
continua de flores; la mayoría de las modernas variedades provienen de la
variedad William Sim, producida en Maine en 1938 (15).
1.1.3 Clavel estándar. Se denomina clavel estándar a los cultivares cuyas
características son de una flor por tallo, conocido bajo el sinónimo de
monoflor. Requiere de temperaturas altas en el día y bajas durante la
noche, para lograr mayor calidad; alcanza tallos hasta de un metro de
longitud permaneciendo recto y consistente (7).
•
•
•
5
1.1.4 Marchitamiento vascular del clavel por Fusarium oxvsporum [. §R.
dianfhi. Originalmente se reportó en el sur de Francia en 1800 y sólo hasta
1975 se reportó la enfermedad en Colombia, debido a la importación de
esquejes infectados de Estados Unidos, Holanda, Francia, Alemania e Israel
(2).
En los últimos 20 años, ha sido una de las enfermedades más limitantes y
que mayores pérdidas ha ocasionado en el mundo, no obstante las
diferentes medidas de control aplicadas (5).
1.1.4.1 Síntomas visuales de la enfermedad. La enfermedad se
caracteriza por la apariencia unilateral de los síntomas de marchitamiento,
acompañada por el amarillamiento parcial de las hojas y el doblamiento de
los brotes hacia el lado de la planta enferma, a causa de la inteñerencia en
el crecimiento; en estados iniciales, en las hojas, puede observarse la mitad
clorótica y la mitad de un color verde normal. Además se observa un
enanismo de los brotes y una disminución del crecimiento de la planta. Los
síntomas de la enfermedad afectan la planta avanzando hacia arriba hasta
causar un marchitamiento generalizado y su muerte .
•
6
Al realizar un corte transversal del tallo, en los haces vasculares, se observa
una coloración blanquecino-amarillenta o marrón con la muerte y el
deshilachamiento de los tejidos sin afectarse la médula.
Las raíces y los tallos no presentan daño inicial, pero luego se ven afectados
severamente por la formación de cavidades, mostrando una pudrición seca
en la base de la planta y en la raíces se puede presentar ataques de otros
patógenos (5).
1.1.4.2 Ciclo de la enfermedad. La enfermedad se inicia con el
crecimiento de hitas o con la germinación de las clamidosporas en latencia
en los tejidos muertos del hospedante y estimulados por los exudados de
los esquejes recién sembrados. Las hifas del hongo penetran directamente
la epidermis de las raíces, pasan a la corteza y a la endodermis y entran a
los vasos del xi lema; la hitas también pueden penetrar por heridas.
El hongo, una vez dentro de la planta, se mueve hacia el tejido vascular por
colonización intracelular de los vasos del xilema y los invade cuando están
maduros, o si la penetración es por heridas, se sitúa en ellas (5).
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•
7
El patógeno coloniza los vasos del xi lema por crecimiento del micelio o por
medio de transporte pasivo de las microconidias producidas en dichos
vasos, lo cual ocasiona una colonización rápida y discontinua.
La colonización inicial está restringida a los tejidos vasculares y cuando el
hospedante está muy afectado, ocurre la invasión de los tejidos adyacentes,
como son la médula, el cambium, el floema y la corteza (5)
1.1.4.3 Manejo y control de la enfermedad. Para el control de las
enfermedades vasculares, y en especial, de la ocasionada por E oxysoorum
f. sp. dianfhi, se han utilizado diferentes métodos: el más importante para
prevenir el establecimiento del patógeno en el suelo consiste en la
producción de esquejes sanos, lo cual se ha logrado mediante certificación
de material básico de propagación y el cultivo de meristemos; los demás
métodos se utilizan para disminuir significativamente el patógeno una vez
que se establece en el suelo; el tratamiento con vapor ha sido el método
más eficiente para la reducción de la enfermedad pero su costo es muy
elevado; otro método es el uso de químiCOS como los fungicidas sistémicos
del grupo de los Benzimídazoles y de los Tiofanatos, estrategia costosa que
crea resistencia del patógeno después de aplicaciones repetidas (4).
•
8
Actualmente se viene implementando el uso del control biológico mediante
microorganismos como bacterias y hongos, conjuntamente con variedades
resistentes (1).
1.2 DESCRIPCION DEL PATOGENO
Según Booth, el género Fusarium fue descrito en 1809 por Link pero sólo fue
válido en 1821 ante el Código Internacional de Botánica (8).
El género Fusarium tiene como características principales: producen
esporodoquios y típicamente dos tipos de conidias llamada macroconidias y
microconidias, ambos producidos en filiales.
Las microconidias son unicelulares y de forma esférica u ovalada. Las
macroconidias son grandes, alargadas y multiseptadas. Existen conidias de
tamaño intermedio entre las macroconidias y las microconidias. Además
presenta una estructura de resistencia denominada clamidospora, que son
esporas formadas a partir de la condensación del contenido de las hifas,
sobre las conidias, de paredes gruesas, mediante las cuales el hongo
•
•
9
sobrevive en condiciones ambientales desfavorables en ausencia de plantas
hospedantes.
E oxysporum es un hongo cosmopolita parásito de más de 100 especies de
plantas Gimnospermas Y Angiospermas.
El patógeno tiene la capacidad de formar colonias rápidamente, con una
tasa de crecimiento micelial de un centímetro diario en P.DA a 25 grados
centígrados. Su presentación es de micelio aéreo, abundante, algodonoso,
de coloración variable que va desde el blanco hasta el rosado durazno,
presentando un tinte de coloración violeta. Es un hongo al cual no se le ha
podido determinar su fase perfecta o telemorfo (3) .
•
10
Según Alexoupoulus y Mins presenta las siguientes características:
Super reino: Eucaryonta.
Reino: Mycetae.
División: Amastigomycota.
Subdivisión: Deuteromycotina.
Forma-clase: Deuteromycetes.
Forma-orden: Moniliales.
Forma-familia: Tuberculariaceae.
Forma-genero: Fusarium.
Forma-especie: Fusarium oxYsporum.
Forma-especial: Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
1.3 GENERAUDADES SOBRE EUCALIPTO COMUN
Este árbol es uno de los representantes genuinos forestales, conocido bajo
los sinónimos de eucalipto blanco, eucalipto criollo, eucalipto globoso y
eucalipto gomero azul. Su nombre científico es Eucaliptus globulus labill
pertenece a la familia de las Mirtáceas, originario de Australia
específicamente de Tasmania, con característica corpulenta y erguida, que
11
puede alcanzar alturas que van desde los 25 hasta los 100 metros de altura
en su lugar de origen; en Colombia ha alcanzado alturas de 10 a 25 metros.
. . Fue introducido en Colombia por vez primera en el año de 1793, siendo
plantados los primeros ejemplares en los alrededores de la vieja Santa Fe,
posteriormente fue difundido por las demás zonas del país (22).
El eucalipto globoso es uno de los más valiosos ejemplares arbóreos, dada
la calidad y abundancia de su madera. Aunque este árbol posee troncos
espesos alargados, las ramas primarias relativamente delgadas, su corteza
es delgada de color pardo, grietada, que se desprende en largas láminas
denominadas ritidomis, dejando zonas de coloración clara; sus troncos son
utilizados para la fabricación de postes aislantes, construcciones, muebles y
como combustible (22).
Las hojas verdaderas existentes se encuentran sólo en las ramas nuevas e
inferiores, presentando láminas anchas y abrazantes. Cuando tiernas las
hojas son sésiles o sentadas, la casi totalidad del follaje está constituido por
hojas transformadas u hojas ealciformes de bordes curvos, faleadas, o sea
en forma de hoz, acuminados, coriáceos y vidriosas. Exhalan aromas
penetrantes debido a las incontables glándulas oleo-resinosas que se
•
12
forman en su parénquima, las cuales segregan principios aromáticos como
el denominado aceite esencial de eucalipto o eucaliptol denominado de igual
forma cineol, derivado terpénico de formula C10H1S05, descubierto por
Wallach y Brass en esencia de abrótano y que posteriormente se denominó
en esencias de Euca/iptus globulus labill (8).
La esencia de eucalipto común se presenta con un rendimiento del 0.7% en
hojas frescas y de un 1.6 a 3% en hojas secas. La esencia de eucalipto
globoso contiene de un 60 a un 85% de cineol cuyo peso específico a 15
grados es de 0.91 a 0.93, su poder rotatorio es variable puede ser hasta de
+13 grados, su solubilidad puede ser de 1:2 a 1:4, esta esencia de eucalipto
blanco contiene además los siguientes compuestos bioquímicos : Pineno,
Canteno, Sesquiterpenos, Cineol, Alcohol Isoamilico, Alcohol Fenchilico,
Terpineol, Borneol, Isoborneol, y Aldehidos Valerianico, Butírico y
Capriónico (18,13) .
La esencia de eucalipto se aplica en medicina con propiedades curativas de
problemas respiratorios como asma bronquial, bronquitis crónica y
afecciones catarrales en general en la fabricación de jabones, perfumería,
fabricación de papeles para cigarrillos aromatizados y en ·'a actualidad se
• 13
viene evaluando los extractos de hojas de eucalipto en el control biológico
de hongos fitopatógenos (22, 17).
1.4 EXTRACTOS VEGETALES
La utilización de extractos de plantas y el uso de elicitores para el control de
hongos fitopat6genos, son las técnicas que más han mostrado interés en los
últimos años por parte de los investigadores, debido a que los métodos
convencionales para el control de enfermedades en plantas ha originado
problemas tales como la resistencia de los patógenos a los fungicidas,
presencia de residuos de fungicidas en los productos vegetales y en
especial el daño irreparable al medio ambiente y el hombre.
Elroy Rice (14) muestra una serie de compuestos biológicamente activos
comprometidos como agentes alelopáticos, entre los cuales están los
alcaloides (cocina, quinina, atropina, papaverina, codeina, etc.), lactonas,
antraquinonas, nafloquinonas y antraquinonas, derivados de los ácidos
benzoico y cinámico (2,5 dihidroxibenzoico) toxina producida por el E.
globulus labill, cumarinas, flavonoides, taninos, terpenos y esteroides entre
otros, no comunes en todos los vegetales y son denominadas sustancias
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14
ergásticas o metabolitos secundarios, que se acumulan en cierto tipo de
tejidos como hojas, tallos, flores, frutos, raíces y semillas en diferentes
concentraciones (11).
1.4.1 Antecedentes. Biggs en 1990, experimentó con 40 extractos de
plantas para el control de Leucostoma persooni en durazno y obtuvo muy
buenos resultados al comparar estos extractos cOn un control químico .
Pumima et al en 1989, aplicaron extractos de hojas de plantas de Lantana
camara, Mentha arvensis y Ocimum sanctum en tomate para controlar la
pudrición causada por Aspergi/lus niger. Cuando plantas sanas y maduras
de tomate fueron tratadas con estos extractos presentaron niveles más bajos
de pudrición que los frutos no tratados .
Ghewande en 1989, manejó enfermedades foliares usando extractos de
Azadirachta indica, Lewsonia inermis, Triadex procumbes, Porgamia pinnata
y fungicidas como Mancozeb y Carbendazim. El mejor control se obtuvo
utilizando el fungicida Mancozeb, pero A. indica y L. inermis fueron mejores
que Carbendazim.
•
..
15
Malcolm, citado por Correa y Rojas en 1989, encontraron que el extracto de
rizomas y especialmente el extracto de tallos jóvenes de Aegopodium
podagraria en acetona poseían actividad antifúngica.
Matta y Poveda en 1995, evaluaron el efecto de los extractos de equisetum,
manzanilla, ají y ajo, bacterias epifíticas y agroplus, sobre el proceso de
epiqemia de la mancha de Ascochyta (Ascochyta pisiJ y del Mildeo Polvoso
(Ervsiphe pisO del guisante (Pisum sativum varo Macrocarpon). Mostraron
mejor efecto el tratamiento con los fungicidas Flusilazol, Clorotalonil, azufre
elemental y Carbendazim, seguido por los extractos de ají y 'ajo que tuvieron
buen comportamiento (19).
Conner y Beuchat en 1984, trabajando con aceites esenciales de clavo,
canela, cebolla, ajo, orégano y tomillo comprobaron su efecto de
interferencia sobre la capacidad de recuperación de ocho especies fúngicas
(Gandida lipolvtica. Debarvomvces hansenii. Hansenula anomala, Kloeckera
apiculata, Lodderomvces elongisporus, Rhodotorula rubra, Saccharomyces
cerevisiae y Torulopsis glabrata).
•
16
Reuveni et al en 1984, señalan las propiedades fungistáticas del aceite
esencial de albanaca (Oeimum basilieum) sobre Fusarium oxysporum f. sp.
vasinfectum y Rhizopus nigrieans.
Janssen y Baerheim en 1986, investigaron el efecto de los aceites
esenciales sobre varios organismos patógenos como bacterias y hongos
medi.ante la técnica de difusión en antibiograma, midiendo los diámetros de
inhibición de las colonias ante varias dosis de aceites esenciales. Estos
investigadores trabajaron con Eeheriehia eOIi, Stafilococcus aureus, Candida
Iypolitiea y Saccharomyces cerevisiae.
Femández et al en 1990, probaron los aceites esenciales de limonaria
(Cymbopogea cítrafus), romero (Rosmarinus offieinalis 1.:.) y lomillo (Thymus
§Q.) sobre cinco aislamientos de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Los
aceites esenciales mostraron una limitada acción de inhibición de la
germinación de esporas del hongo mientras que el extracto en sí tuvo un
efecto significativo (16).
Montes et al en 1994, evaluaron la eficiencia del extracto de 50 plantas en
el control de Alternaria salani en pimentón determinando una acción
inhibitoria definida con las especies Allium sativum. Argemone mexicana y
• 17
•
Eucaliptus globulus. En vivero destacaron d. sativum. Chenopodium
ambrosioides. Tagetes erecta y Mentha piperita. que dieron una protección
similar al Maneb. Igualmente evaluaron 85 especies de plantas para el
retraso en el desarrollo epidémico de Phytophthora infestans en pimentón de
los cuales sólo Mentha piperita logró retrasar la enfermedad a nivel de
campo (20, 21).
Pérez el al en 1993, evaluaron los extractos vegetales de Taraxacum
officinale, Punica granatum, Piper auritium, Ambrosia artemisaefolia y
Genchrus §Q. en el control del virus del enchinamiento del pimentón,
mostrando mejor resultado las especies 1 officinale + P. auritium después
del Endosulfan comparado con el testigo (23).
Velandia en 1993, evaluó el extracto de ajo en el control de Plasmodiophora
brassicae, concluyendo que el extracto de ajo podría llegar a ser una
alternativa en el control de hongos fitopatógenos .
18
2 METODOLOGIA
El trabajo de laboratorio e invernadero fue desarrollado en el laboratorio de
Control Biológico del Postrado de la Facultad de Ciencias Agropecuarias y
fitotrón de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, con sede
en Tunja, que presenta las siguientes coordenadas geográficas:
Altitud:
Latitud:
Longitud:
2690 m.s.n.m.
5 grados 33 minutos N.
73 grados 24 minutos.
Temperatura: 13 grados centígrados.
2.1 EXTRACTO DE HOJAS DE EUCAUPTO
2.1.1 Preparación. El extracto se preparó solamente de hojas verdaderas
de la especie E. g/obu/us /abi/t, se tomaron 300 gramos de hojas frescas,
•
•
19
provenientes de diferentes plantas ubicadas dentro de los predios de la
Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.
Las hojas fueron desinfectadas previamente en hipoclorito de sodio al 1 % Y
luego lavadas con agua destilada esterilizada. Se licuaron en un litro de
agua estéril, por diez minutos y se filtró en tela de gasa obteniéndose el
extracto puro. Para llevar el extracto a sus diferentes concentraciones se
tomaron 5, 10, 15 Y 20 mi de éste adicionándosele agua destilada hasta
llevarlo a 100 mi; la concentración al 100% corresponde al extracto puro.
El extracto se preparó el mismo día de su utilización, para evitar su
fermentación.
2.2 EL PATOGENO
2.2.1 Obtención. El hongo F. oxysoorum f. sp. dianfhi, raza fisiológica 2 la
facilitó el profesor Germán Arbeláez profesor de la Universidad Nacional de
Colombia, la cual está determinada como la más frecuente en la Sabana de
Bogotá y una de las más agresivas como ocurre también en otros países
•
donde se cultiva el clavel como: Holanda, España, Italia, Inglaterra y los
Estados Unidos.
2.2.2 Propagación. Se hizo en el medio de cultivo P.DA: Papa (250 gr),
Dextrosa (20 gr) y Agar-agar (16 gr). Se sembró el hongo en 20 cajas de
petri de 9 centímetros de diámetro y se llevaron a una mufla a 25 grados
centígrados durante 10 días. Pasado este tiempo en la mufla, el hongo se
utilizó para realizar las diferentes pruebas del ensayo.
2.3 PRUEBAS DE LABORATORIO
2.3.1 Prueba de Antibiosis : Hongo - Extracto de eucalipto. Se tomaron
5, 10, 15 Y 20 mi del extracto de hojas de eucalipto y se les adicionó P.DA
hasta llevarlo a 100 mi para obtener las diferente!! concentraciones (Tabla
1), para la concentración del extracto al 100% se le adicionó solamente
Agar hasta afirmar el medio. Se sembró en cada caja de Petri un disco de
9 milímetros de diámetro del hongo E. oxvsPorum f. sp. dianthi Raza 2,
dejándolas al medio ambiente (Ver Fotografia 1). En el testigo al medio de
cultivo P.D.A. no se le agregó el extracto.
21
TABLA 1. Lista de tratamientos
.. Tratamiento Denominación
TO Sin extracto de eucalipto
T1 Extracto de eucalipto al 5%
T2 Extracto de eucalipto al 10%
T3 Extracto de eucalipto al 15%
T4 Extracto de eucalipto al 20%
T5 Extracto de eucalipto al 100%
•
..
• FOTOGRAFIA 1. Inicio prueba de antibiosis: hongo-extracto de
eucalipto
22
•
23
2.3.2 Prueba de germinación de conidias. En una cámara húmeda (caja
de petri, papel de filtro y soporte de vidrio) se le colocó un porta objetos con
una gota de suspensión de conidias del patógeno más una gota del extracto
de hojas de eucalipto en las concentraciones. Estas cámaras se colocaron
en una mufla a 25 grados centígrados por 24 horas.
2.4 PRUEBA DE INVERNADERO
Para esta prueba se utilizaron las mismas concentraciones del extracto de
hojas de eucalipto de las pruebas en el laboratorio.
Cada unidad experimental consta de una matera plástica de 10 centímetros
de diámetro, a la cual se le incorporó suelo tratad!) en una mufla a 70 grados
centígrados por 24 horas.
Los esquejes de clavel de la variedad Flavio fueron llevados a inmersión de
raices en cada una de las concentraciones de extracto de eucalipto durante
tres horas; posteriormente fueron inmersos durante 15 segundos en una
suspensión conidial de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, calibrada en el
hemacitómetro a una concentración de un millon de esporas/mI.
•
.,
24
Los esquejes fueron transplantados uno por matera, previamente arregladas
según su diseño experimental.
2.5 DISEÑO EXPERIMENTAL
2.5.1 Diseño experimental en prueba de laboratorio. Para la prueba de
laboratorio se utilizó un diseño experimental completamente al azar; se
evaluaron 5 tratamientos y un testigo (Tabla 1), con cuatro replicaciones
para un total de 24 unidades experimentales. Cada unidad experimental
consta de una caja de petri (Anexo A).
2.5.2 Diseno experimental en prueba de invernadero. Se experimentó
por medio de una distribución completamente al azar, con 5 tratamientos y
un testigo (Tabla 1), con 10 replicaciones para un total de 60 unidades
. experimentales; cada unidad experimental consta de una matera y un
esqueje de clavel (Ver Anexo B).
..
•
..
25
2.6 EVALUACION
2.6.1 Evaluación en laboratorio
2.6.1.1 Prueba de antibiosis: Hongo - Extracto de eucalipto
2.6.1.1.1 Tasa de crecimiento micelial. Una vez sembrado el patógeno en
el P.DA con fas diferentes concentraciones del extracto de hojas de
eucalipto, se llevaron a cabo mediciones del diámetro de la colonia cada
segundo dia durante 14 dlas, tiempo en el cual en las cajas de petri del
testigo el hongo las invadió completamente.
2.6.1.1.2 Tasa de esporulación del hongo. Luego de determinar el
crecimiento micelial del hongo de los respectivos tratamientos, se tomaron 4
discos de 9 milímetros de diámetro, cada uno del medio con el hongo, los
cuales fueron suspendidos en tubos de ensayo que contenían 10 mililitros de
agua destilada esterilizada; se le agregó 4 gotas de lactofenol con el fin de
darle tinción a las estructuras. En el conteo de conidias se utilizó la cámara
de Neubauer .
•
•
26
2.6.1.2 Pruebas de germinación de conidias. Pasadas 24 horas a cada
uno de los porta-objetos, se les adicionó una gota de la~ofenol, se les
colocó un cubre-objetos y con ayuda del microscopio en el ocular de 40X,
se hizo el conteo de conidias con o sin germinación en cuatro campos
diferentes .
2.6.2. Evaluación en invernadero
2.6.2.1 Evaluación de la incidencia de F. oxysporum f. sp. dianthi en los
esquejes de clavel. Una vez muerto el testigo (esqueje de clavel sin
tratamiento), se evaluó la respuesta de control de las concentraciones del
extracto de las hojas de eucalipto en los esquejes de clavel mediante la
escala de índice de la enfermedad utilizadas por Barragan y Martinez (6)
observadas en la Tabla 2.
41 27
• TABLA 2. Escala de indice de la enfermedad
ESCALA SINTOMATOLOGIA
Grado O planta sana
Grado 1 planta enferma primer tercio
Grado 2 planta enferma segundo tercio
Grado 3 planta enferma tercer tercio
Grado 4 planta muerta
•
28
Para hallar el porcentaje de infección por tratamiento se utilizó la formula
general de Kaspers.
n.v. % I = --- x 100
N.i.
donde v = Grado
i = Grado más alto
n = Número de plantas en cada grado
N = Número total de plantas
%1 = Porcentaje de infección
Además del porcentaje de infección, se evaluará el peso fresco, longitud de
la raíz y longitud del tallo de cada uno de los esquejes
•
•
29
3 RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1 PRUEBAS DE LABORATORIO
3.1.1 Prueba de antibiosis: Hongo - Extracto de eucalipto
3.1.1.1 Tasa de crecimiento micelial. En el testigo el crecimiento del hongo
fue abundante de color púrpura en el medio de cultivo P.DA, su crecimiento
fue radial sin irregularidades.
Con los demás tratamientos el crecimiento micelial fue lento principalmente
con los tratamientos al 15, 20 Y 100% del extracto de eucalipto.
Para esta variable el análisis de varianza muestra que existen diferencias
altamente significativas entre los tratamientos (Tabla 3).
. ' *' .' ••
TABLA 3. Análisis de varianza para el crecimiento micelial
Diseño experimental completamente al azar
F. REQUERIDO
FUENTE DE VARIPC 1:) N G.L. s.e. e.M. F.OBSERVAOO
5"0 1%
TRATAMIENTOS 5 13<QO.33 2678.06 193D 2.77 425"
I
ERROR 18 249D 13.83
I I
TOTAL 23 13539.33
c.v. = 9.962
.... = AKamente signWicativo
•
31
En la Tabla 4 se muestra que el crecimiento del hongo fue mejor con el
testigo que con los tratamientos de eucalipto (Fotografía 2). A los 12 dias en
el testigo la colonia fungosa tuvo un diámetro de 89.2 mm el cual fue mejor y
con diferencias significativas al 5% en comparación al crecimiento del hongo
en P.D.A. con el extracto de eucalipto al 5, 10, 15, 20 Y 100% con los cuales
las colonias tuvieron un diámetro de 32.2, 29.5, 28.5, 26.2 Y 18.2 mm
respectivamente (Figura 1) .
Con las concentraciones del 5, 10, 15, 20 Y 100% del extracto de eucalipto el
crecimiento micelial fue de 63.8, 66.9, 68.6, 70.5 Y 79.5% respectivamente y
menores en comparación con el testigo que fue del 100% (Tabla 5). Estos
resultados indican que el extracto de eucalipto en sus diferentes
concentraciones afectó e[ crecimiento mice[ial de [a colonia de Fusarium
oxvsporum f. sp. dianthi.
Para esta variable el modelo de regresión da la ecuación de la curva
y = 69.547 - 3.258X + 0.027X2 con un coeficiente de correlación r = 0.82 01er
Anexo O) que determina que existe una estrecha relación entre la variable
independiente concentración del extracto y la variable dependiente
crecimiento micelial, sin embargo el ANOVA para el análisis de regresión
muestra que no existen diferencias significativas ni al 1 y 5% entre estas dos
•
•
FOTOGRAFIA 2. Efecto del extracto de eucalipto en el crecimiento
micelial de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
32
•
•
•
•
T AS LA 4. Efecto del extracto de euc alipto en el cree imiento mi:; elial de Fusarium oXI§Porumf. sp. dianthi
DiáTTEtro Trawi;!nto (mm)
Testgo 89.25 (A)'
Extl<lCtl de eucaliptl al 5% 3225 (9)
Extl<lCto de e ucalipto al 10% 29.50 (e)
Extl<lCbde eucalitpo al 15% 28.50 !C)
Extracto de e ucalipto al m% 26.25 (e)
Extl<lClO de e ucali pto al1 00% 18.25 (D)
"", Letras iguales son signifi:; ativamente diferentes al nivel del i% para la prueba de Duncan
•
•
o
'"
(ww) "1Vl'3~IW O.lN3IWI~3H~
f -1 ¡ J ¡ / / f /- f I I I
\ \ \
\ \ I \ \ I
1 t \ \ \ \ '1 t
\ \ \ \ \ \ \ I \
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34
eu'S _ c: CD,!!! e'tJ .c " o Do 111 111 ,B"": nI:: :: ¡: ~ o ::J CD CD 'ti o
~ 1:: e~ - 111
'" ~ 111 1- Cii.r
'ti
~ CD
N iü
• 35
TABLA 5. Efecto de cinco concentraciones de extracto de eucalipto en
la inhibición del crecimiento micelial de
Fusarium oxysporum f. sp. dianthi .
• Tratamiento Diámetro Inhibición del
(mm) crecimiento (%) Extracto de eucalipto 5 % 32.25 63.86
Extracto de eucalipto 10 % 29.50 66.94
Extracto de eucalipto 15 % 28.50 68.66
Extracto de eucalipto 20 % 26.25 70.58
Extracto de eucalipto 100% 18.25 79.55
Testigo 89.25 100.0
•
ti
36
variables ya que el coeficiente de variación fue de 50.9 debido a la gran
amplitud entre los dos últimos intervalos que corresponden a las
concentraciones del extracto del 20 y 100% (Ver Anexo e y Figura 2). Es de
conocerse cómo endógenamente las plantas sufren algunos cambios en el
metabolismo de los compuestos aromáticos al momento de la invasión por
patógenos, dicho caso no excluye a los hongos vasculares como Fusarium
sp .. Muchas de estas sustancias orgánicas, tienen la propiedad de actuar
frente a hongos a nivel de sus membranas celulares, ácidos nucleicos y
sobre sus sistemas enzimáticos inhibiendo el crecimiento micelial de la
colonia o su destrucción total; igualmente se le conocen efectos inhibitorios
a este tipo de compuestos sobre la germinación de conidias haciendo que
estos muchas veces revienten protegiendo la planta de la infección
(Fernandez 16).
• ., •
90 •• -------------------------------------------------------------------,
80
70
60
-Iso ~ Ii:i ~ 40-1-
, • y = 69,547 • 3,258)( + O,027X'
Q
30 r '-._~ 20
10
0~1--~~~--~_+--+__r--~~~--~_+--+__+--~~~--~_+~
o 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
CONCENTRACION (%)
FIGURA 2. Regresión para la variable crecimiento micelial
'.
'~
--OBSERVADO ESPERAOO
•
w -..¡
•
•
•
38
3.1.1.2 Tasa de esporulación. Para esta variable el análisis de varianza
mostró que existen diferencias significativas entre los tratamientos (Tabla 6).
En la Tabla 7 se muestra que la esporulación fue de 2"699.000 conidias/ml
entre macroconidias y microconidias en el testigo, siendo el mejor con
respecto a los tratamientos con el extracto de eucalipto y con diferencias
estadísticas al nivel del 5%. Entre los tratamientos con el extracto de
eucalipto en concentración al 15% la esporulación fue de 471.875
conidias/ml siendo mejor y con diferencias significativas al 5% con relación a
las demás concentraciones del extracto.
Para los tratamientos a la concentración del 5, 10, 20 Y 100% la
esporulación del hongo osciló entre los 111.125 y 227.125 conidias/ml, sin
diferencias estadísticas entre sí al nivel del 5%. Estos resultados están
indicando que el extracto de eucalipto en sus diferentes concentraciones
afectó la esporulación de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
En la concentración del extracto de eucalipto al 15% la esporulación del
hongo fue mejor a lo esperado (Figura 3), las causas directas a esta
medición los autores no tienen una explicación concreta; sin embargo,
Foster en 1974, citado por Femández (16), señala que muchas sustancias
• ., • •
TABLA 6. Análisis de varianza para esporulación
Disefio experimental completamente al azar
F. REQUERIDO
FUENTE DE VARI/IC ION G.L. S.C. C.M. F.OBSERVAOO
5% 10/0
TRATAMIENTOS 5 2.08 4.17 238.63 2.77 425··
ERROR 18 3.15 1.71
TOTAL 23 5.23
e.v. = 20.96
.... = AKamente significativo
•
•
..
TABLA 7. Efecto del extr8Cto de eucaUpto en la esporul8Ción
NUmero de Inhibción de la Tlatam iento coni:lias I mi esp::lIulaoon ("k)
Testgo 2'699000 !A)' 100
ExtJac\:) de eucalip\:) a15% 227125 (e) 91,68
ExtiaClo de eu::aliplo al 10% 12s:!50 (e) 96,36
ExtiaC1D de Q u::alip1D al 15% 471875 (B) 82.51
ExtiaC1D de Q u::alip1D al 20% 151785 m 94.31
ExtiaClo de eu::alipbJ al 100% 111125 (e) 96,88
.. = Letras iguales son signifi:: atJvamente diferentes al nivel del 10m para la prueba de Duncan
•
I
' . •
~ooooo----------------------------------------------------------------------
2S00aoo
2000000 ----
1000000
o ' TO T1 T2 T3 T4
TRATAMIENTOS
FIGURA 3. Efecto del extracto de eucalipto sobre la "porulaclón del hongo Fysarlum oxysporumf. 8p. dlanlh!
TS
.'
.j>. .....
•
..
42
fungitóxicas y desinfectantes presentan una acción más eficaz a bajas
concentraciones debido a que en concentraciones altas se presenta una
competencia entre los componentes de la solución fungitóxica para su
fijación a los receptores de la membrana citoplasmática del organismo
atacado, es decir, las moléculas del componente inactivo saturan las
entradas a la célula y bloquean las moléculas del paso del componente
activo. Otro aspecto a este resultado, que puede explicar su irregularidad,
es la variabilidad genética del hongo o en su defecto podría deducirse a esta.
concentración como un punto intermedio entre el efecto fung'istático y tóxico
donde la colonia tendría la posibilidad de recuperarse por generación de
nuevas hifas y por ende la producción de nuevas estructuras reproductivas o
conidias, esta última explicación es invalidada cuando se retoma la variable
germinación donde la concentración del extracto de eucalipto es
directamente proporcional a la germinación.
En la concentración del 5, 10, 15, 20 Y 100% del extracto la esporulación fue.
de 91.5, 95.3, 82.5, 94.3 Y 95.8% respectivamente menor con respecto al
testigo que fue del 100% (Ver Tabla 7).
Para esta variable, el modelo de regresión da la ecuación de la curva
y = 1'804.354.84 - 13.159.52X + 1063.63X2 con un coeficiente de
•
•
43
correlación r = 0.74 (Anexo D) que determina que existe una estrecha
relación entre la variable independiente concentración del extracto y la
variable dependiente esporulación; sin embargo el ANOVA para el análisis
de regresión muestra que no existen diferencias significativas ni al 1 ni al 5%
entre estas dos variables ya que el coeficiente de variación fue de 138.9
debido a la gran amplitud entre los dos últimos intervalos estimados que
corresponden a la concentración del extracto del 20 y 100% (Figura 4) .
3.1.2 Prueba de gennlnación de conidias. Para todos los tratamientos la
inhibición en la germinación de conidias se acentúa a medida que se
aumenta la concentración del extracto de eucalipto (Figura 5). En el
tratamiento testigo se observan conidias germinadas con tubos getminativos
largos en tanto que en los tratamientos con extracto se observan conidias
germinadas con tubos germinativos cortos a excepción del tratamiento para
la concentración al 100% en el cual no se observa tubo germinativo.
Para esta variable el análisis de varianza muestra que existen diferencias
altamente significativas entre los tratamientos (Tabla 8). En la Tabla 9 se
muestra que el testigo tuvo un porcentaje de germinación de conidias del
86.3% siendo el mejor y con diferencias estadísticas con
• •• ••
30oo0ooTI----------------------------------------------------------------,
2500000
2000000
e 1500000
~ e z ... y .. 1·8Q.43S4.~ .123159.52>< + 1063.63X2
8 1000000 . .-"
500000
o t 5 10 15 '\ 0 25 30_~-4O-'~50 SS 60 65 70 75 80 85 90 95 leO
·~Ooo~--------------------------------------------------------~
CONCENTRACION (%)
FIGURA 4, Regresión para la variable esporulaclón
[-OBSERVADO I- ESPERADO
•
t
•
~
i Di: W
" w Q
W :z "" z
g a.
• .' 100¡-----------------------------------------------------------------------
~t
70
80
50
40-
30-
20 J
I 10
O -TO T1 T2 T3 T4
TRATAMIENTOS
FIGURA 6. Efecto del extracto de eucalipto en la germinación de conidias de Eussrlum oxysporum f • • p. dlantbl
T5
.,
.¡,. 01
.' • • •
TABLA 8. Análisis de varianza para germinación de conidias
Diseño experimental e ompletamente al azar
F. REQUERIDO
FUENTE DE VARIPC ON G.L. s.e. e.M. F. OBSERVADO
50,'0 1%
TRATAMIENTOS 5 16924.73 3384.94 100.02 227 425 ••
ERROR 18 338.46 18.80
- TOTAL 23 17263.19
c.v. = 11.12
""" = Altamente signWicativo
•
•
¡
T AB LA 9. Efecto del extracto de euc alipto en la germinación de c onidias . de Fusarium oXl§Porum f. sp. dianlhj
TIlj,tM! ienlo Poltenlitje de conidiis germinadas
Testgo 86.a5 (A)'
ExtJactl de eucaVptl al 5% 52.75 (B)
ExtlllC~ de e\l:alip1D al 10% 38.28 m
ExtlaClo de e \l:aHplo al 15"10 al.a7 (O)
ExtlllC1D de e \l:atip1D al :10% 24.14 (El
ExtlllC1D de e\l:a6p1D al 100% 0.0 (F)
.. = Letras iguales son signifbativamente diferentes al nivel del 1% para la prueba de Duncan
•
•
48
respecto a los tratamientos con extracto de eucalipto. Con las
concentraciones del extracto del 5, 10, 15, 20 Y 100% el porcentaje de
germinación de conidias fue de 52.7, 38.2, 31.3, 24.1 Y 0.0%
respectivamente los cuales fueron significativamente diferentes al nivel del
5%; con la concentración del extracto al 100% fue el más efectivo en la
inhibición de la germinación de las conidias. Estos resultados indican que el
extracto de eucalipto a sus diferentes concentraciones inhibe la germinación
de conidias de Fusarium oxvsporum f. sp. dianthi.
Para esta variable el modelo de regresión muestra la ecuación de la curva
y = 77.82 - 3.51X + 0.027X2 con un coeficiente de correlación r = 0.97
(Anexo D) que indica que existe una estrecha relación entre la variable
independiente concentración del extracto y la variable dependiente
germinación; el ANOVA para el análisis de regresión muestra que existen
diferencias significativas al 5% entre la variable concentración del extracto y
germinación de conidias, con un coeficiente de variación de 21.34 (Figura 6) .
•
ea
80
70
_ 60
~
I SO
I 40
I 30
§ 20
10
o
-10
.
~ •
~ \
5 10
.. • •
, y .. n.823 - 3.S18X + O.027X2
--OBSERVADO \ --ESPERADO
~
15 20 25 30 35 40 "S 50 55 50 85 70 75 80 85 90 " 1 O
CONCENTRACION 1%)
FIGURA 8. Regresl6n para la variable germlnacl6n de conldlas
~
•
•
•
•
50
3.2 PRUEBA DE INVERNADERO
A los tres días de haber tratado los esquejes de clavel variedad Flavio se
presentó una clorosis en las plantas con el extracto de eucalipto siendo más
severo en la medida que se aumenta la concentración del extracto. Con la
concentración al 100% se presenta una toxicidad total de los esquejes, los
tratamientos a las concentraciones del 5, 10, 15 Y 20% presentaron menor
índice de toxicidad (Ver Fotografía 3).
3.2.1 Efecto del extracto de eucalipto en el control de Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi. A los 42 días después del transplante, en el
testigo aparecieron los primeros síntomas de la enfermedad caracterizada
por un enroscamiento de hojas y clorosis solamente a lo largo de la mitad de
la lámina foliar en tanto que la otra mitad permaneció de color verde. Cinco
días después los síntomas fueron observados en las plantas tratadas con el
extracto al 5 y 20% Y a los 63 días en plantas del tratamiento a la
concentración del extracto al 15%. Es de anotar que para esta fecha se
observó la aparición de los primeros botones florales en cuatro plantas del
tratamiento al 10% del extracto.
• 51
•
•
FOTOGRAFIA 3. Efecto tóxico del eucalipto en concentraciones altas
en los esquejes de clavel
•
•
•
•
•
52
A los 90 días del transplante el menor porcentaje de plantas enfermas fue
del 20% con la concentración del extracto de eucalipto al 10%; para los
demás tratamientos las plantas enfermas fueron del 80 al 100% (Fotografía
4, Figura 7 y Tabla 10).
Para especificar y comprobar la presencia del patógeno se realizaron cortes
longitudinales en todos los esquejes determinándose que en casi todos se
presentan manchas vasculares menos en seis (6) replicaciones del
tratamiento a la concentración del extracto al 10% (Fotografia 5 y 6). Se
sembraron en P.DA cortes transversales del primer tercio de algunas de las
replicaciones de los tratamientos los cuales mostraron la presencia de E
oxYsporum f. sp. dianthi en los tejidos vasculares de los esquejes.
Existen algunos compuestos presentes en plantas superiores que afectan el
crecimiento cuando se aplican exógenamente a plantas, dentro de este
grupo se incluye gran variedad de compuestos fenólicos que segun su
estructura, posición de sus radicales en dicha estructura y su concentración
actúan inhibiendo o estimulando la acción de la enzima AIA-oxidasa. Dentro
de los extractos de eucalipto existe específicamente un compuesto
denominado Umbeliferona, el cual a bajas concentraciones actúa
'.
•
•
•
53
estimulando la formación de raices en esquejes de alubias por su acción
inhibitoria frente a la enzima AIA-oxidasa. Barceló (6) .
FOTOGRAFIA 4. Efecto del extracto de eucalipto en la prueba
de invernadero
------~---- ------ - ---
.'
z 2
~ IL i!: w Q
w
~ w ~ ~
• •
100
1 81)+1--1
50
40L-
30
20
10
O ro T1 12 13 T4 T5
TRATAMIENTOS
FIGURA 7. Efecto del extracto de eucalipto sobre el porcentaje de Infección en las plantas do clavel
•
~
• • •
TABLA 10. Efecto del extracto de eucalipto $Ob ... el porcenlaje de inécclon y n'umelO de plantas con flor y con reblO_ en clavel.
-_. -- -
N~merode N ~mel\) de plantas PoICentaje de N~melO de Plantas con Tratam ie nto planas Inoculadas enfermas infección plantas con fbles re1IOj'ps
T~igo 10 10 90.0 O 3
Co oce n1laC ión al 5% 10 8 37.5 O 4
C onceMI<!C ión al 10% 10 2 7.5 4 O
C oncentI<!C ión al 15"10 10 8 45.5 O 3
Conee 1'11"'" ¡; n al 20% 10 8 57.5 O 1
-
Concent"", ión al 100% 10 10 67.5 O 2
•
<n <n
•
•
•
•
56
FOTOGRAFIA 5. Testigo con ataque severo por Fusarium oxysporum .f.
sp. dianthi. .
•
•
•
57
FOTOGRAFIA 6. Corte longitudinal de plantas mostrando los síntomas
a nivel vascular en el testigo (izquierda), en
comparación con una planta sana tratada con el
extracto al 10% (derecha) .
•
•
•
•
58
Para la variable longitud del tallo el análisis de varianza nos muestra que
existen diferencias altamente significativas entre los tratamientos (Tabla 11).
En la Tabla 12 se muestra que la longitud del tallo fue de 27.4 cm en el
tratamiento a la concentración del 10% del extracto, siendo este el mejor con
diferencias estadísticas con respecto a los demás tratamientos,
probablemente debido al efecto de algunos compuestos como los
ortohidroxifenoles, trihidroxifenoles sobre los sistemas auxínicos apicales de
los esquejes. Barceló (6). Con el testigo y las concentraciones del extracto
del 5, 15 Y 20% la longitud del tallo fue de 18.7, 17.8, 19.9 Y 18.7 cm
respectivamente los cuales son estadísticamente iguales entre si y
significativamente mejores que el tratamiento en la concentración del
extracto al 100% que tuvo una longitud del tallo de 14.8 cm (Fotografía 7).
Para la variable longitud de la raíz el análisis de varianza muestra que no
existen diferencias significativas en los tratamientos (Tabla 13), sin embargo
se puede observar que la longitud de la raíz fue mejor en el tratamiento a la
concentración del 10% (Ver Figura 8); lo que indica que además del efecto
del extracto sobre las estructuras del patógeno, igualmente este pudo haber
ejercido un efecto fisiológico frente al crecimiento radicular por estimulación.
Es de considerar que la incidencia del patógeno es más alta en
• . ' • •
TABLA 11. Análisis de varianza para longitud del tallo
Dseilo experimental e ompletamente al azar
F. REQUERIDO
FUENTE DE VARIPC ION G.L. S.C. C.M. F. OBSERVADO
6% 1%
TRATAMIENTCS 5 888.16 177.63 9.40 238 337 ••
ERROR 54 10:20.70 1890 I !
I
TOTAL 69 1908.85 .
--
c.v. = 22.23
.... = A~amente signKicativo
•
•
•
•
TABLA 12. Efe:::to del extracto de eucalipto en la longitud del taRo y raíz de esquejes de clavel
Tramlien1D lorgttud del Longttu:l de talb (om) la raiz (om)
Testgo 18.70 (8)' 16,40
ExtlllCtl de eucaliptl a15% 18.70 (B) 16.40
ExtlllClo de elXaliplo al 1O"k 27.40 (A) 19.50
ExtlllC1:l de e lXaliplo al 15% 17.80 (8) 15.50
ExtlllClo de e lXaliplo al 23% 1990 (B) 16.80
ExtIlIClo de elXalip10 al 100% 14.80 ~) 15.30
.. = Letras iguales son signifi:;ativamente diferentes al nivel del 1 o~ para la prueba de Duncan
•
•
'.
- - - --~- - - - --- - --- - --- - - - - - - -
61
FOTOGRAFIA 7. Efecto del extracto de eucalipto en la longitud del tallo
en los esquejes de clavel.
(De izquierda a derecha: TO, Ti , T2, T3, T4,T5)
'. • • •
TABLA 13. Análisis de varianza para longitud de la raiz
Dseno experimental completamente al azar
F. REQUERIDO
FUENTE DE VARIPC ON G.L. s.e. e.M. F.OESERVAOO
5% 1~oQo
TRATAMIENTCEi 5 115.48 2309 1.33 238 3.37
ERROR 54 935.70 1734
TOTAL 59 1052.18
c.v. = 25.06
•
1 o
• •
30--------------------------------------------------------------------------
25-+:-----
20----,
• LONGITUD DEL TALLO (cm)
I o LONGITUD DE LA RAIZ (cm)
E 15 (!)
9 10-1-
5
o TO T1 T2 T3 T4 T5
TRATAMIENTOS
FIGURA 8. Efecto del extracto de eucalipto 80bAl la longitud del tallo y ralz en las plantas de clavel
•
g¡
•
•
•
64
raices jóvenes. Arbelaez (3). Si la umbeliferona acelera el crecimiento
radicular, ayuda a ejercer una menor posibilidad de penetración de hifas del
patógeno al sistema radicular, protegiendo a la planta de la infección y
logrando por ende una mayor posibilidad en el desarrollo del tallo y como
resultado mayor peso fresco.
Para la variable peso fresco el análisis de varianza nos muestra que existen
diferencias altamente significativas entre los tratamientos (Tabla 14). En la
Tabla 15 vemos que con el tratamiento a la concentración del 10% el peso
fue 14.34 gr siendo el mejor y con diferencias estadísticas en comparación
con cada uno de los demás tratamientos. Aunque los tratamientos a la
concentración del 20% con peso promedio de 11.3 gr y el tratamiento a la
concentración 5% con un peso promedio de 10.6 gr no muestran diferencias
estadísticas entre sí, si las presentan con el testigo y los tratamientos al 15 y
100% del extracto. Para el testigo y los tratamientos a la concentración al 15
y 100% del extracto el peso fresco fue de 7.6, 8.8, y 5.5gr respectivamente,
con diferencias significativas entre ellos (Figura 9). Segun los resultados
anteriores se observa que el extracto de eucalipto presenta uf! efecto control
en el porcentaje de infección de la enfermedad marchitamiento vascular en
los esquejes de clavel, sin embargo a concentraciones altas se observa que
el extracto afecta la longitud del tallo, raíz y peso fresco .
t, * • •
TABLA 14. Análisis d~ varianza para peso fresco
Disei'io experimental completamente al azar
F. REQUERIDO
FUENTE DE VARIAC ION G.L. s.c. C.M. F. OBSERVADO
5% 1%
TRATAMIENTOS 5 467.gJ 9359 14.46 2.38 3.37 ••
ERROR 54 394.48 6.47
,
TOTAL 59 817.46 I
c.v. = 26.16
.... = Mamente significativo
•
•
•
TABLA 15. Efecto del extracto de eucalipto en el peso fresco de los esquejes de clavel
Peso 1nasoo TIa1am erno (gr)
Testgo 7.66 (D)"
ExtIacb de eucaliptl al 5% 10.63 (B)
ExtlaC1!I de e u;alip1!l '" 10% 1434 (A)
ExtlaC1!I de e u;alip1!l '" 15% 8.81 (cl
ExtlaCln de El u;aUpln '" 2)% 11.30 (B)
ExtlaC1D di! eu;alipCO al 100% 5.00 (E)
• = Letras iguales son signifbativamente diferentes al nivel del 1% para la prueba de Duncan
• • •
15
l 1~--------------------------~
12-----------------------------1
1011-------
~ ~ o
8---
4----
2--
TO T1 T2 T3 T4 T5 TRATAMIENTOS
FIGURA 9. Efecto del extracto de eucalipto sobre el peso fresco de las plantas de clavel
•
al
"'"
•
•
•
•
68
4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1 CONCLUSIONES
El extracto de eucalipto afectó significativamente el crecimiento micelial y la
esporulación de Fusarium oxysoorum f. sp. dianthi.
El porcentaje de germinación de conidias de Fusarium oxvsoorum f. sp.
dianthi siempre fue menor con el extracto de eucalipto y con diferencias
altamente significativas con relación al testigo.
La mayor longitud del tallo, raíz y peso fresco de las plantas de clavel se dio
con el tratamiento correspondiente a la concentración del 10% del extracto
de eucalipto.
El mejor control de la enfermedad calculado en porcentaje de incidencia en
los esquejes de clavel se obtuvo con el extracto de eucalipto al 10%.
•
•
69
Los coeficientes de regresión tueron altos, el ANOVA no mostró diferencias
significativas sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de
conidias posiblemente debido a la amplitud en los dos últimos intervalos que
corresponden al 20 y 100% del extracto.
4.2 RECOMENDACIONES
Se recomienda evaluar el extracto de eucalipto con diferentes
concentraciones a intervalos más uniformes encaminados al control de
Fusarium oxysoorum f. sp. dianthi en condiciones naturales.
Identificar los compuestos del extracto de eucalipto que tienen un efecto
directo en el control de Fusarium Qxysoorum f. sp. dianthi.
Evaluar el extracto de otras especies de plantas para el control de Fusarium
Qxysporum f. sp. dianthi.
Incentivar a profesionales y agricultores a participar en un manejo biológico
y sus problemas fitosanitarios reduciendo en un alto grado el uso de
pesticidas.
•
•
...
70
BIBLIOGRAFIA
1. ACOPAFLOR. Respuestas de algunas variedades de clavel estándar a las razas fisiológicas 1, 2, 4, Y 8 a aislamientos de baja patogenicidad de Fusarium OXYSDOrum f. sp. dianthi y a Phia/oohora cinesescens. Volumen 2. Bogotá D.C., 1995. P 4 - 5.
2. ARBELAEZ, Germán. Determinación de las razas fisiológicas de Fusarium oXVSOQrum f. sp. dinthi en clavel en la Sabana de Bogotá. EN: REVISTA ASOCOLFLORES. Edición 23. Bogotá.
3. ---o El marchitamiento vascular del clavel (Fusarium oxysoorum f. sp. dianthi.) en Colombia: Importancia, variabilidad del patógeno y estrategias de control integrado, con énfasis en el control biológico. Tomo 1. Santa Fe de Bogotá, 1993.
4. ---, el al. Control integrado del marchitamiento vascular del clavel ocasionado por Fusarium oxYSPOrum f. sp. dianthi. EN: AGRONOMIA COLOMBIANA. Volumen X. Santa Fe de Bogotá, 1993.
5. ----o Las enfermedades vasculares del clavel en Colombia y el mundo. EN: AGRONOMIA COLOMBIANA. Santa Fe de Bogotá. Volumen X 1993. P 14-16.
6. BARCELO, Juan. Fisiología Vegetal. Pirámide S.A : Madrid, 1986. P. 526.
• 71
7. BARRAGAN, L. Arcadio y MARTINEZ, L. Carlos. Evaluación del control de Fusarium oxysoorum f. sp. dianthi con Fenpiclonil, Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida en el cultivo del clavel en la Sabana de Bogotá. Tunja. 1992. 116 pag: il. Tesis (Ingeniero Agrónomo). Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias.
8. BOOTH, C. The genus Fusarium, commonwealth mycologycal institute. EN: BARRAGAN, L. ARCADIO Y MARTINEZ, L CARLOS. Evaluación del control de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi con Fenpiclonil, Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida en la Sabana de Bogotá. Tunja, 1992. p. 116: Tesis U.P.T.C.
9. CESPEDESIA. Flora ornamental. Volumen IV. 1975, p. 113.
10. CIBA-GEIGY, AGRICULTURA. Flores Colombianas adornan el mundo. Edición 8,1994. p. 19 - 20.
11. CORDOBA, Carlos Vicente. Fisiología vegetal. H. Blume : Madrid España.
12. DE LARRA, Jesús. Cultivos ornamentales. Aedos : Barcelona España, 1975. p. 145 -159.
13. DICCIONARIO CIENTIFICO ATLANTE. Diccionario de química. Atlante SA: México D.F. Altamirano, 1943.
14. ELROY RICE. Allelophaty. Capítulo X. Academy Press; Inc.
15. ENGLlSH, U.S y KINHAM, H.G. Producción comercial de claveles. Acribia : Zaragoza España, 1977. p. 209 - 222.
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17. FULLER, Harry et al. Botánica. Interamericana, 1974
18. GRAN ENCICLOPEDIA DE LA HISTORIA QUIMICA. Tomo XII. Francisco Seix : Barcelona España. p. 292 - 306.
•
•
-
72
19. MATTA L, Nubia Judith y POVEDA C, Martha Judith. Efecto de bacterias epifíticas, agroplus y algunos extractos de plantas sobre el proceso de epidemia de la mancha de ascochyta (Ascochvta pisiJ y del mildeo polvoso (Erysiphe pisO del guisante (Pisum sativun varo macrocarpon). Santa Fe de Bogotá. 1995. 53 p: il. Tesis (Ingeniero Agrónomo). Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Agronomía.
20. MONTES, R. FRAIRE, L. Retraso en el desarrollo epidémico de Phytophthora infestans en Jitomate con el uso de extractos vegetales EN: Revista de la Asociación Latinoamericana de Fitopatólogos. Volumen 29. Lima Perú, 1994.
21 .. MONTES, R. Y GARCIA, R. Eficiencia de extractos vegetales para el control de Alternarla solani en Jitomate. EN: Revista de la Asociación Latinoamericana de Fitopatólogos. Volumen 29. Lima Perú, 1994.
22. PAEZ, Carlos. Biología vegetal. Novena edición. Retina: Bogotá O.E., 1971.
23. PEREZ, R. et al. Evaluación de extractos vegetales para el control del virus del enchinamiento del Jitomate (Lycopersicon esculentum) en Oaxaca. México. EN: Revista de la Asociación Latinoamericana de Fitopatólogos. Volumen 29. Lima Perú, 1994 .
• 73
•
ANEXOS
..
74
ANEXO A. Plano de campo del diseño experimental en laborat6rio
•
c:J c:J c:J c:J c:J LJ [:J c:J c:J [:J LJ c:J [:J ~ ~ c:J [:J c:J [:J LJ ~ LJ [:J c:J D = Unidad experimental consta de una caja de Petri de 90 mm de diam
----
LO 1'-
•
"lB ff.'070::t !!r:r r¡f:ii?{J;;;¡¡tJ;;;;~;;;-V V"';.::i.J.Oll
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! EJ EJ EJ EJ EJEJ EJ EJ EJ EJ i ....
! EJEJEJEJEJEJEJEJEJEJ ! 111
~ "
. i EJEJEJEJEJEJEJEJEJEJ D
.. .. 1
• 76
ANEXO C. Tablas de ANOVA para el modelo de regresión
VARIABLE CRECIMIENTO MICELlAL .
• FUENTE DE G.L. S.C. C.M. F.OBSERVADO F. REQUERIDO VARIACION 5% 1% MODELO 2 2263,44 1131,72 3,13 9,55 30,81 ERROR 3 . 1084,14 361,38 TOTAL 5 3347,58
VARIABLE ESPORULACION
FUENTE DE G.L. S.C. C.M. F.OBSERVADO F. REQUERIDO VARIACION 5% 1% MODELO 2 2,91 1,45 1,89 9,55 30,81 ERROR 3 2,3 7,69 TOTAL 5 5,22
VARIABLE GERMINACION DE CONIDIAS
FUENTE DE G.L. S.C. C.M. F.OBSERVADO F. REQUERIDO VARIACION 5% 1%
MODELO 2 4021,83 2010,91 28,81 9,55 30,81 ERROR 3 209,36 69,78 TOTAL 5 4231,19
.f· .-,"-., • •
ANEXO D. Análisis de regresión para las variables dependientes crecimiento micelial, esporulación y germinación de conidias
VARIABLE ECUACION CUADRATICA PARA
DEPENDIENTE EL MODELO DE REGRESION
CRECIMIENTO
MICELlAL y= 69,547 - 3,258X + 0,027)(
ESPORULACIO y= 1804354,84 -123159,52X + 1063,63i
GERMINACION 2
DE CONtDIAS y= 77,823 - 3,518X + O,027X
r = Coeficiente de regresion C.V. = Coeficiente de variación Fc = F calculado
r C.v.
0,822 50,919
0,746 138,99
0,974 21,43
•
Fc
13,13
1,89
28,.!3L
-..j -..j