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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

MECANISMOSDE LA DIVISION

DE CONTROLCELULAR EN

BIOLOGICOMICROALGAS

SONSOLES GONZALEZ GILOctubre 1994MADRID,

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

unu ni ~ ~ ni ini u530953658X*UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

TESIS DOCTORAL

MECANISMOS DE CONTROL BIOLOGICODE LA DIVISION CELULAR EN MICROALGAS

que presenta la Licenciada enBiologa Sonsoles Gonzlez Gilpara optar al grado de Doctor

Madrid, Octubre 1994

Victoria Lpez Rodas, Dra en Veterinaria y Eduardo Costas Costas, Dr enBiologa, ambos Profesores Titulares de Universidad y adscritos alDepartamento de Produccin Animal de la Facultad de Veterinaria de laUniversidad Complutense de Madrid,

CERTIHCAN: Que la Licenciada en Biologa D~Sonsoles Gonzlez Gil ha realizado Bajonuestra direccin el trabajo tituladoMecanismos de control biolgico de ladivisin celular en microalgas, y queel referido trabajo rene lascondiciones necesarias para optar algrado de Doctor,

Madrid, a 25 de Octubre de mil novecientos noventa y cuatro

Los codirectores, de la Tesis

Dra. Victoria Lpez Rodas Dr, Eduardo Costas Costas

ILMO SR. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

INDICE

1.-INTRODUCCION . 11 .1.- Proliferaciones masivas de organismos fitoplanctnicos 11 .2.- Factores ecolgicos 21 .3.- Universalidad de los mecanismos biolgicos que controlan

el ciclo de divisin celular1 .4.- Ciclo celular. Factor Promotor de la Mitosis y p34 cdo2,, 51.5.- Ciclinas 1 01 .6.- Regulacin de la fase 02: activacin del MPF y entrada en

mitosis 111 .7.- Desactivacin del MPF: salida de la mitosis 1 41 .8.- Regulacin de la fase G 1 71.9.- Regulacin en organismos pluricelulares. Factores de

crecimiento 191.10.- Protooncogenes 241.11.- Inhibicin por contacto 281.12.- Formas de resistencia 291.13.- ~Justificacion 341.14.- Objetivos 37

2.- MATERIAL Y METODOS 392.1.- Condiciones generales de los cultivos 40

2.1.1.- Aislamiento y fundacin de clones 402.1.2.- Mantenimiento de los cultivos 412.1.3.- Tasas de reproduccin 42

2.2.- Estimacin del efecto de los Factores de Crecimiento sobreel Ciclo Celular de los diversos organismos 44

2.3.- Estimacin del efecto de los Factores de Crecimiento sobrela germinacin delos quistes de dinoflagelados 46

2.4.- Estimacin del efecto de la inhibicin por contacto sobrelos diversos organismos 48

2.5,- Anlisis estadstico 52

3,- RESULTADOS 53a.i.- Resultados correspondientes al efecto de los Factores de

crecimiento sobre el ciclo celular de los organismos 543.2,-ResultadOs del efecto de los Factores de Crecimiento sobre

la germinacin delos quistes de dinoflagelados 65

3.3.- Resultados correspondientes al efecto de la inhibicin por

contacto sobre los diversos organismos 70

4.- DISCUSION 76

5.- CONCLUSIONES 92

6.- RESUMEN 95

7.- SUMMARY

8.-BIBLIOGRAFA . 100

1149.- APENDICE

INTRODUCCION

1.1- Proliferaciones masivas de organismos fitoplanctnicos

Desde hace tiempo, las proliferaciones masivas o blooms dedeterminados organismos fitoplanctnicos han llamado la atencin porsu apariencia espectacular. En general, son producidas por poblacionesmuy concentradas de determinados organismos, en las que predominanuna o pocas especies,

De entre las proliferaciones ms conocidas, quiz las mareas rojassean unas de las ms estudiadas, no slo por su importancia econmicasi no tambin por el problema sanitario que representan. Las mareasrojas son producidas por poblaciones de determinadas especies dedinoflagelados marinos que suelen dar lugar a que el agua cambie a uncolor rojizo o pardo. Normalmente estas manchas de color se limitan a lacapa superficial y desaparecen en pocos das.

Aunque las mareas rojas no suelen tener otro efecto que el cambiode coloracin del agua, en algunas ocasiones resultan txicas para ciertosorganismos marinos, y a travs de ellos para el hombre, Losdinoflagelados pueden llegar a alcanzar tales concentraciones en el mar(por ejemplo Prorocentrum minimun lleg a alcanzar concentracionesde 1,7. iQ~ clulas -~ en el fiordo de Oslo en 1979 en el transcurso deuna marea roja (Tangen, 1980)) que las consecuencias ecolgicas de lasmareas rojas pueden llegar a ser catastrficas. Entre ellas, cabe destacarel descenso brutal en la concentracin de oxgeno que se producecuando existen semejantes concentraciones de organismos, lo que dalugar indirectamente a mortandades de peces y de otras especiesmarinas. Del mismo modo, a veces se producen obturaciones de lasagallas de los peces debido a la acumulacin de los dinoflagelados, lo quetambin produce la muerte del animal por asfixia (Taylor, 1987).

Sin embargo, quiz el principal problema que causan losdinoflagelados sea su capacidad de producir toxinas, no solamentecuando se encuentran en grandes concentraciones sino incluso enconcentraciones aparentemente normales. Estas toxinas afectanpricipalmente a moluscos filtradores, aunque, en algunos paises, tambin

1

afectan a peces, e indirectamente llegan a afectar al hombre cuandoconsume dichos moluscos, El coste econmico que esto produce, tantoen la acuicultura, la pesca o incluso en el turismo, es tal que ennumerosos paises, incluido Espaa, existen grandes programas demonitoring cuyo fin es el de poder predecir cuando se va producir unamarea roja o cuando van a producirse episodios de toxicidad (Andersenet al., 1993: Fyllingen & Martinussen, 1993; Mario & Maneiro, 1993;Reguera et al,, 1993).

Sin embargo, no slo los dinoflagelados sufren estos incrementosmasivos en su proliferacin celular, sino que otros grupos de organismosunicelulares tambin las sufren, As, cabe destacar el caso de lascianofceas entre aquellos organismos de aguas continentales qUeproducen proliferaciones espectaculares. El grado de paralelismo con elcaso de los dinoflagelados y las mareas rojas es evidente, ya que lascianoficeas, adems de colorear el agua en tonos verde-azulados, tambinprovocan episodios de toxicidad entre los animales y el hombre. Adems,incrementan la cantidad de materia orgnica en las aguas profundas,acabando con el oxigeno disuelto y produciendo una considerablereduccin de la biodiversdad con mortandades masivas de peces.Muchas especies de cianofceas comunican al agua un sabor y olordesagradables impidiendo su consumo, mientras que otras especiesproqucen potentsmas ficotoxinas (del grupo de la saxitoxina al igual quealcaloides neurotxicos) con efectos paralizantes capaces de matar alganado y aves acuticas (o incluso seres humanos) que beben dichasaguas (Charmichael et al., 1990; NRA, 1991).

Tradicionalmente, todos estos procesos en los que intervienencasos anmalos (pero no por ello infrecuentes) de grandes incrementosen las tasas de divisin de determinados organismos, se haninterpretado desde un punto de vista ecolgico como fruto de complejasinteracciones entre mltiples factores,

1.2- Factores ecolgicos

Entre los factores ecolgicos que pueden afectar a los blooms defitoplancton destacan los factores fsicos como la estratificacin de la

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columna de agua, las mareas, los vientos, la luz o la temperatura. As porejemplo, una marea roja solamente se producir si los dinoflageladosencuentran un turbulencia relativamente baja de la masa de agua congran estabilidad del medio (Figueiras, 1989) y temperaturas altas (Perez-Camacho, 1989).

Adems, los factores nutricionales son de gran importancia ya quesolamente en el caso de que existan nutrientes suficientes en el medio,podrn proliferar los organismos. Actualmente, dado el alto grado decontaminacin que existe en el mundo, factores como la acuicultura,aguas residuales urbanas e industriales, la deforestacin, la agricultura yla ganadera contribuyen significativamente a la eutrofizacin de las aguas(tanto marinas como continentales) incrementando, entre otroscontaminantes, el nivel de fosfato de ocanos (Hallegraeff, 1993),acequias, ros, lagos y embalses (Alvarez et al,, 1991). Es tan difcil esteproblema, que incluso especies que normalmente no son txicas(Chrvsochromulina, Nitzschia punaens cf. multiseries o Prvmnesiumparvum) pueden llegar a producir toxicidad bajo regmenes anmalos denutrientes como por ejemplo un deficiencia de fosfatos (Hallegraeff,1993),

1.3- UnIversalidad de los mecanismos biolgicos que controlan elciclo celular

En la actualidad se piensa que los factores biolgicos, propios delorganismo tienen un papel determinante en el control de su propiaproliferacin.

En los ltimos 4 aos se han empezado a elaborar una serie dehiptesis sobre el modo en que todos los organismos, de cualquier nivelevolutivo, controlan su ciclo celular, Esta regulacin est basada en laexistencia de determinados genes, denominados genes cdc (de ciclo dedivisin celular), que hasta el momento se han encontrado en todos losorganismos eucariotas analizados (Nurse, 1990; Cantley et al., 1991;North, 1991: Moreno, 1992; Norbury & Nurse, 1992; Murray, 1993), yque responden a la accin de factores de crecimiento (Goustin et al,,1986). Por este motivo, la hiptesis que se ha desarrollado es que existe

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un mecanismo de control de la divisin celular en todos los organismosde todos los niveles evolutivos, y que este mecanismo es un mecanismouniversal (Nurse, 1990).

Cuando se empezaron a realizar este tipo de estudios ya se conocacon bastante detalle los controles que regulan la divisin celular de lasclulas de mamfero. Un enfoque multidisciplinar muestra que este tipode clulas, aparentemente las ms evolucionadas del reino animal,controlan su crecimiento mediante 4 leyes generales (Lewin, 1987):

1- Dependencia de anclaje: las clulas necesitan una superficieslida o firme a la cual sujetarse.2- Dependencia de suero: el suero es necesario porque suministralos factores de crecimiento esenciales para el crecimiento de laclula.3- Densidad de saturacin o inhibicin por contacto: las clulascrecen unicamente hasta una densidad determinada porque elcrecimiento se inhibe, quiz por procesos en los que mediancontacto clula-clula.4- Envejecimiento celular: aparentemente las clulas estnprogramadas para morir despus de un determinado nmero dedivisiones, que varia de un tipo celular a otro.

Mientras, un enfoque molecular aplicado a cada uno de estosprocesos ha revelado la existencia de genes de ciclo celular cuyosproductos son capaces de hacer progresar ste a lo largo del tiempodependiendo tanto de los nutrientes como de las interacciones que seproducen entre las clulas.

El registro fsil demuestra que hace unos 3500 a 4000 millones deaos existieron seres procariotas. que habitaron la Tierra durante unos2000 millones de aos, y que, evolucionando y diversificndose dieronlugar a una enorme variedad de tipos diferentes. Se puede afirmar queestos procariotas inventaron todas las formas posibles deaprovechamiento de los recursos para su alimentacin, o lo que es lomismo, que todas las rutas bioqumicas fundamentales fueronestablecidas en ese periodo. Los eucariotas ms primitivos aparecieron

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hace unos 1000 millones de aos derivados, en opinin de la mayora delos investigadores, de estos procariotas preexistentes medianteendosimbiosis (Shopf, 1978; Margulis, 1981; Margulis & Sagan, 1985;Knoll, 1992).

El hecho de que se hayan aislado genes del ciclo de divisin celularen todo el reino eucariota, desde las levaduras hasta el hombre, y el quehaya tal grado de homologa entre todos estos genes (Nurse, 1990), nohace ms que apoyar estas hiptesis.

Si todos estos organismos eucariotas tienen mecanismos de controlde la divisin celular semejantes, sera posible que, efectivamente, elcontrol fuese universal y abarcase par tanto a microalgas que tuvieronimportancia en el proceso evolutivo que di lugar a la aparicin de lasprimeras clulas eucariotas? Si esto es as, algas tan primitivas como losdinoflagelados, las clorofceas o las diatomeas se dividiran segn losmismos principios por los que se divide una clula de mamfero.

Cuales son estos principios que regulan el ciclo de divisin celular?

1.4- Ciclo celular. Factor Promotor de la Mitosis y p34cd02

El ciclo celular es el conjunto de reacciones que se desarrollan enese proceso y consta de 2 fases bien diferenciadas: la fase 5 de sntesisde DNA, en la que los cromosomas se duplican; la fase M, de mitosis, enla que los cromosomas duplicados se segregan en los polos opuestos dela clula, y las fases Ql y 02 en las que las clulas preparan lamaquinaria bioqumica necesaria para el inicio de la fase de sntesis deDNA (5) o de mitosis (MI, Al final de la fase M la clula se divide en dosmediante el proceso de citocinesis. As, un ciclo celular completo serepresentara esquematicamente de la siguiente forma: 01 5 02 M(Figura 1).

A pesar de la innumerable diversidad de organismos vivos existentesen el planeta, y de la cantidad de investigadores que centran sus

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estudios en la regulacin del ciclo celular, no ha sido hasta principios de1990 cuando se ha puesto de manifiesto que los mecanismos bsicos decontrol del ciclo celular son practicamente comunes a todas las clulas,ya sean de organismos procariotas o de eucariotas, y que por tanto, sepuede hablar de un control universal del ciclo celular (Nurse, 1990).

Tres de los organismos que ms han contribuido al estudio delcontrol de la divisin celular de organismos eucariotas, han sido la ranaXenopus laevis, la levadura de fisin Schizosaccharomvces pombe y lalevadura de gemacin Saccharomyces cerevisae

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A principios de los aos 70, Masui y Markert (1971), manipulandooocitos de Xenonus, descubrieron que cuando el citoplasma de unaclula en mitosis se microinyectaba en otra clula en cualquiermomento de la interfase (G, S o 02). sta ltima entraba en la fase M.Aparentemente, el citoplasma de la clula en Mitosis contena unasustancia capaz de inducir el proceso divisor en ovocitos inmaduros. Aesta sustancia se le denomin Factor Promotor de la Mitosis o MPFdel ingls M-phase-promoting Factor, Este factor, que no se lograislar hasta el ao 1988 (Lohka et al., 1988), es de importancia universalpara las clulas eucariotas y ha sido altamente conservado durante laevolucin, encontrndose en organismos tan distintos como mamferos,erizos de mar, pollos, almejas. levaduras, etc. Durante cada ciclo celular,la actividad del MPF fluctua, ya que siempre es detectada en Mitosispero nunca en Interfase.

Cuando se logr aislar y purificar este factor MPF, se vi queconstaba principalmente de dos subunidades proteicas de 34 y 45kilodaltons, y que su oscilacin en cuanto a actividad dependafundamentalmente de la sntesis de otras protenas citoplasmticasconocidas como ciclinas.

Paralelamente a estas investigaciones de Biologa Celular, losgenetistas seguan por su cuenta el estudio del ciclo celular. La base desus trabajos eran las levaduras, hongos unicelulares que se reproducencasi tan rapidamente como las bacterias y cuyo genoma puede ser

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menor del 1/100 del de un mamfero, por lo que son muy tiles a lahora de proceder a la identificacin, clonaje y caracterizacin de losgenes involucrados en el control del ciclo celular (Alberts et al., 1992).

Las dos especies utilizadas ms frecuentemente son la levadura degemacin Saccharomvces cerevisae y la levadura de fisinSchizosaccharomvces pombe. Mientras que la primera se divideasimtricamente produciendo una pequea yema que va creciendo a lolargo del ciclo celular, la segunda se divide simetricamente por escisinen dos clulas hijas bastante similares, Los linajes evolutivos quecondujeron a las levaduras de fisin por un lado y a las de gemacin porotro, divergieron hace muchos millones de aos (Pringle & Hartwell,1981; Nurse, 1985), y a pesar de que existen diferencias evidentesrespecto a su ciclo (5. pombe tiene fases 01, 5, G2 y M bien definidasmientras que 5. cerevisae tiene fases Ql. 5 y M pero no una fase 02normal), ambas poseen ciclos similares al de las clulas eucariotassuperiores, con fases 5 y M perfectamente caracterizadas (Moreno,1992).

Gracias a estos dos organismos se empezaron a aislar lo queactualmente se conoce como genes del ciclo celular o genes cdc, genesque participan directamente en el control de la divisin celular,codificando productos (receptores membranales, protenas, etc) queson indispensables en dicho control. Para la identificacin de dichosgenes, fu necesario el estudio de mutantes del ciclo de divisin celular,cuyas mutaciones afectaban especficamente a los componentes quecontrolan el ciclo celular, y en funcin de una temperatura determinada,se bloquean en una parte especfica del mismo, As, la clula no puedeproceder a los pasos siguientes del ciclo.

De entre todos los mutantes analizados, la cepa cdc 2 de 5. nombedestacaba porque se bloqueaba en dos puntos del ciclo celular, primeroen 01, antes del inicio de la fase 5 y luego en 02 antes del inicio de lafase M, Por tanto, la protena codificada por el gen cdc 2 era necesariapara que los dos procesos tuvieran lugar. Adems, esta protena tena unpeso molecular de 34 Kd, Tiempo despus, se la identific como uno de

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los componentes del MPF (Hartwell et al., 1974; Nurse & Bisset, 1981;Reed et al., 1985; Dore, 1990; Lewin, 1990). siendo llamada ~34tdc2.

De la misma manera se han encontrado muchos genes cdc, que sonhomlogos al cdc2 encontrado en 5. pombe. As, en la levadura 5

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cerevisae se ha encontrado el gen CDC 28 con un 63% de homologiarespecto al cdc 2 (Beach et al., 1982), mIentras que en humanos se haencontrado el gen CDC 2 FIs que es capaz de llevar a cabo todas lasfunciones de cdc 2 o CDC 28 en los respectivos organismos en ausenciade sus propios genes (Draetta et al., 1987; Lee & Nurse, 1987). Asmismo, se han encontrado genes homlogos a cdc 2 funcionales enDrosophila melano~aster (Moreno, 1992), en plantas superiores(Hirayama et al., 1991), en algas rojas y pardas (John et al., 1989), enXenouus laevis (Dunphy et al., 1988) y en estrellas de mar (Labbe et al.,1989). Hasta ahora, en todos los organismos eucariotas analizados, yasean animales o plantas. se ha encontrado una protena equivalente acdc 2, lo que parece indicar claramente la presencia universal de estaprotena en todos los organismos eucariotas.

1.5- Cidlinas

En 1989, trabajando con embriones de almejas se descubrieronunas protenas que, a diferencia del resto, se iban acumulando a lo largode la interfase del ciclo celular para destruirse totalmente, al final decada mitosis (Hunt, 19891 y que por esta razn se denominaron ciclinas.Estas protenas, de un peso molecular de 45 kd formaban parte del MPFjunto con la ~34cdc2. Actualmente, los genes de las ciclinas ya han sidodonados en gran cantidad de organismos tan dispares como ranos,moscas, humanos y levaduras (gen cdc 13), por lo que su distribucintambin parece ser universal (Nurse, 1990; Pines & Hunter, 1990).

Hasta el momento se han identificado dos clases de ciclinas, A y B,y, aunque sus funciones no han sido todava claramente definidas, ambasse asocian con la p34 (Hunt, 1991), Sin embargo, al parecer la ciclina Bes la verdaderamente responsable de interaccionar con la p34cdC2 en laMitosis, al menos en levaduras. La funcin de la ciclina A no esttotalmente clara, pero se ha sugerido que tambin forma complejos con

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la p34CdC2 (Norbury & Nurse, 1991). Otro tipo de clasificacinpermitira agrupar a las ciclinas en dos grupos, ciclinas 01 y ciclinas 02,en funcin de si son efectores positivos de la transicin 01/5 o de latransicin 02/M del ciclo celular respectivamente (Surana et al., 1991),Por el momento, las ciclinas 01 slo se han descrito en la levadura S

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cerevisae, asociadas con la p34ODC28, mientras que las ciclinas 02 sehan encontrado practicamente en todos los organismos estudiados, Alparecer, 5. cerevisae es el nico organismo en el que las dos principalestransiciones del ciclo celular (G1/S y G2/M) estn reguladas por dosclases distintas de ciclinas (01 y 02 respectivamente) en asociacin conla misma subunidad cataltica (Surana et al,, 1991),

Sin embargo, la asociacin de las ciclinas 01 con la protena p34 y laconsiguiente activacin de la actividad kinasa, es en muchos aspectosparalela a la activacin de la p34 por ciclinas mitticas (02) (Ohlara etal,, 1991), y ocurre de la misma forma en todos los organismoseucariotas estudiados (Nurse, 1990),

1.6- Regulacin de la fase 02: Activacin del MPF y entrada en laMitosis

As, una molcula de ciclina se asocia a otra molcula de protenapS4CdC2 para formar un dmero, La p34 (o su homloga en su caso) esuna protein kinasa (pk) cuya actividad enzimtica est regulada por lafosforilacin del aminocido tirosina 15: si la pk est fosforilada endicho aminocido, este fosfato impide la unin del ATP a ese sitio por loque la protena es inactiva. Consecuentemente, la desfosforilacin de lap34 hace que sta se active, mediante la estimulacin de su actividadkinasa, permitiendole entonces fosforilar a distintos efectores (Figura2),

Hasta el momento, los organismos mejor estudiados han sido laslevaduras, en especial la de fisin 5, pombe. En ella, lafosforilacin/desfosforlacin del complejo formado por p34cdC2/ciclinaviene regulada por los productos de tres genes: el gen cdc 25 y losgenes wee 1 y mik 1 como activador e inhibidores respectivamente de

1

11

11

Activacin del complejo p34CdC2 ciclina B 1Figural.

-s

4

Pre MPFp34cd02 Kinasa nactiva ~.--- p340d02 Kinasa activa

MPF

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la actividad kinasa (Nurse, 1990; North, 1991; Labib & Nurse, 1993;Murray. 1993).

La protena cdc 25 es una protena que se va acumulando a lo largodel ciclo celular hasta alcanzar una concentracin tal que permite a laclula pasar del punto de inicio o start de la mitosis, punto en el que laclula entra irremediablemente en la fase M, independientemente delas condiciones externas; de esta forma la protena cdc 25 le comunicaal complejo cdc 2/ciclina que la duplicacin de los cromosomas (delDNA) ha terminado, es decir que la fase S ha finalizado (Kumagal &Dunphy, 1991). Recientes trabajos demuestran que la protena cdc 25es una fosfatasa, que al aumentar su concentracin, promueve ladesfosforilacin de la protena cdc 2 en la fase 02 del ciclo celular,, loque activa la actividad klnasa de esta protena y promueve a la celula aentrar en la fase M (Moreno et at., 1990; Krek & Nigg, 1991; Labib &Nurse, 1993; Murray, 1993). El hecho de haberse encontrado geneshomlogos al cdc25 de S. nombe en S. cerevisae, Drosophila y Homosapiens (Russell et al.. 1989: Edgar & OFarrell, 1989; Sadhu et al.,1990 respectivamente) parece confirmar todava ms la universalidadde un control de la entrada en Mitosis para todos los organismoseucariotas.

Por otro lado, los productos de los genes weel y mikl inhiben laentrada en mitosis de la clula al impedir la desfosforilacin de lap340d02. El ms estudiado de los dos es el gen weel, cuya protena esuna protein kinasa que fosforila (es decir inactiva) a la p34 in vitro(Parker et al., 1992).

Con la activacin del complejo cdc2/ciclina se suceden una serie decambios caractersticos de la Mitosis como resultado de la fosforilacinde algunos de los sustratos de dicho complejo: as, la cdc2 fosforila a laslminas A, B y C de la membrana nuclear y a la vimentina, cuyosestados fosforilados permiten que se produzca la rotura de la membrananuclear durante la Mitosis (Norbury & Nurse, 1992). Otro de lossustratos fosforilados es la Histona Hl, que tiene gran importancia en elproceso de condensacin de los cromosomas (Nurse, 1990). Lafosforilacin de otros sustratos como la p60SrC~ la nucleolina, el antgeno

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T SV4O, la RNA polimerasa II y el factor de elongacin Ef-ly son losresponsables respectivamente de la reorganizacin del citoesqueleto, lareorganizacin del nucleolo, la replcacin del DNA y la inhibicin de latranscripcin, todos ellos procesos que se producen al inicio de lamitosis (Morgan et al,, 1989; Moreno, 1992; Norbury & Nurse, 1992).

1.7- Desactivacin del MPF: salida de la Mitosis

Al final de la Mitosis, en la anafase, el complejo cdc2/ciclina seinactiva por lo que los sustratos de este complejo tienen que serdesfosforilados, Hasta hace relativamante poco tiempo no se sabaexactamente cual era el proceso por el cual el complejo p34~dc2/ciclinaera destruido, pero una de las condiciones necesarias para ello pareceser la degradacin de las ciclinas, con la consiguiente destruccin delcomplejo y la inactivacin de la p

34cdC2, que entrar degradada en lasiguiente interfase del prximo ciclo celular (Draetta et al., 1989;Murray & Kirschner, 1989).

En eucariotas, y particularmente en la rana Xenopus laevis, ladegradacin de las ciclinas se lleva a cabo mediante una vadependiente de ubiquitina, de una manera anloga a cmo se degradanmuchas de las protenas celulares (Luca, 1993). En este proceso,muchas copias de una molcula conocida como ubiquitina se unencovalentemente a restos de lisina de la protena diana que va a serdestruida, de manera que slo aquellas protenas que estnmultiubiquitinizadas sern posteriormente degradadas por una proteasa.Durante el ciclo de degradacin de las ciclinas de Xenonus se hanobservado complejos multiubiquitinadOs de ciclinas, que siguen unacintica muy parecida a la de las ciclinas, acumulndose a lo largo delciclo celular para desaparecer al final de la Mitosis.

Pero quiz lo ms llamativo no sea este hecho, sino el que ciclinasprocedentes de muy diversos organismos muestren una degradacindependiente de ciclo celular en extractos de Xenotus (Glotzer et al..1991), lo que sugiere que debe existir una estructura mnima esencialque confiera a las ciclinas de todos los organismos la propiedad de serdegradadas va ubiquitina.

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Cuando se compararon los ltimos 90 aminocidos del extremo N-terminal de 13 ciclinas procedentes de 8 especies diferentes se observque exista solamente un 10-20% de conservacin de la secuencia. Sinembargo, en todas las ciclinas analizadas se encontr una regin de 9aminocidos conocida como destruction box que era reconocida comoseal por el sistema conjugador de la ubiquitina, y que contena 4aminocidos altamente conservados. Adems, exista otra regin, nadaconservada entre las ciclinas, que contena una alta proporcin deLisinas (~ 17%) que sirve de sitio de unin a la ubiquitina.

* ** * *

En resumen, el control ejercido sobre el ciclo celular garantiza quetodos los procesos que se dan en l ocurran de una manera correcta ypuntual. Por ejemplo, la Mitosis no puede comenzar hasta que la clulaha crecido lo suficiente y la replicacin de su genoma haya tenido lugar.Adems, la divisin celular no puede ocurrir hasta que el huso mitticohaya distribuido los cromosomas entre las clulas hijas. La ordenacincorrecta de todos estos procesos se produce a travs del MPF que es elcomplejo formado por la ~34cdc2y las ciclinas.

La activacin del MPF al inicio de la Mitosis aparece como resultadode una extensa interaccin entre molculas estimuladoras (como lapsOcdc2b) e inhibidoras (como pweel y pmikl), que adems se debeconjugar con los sistemas celulares que verifican que procesosbioqumicos como el crecimiento celular, la duplicacin del centriolo yla replicacin del DNA han tenido lugar correcta y previamente a laentrada en Mitosis (Hartwell & Weinert, 1989). Una vez que el MPF (olo que es lo mismo, la p34cdc2) es activado, la clula entra en Mitosis, loque conleva a una serie de procesos como la condensacin decromosomas, la reorganizacin del citoesqueleto, la rotura de lamembrana nuclear y cambios en la morfologa celular, que nonecesariamente se dan en todos los eucariotas (Nurse. 1990).Finalmente, el MPF activado hace que se activen determinados enzimasque provocan la unin de la ubiquitina a las molculas de ciclina delMPF, lo que activa la degradacin de las ciclinas y la consiguiente

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inactivacin del MPF, induciendo a que el ciclo celular entre en lasiguiente interfase, es decir que salga de la Mitosis (Figura 3).

Al mismo tiempo, todos estos hechos promueven que tenga lugar lasegregacin de los cromosomas, su descondensacin, la formacin de lamembrana nuclear y por ltimo, la citocinesis, aunque, al igual que en laMitosis, no todos ellos tienen lugar en todos los eucariotas.

1.8- Regulacin de la fase Ql

Los ritmos de crecimiento de organismos sencillos de vida librecomo las levaduras, dependen principalmente del apode de nutrientes.Bajo condiciones de privacin nutricional, las clulas hijas producidasen ciclos rpidos de divisin celular seran tremendamente pequeas,debido a lo cual las clulas necesitan un mecanismo que les permitacontrolar el ritmo del progreso del ciclo de divisin (especialmente elcromosmico) de acuerdo con el ritmo de crecimiento celular. En laslevaduras, as como en la mayor parte de los organismos eucariotas, lasduraciones de las fases 8 (sntesis de DNA) y M (mitosis) permanecenrelativamente constantes, independientemente de que las condicionesexternas sean favorables o no, En cambio, la fase 01 suele ser la que seprolonga cuando las clulas sufren condiciones adversas, por lo quedebe existir un punto crtico en la fase 01 en el que la clula puedadetenerse si el ambiente no es favorable al crecimiento (Norbury &Nurse, 1992).

Este punto se conoce normalmente como punto de restriccin R sinos referimos a clulas de mamfero, o punto de Inicio o Start si nosreferimos al resto de las clulas eucariotas. Se ha postulado. ypracticamente, aceptado la existencia de un factor promotor de la fasede sntesis, que actuara en el intervalo 01/5, concretamente en elpunto de restriccin (Norbury & Nurse, 1992), Tanto en levaduras comoen fibroblastos de mamfero, para que se pueda pasar del punto derestriccin es necesaria la presencia de la p340d02 (o su homloga), perocual es su funcin exacta permanece todava sin describir.

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ut

Una vez superado este punto de restriccin, la clula contina elresto de las fases de su ciclo celular independientemente del ambienteexterno, Sin embargo, si la clula no ha podido pasar del punto Rpermanece en estado quiescente o en fase Go, como as se hadenominado al estado de la fase 01 en el que las clulas permanecen ala espera de que su ambiente mejore. El tiempo que las clulaspermanecen en el estado Go depende del tipo celular de que se trate,pudiendo variar desde minutos hasta incluso aos. En el hombre, porejemplo, las neuronas o eritrocitos no se dividen nunca despus dehaber alcanzado la madurez. Sin embargo, las clulas epiteliales sedividen de forma continua y rpida a lo largo de toda la vida delorganismo, completando su ciclo celular en 8 horas.

Sin embargo. las condiciones que se han de cumplir antes de queuna clula crezca y se dMda son considerablemente ms complejas parauna clula animal que para una levadura. En OrganismOs unicelularescomo las levaduras, protozoos y bacterias, existe una fuerte presinselectiva sobre cada clula individual para que crezca y se divida tanrapidamente como sea posible. De ello depende la supervivencia de la

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especie o de la cepa. Por esta razn, el ritmo de divisin celular de estetipo de organismos slo est limitado por el ritmo con que la clulapuede tomar los nutrientes del medio y transformarlos en materialcelular,

Por el contrario, las clulas de un organismo pluricelular formanparte de un complicado conjunto celular, donde lo importante no es lasupervivencia de unas pocas clulas sino la de todo el organismo. Por lotanto existen complejos controles de la divisin celularconsiderablemente ms complejos que los que actan en un organismosimple como la levadura, aunque sus principios bsicos sean los mismos.

1.9- Regulacin en organismos pluricelulares: factores decrecimiento

El cultivo de clulas en el laboratorio nos ha permitido conocercmo se produce la divisin celular dentro de un orgnanismopluricelular. As, si a unas clulas de vertebrado mantenidas en uncultivo artificial se les elimina completamente el suero del medio, nopasarn del punto de restriccin R y permanecern en el estado Go,aunque tengan en el medio todos los nutrientes necesarios para sucrecimiento y divisin. Los componentes esenciales del suero sonpequeos pptidos llamados factores de crecimiento, que estimulan ladivisin celular mediante la activacin de la transcripcin dedeterminados genes. As, cuando a clulas en cultivo que permanecenen un estado quiescente Go se les aade en el medio suero o algnfactor de crecimiento especifico, la estimulacin de la divisin celularhace que estas clulas salgan de la fase Go y terminen el resto de suciclo celular (Cross & Dexter, 1991).

Los factores de crecimiento conocidos hasta el momento tienen tresmodos distintos de actuacin:

- Pueden actuar de forma autocrina, mecanismo en el que losfactores de crecimiento sintetizados por una clula actansobre la misma clula. Un ejemplo es el factor de crecimientotransformante (TOP).

1

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- Pueden actuar de forma paracrina, en la que los factores decrecimiento secretados por una clula actan sobre clulasvecinas. Como ejemplo tenemos a los factores peptidicos,como el epidrmico (EGF), y derivado de plaquetas (PDGF).- Pueden ser endocrinos, actuando sobre clulas lejanas yviajando hacia ellas mediante la corriente circulante. Elejemplo ms caracteristico son las hormonas.

Las clulas que responden a la accin de factores de crecimientotienen en su membrana receptores especficos para dichos factores; lagran variedad de estos factores y de sus receptores, junto con susinteracciones con clulas y tejidos, proporcionan un equilibrio para quese verifique de forma coordinada la proliferacin celular durante eldesarrollo. A menudo, la mayora de los tipos celulares necesitan variosfactores de crecimiento para conseguir una respuesta proliferativamxima, y no slo uno en particular, debido sobre todo a que losestmulos mitognicos actuan en diferentes estadios del ciclo celular(James, 1984). SIn embargo, un nmero bastante pequeo de factoresde crecimiento (aproximadamente 30), en sus distintas combinaciones,es el que regula selectivamente la proliferacin de cada uno de losmuchos tipos celulares de un organismo superior (Alberts et al., 1992),

El componente mayoritario del suero es el factor de crecimientoderivado de plaquetas (PDGF), llamado as por ser liberado por lasplaquetas en un proceso de cicatrizacin, estimulando a las clulasconjuntivas a dividirse y paliando as el dao producido. La unin delPDGF y en general de cualquier factor de crecimiento a su receptorespecfico en la clula diana, desencadena una cascada de seales atravs del citoplasma, que puede alcanzar el ncleo y alterar laexpresin gnica.

En particular, la unin del PDGF, el EGF, la insulina y algunaslinfoquinas a sus receptores da lugar a la activacin del dominio tirosn-kinasa presente en la porcin citoplasmtica de sus receptoresrespectivos (Hunter & Cooper, 1985). En el caso del receptor del PDGF,uno de los sustratos que es fosforilado (y en consecuencia activado) porla actividad kinasa es otra protein kinasa que fosforila a un fosfolpido

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presente en la membrana de la clula diana: el fosfatdl inositol (PI), Losfosfolipidos de inositol mas importantes de la membrana son dosderivados (por fosforilaciones sucesivas) del PI: el PI-fosfato (PIP) y elPI-bifosihto (PIP2), localizados ambos en la cara interna de la membranaplasmtica. Sin embargo, parece que es la hidrlisis del HP2 la que esrealmente importante en el proceso de sealizacin (Alberts et al,,1992) (Figura 4).

La hidrlisis del PIP2 se produce mediante la accin enzinitica deuna fosfodiesterasa, la Fosfolipasa O. Los detalles del proceso deactivacin no son bien conocidos pero existen evidencias de que unreceptor de membrana activado activa a una protena O (denominadaGp). la cual a su vez activa a la fosfolipasa O (Cascales, 1989; Alberts etal,, 1992). De esta manera, el PIP2 es escindido en dos compuestos, el1,4,5 trifosfato inositol (IP3) y el diacilgilcerol (DAG), que actan comosegundos mens~jeros responsables de la transduccin de seales quetendr lugar a continuacin desde la superficie celular hasta el ncleo.

El IP3 es una molcula hidrosoluble que se difunde en el citoplasmay que moviliza los reservorios intracelulares de calcio (como el retculoendoplasmatico), haciendo que se eleve la concentracin de calciocitoplasmtica. El calcio no slo es un elemento imprescindible para laviabilidad celular, si no que la progresin a travs del ciclo de divisincelular (01 y Mitosis) es muy sensible a las concentracionesintracelulares de calcio, La calmodulina, el principal receptor del calcioen clulas cucariotas (excepto en las musculares), hace que se produzcauna aceleracin del ciclo celular (por acortamiento de la fase 01) conuna simple elevacin de su concentracin intracelular. Adems, enclulas de raton, se ha comprobado que a concentracin de calinodulinase duplica abruptamente en el lmite 01/5, lo que coincide con lainiciacin dc la sntesis del DNA (Rasmunsen & Means, 1989). SInembargo, este aumento de calcio es transitorio, ya que el calcio esrapidamente bombeado hacia el exterior de la clula y porque el 1P3 sedesfosforila (se inactiva) rapidamente.

Por su parte, el DAG es una molcula hidrofbica que permanecepor tanto cerca de la membrana plasmtica1 Su funcin principal es la

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de activar a la protein kinasa O (pk O), que es dependiente de calcio yque a la vez provocar importantes cambios en el citoplasma celular: enprimer lugar, es la responsable de la modificacin de la actividad devarias protenas diana, mediante la fosforilacin de residuos de serma otreonina especficos. En segundo lugar, la pk O activa por fosforilacin alintercambiador membranal de protones Na+H+, que har que suba elpH intracelular, lo que en muchas clulas ya es una seal por s solainductora de proliferacin (Pouyssegur et al., 1986). Las pruebas msconvincentes sobre el efecto del incremento del pH intracelular en ladivisin celular, son las producidas en fibroblastos mutantes de ratn,donde solamente un incremento de 0,2 unidades de pH sobre el pHnormal de la clula, lleva a una activacin de la sntesis proteica (Bravo& Mc Donald-Bravo, 1986), En otros eucariotas como protozoos ylevaduras tambin se han observado cambios de pH intracelular duranteel ciclo celular: durante el ciclo de Dictvostelium el pH oscila deacuerdo con el ciclo de replicacin del DNA, en un rango de 0,1-0,3unidades de pH debido a la salida de H~ a travs del intercambiadorNa~/}-l4 (Cascales, 1989). Y en tercer y ltimo lugar, la protein kiinasa Oincrementa la transcripcin de determinados genes conocidos comogenes tardos, entre los que se encuentran algunos protooncogenescomo c-fos, que codifica para un factor de transcripcin (Curran &Franza, 1988), c-myc, cuyo producto se requiere en la replicacin delDNA (l-Ieikkle et al., 1987) y c-jun, cuyo producto es otro factor detranscripcin (Disa et al,, 1989),

A partir de aqu se inicia una secuencia de acontecimientos queculminar en la sntesis de DNA y en la divisin celular.

Cuando las clulas crecen en un medio ambiente controlado, ladivisin celular puede acelerarse, retardarse o detenerse. Existenmuchos sistemas para acelerar la divisin celular e incluso paramimetizar alguno de los procesos moleculares que ocurren en un ciclocelular, A este respecto, cada una de las dos ramas del proceso desealizacin mediante fosfolpidos de membrana puede ser provocadopor agentes artificiales. As, los efectos del IP

3 pueden ser mimetizados

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aaeeeeaeee

ti!.Ec~w

0=

0

az=

o0=0=0=0=0=0=0= itt1

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utilizando un lonforo de calcio o la lonomicina, los cuales permiten queel calcio entre en el citoplasma celular desde el exterior de las clulas.Por su parte, los efectos del DAG se mimetizan bien por derivadosmonoacilados del DAG o bien por steres de forbol, productos vegetalesque entran en la celula por difusin y se unen a la protein kinasa Cactivandola directamente. Curiosamente, estos steres de forbol sonutilizados muy frecuentemente en estudios in vitro relacionados conla Biologa del Cancer, al ser sustancias conocidas como promotorestumorales que causan cancer con una frecuencia bastante alta si seaplican despus de un tratamiento con carcingenos (Lamph et al.,1988).

Sin embargo, y aunque nos liemos centrado en un solo tipo demecanismo transductor de seales que comparten muchos factores decrecimiento, existen muchas vas de sealizacin a travs de lamembrana, Una de ellas es el sistema J3-adrenrgico, en el que laocupacin del receptor por el agonista produce la activacin del enzimade membrana Adenilato Ciclasa, lo que produce a su vez un incrementointracelular de AMPc.

El hecho de que los distintos factores de crecimiento no acten porel mismo mecanismo sugiere que deben existir diferentes vas detransduccin de seales a travs de la membrana, aunque no todas ellaslan sido por el momento clarificadas (Alberts et al,, 1992). Laimportancia de estas vas y sus mecanismos est reforzada por losrecientes hallazgos que hacen suponer que ciertos protooncogenescodifican protenas que participan en la transduccin de seales(Berridge, 1987),

1.10- Protooncogenes

En los procesos fisiolgicos normales proliferativos como laernbriogness, la cicatrizacin, la regeneracin tisular o la respuestainmune, la divisin celular est regulada por factores de crecimiento ypor genes y productos gncos que responden a dichos factores decrecimiento (Baserga et al,, 1986; Goustin et al,, 1986; Cantley et al.,1991; North, 1991). As, toda alteracin de la estructura de estas

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molculas o de su concentracin originar diferentes patologas. Porejemplo el enanismo y la diabetes son debidas respectivamente a unafalta de hormona de crecimiento o de insulina. Lo mismo ocurre concualquier modificacin del nmero, de la funcin o de la afinidad de losreceptores membranales: el pseudoparahipotiroidismo, enfermedad quese caracteriza por una cada del calcio plasmtico que originaconvulsiones y tetanias es debida a un fallo de las protenas O deacoplamiento. Lo mismo ocurre en enfermedades autoinmunes como lamyasthenia gravis, parlisis muscular que se produce por la fabricacinpor parte del enfermo de anticuerpos antireceptores de la acetil colina,por lo que la contraccin muscular estar inhibida.

Una caracterstica principal de todos los eucariotas superiores es laduracin definida de la vida de cada organismo, una propiedad que seextiende a las clulas somticas individuales, cuyo crecimiento ydivisin est altamente regulado. Una excepcin la constituyen lasclulas cancerosas que se originan como variantes que han perdido sucontrol de divisin normal. Existen numerosos agentes que conviertenlas clulas normales en clulas transformadas y se usan corno sistemasmodelo para el estudio de los procesos Implicados en el cncer,Numerosos descubrimientos realizados en estos ltimos aosproporcionan una visin inesperada sobre la naturaleza del cncer, ypermiten un mejor conocimiento del proceso. Durante aos losinvestigadores se han preguntado qu es lo que hace que las clulascancerosas se diferencien de las normales: la respuesta a este enigma anivel molecular se ha podido obtener recientemente a partir deresultados procedentes de campos biolgicos muy diversos. Losprogresos realizados en todos los campos de la biologa, desde lasmanipulaciones genticas hasta los anticuerpos monoclonales, permitenabordar la exploracin de como funcionan los genes en una clula de unorganismo superior.

En general, se puede decir que la produccin anormal de losfactores de crecimiento, de sus receptores celulares o de susmediadores intracelulares puede conducir a estados patolgicos entrelos que se incluye el cancer, en los cuales los mecanismos quegobiernan la proliferacin celular estn alterados, De esta forma,

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cualquier gen que codifique para un factor de crecimiento, para unreceptor de membrana o para una protena reguladora de latranscripcin puede ser considerado un protooncogen (Egan &Weinberg, 1993).

As, las clulas transformadas carecen de las restricciones y loscontroles que rigen el crecimiento de las clulas normales, En estesentido, estas clulas crecen ms rapidamente que las normales al nodepender de suero ni de factores de crecimiento para crecer, hanperdido su capacidad de crecer en monocapa sin necesidad de unasuperficie solida a la cual adherirse, e incluso no tienen fenmenos deinhibicin por contacto clula-clula. Adems, las clulas transformadasson inmortales y no alcanzan la senescencia cuando estn en cultivo(Alberts et al., 1992).

Hasta ahora se han identificado ms de 50 protooncogenes y todoslos estudios apuntan a que la mayora de ellos son genes que participanen el control de la divisin celular de cualquier clula normal, As, laindependencia de factores de crecimiento por parte de las clulascancerosas o su capacidad de crecimiento ilimitado obedecera aalteraciones en cualquiera de los componentes del sistema deinternalzacin de las seales transmitidas por factores de crecimiento:el propio factor de crecimiento, su receptor especfico o su sistema detransmisin intracelular hasta el lugar de accin, entre los que seincluyen protenas 0, protein kinasas o protenas reguladoras de laactividad gnica localizadas en el ncleo,

Una caracterstica sorprendente de este grupo de genes es que hanconservado su secuenca de nucletidos practicamente invariabledurante millones de aos, y as por ejemplo el oncogen c-myc presentauna homologa de ms del 95% en varias de sus regiones entre laestrella de mar Astera vukaris y el hombre (Walker et al., 1992), a lavez que se han detectado protenas anlogas a las del oncogen c-myc eneucariotas primitivos y en praxlnophyceas (Costas et al,, in press a).

Lo mismo ocurre con la protena codificada por el oncogen c-src,p6OSrc, que durante muchos aos se consider caracterstica de clulas

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de vertebrado, pero que recientemente se ha encontrado en DrosoDhila(Hunter, 1984). La protena p6OSrC es una protein kinasa de lamembrana plasmtica que fosforila residuos de tirosina en gran cantidadde protenas diana, entre las que se incluye el receptor de lafibronectina, que cuando se encuentra fosforilado pierde la afinidad pordicha protena dando lugar a un debilitamiento general de lasadhesiones celulares y haciendo que, en ltimo trmino, la clula seredondee (Hirst et aL, 1986). Este hecho es una de las caractersticasque adquiere una clula cuando es transformada: no necesita unasuperficie a la que adherirse, su forma es redondeada y ha perdido sudependencia de anclaje.

Otro ejemplo significativo de protooncogenes conservados a lo largode la evolucin es el de la familia de los genes ras. Estos protooncogenesestn relacionados con protoencogenes que codifican receptoresmembranales produciendo protenas que se unen e hidrolizan GTP,indicando una estrecha relacin con las protenas O que participan enmuchos de los procesos transductores de seales (Cascales, 1989). As,los genes ras mutantes estn asociados con grandes incrementos de IPay DAG, de manera que hacen a la clula hipersensible a diversos factoresde crecimiento como el PDGF. En un principio estos genes seidentificaron en mamferos como parte de una gran familia de genes (N-K- y H-ras) que codificaban protenas de 21 Kd localizadas en la caracitoplasmtica de la membrana celular, pero recientemente se hacaracterizado en Xenopus un c-DNA de K-ras cuya secuencia espracticamente homloga a su correspondiente de mamfero (Andeol etal., 1992), mientras que en la levadura de gemacin S. cerevisae se hanencontrado genes homlogos a ras que participan en el control del ciclode divisin celular de acuerdo con el aporte de nutrientes en el medio(Barbacid, 1987), As mismo, en la levadura de fisin 5. pombe existengenes homlogos a ras cuyos productos controlan la meiosis, laesporulacin y el tamao celular (Egan & Weinberg, 1993), mientrasque en D. melanogaster los genes ras controlan el desarrollo del ojocompuesto (Perrimon, 1993),

En el DNA de levaduras, anfibios, gallinas, insectos y mamferos sehan encontrado secuencias similares a los protooncogenes que se

.1

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encuentran en humanos. Esto quiere decir que los antecesores de losprotooncogenes humanos deban haber evolucionado ya hace unos 800millones de aos, cuando viva el antecesor comn de seres humanos ylevaduras, ya que si los protooncogenes no desempeasen un papel tanvital en la supervivencia celular normal, no se habran conservado en elgenoma (Knoll, 1992),

Quiz, la conclusin ms general que podemos extraer sea que latransformacin de clulas normales en cancerosas se efecta bajo ladireccin de genes cuya funcin normal es contribuir al crecimiento ydivisin de las clulas. En realidad cualquier gen implicado directa oindirectamente en el control del crecimiento y divisin celular puedeser considerado un protooncogen.

El esclarecimiento de todos los mecanismos que controlan laproliferacin celular normal junto con la regulacin de dichosmecanismos durante procesos de diferenciacin y desarrollo deorganismos superiores es uno de los mayores desafos de lainvestigacin bsica sobre el cncer, Sin embargo no es facil afrontar elproblema en dichos organismos, por lo que se hace necesario el empleode sistemas modelo que tengan las propiedades de las clulassuperiores pero cuyo manejo sea mas sencillo. As, la deteccin1aislamiento y caracterizacin de los productos de los propiosprotooncogenes o de los genes del ciclo de divisin celular en dichossistemas modelo sea un objetivo prioritario. En este sentido es desuponer que cuanto ms esencial sea la funcin de estos componentescelulares mejor se habrn conservado durante la evolucin. Por todosestos motivos, organismos como 5. cerevisae, Neurosuora crassa

,

Dictvostelium discoideum o D. melano~ater estn contribuyendo yaenormemente al entendimiento de los secretos del cancer y de losmecanismos reguladores de la divisin celular en los organismossuperiores.

1.11- InhibicIn por contacto

La inhibicin por contacto es un fenmeno tradicionalmenteasociado a clulas animales como un mecanismo que utilizaran para

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controlar su divisin celular, Este mecanismo se observa facilmente enclulas que estn mantenidas con suero en placas de cultivo delaboratorio, Estas clulas, normalmente fibroblastos o clulas epiteliales,empiezan a crecer hasta que entran en contacto unas con otras,momento en el que han formado una monocapa en toda la placa. Eneste instante, las clulas paran su crecimiento, pero si se abre unaherida en la monocapa, es decir se crea una zona libre de clulas, lasclulas que estn situadas en los bordes de la herida empiezan a crecernuevamente hasta que las clulas vecinas se toquen de nuevo unas conotras, Este tipo de fenmeno se conoce normalmente con el nombre deinhibicin por contacto o inhibicin de la divisin celular dependientede densidad, y est afectado por muchos factores biolgicos entre losque se incluyen la competencia por factores de crecimiento o cambiosen la forma relacionados con los contactos intercelulares (Figura 5)(Alberts et al,, 1992),

El crecimiento de algunos eucariotas unicelulares como lasmicroalgas sugiere un fenmeno parecido y as, si se deposita un inculode una microalga en un medio de cultivo apropiado bajo condicionesambientales idneas, el inculo crece de forma exponencial durantevarios das hasta que alcanza la saturacin (Brand et al., 1981),Tradicionalmente, se interpreta esta saturacin como consecuencia delagotamiento de los nutrientes del cultivo o del acmulo de metabolitosde deshecho,

Sin embargo, es probable que dicho proceso de saturacin sea unproceso ms complejo de lo que aparentemente representa a simplevista, en el que adems de estos factores densodependientes influyanotros mecanismos de control biolgico como la inhibicin por contactoo la competencia por factores de crecimiento,

1.12- Formas de resistencia

Gran cantidad de microalgas producen formas de resistencia oquistes como un mecanismo de defensa frente a determinadascondiciones adversas, De esta manera pueden aguantar grandes perodos A

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FIgura 5Inhibicin por contacto ~

Capa confluente declulas formada denuevo por divisin 1celular

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de tiempo en condiciones en las que la clula vegetativa no podrasobrevivir. Cuando estas condiciones ambientales mejoran y sonfavorables, los quistes de resistencia germinan dando de nuevo lugar aclulas vegetativas.

En el caso de los dinoflagelados los quistes de resistencia puedenpermanecer en el sedimento marino por perodos superiores a 15 aos(Blanco, 1989) y conservarse en estado perfectamente viable,

El ciclo de vida de los dinoflagelados es un ciclo caracterstico en elque las fases diploides alternan con las haploides (Figura 6). En el casopanicular de los dinoflagelados planctnicos, la fase vegetativa, de vidalibre, es haploide y se reproduce asexualmente por una simple divisin,Solamente en determinadas condiciones ambientales la fase vegetativase reproduce sexualmente dando lugar a un zigoto diploide oplanozigoto. Estos zigotos pueden continuar su vida en el plancton hastaque sufren una meiosis para volver a dar clulas haploides vegetativas yplanctnicas (Dale, 1983).

En algunas ocasiones, especialmente cuando las condicionesambientales no son favorables, los zigotos pueden formar una cubierta deresistencia dando lugar a lo que se conoce como quiste de resistencia ohipnozigoto. Este quiste es extraordinariamente resistente acondiciones adversas como la desecacin, condiciones reductoras en elsedimento o tratamiento con algunos cidos, y puede permanecer viableaunque sin germinar durante periodos superiores a 15 aos (Blanco.1989), La posterior germinacin de estos quistes dara de nuevo lugar ala fase de vida libre,

Gran nmero de autores han postulado sobre el posible papel de losquistes de resistencia en la vida de los dinoflagelados, En general yfundamentalmente, son un mecanismo de supervivencia de las especiesque los producen frente a pocas claramente desfavorables, De estaforma, los quistes que pasan al sedimento pueden servir de inculoapoblaciones que se desarrollen en aos posteriores en la misma zona,Adems, en el caso de que la poblacin de clulas vegetativas de vida

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Ciclo de vida de los dinoflagelados .10

A

2n

nS,Ot,eresistencia N~

Germinacin6

Ergura E

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libre desaparezca, seda una reserva de clulas que evitarla el problemade la desaparicin de dicha especie (Blanco, 1989).

En segundo lugar, los quistes permiten ampliar el rea dedistribucin de la especie por medio de su dispersin. El hecho de quesean tan resistentes permite que puedan ser transportados de unaforma viable de una zona a otra en la que se pueda desarrollar la fasemvil, De hecho, esta hiptesis ha sido sugerida recientemente comouna de las posibles explicaciones a la aparicin de especies productorasde mareas rojas en zonas donde no haban aparecido nunca (Anderson etal., 1982; Ellegaard et al., 1993; Gosselin et al., 1993; Anderson, 1994).La resistencia de estos quistes es tan grande, que Incluso se ha llegado asugerir que el transporte de grandes masas de agua por el lastre de losbarcos mercantes, conteniendo quistes de dinoflagelados txicos (hastams de 300 millones de quistes en un slo tanque), hara de inculoinicial de una poblacin en lugares extraordinariamente alejados de lazona original de dicha poblacin (Anderson, 1994),

En tercer lugar, los quistes pueden ser un mecanismo de defensacontra la predacin (Dale, 1983) dada la resistencia que tienen susparedes y la tendencia de los quistes a depositarse en el sedimento,

Y en cuarto y ltimo lugar, aunque no por ello menos importante, losquistes de resistencia y su posibilidad de actuar bajo condicionesfavorables como un inculo inicial de la columna de agua, son una de lashiptesis sobre la formacin y el origen de las mareas rojas (Steidinger,1975; Anderson & Wall, 1978; Blanco, 1989; Estrada, 1989; Rigby etal,, 1993).

Una vez que las condiciones ambientales mejoran, estos quistes deresistencia pueden germinar para dar de nuevo lugar a la fase vegetativahaploide. La germinacin de los quistes de dinoflagelados es unfenmeno que ha sido ampliamente estudiado, y que, tradicionalmentese acepta como el resultado de una compleja interaccin entre diversosfactores ambientales como la duracin del da, la intensidad de la luz, latemperatura y la cantidad de nutrientes y oxgeno (Anderson, 1980).Pero la regulacin de la germinacin todava es un problema que no se

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ha llegado a resolver, ya que despus de su formacin los quistes entranen un periodo de quiescencia en el cual, aunque las condicionesambientales sean idneas, no se produce la germinacin (Pfiester &Anderson, 1988). Se ha propuesto que, en una alternativa a losmecanismos ambientales, existen mecanismos biolgicos que regularanesta germinacin y as se han sugerido diversos mecanismos basados enla existencia de relojes endgenos (Anderson & Keafer, 1987; Costas &Varela, 1989).

1.13- Justificacin

Tradicionalmente se asume que todos estos mecanismos soncaractersticos de los organismos pluricelulares. Sin embargo, trabajosrecientes hacen suponer que los mecanismos de control de la divisincelular y los fenmenos de inhibicin por contacto y de envejecimientopueden ser universales, quiz como consecuencia de su origen evolutivoen una fecha muy temprana, y que afectaran por tanto a todo tipo declulas eucariotas (Nurse, 1990; North, 1991).

La comprensin de los procesos implicados en el control de ladivisin celular en los organismos pluricelulares resulta ms dificildebido a la complejidad que en ellos alcanzaron dichas vas, Sinembargo, esta universalidad de los mecanismos de control del ciclo dedivisin celular puede abordarse utilizando determinados phyla deorganismos unicelulares, que, aparentemente. jugaron un papeldestacado en la aparicin y diversificacin de las clulas eucariotas.Estudiar dichos procesos en eucariotas ms sencillos debido a su mayorsimplicidad, puede permitir una visin global e integradora delfenmeno de la divisin celular y de los controles ejercidos sobre ella,as como una mejor comprensin de los procesos individuales quetoman parte en ella. Adems, si se enfocan con una perspectivaevolutiva, podran proporcionar una valiosa informacin paracomprender cmo se originaron estos mecanismos, y cmo sediversificaron hasta alcanzar la complejidad que tienen en los eucariotassuperiores de hoy en da,

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A pesar de que los estudios relativos a la regulacin del ciclo celularse han realizado en una gran variedad de organismos, que abarcan desdeeucariotas muy primitivos como levaduras hasta los ms evolucionadoscomo el hombre, este tipo de estudios no se ha realizado en microalgas,que sin embargo tuvieron gran importancia en el proceso evolutivo quedi lugar a la aparicin de las primeras clulas eucariotas,

As, intentaremos estudiar todos estos controles de la divisincelular, aparentemente caractersticos de clulas evolucionadas, enorganismos primitivos que tuvieron cierta importancia en la aparicin ydiversificacin de las clulas eucarotas.

En primer lugar dedicaremos un especial inters a losdinoflagelados por sus peculiares caractersticas. Los dinoflagelados hansido considerados como los organismos de transicin entre procariotasy eucariotas, acundose para ellos el trmino de mesocariotas (Dodge,1965), Tambin han sido considerados como los eucariotas msprimitivos (Bujak & Williams, 1981). Ms recientemente han sidoconsiderados como una lnea hermana de los actuales eucariotas,filogenticarnente paralelos a ellos, pero no sus antecesores evolutivos(Loeblich, 1976; Bujak & Williams, 1981; Herzog et al,, 1984). Losdinoflagelados surgieron hace unos 800 millones de aos. En estetrabajo utilizaremos dinoflagelados primitivos como los prorocentralesProrocentrum lima (Ehrenberg) Dodge y Prorocentrum triestinumSchller, as como dinocontas ms evolucionados como Alexandriumtamarense (Halim) y & anriu xcay~ta Balech.

Estudiaremos adems representantes de dos grupos de verdaderoseucariotas, supuestamente primitivos: el gamofito Sniro~vra insWnis(Hasal) Kutz y la praxinoficea Tetraselmis suecica Stein, Adems,trabajaremos con uno de los grupos eucariotas de reciente aparicin: labacillaroficea Phaeodactvlum tricornutum (Bohlin).

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Los gamofitos son algas verdes, de clulas simtricas y concloroplastos alineados normalmente a lo largo del eje longitudinal de laclula, Todos ellos son de agua dulce, encontrndose habitualmente enaguas de estanques, lagos y ros, Tradicionalmente, los gamofitos seclasificaban dentro del grupo de los clorfitos, siendo considerados unode los antecesores evolutivos de las plantas superiores, pero en la :1actualidad se les agrupa aparte (Margulis & Schwartz, 1985).Aparecieron hace 300 millones de aos.

1s

Por su parte, las praxinofceas se consideran parte de los clorfitos,que constituyen uno de los principales componentes del fitoplancton,estimndose que fijan ms de 1000 millones de toneladas de carbono alao en los oceanos y mares de agua continental, Aparecieron haceaproximadamente 1000 millones de aos, siendo consideradas las algasverdes ms primitivas (Margulis & Schwartz, 1985).

En tercer lugar, las diatomeas se encuentran ampliamentedistribuidas en las zonas iluminadas de los ecosistemas acuticos detodo el mundo, constituyendo uno de los grupos base de las cadenastrficas de los oceanos y de las aguas continentales. Actualmente sepiensa que existen unas 10 000 especies vivas, pero estos organismosaparecieron en el Cretcico (desde hace 138 a 66 millones de aos) de 1forma que existen cientos de especies fsiles (Margulis & Schwartz,1985).

1UJi

11-36-

1.14- Objetivos

En este trabajo nos planteamos que estos mecanismos de control dela proliferacin celular podran haber aparecido en una poca tempranade la evolucin, asociados a la aparicin de las clulas eucariotas. Porello nos proponemos los siguientes objetivos:

1) Estudiar desde un punto evolutivo, si microalgas representantesde grupos filogenticos que tuvieron relativa importancia en el procesoque di lugar a organismos pluricelulares, responden a determinadosmitgenos como lo hara cualquier clula de mamfero u otro organismoeucariota ms evolucionado. Durante los ltimos cuatro aos estoscontroles han sido estudiados en algunos de los organismos eucariotasms primitivos (las levaduras) y en muchos organismos de una granvariedad de phyla llegando hasta el hombre, y siendo consideradosuniversales a todos ellos. Sin embargo, las microalgas han sidoescasamente estudiadas a pesar de tener gran importancia en la escalaevolutiva, especialmente en la aparicicin y diversificacin de losprimeros organismos pluricelulares.

2) Estudiaremos el crecimiento de los organismos en mediossuplementados con diversos factores de crecimiento, analizando elposible papel ecolgico que podran tener dichos mitgenos en mediosnaturales. Tradicionalmente, la proliferacin de las microalgas es unfenmeno que en el laboratorio ha sido achacado a la presencia oausencia de determinados factores nutricionales en el medio de cultivo,mientras que en los estudios ecolgicos de campo, el cese delcrecimiento o los blooms proliferativos de microalgas se achacanprincipalmente a factores ecolgicos como la ausencia o presencia denutrientes especficos, determinadas condiciones luminosas o inclusocondiciones de estabilidad en la columna de agua. Sin embargo, lasltimas hiptesis al respecto apuntan hacia un control de laproliferacin celular, que no slo se basa en factores ecolgicos sinotambin en factores biolgicos, como pueden ser la presencia en elmedio de factores de crecimiento o el envejecimiento celular.

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3) Analizaremos si los factores de crecimiento pueden ser unmecanismo biolgico de control de la germinacin de determinadosquistes de dinoflagelados. Si la regulacin del ciclo de divisin celular esun mecanismo universal, y los factores de crecimiento son capaces deinducir la divisin celular en zigotos o en clulas quiescentes demamfero quiz sean tambin capaces de regular la germinacin de losquistes de dinoflagelados,

4) Por ltimo analizaremos si la Inhibicin por contacto es otromecanismo de regulacin de la divisin celular presente en organismosprimitivos. Hasta ahora este tipo de fenmeno haba sido descritosolamente en organismos pluricelulares, y ms concretamente enclulas evolucionadas de mamfero, Pero si el mecanismo de regulacinde la divisin celular es universal a todas las clulas eucariotas, y lainhibicin por contacto forma parte de este control, las algasunicelulares tambin podran tenerlo.

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MATERIAL Y MIETODOS

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MATERIAL Y METODOS

2.1- Condiciones generales de los cultivos

2.1.1- Aislamiento y fundacin de clones

Para la realizacin de los experimentos se trabaj con organismospertenecientes a niveles evolutivos muy distintos entre s: mesocariotas(dinoflagelados) y verdaderos eucariotas (protistas como gamophyceae,pradnophyceae y bacillartophyceae).

Los dinoflagelados tuvieron una procedencia diversa: los tres clonesde Prorocentrum triestinum Schiller (Pt-a. Pt-b, Pt*) fueron aislados apartir de la marea roja que tuvo lugar en Septiembre de 1983 en lascostas gallegas (Costas & Varela, 1987). Prorocentrum lima(Ehrenberg) Dodge y Alexandrium excavata Balech procedan de lacoleccin de dinoflagelados del Instituto Espaol de Oceanografia deVigo y fueron aislados en la Ra de Vigo en 1989. Por ltimo se trabajcon dos tipos celulares distintos de Alexandrlum tamarense (Halim)Balech: quistes recogidos en un sedimento arenoso de la Baha de LaCorua en Marzo de 1991, y clulas vegetativas procedentes de dosclones (At-a. At-b) aisladas en la Baha de La Corua en Mayo de 1985.

Los protistas eucariotas Tetraselmis suecica Stein (praxinophyceae),Phaeodactilum tricornutum (Bohlin) (bacillariophyceae) y Snirogvrainsignis (Hasal) Kutz (gamophyceae), Las dos primeras especies seaislaron en la Ra de Vigo en 1989 y procedan de la coleccin delInstituto Espaol de Oceanografa de Vigo, mientras que 5. insWnis seobtuvo en 1989 a partir de una muestra de agua del Pantano de Argandadel Rey.

Todos los clones de cada especie se obtuvieron a partir de una nicaclula vegetativa haploide de la muestra inicial mediante unamicropipeta. Dicha celula fu depositada en una placa de Petr, De estaforma es posible obtener cultivos clnicos a partir de esa nica clulaque, dividindose asexualmente, darla lugar a una poblacin en la quetodos los individuos serian genticamente idnticos.

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En el caso de la gamophyceae S. insWnis el procedimiento seguidofu distinto por ser un alga filamentosa: se alsl un solo filamento de lamuestra inicial mediante pinzas y se deposit en una placa de Petr,Todas las clulas del filamento sern geneticamente identicas ya queproceden de una nica clula inicial; en el caso de producirsereproduccin sexual (conjugacin) el zigoto diploide resultante daralugar mediante meiosis a dos clulas idnticas a sus antecesores.

2.1.2- Mantenimiento de los cultivos

Todas las especies marinas (P. lima, P. triestinum, A. tamarense, A

.

excavata, T. suecica, P. tricornutuml se cultivaron en placas de Petr con20 ml de agua de mar natural procedente de la Baha de La Coruaenriquecida con medio f/2 de Guillard sin silicatos (Sigma).

La especie de agua dulce, Sniro~yra insianis, creci en placas dePetr con 20 ml de agua dulce procedente del Pantano de Arganda,enriquecida tambin con medio f/2.

El medio f/2 es un medio de enriquecimiento ideal para muchasespecies de microalgas, ya que les proporciona los nutrientes yvitaminas necesarias para su crecimiento (Guillard, 1975; Navarro,1990). Su composicin queda reflejada en la Tabla 1 del Apndice.

Todos los cultivos se conservaron en cmaras de cultivo coniluminacin continua de 50 ~.tEin m2 s-1 de intensidad y a unatemperatura constante de 2010C.

Para mantener los cultivos en el tiempo se realizaron transferenciasseriadas cada 15 das o cada mes dependiendo del organismo, de uninculo a medio fresco, siempre en condiciones rigurosamente axnicas.

Adems, y para evitar posibles contaminaciones, siempre se trabajen cmara de flujo con medios filtrados (0,22 ~.t millipore) yesterilizados previamente. Como medida de seguridad, se trataron todos

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los cultivos con 150 mg E1 de Penicilina y 100 mg E de Estreptomicinaen un pulso de dos horas.

Previamente a la realizacin de los distintos experimentos secomprob la inexistencia de bacterias en el cultivo mediante el uso detcnicas de epifluorescencia. Para ello se tie la muestra de agua conuna solucin de 0,1 mg mV1 de Naranja de Acridina, paraposteriormente pasar la muestra por un filtro negro de 0~22k(Millipore). Si a continuacin se coloca el filtro sobre un porta y seobserva al microscopio de fluorescencia, es posible comprobar si existeno no bacterias en la muestra,

2.1.3- Tasas de reproduccin

Para cuantificar el crecimiento de los cultivos, se utiliz elprocedimiento habitual de medir las tasas de reproduccin mximasaclimatadas en divisiones dw1 segn la frmula de Crow y Kimura(1970):

div dia1= 1/Ln2 Ln(Nt/No)/t

siendo: Nt= nmero de clulas en el tiempo tNo= nmero de clulas en el tiempo Ot= tiempo

Adems, en el caso del experimento con factores de crecimiento, semidi el crecimiento celular en densidades celulares, contando elnmero de clulas mL1 durante los das en que se efectu laexperiencia.

Tanto los dinoflagelados. como la gamophyta S. insWnis y lapraxinophyta T. suecica , se contaron directamente en un microscopioinvertido Zeiss Axiovert.

Cuando se realiza una transferencia de algas a medio nuevo, stascrecen de una forma exponencial, hasta un momento en el que la falta

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de nutrientes o fenmenos densodependientes limitan su crecimiento(Alberts et al,, 1992; Costas et al,, 1993). Entonces, las algas seempiezan a dividir sexualmente formando zigotos o quistes diploides ydisminuyendo de esta manera la poblacion, pudiendo incluso llegar adesaparecer. Es por ello por lo que el contaje de clulas se realizsiempre durante los 10 primeros das despus de la transferencia,tiempo estimado en el que el cultivo crece exponencialmente (Brand etal,, 1981),

El nmero de contajes a realizar en cada caso se estim mediante laTcnica de las Medias Progresivas de Williams (1977). obtenindose unerror inferior al 5% en todos los casos.

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2.2- Estimacin del efecto de los factores de crecimiento sobre elciclo celular de los distintos organismos.

Para cuantificar el efecto que producan distintos factores decrecimiento as como un mitgeno artificial (ester de forbol), sobre elcrecimiento de diversas microalgas unicelulares pertenecientes cadauna de ellas a un nivel evolutivo diferente, As, se analizaron lassiguientes especies: P. lima, 5, insi~nis, Iu~ka y P. tricornutum

,

Tres replicados de cada especie crecieron en placas de Petr con20 ml de medio artificial ASPM en el caso de ser organismos marinos oen agua destilada en el caso de ser dulceacuicolas. Ambos medios sesuplementaron con un enriquecimiento f/2 (Sigma) sin silicatos, ElASPM es un medio artificial empleado habitualmente como sustituto delagua. de mar. Dado que se conocen todos sus componentes, es un medioideal para poder discernir de una manera precisa el efecto de cualquiercompuesto que se aada al medio sobre los organismos presentes en l,Esto no sera posible si se emplease agua de mar natural, ya que podraposeer sustancias (factores de crecimiento, metabolitos de excrecin deotros organismos, sustancias txicas, etc) que interferiran en elcrecimiento de las microalgas, La composicin del ASPM quedareflejada en la Tabla 2 del Apndice.

De la misma manera, el agua destilada es un medio frecuentementeutilizado con organismos de agua dulce como sustituta del agua dulce deprocedencia natural,

Para estimar el efecto producido por los factores de crecimiento, elmedio de cultivo fu suplementado con diversos factores de crecimientoy mitgenos artificiales en las concentraciones que se indican acontinuacin:

1- Un control en ASPM f/2 o en agua destilada f/2 paraorganismos marinos y dulceacuicolas respectivamente (A),

2- A + 10 ng/ml de Factor de Crecimiento Derivado de PlaquetasPDGF (SIGMA).

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3- A + 10 ng/ml del ester de forbol Monoacetato 12 de Forbol(PMA) (SIGMA).

4- A + 10% de Suero Bovino Fetal (FBS) (FLUKA).

Los organismos as cultivados se mantuvieron en cmaras de cultivocon una temperatura constante de 2010C,un rgimen de iluminacinde 12:12 br Luz-Oscuridad y una intensidad luminosa de 50 kxEin nr2si,

Finalmente, se hallaron las tasas de reproduccin mximasaclimatadas en divisiones dia-1 mediante la frmula de Crow y Klmuraanteriormente mencionada.

En una segunda prueba, se trataron varios dinoflagelados con losmismos factores de crecimiento, El grupo de los dinoflagelados es unode los grupos filogenticos ms controvertido, siendo consideradosorganismos intermediarios entre procariotas y eucariotas (Dodge, 1965)o antecesores evolutivos de los eucariotas actuales (Bujak & Williams,1981). Por ello, un mayor estudio de su ciclo de vida as como de lasrutas que controlan su ciclo de divisin celular podra aportarinteresantes avances en su posicin filogentica.

De este modo, trabajamos con dos especies de dinoflagelados: elprorocentral P. triestinum y el dinoconta A. tamarense. Tres replicadosde cada clon (Pt-a, Pt-b, Pt-t At-a, At-b) crecieron en las mismascondiciones experimentales que se mencionaron anteriormente y conlos mismos factores de crecimiento, as como en agua de mar naturalprocedente de la Baha de La Corua, y enriquecida con f/2.

En este caso, el crecimiento de los organismos fu estimadomediante el mtodo habitual de medir las tasas de reproduccin endivisiones da-1, as como midiendo las densidades celulares en clulasm-1, como un mtodo ms eficaz para evaluar correctamente el procesoseguido por el cultivo da a da durante todo el experimento.

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2.3- EstImacin del efecto de los factores de crecimiento sobre lagerminacin de los quistes de dinoflagelados.

Para estimar el efecto de los factores de crecimiento sobre lagerminacin de los quistes del dinoflagelado Alexandrium tamarense, seemple un sedimento de arena superficial recogido a 1 metro deprofundidad en la Baha de La Corua en Marzo de 1991, con el agua auna temperatura de 13,5 0C.

Dado que las bacterias son capaces de sintetizar y excretar factoresde crecimiento al medio (Morotom et al., 1990), su presencia en elsedimento arenoso podra suponer una alteracin de los resultados. Poresta razn, los sedimentos que se iban a utilizar en el experimento setrataron previamente con antibiticos para eliminar las bacterias quepudieran estar presentes en el medio, As, varias alcuotas de 1 ml desedimento se lavaron tres veces con medio artificial ASPM mediantecentrifugacin, y se trataron posteriormente con 150 mg 1-1 d epenicilina y 100 mg 1-1 de estreptomicina durante un periodo de 2horas, A continuacin, las muestras se volvieron a lavar para eliminar lapresencia de los antibiticos.

Sin embargo, al desconocer el efecto que pudieran tener losantibiticos sobre la germinacin de los quistes, se realiz una pruebaprevia que consisti en que 4 alcuotas de 1. ml de sedimento cada unase dejaron crecer simplemente en 3 ml de medio ASPM f/2, mientrasque otras 4 se trataron previamente con 150 mg V1 de penicilina y 100mg ~ 1 de estreptomicina durante un periodo de 2 horas.Posteriormente, se cont el nmero de clulas vegetativas en cada casoy se comprob la inexistencia de diferencias significativas entre lagerminacin de unos quistes y otros,

A continuacin, 4 alcuotas ya axnicas de 1 ml cada una sedepositaron en placas multiensayo con 3 ml de los siguientes medios:

1- Un control en agua artificial ASPM con enriquecimiento f/2,2- Un control en ASPM f/2 suplementado con un 10% de medIo

RPM! (DIFCO).

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3- ASPM f/2 suplementado con 10 ng mV de PDGF (SIGMA).4- ASPM f/2 suplementado con un 10% de FBS (FLUKA),

El RPM! es un medio standard utilizado habitualmente en loscultivos de clulas de mamfero que proporciona nutrientes pero ningnfactor de crecimiento.

Todos los cultivos se mantuvieron en cmaras de cultivo con unailuminacin de 50 gEin m2 s~ y un periodo de 12:12 horas de luz-oscuridad a 200C. Para evitar diferencias en el grado de Iluminacinrecibida, todas las placas multiensayo se cambiaban aleatoriamente desitio una vez al da,

Para realizar el contaje de las clulas germinadas, todos los das seretiraba el medio lquido de cada pocillo con una jeringuilla estril,evitando hacer turbulencias en el sedimento arenoso. A continuacin, sefijaba la muestra lquida con formaldehdo al 4% y se contaban en unmicroscopio invertido las clulas vegetativas de A. tamarense que habangerminado. Una vez efectuado el contaje de las clulas, se proceda alllenado de los pocillos con otros 3 ml de cada medio respectivo.

Este procedimiento se realiz todos los das, a la misma hora ydurante un periodo de 7 das, que fu el tiempo en el que se observaronclulas vegetativas,

Al mismo tiempo, se fijaron muestras del sedimento original paracontar el nmero de quistes m-1 de sedimento en cada pocillo alprincipio del experimento. As se pudo estimar posteriormente elporcentaje de germinacin para cada tratamiento como el nmero totalde clulas germinadas/nmero total de quistes en el sedimento alprincipio del experimento.

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2.4- Estimacin del efecto de la inhibicin por contacto en distintosorganismos

En un intento de comprobar si la inhibicin por contacto es unmecanismo de control de la proliferacin celular que fu desarrolladoantes de la aparicin de los organismos pluricelulares, sometimos a losdinoflagelados Alexandrium excavata, Prorocentrum lima yProrocentrum triestinum, a la gamophyceae Sniro~vra insignis, a lapraxinophyceae Tetraselmis sp. y a la bacillariophyceae Phaeodactilumtricornutum a 3 tipos de experimentos.

Los cultivos de las distintas especies se cultivaron tal y como sedescribe en los puntos 2.1,1 y 2.1,2, mediante transferencias seriadasde inculos de 50030clulas a medio nuevo una vez cada da. De estaforma, los cultivos crecieron exponencialmente durante unos 20-30 dasy despus empezaron a mostrar evidencias de una clara inhibicin delcrecimiento debido, aparentemente, a una alta densidad celular o a unafalta de nutrientes. El mtodo usado para detectar cuando un cultivoalcanzaba la saturacin, fu el de medir diariamente las tasas dereproduccin y la densidad celular (en clulas m-1); as, cuando la tasase aproximaba a cero (es decir, no exista practicamente crecimiento) yla densidad celular alcanzaba su mximo valor, el cultivo se considerabasaturado,

Tres das ms tarde de considerarse el cultivo saturado, se procedia realizar los 3 experimentos siguientes, que quedan esquematizados enla Figura 7.

Experimento 1- Cinco replicados de cada especie se centrifugarondurante 20 minutos a 1000 rpm y se resuspendieron en la mismacantidad de medio nuevo, Es decir, obtendremos un cultivo conmedio nuevo pero con una densidad celular a saturacin. Semidieron entonces, durante 5 das las tasas de reproduccin y lasdensidades celulares.

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Figura 7- Esquema de los procedimientos a los que fueron sometidos losdiferentes cultivos celulares.

CULTIVO SATURADO

Experimento 1 Expermento 3

*Centrifugacin

Experimento 2

+Centrifugacin

*Centrifugacin

Eliminar elsobrenadante t Eliminar elprecipitado

Resuspender enmedio nuevo

Filtrar el medio00,22U

Eliminar mecnicamentela mitad del cultivo

Tendremos un cultivocon medio nuevo y

densidad celular elevada

4Aadir inculo nuevo

con clulas en crecimientoexponencial

4Tendremos un cultivo conmedio saturado y densidad

celular baja

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Exoerimento 2- CInco replicados de cada especie se centrifugarondurante 20 minutos a 1000 rpm, A diferencia del caso anterior,despus de la centrifugacin el medio saturado se filtr a travs deun filtro de 0,22 ~x,obteniendose as un medio saturado libre declulas y axnico, A continuacin un inculo de cada especie con lasclulas en crecimiento exponencial se dej crecer en este medio.

Es decir, obtendremos un cultivo con un medio saturado pero con unadensidad celular baja.

Con estos dos experimentos es posible discernir si las clulas veninhibido su crecimiento por un proceso de inhibicin por contacto(elevada densidad celular) o bien por fenmenos tales como la falta denutrientes o la acumulacin de metabolitos de deshecho, de una maneramutuamente excluyente. As, si las clulas presentan fenmenos deinhibicin por contacto, sern capaces de crecer en el experimento 2(densidad celular baja) pero no en el experimento 1 (densidad celular asaturacin). Por el contrario, si la proliferacin celular se ve inhibida porfalta de nutrientes o acmulo de catabolitos, las clulas no sern capacesde crecer en un medio saturado pero s en un medio nuevo con aportede nutrientes: es decir, no crecern en el experimento 2 pero s en el1.

Exuerimento 3- Asimismo, se realiz otro tipo de experimento enaquellas especies capaces de crecer en monocapa: S. insianis y li.lima. Cinco replicados de cada especie crecieron en placas de Petrhasta alcanzar la saturacin. Una vez que los cultivos alcanzaron lasaturacin, se procedi a la eliminacin mecnica de las clulas deuna de las mitades de la placa de Petri, tal y como se hacehabitualmente en los estudios con fibroblastos de mamfero, En estecaso, si las clulas de la mitad de la placa que no han sido

eliminadas continan creciendo, significara que su crecimiento sevi inhibido por un fenmeno de inhibicin por contacto (aldisminuir la densidad celular pueden seguir creciendo),

Para valorar los 3 experimentos, se midieron las tasas dereproduccin y las densidades celulares durante los 5 das siguientes alinicio de los mismos, en cada uno de los cinco replicados de cada

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especie. Las densidades celulares se estimaron como el nmero declulas mL1 (o por cm2 en el caso del experimento 3 en el cual semidieron las clulas por unidad de rea), Las tasas de reproduccin semidieron en divisiones da- (Crow & Kimura, 1970). As mismo, secalcul el porcentaje de incremento de densidad celular (A) en las 24horas siguientes de realizado el experimento,

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2.5- Anlisis estadstico

Las comparaciones estadsticas se realizaron, en todos los casos,mediante las pruebas no paramtricas de la U de Mann Whitney para lacomparacin de dos medias, y la 1-1 de Kruskal Wallis para lacomparacin de tres o ms muestras (Siegel, 1956). Elegimos laestadstica no paramtrica debido a que no se puede asumir lanormalidad en la distribucin de todos los resultados obtenidos,

El test de U de Mann Whitney es la alternativa no paramtrica mseficaz a la prueba paramtrica t de Student para la comparacin de lasmedias de dos grupos independientes. Su relacin potencia-eficienciaes de un 95,5%.

Por su parte, el test H de Kruskal Wallis tiene tambin una relacinpotencia- eficacia del 95,5% frente a la prueba paramtrica F, siendopor tanto la alternativa no paramtrica ms eficaz para la comparacinde tres o ms muestras,

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RESULTADOS

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2RESULTADOS

3.1- Resultados correspondientes al efecto de los factores decrecimiento sobre el ciclo celular de los organismos

En la Tabla 1 se representan en divisiones da- las tasas dereproduccin mximas aclimatadas de todos los organismos en los 5medios ensayados: control en ASPM o en agua destilada enriquecido conf/2 y sin ningn aporte de factores de crecimiento, medio controlsuplementado con Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF),medio control suplementado con Monoacetato 12 de Forbol (PMA),medio control suplementado con Suero Bovino Fetal (FBS) y medionatural (agua de mar o dulce) enriquecido con f/2, Del mismo modo, lasFiguras 1-5 del Apndice representan el crecimiento de cada organismoen dichos medios.

Aunque se trata de organismos filogeneticamente muy diferentesentre s, todos ellos muestran un aumento de su tasa de reproduccincon la adicin de factores de crecimiento, As, todos los organismostienen una tasa de reproduccin mnima en el control sin factores decrecimiento, y tanto el PDGF, el FBS o el PMA producen grandesdiferencias (pcto,Ol) en su proliferacin.

En todos los casos, excepto en el dinoflagelado Prorocentrum lima

,

el valor mximo de proliferacin es alcanzado en presencia de FBS, queproduce incrementos de hasta 8.71 y 9.66 veces el valor alcanzado en elexperimento control en los casos de los eucariotas Tetraselmis suecica ySpiro~Tra insianis respectivamente.

Por otro lado, tanto el PDGF como el PMA, provocan unas tasas dereproduccin muy similares en todos los organismos, no existiendodiferencias significativas (p>O,OS) entre los valores alcanzados.

Entre todos los organismos ensayados, los que sufren unaproliferacin mayor en presencia de factores de crecimiento y del PMAson las eucariotas, particularmente la gaimophyta 5. insignis, cuya tasa dereproduccin control se incrementa un promedio de 9.33 veces en

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Tabla 1- Tasas de reproduccin en divisiones/da de los distintos organismosen los medios ensayados. Con una * se indica la inexistencia de diferenciassignificativas (pcco,01) entre las tasas de reproduccin del medio control y lastasas en medios suplementados con factores de crecimiento, y con ** se indicala existencia de diferencias significativas (p>O,0S).PDGF= Factor de crecimiento derivado de plaquetasPMA= Monoacetato 12 de forbolFBS= Suero bovino fetalAgua natural= Agua de mar o dulce, segn los organismos

Medios P.lima T.suectca Sinsignis P.tricornutum

ASPM f/2 (A) 0,130,04 0,140,02 0,120,07 0,120,02

A+PDGF O,61O,03** 1 ,020,02** 1,1 10,02** 0,730,02**

A+PMA 0,580,08** 0,940,04** ,o9o,o4** o,62o,o2**A+FBS 0,530,02** 1 ,220,04** 1, 160,04~ 0,830,03**

Agua natural 0,3 10,08** 0,740,01** 0,360,02** 0,5 10,04**

ti

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presencia de factores de crecimiento, mientras que el dinoflagelado Lilma se encuentra en una posicin intermedia al ver Incrementada sutasa de reproduccin una media de 3.90 veces respecto al control.

Un hecho a destacar es el crecimiento que se produce en losorganismos cuando son cultivados en un medio natural (agua de mar odulce, en cada caso). Todos los organismos alcanzan unas tasas dedivisin, que si bien son superiores estadisticamente (pc0,01) a lasobtenidas en un medio artificial, son menores (pc0,01) a los valores quese alcanzan en un medio suplementado con factores de crecimiento, Aspor ejemplo, T, suecica multiplica una media de 7,5 veces su tasa dedivisin control con factores de crecimiento, mientras que solo lo hace5,28 veces en agua natural: lo mismo les ocurre al resto de losorganismos: tanto P. lima, como S. insignis o P. tricornutum venincrementadas su tasa de divisin en presencia de factores decrecimiento un promedio de 4.40, 9.33 y 6.05 veces respectivamente,mientras que en un medio natural solo lo hacen 2.38, 3.00 y 4.25 veces,

En cuanto a la respuesta particular de los dinof?lagelados, quedareflejada en la Tabla 2, Todos ellos (excepto el clon Pt* de Ltrestnuml responden de una manera semejante: en presencia defactores de crecimiento y mitgenos artificiales incrementansignificativamente su crecimiento (pc0,001) respecto a los controlescarentes de factores de crecimiento, Adems, tanto el PDGF como elPMA provocan incrementos similares de proliferacin en cadaorganismo no encontrandose diferencias significativas entre ellos(p>0,0S). As, los dos clones de Alexandrium tamarense, At-a y At-b,incrementan su tasa de reproduccin una media de 398,33% y318,18% en presencia de factores de crecimiento, mientras que los dosclones de Prorocentrum triestinum, Pt-a y Pt-b, lo hacen en un423,33% y un 287,33% respectivamente. Las Figuras 6-10 delApndice representan el crecimiento de cada organismo en losdistintos medios,

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Tabla 2- Tasas de reproduccin en divisiones/da de los distintos dinoflageladosen los medios ensayados. Con una * se indica la inexistencia de diferenciassignificativas (p>0,05) entre las tasas de reproduccin del medio control y las delos medios suplementados con factores de crecimiento, mientras que con ** seindica la existencia de diferencias significativas (pc0,0