UNIVERSIDAD DEL MAR

CAMPUS PUERTO ESCONDIDO

PROFESORRUÍZ RUÍZ FRANCISCO GUMARO

MATERIABIOLOGÍA DE PROCARIOTAS

PRACTICA N.8

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICOS DEL AGUA PARA CONSUMO HUMANO

INTEGRANTESCRUZ JIMÉNEZ GUADALUPE

GARCÍA HERNÁNDEZ SELENE

FECHA DE ENTREGA24/JUNIO/2010

INTRODUCCIÓN

La ingestión de agua contaminada es tan sólo una de las posibles fuentes de microorganismos infecciosos. (1)

Existen diversos métodos o técnicas para el análisis de microorganismos de acuerdo a los diferentes tipos de muestras, las cuales pueden dividirse en dos grandes grupos que son: métodos directos y métodos indirectos. (9)

Los métodos indirectos entre los que se encuentra el recuento de células viables en placa o simplemente Cuenta Viable en Placa (CVP) la cual puede realizarse por vaciado en placa o bien por extensión. Los métodos directos son aquellos que usan conteos al microscopio, pero tienen la desventaja de que realizan el recuento tanto de microorganismos viables como no viables por lo que son conocidos como recuento total de microorganismos.De los muchos microorganismos infecciosos que se encuentran, en el agua se pueden hallar bacterias (como Shigella, Escherichia coli, Vibrio y Salmonella), virus (como el virus Norwalk y rotavirus) y protozoos (como Entamoeba, Giardia y Cryptosporidium). (1)

Estos microorganismos pueden provocar síntomas como náuseas, vómitos, diarrea y calambres estomacales. En las personas adultas con un buen estado de salud, estas enfermedades suelen ser leves y duran poco tiempo. (1)

Debido a su resistencia a la desinfección, la Giardia y el Cryptosporidium son, en la actualidad, las causas más frecuentes de enfermedades transmitidas por el agua. (1)

“En la purificadora agua vital (2) que se encuentra en Puerto Escondido y surte los garrafones a la Universidad del Mar; se toman las siguientes precauciones esta purificadora manda a analizar el agua en el laboratorio estatal de Salud Publica de Oaxaca, departamento de análisis sanitaros, sección de físicos químicos de aguas y alimentos. Principalmente analizan cuatro microorganismos bajo la Norma oficial mexicana NOM-201-SSA-2002, Productos y servicios agua y hielo para consumo humano envasados y a granel” (Etelberto Escobar 2010), menciona el químico encargado de la purificación de agua. Mesofilos NOM-092-SSA1-1994, Coliformes totales NOM-112-SSA1-1994, Coliformes fecales NOM-112-SSA1-1994, Cholerae NOM-031-SSA-1993. (3) Los organismos patógenos llegan al agua en forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo, por lo tanto, pueden no estar en una muestra que se envíe al laboratorio.

OBJETIVOSConocer cuales son los organismos que se presentan en el agua que se consume diariamente en la institución.

MATERIALES

MATERIALES· Aceite de inmersión · Cubreobjetos · Agar eosina y azul de metileno · Franela* · Agar MacConkey · Frascos para tomar las muestras*· Agar nutritivo · Gradilla · Agua destilada · Jabón antibacterial* · Agua destilada estéril · Jeringas* · Alcohol · Lugol · Asa acodada · Matraz Erlenmeyer de 150 ml· Asa bacteriológica de aro · Mechero bunsen · Autoclave · Membrana 0.45 µm · Balanza analítica · Microscopio · Bomba de vacio · Muestras de agua potable· Cajas de Petri con agar nutritivo · Pipeta Pasteur · Cerillos* · Plumón indeleble*

· Charolas para pesar · Portaobjetos · Cinta maskintape* · Solución de azul de metileno· Cinta para film · Solución de cristal violeta· Cloro* · Solución de fucsina · Cronometro · Solución de safranina

*material que deberá traer el alumno

METODOSEn la primera sesión se esterilizo el material como fue las cajas petri, los agares a utilizar y agua destilada. Para esto nos repartimos el trabajo por equipo, una de nosotras peso el agar a utilizar y otra envolvió el material a esterilizar. Posteriormente vertimos el agar en las cajas petri, para que cuando estuvieran solidas se pudieran sellar, esto se realizo el la tarde de ese día y obviamente también se rotularon. La segunda practica que tuvimos con relación a esta, el profesor nos dio unas practicas las cuales se trataba de pruebas bioquímicas que teníamos que realizar en estas muestras que íbamos a tomar y en una sepa problema que el nos dio. Para esto teníamos que preparar mas medio de cultivo y esterilizarlo, así que en esta practica, todos nos ayudamos a la preparación de medio de cultivo. Y se procedió a tomar las muestras, en este caso las muestras fueron tomadas de Vice-rectoría académica y de Administrativa. Para que ese día también pudiéramos sembrar, teniendo ya la muestra cada uno de los equipos fue a la campana de extracción de gases y con ayuda de una jeringa y de un asa acodada se sembró en los agares ya preparados. También se hizo una siembra en membrana con bomba de vacio la cual primero se esterilizo el material que se iba a utilizar para este procedimiento, ya estando esto se monto el equipo y al dentro del embudo se colocó la membrana y esta se colocó en una caja petri con agar. Para la tercera practica proseguimos a preparar tinciones y frotis, primeramente se hizo tinciones con la tinción Gram y con tinción de Ziehl-Neelsen. La tinción Gram consiste en tomar un porta objetos y poner una gota de agua destilada, después tomar la muestra y homogenizar la mezcla posteriormente pasar este por el fuego. Ya que se tiene el frotis se le agrega cristal violeta por un minuto al paso de este se le pone agua, después se le agrega lugol por un minuto y se enjuaga por veinte segundos con alcohol y al final se le agrega safranina por un minuto y se lava con agua destilada, se deja secar y se observa a microscopio. Y el de Ziehl-Neelsen, se prepara el mismo frotis después se cubre el frotis con Fucsina fenicada y se calienta hasta emisión de vapores durante 5 minutos. Posteriormente se lava con agua, para que se le agregue alcohol ácido para decolorar durante un minuto (asegurándose de que no se desprende más color rojo). Por ultimo Lavar con agua para eliminar el exceso y se le agrega azul de metileno al 1% como colorante de contraste. Después realizamos resiembra de nuestras sepas del agua, para tener una muestra mas pura, para esto preparamos Agar nutritivo entre todo el grupo y así tuvimos el agar para realizar la resiembra. Para terminar en nuestra última sesión también realizamos frotis y tinciones y además le tomamos unas fotos a nuestras placas y muestras en el laboratorio de Biología. En esta sesión también esterilizamos en sucio para sacar un poco de material a entregar. Además de hacer las siembras en las pruebas bioquímicas, una que realizamos ese día fue una parte de la catalasa la cual consistía en que con una guja de inoculación o con una asa bacteriológica recta estéril, tomar el centro de una colonia pura de 18 a 48 h y colocar sobre un portaobjetos de vidrio limpio, después se le agregó una gota de peróxido de hidrogeno al 30%, sobre la colonia puesta en el portaobjetos, usando un gotero o pipeta Pasteur, y así observamos se de inmediato se hizo la formación de burbujas (liberación de burbujas) o no, al final desechamos el portaobjetos colocándolo en un recipiente con desinfectante en este caso fue en cloro.

Pruebas bioquímicas Prueba de citrato: Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única

fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Prueba de la catalasa: Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Prueba de fenilalanina desaminasa: Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias.

Prueba del indol: Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa.

RESULTADOS Los resultados que obtuvimos de las tinciones fueron buenos. Resultados de la resiembra de la prueba del agua. Los resultados de las tinciones fueron buenas, se observaron bacilos gram negativos.

Bacterias observadas al microscopio 10x en tinción gram.

Resiembra que obtuvimos de Vice-rectoría académica.

Esta imagen es otra resiembra de la misma cepa. Estas resiembras se tomaron del agar McConkey.

Esta imagen es de otra de las resiembras pero del Agar eosina y azul de metileno.

Resultados de las pruebas bioquímicas Fermentación de carbohidratos

Esta prueba quedó un poco dudosa ya que el cambio de color que se formó fue un color anaranjado lo cual dice que existe la posibilidad que sea positiva o negativa ya que este cambio debe ser muy notable; se le considera efecto retardado. Y se mostro una capa blancuzca en la superficie.

Catalasa

Aquí se iba a mostrar el desprendimiento de burbujas si esta era positiva lo cual en esta si se presentaron con gran rapidez.Y en las pruebas bioquímicas que realizamos con las resiembras una fue la de la catalasa la cual en su primera parte que realizamos nos dio positivo, que fue el desprendimiento de burbujas.

Licuefacción de gelatina

Si hubo crecimiento el cual se encontraba turbio en la parte superior del medio de cultivo con una apariencia de nata y más abajo se mostraban tres capas.

Prueba motilidad

Prueba agua

Prueba agua

Se consumió parte del agar, se mostraron dos colores diferentes anaranjado y amarillo al igual que se mostraban puntos en la superficie lo que mostraba la movilidad.

Producción de H2S

Aquí no se presento crecimiento ni otro resultado el cual diera como positivo esta prueba.

OBSERVACIONESObservamos que el Agar Eosina y Azul de Metileno cuando se realizó la siembra en este, que es de un color verde-azul cambió a transparente como si fuera agar nutritivo, aunque solo tuvimos positivo en la siembra que realizamos de la toma de vice-rectoría académica y no de administrativa. Lo que si observamos es que en las tres siembras que teníamos de esta las tres dieron positivas. Aunque se sembró en dos agares diferentes como lo fue el Agar Eosina y Azul de Metileno y Agar MacConkey. Y la que sembramos en la membrana fue en el agar Eosina y Azul de Metileno y este se puso negro, alrededor de las colonias ya sembradas. Fermentación de carbohidratos: esta prueba dio positiva ya que cambió de color rojo a un marrón claro y con una capa blanca en la superficie, el cambio de color nos dio que crecieron fermentadoras de azucares. Catalasa: dio positiva por lo tanto crecieron microorganismos que contienen citocrómo la enzima descompone el H2O2 que son la burbujas que se observan.Producción de H2S: en el agar sulfito de bismuto en el que se sembró s selectivo por lo tanto permite la identificación y crecimiento de microorganismos específicos en este caso de salmonella. De acuerdo con nuestros resultados no se obtuvo crecimiento y también pudo ocurrir que hubo una mala siembra en donde se calentó demasiado en asa de cultivo y provoco la muerte de los microorganismos.

CONCLUSIONES

Prueba agua

Lo que concluimos fue que posiblemente las bacterias que encontramos pueden ser coliformes ya que con lo que sucedió con el agar eosina y azul de metileno nos da una referencia a que tal ves si sean coliformes, lo cual creo que nos debía de preocupar.

BIBLIOGRAFIA 1. http://www.state.nj.us/health/eoh/hhazweb/micro_sp.pdf fecha de consulta 20/05/10.2. Agua purificada (vital) Ircosa Carr. Costera Col. Los Mángales tel.: 58200773. http://www.cofepris.gob.mx/work/sites/cfp/resources/LocalContent/1341/3/mod127ssa1.pdf fecha de

consulta 18/05/10.4. Manual de métodos estandarizados en microbiología veterinaria-George E. Coltral; La prensa Médica

Mexicana 302-303pp.5. http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/indol.htm