virus hbv final
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Propuesta resumen informacion VPH , presentacion en español que resumen vph riesgos , causas y tratamientos.TRANSCRIPT
El virus de la hepatitis B regula la apoptosis y la tumorogénesis a través de la vía del TGF-B (FACTOR DE TRANSFORMACIÓN DE CRECIMIENTO BETA) por microRNA 15a y Smad7
Magda Lorena Barrios VillamizarCOD 2110553
Laura Marcela Villarreal BecerraCOD 2121343
Introducción
Infección por el HBV es un problema importante de salud pública 350 millones de personas infectadas a nivel mundial de forma crónica
HBV es un virus envuelto, hebra doble de DNA parcial, genoma 3,2 kb
mRNA codifica: polimerasa, core, envoltura, pre S1, S2 y proteína X
Prot X promotor de tumorogénesis ¿HBV inhibe la apoptosis mediante miR15 y Bcl-2?
Proteínas Smad son señal clave en el rol de TGF B1
Smad7 inhibe TGF-B La vía de señalización por TGF-B - hepatocarcinoma celular
No se conoce muy bien el mecanismo de HBV para producir HCC
Materiales y métodos
Tejidos hepáticos de humanos con HCC
Ratones transgénicos con HBV cepa BALB/C
Plásmidos construidos con Smad7 y Smad2
Anticuerpos derivados de cabra y conejo y reactivos • Peroxidasa de rábano
picante, etc
Cultivos celulares y técnicas de
transfección
Extracción de RNA y PCR en tiempo real Inmunotransferencia Inmunofluorescencia Ensayos de actividad
de la caspasa 3/7 Citometría de flujo
Construcción de las líneas celulares HepG2
shSmad7#
Análisis de la viabilidad celular
Evaluación de la tumorogénesis
Resultados
• MiR-15a regula la expression de Smad7 utilizando como blanco su porción 3´UTR.
Los niveles de mRNA de Smad7 fueron significativamente más bajos en las células HepG2 transfectadas con miR15a.
Los niveles proteicos de Smad7 fueron significativamente más bajos en las células con miR15a
Resultados• MiR-15a regula la expresión de Smad7 utilizando como blanco su
porción 3´UTR.
Al examinarse el nivel de afinidad de mIR15a sobre Smad7 se encontró la existencia de una región complementaria en la sección 3´UTR del mRNA de Smad7
Al evaluarse la complementariedad con una cadena Smad7 mutante, donde se observaron alteraciones en el sitio de unión
Al aplicar la técnica de luciferasa para estimar la actividad de Smad7, se encontró que en las células con mIR15a los niveles de Smad7 disminuían tanto su mRNA como la proteína producida
Resultados• El HBV regula la expresión de Smad7 y miR15a en los hepatocitos
¿HBV es capaz de bajar los niveles de mIR15a?
Se confirmó que los niveles de miR15a fueron más bajos en las células transgénicas HepG2C5 y HepG24D14 con HBV
Se analizaron los niveles de mRNA de Smad6 y Smad 7 así como sus proteínas sintetizadas en las células HepG2, HepG2C5 y HepG24D14.
Se encontró que los niveles de mRNA de Smad7 y consecuentemente los de proteína codificada fueron más altas en las células , HepG2C5 y HepG24D14 a comparación de las HepG2.
Resultados• El HBV regula la expresión de Smad7 y miR15a en los hepatocitos
Se transfectaron células HepG2 y L02 con pHBV1.3 o con pHBV1.3mut para analizar las cantidades de mRNA y proteína de Smad7.
El nivel de mRNA y proteína de Smad7 en las células con pHBV1.3 estuvieron más elevados que en las que tenían la variedad mutante del virus o las células control
• HBV regula la expresión de Smad7 por actuación sobre miR15a (ensayos en vivo)
Resultados
Se examinó la cantidad de mRNA de Smad7 en ratones que se infectaron con HBV
La cantidad relativa de mRNA de Smad7 en el tejido hepático de los ratones con HBV fue más alta que en los ratones control
Se quiso evaluar la relación entre mIR15a y mRNA de Smad7 en tejido hepático de pacientes con HCC con HBV crónica
Existe una correlación negativa entre los niveles
de miR15a y mRNA de Smad 7
Resultados• HBV regula la expresión de Smad7 por actuación sobre miR15a
(ensayos en vivo)
Existe una correlación positiva entre los niveles de mRNA de HBV y el mRNA Smad7 en el tejido hepático de pacientes con HCC
Se comparó el nivel de Smad 7 en tejidos tumorales y tejidos adyacentes (5 muestras).
Se evidenció que los niveles de Smad7 en el tejido tumoral fue más alto que en los tejidos adyacentes
De igual manera se evidenció que el nivel de HBV era mas elevado en el tejido tumoral que en el tejido adyacente
• mIR15a realza la señalización de TGF-B por regulación de Smad7.
Resultados
Para evidenciar que Smad7 actúa como un antagonista de TGF-B (por lo tanto también baja los niveles de Smad2), se transfectaron células HepG2 con un plásmido pFLAGmv2Smad7 y se trataron con TGF-B. Se analizó la cantidad total de Smad 2 a nivel celular y nuclear por inmunotransferencia
Se encontró que la imitación de miR15a realzó la actividad de TGF-BEl inhibidor de miR15a inhibió la actividad de TGF-B
Los datos mostraron que la cantidad de Smad2 a nivel nuclear en las células que sobrexpresaban Smad7 fue mas baja, mientras que la cantidad a nivel total (NO NUCLEAR) permaneció similar para los grupos evaluados
Se examinó la cantidad de Smad2 en células
transfectadas con la imitación de miR15a.
• mIR15a realza la señalización de TGF-B por regulación de Smad7.
Resultados
El miR15a realzó la traslocación de Smad2 a
nivel nuclear a través de la regulación de Smad7
La sobreexpresión de Smad7 contrarrestó el efecto de miR15a sobre la traslocación nuclear de Smad2
En otro ensayo se miró la relación miR15a – Smad 7
Las células HepG2 fueron transfectadas con pHBV1.3 o pHBV1.3mut y por medio de ensayos de luciferasa se determinó la actividad de TGF-B.
• HBV inhibe la señalización de TGF-B por medio de la regulación de miR15a
Resultados
La actividad de la luciferasa en las células transfectadas con pHBV1.3 fue significativamente más reducida, es decir disminuía la actividad del TGFB
De manera consistente, la cantidad de Smad 2 en el núcleo se encontró significativamente reducida en las células transfectadas con pHBV1.3
• HBV inhibe la señalización de TGF-B por medio de la regulación de miR15a
Resultados
Para determinar como el HBV interfiere en los niveles de Smad7 a través de miR15a, se transfectaron células HepG2 con pHBV1.3 CON o SIN una imitación de miR15a
Los niveles de Smad7 incrementaron en las
células transfectadas con pHBV1.3
Los niveles de Smad7 incrementaron en las
células transfectadas con pHBV1.3 PERO VOLVIERON A SUS NIVELES ORIGINALES
cuando también se exponían a miR15a
La cantidad de Smad2 en el núcleo fue más bajo para las células
contransfectadas con pHBV1.3, pero en las que además tenían miR15a, la
cantidad de Smad2 volvió a la normalidad
miR15a contrarresta los efectos del virus sobre Smad7, además juega un papel
importante para mantener los niveles de Smad2
También se determinó la cantidad de Smad2 fosforilado en células HepG2 cotransfectadas con pHBV1.3 y pCMVMycSmad2
• HBV inhibe la señalización de TGF-B por medio de la regulación de miR15a
Resultados
El nivel de Smad2 fosforilado en las células transfectadas con pHBV1.3 y pCMVMycSmad2 fue mucho mas bajo que en las células que solo tenían pCMVMycSmad2
Resultados• HBV genera células HepG2 resistentes a TGF-B1
Primero se evaluó como TGF-B induce la apoptosis en las células HepG2 por escisión del fragmento PARP-1
Se comparó el nivel de escisión de PARP-1 en las diferentes células
según se trataran o no con TGF-B
La escisión PARP-1 en las células HepG2G5 y HepG2D414 era mucho
más débil que en las HepG2
HepG2C5 y HepG24D14 resistente a apoptosis por TGFB
Se realizó el ensayo con HepG2 con pHBV1.3 y su variante mutante
La escisión PARP-1 fue reducida en las células pHBV1.3
Resultados• HBV genera células HepG2 resistentes a TGF-B1
En las células cotransfectadas con pHBV1.3 y miR15a la escisión PARP-1 fue
recuperada a cierto nivel
Se evaluó en las células HepG2 y L02 la actividad de la Caspasa 3/7, tratándolas con HBV y su variedad mutante
El nivel de actividad de la caspasa 3/7 en las células transfectadas con pHBV1.3 fue más bajo que en las células
control o en las que tenían el pHBV1.3mut
Resultados• HBV genera células HepG2 resistentes a TGF-B1
Por citometría de flujo se realizó un monitoreo de las células apoptóticas
Después del tratamiento con TGFB1, el porcentaje de células apoptóticas en las con pHBV1.3 fue hasta 3 veces más bajo que en las células control
HBV puede inhibir la apoptosis por la vía TGFB a través de
miR15a/Smad7
Se comprobó la viabilidad celular de HepG24d14 y HepG2 luego de tratarse con TGFB.
Resultados• HBV promueve la tumorogénesis a través de la inhibición de
señalización de TGFB por medio de la regulación de Smad7
La viabilidad de las células HepG24d14 es mayor que la de las células HepG2 luego del tto con
TGFB
Se les inyectó células HepG2, HepG2c5 y HepG24d14 por vía subcutánea ratones y se midió el tamaño de los
tumores desarrollados en el tiempo
Las células HepG2c5 y HepG24D14 formaron tumores más grandes
Resultados• HBV promueve la tumorogénesis a través de la inhibición de
señalización de TGFB por medio de la regulación de Smad7De los tumores desarrollados se
determinaron los niveles de mIR15a y Smad7
Los tumores generados de células HepG24D14 expresaron niveles más bajos de miR15a y niveles más altos de mRNA y proteínas Smad7
Para confirmar la función de Smad7 en la tumorogénesis de las células con HBV, se generaron 2 líneas celulares derivadas de HepG2: shSmad7#1 & shSmad7#2
Resultados• HBV promueve la tumorogénesis a través de la inhibición de
señalización de TGFB por medio de la regulación de Smad7
Se encontró que la viabilidad de Smad7 en las líneas celulares
generadas estaba disminuida, así como su expresión proteica
Los ensayos de formación de tumores mostraron que aquellos generados a
partir de las líneas shSmad7#1 & shSmad7#2 fueron más pequeños
Smad7 es un pilar fundamental en el desarrollo de tumorogénesis
DiscusiónEn este estudio se propuso que el mRNA de HBV actuaba como ceRNAs por miR15a para regular la señalización por TGFB•Contribución al desarrollo de HCC
La desregulación por ceRNAs podría conllevar a la evolución de un cáncer
Smad7 es un nuevo blanco de miR15a
Las líneas celulares con HBV son menos receptivas a los procesos de apoptosis por TGFB
Se necesita investigar más acerca del mecanismo del HBV para producir HCC
Conclusiones
mRNA de HBV actúa como ceRNAs de miR15a, regulando
así la señalización activada por TGFB
Pueden existir mas RNAs virales que puedan actuar
como ceRNAs y que jueguen un rol importante en varios
aspectos celulares
El HBV hace que las células sean más resistentes a los procesos de apoptosis y estimula la proliferación
celular
La infección por virus de Hepatitis B oculto (OBI): presencia de DNA de HBV en la ausencia del antígeno de superficie de Hepatitis B detectable.
VIRUS DE LA HEPATITIS B
TAXONOMIAFamilia Hepadnaviridae
Genero Orthohepadnavirus
Virus envueltoPartícula viral completa (Dane)
Capside icosaédrica (Core) Reservorio: humano.
Se han descrito 8 genotipos: de la A a la H. Diferente distribución geográfica y
variaciones en la presentación clínica.
Estructura del genoma viralADN circular de doble cadena parcial:o Cadena negativa: 3.2 Kb o Cadena positiva: 1.7-2.8 Kb
Codifica siete proteínas a partir de cuatro marcos de lectura abierta (ORF): S, P, C y X
o Antígeno de superficie del VHB (HBsAg)
o AntiHBs (anticuerpos contra el HBsAg)
o Anticuerpos contra la proteína Core del VHB tipo inmunoglubulina M (anti-HBc IgM) e inmunoglobulina G (anti-HBc IgG)
Introducción
• La infección por HBV crónica se caracteriza por la presencia del antígeno de superficie (HBsAg) positivo en suero y por la viremia.
• Caso OBI, persisten los niveles bajos de ADN HBV en suero y en tejidos del hígado, y no se observa presencia del antígeno HBsAg durante la infección crónica o aguda de HBV.
• OBI 4 procesos: transmisión, la reactivación, la contribución a la progresión de la fibrosis hepática y la formación de carcinoma hepatocelular (HCC)
OBI (Occult Hepatitis B Virus infection)
Definición: Presencia de ADN HBV en el hígado sin HBsAg (con o sin ADN HBV en suero).
El ADN HBV en suero puede ser detectable, sin embargo se observa en niveles muy bajos (<200 UI/mL))
Si los niveles de ADN HBV en suero son comparables a los que se detecta habitualmente en casos de infección, se presume un «Falso OBI»
«Falso OBI» Se considera una infección por mutantes de genes de escape S, que producen un HBsAg modificado que no es reconocido por los ensayos utilizados
generalmente.
En estos casos la mejor manera es realizar una determinacion de ADN HBV en hígado ya que el ADN HBV se detecta inclusp cuando HBV no esta presente en suero.
Otras definiciones
OBI: presencia de ADN del VHB detectable sin HBsAg, con o sin anti-HBc o anti HBs-anticuerpo fuera del período de pre-seroconversión.
Presencia de antígeno central de la hepatitis B aislado (anti-HBc) en ausencia de HBsAg y anti-HBs de anticuerpos
La ausencia de anticuerpo (anti-HBc) no excluye la presencia de un OBI seronegativos
Clasificación de OBI
OBI SEROPOSITIVO [anti-HBc and/or anti hepatitis B surface (anti-HBs) positive]
Casos que inician como una infección aguda y/o infección crónica y que posteriormente pierden la expresión del HBsAg.
OBI SERONEGATIVO(anti-HBc and anti-HBs
negative),
Casos en los cuales se cursa una infección sin detección de anti-HBs o anti-HBc debido a una mutación o debido a la pérdida progresiva de
anti-HBs. >20% de los casos no hay detección de los marcadores anti-HBc y/o anti-HBs (OBI seronegativo).
Tabla 1. Definición de casos de OBI.
Figura 3. Representación esquemática del ORF S.
“FALSA OBI”
Infecciones producidas por virus que presentan mutaciones en el HBsAg (mutantes de escape de genes S) las cuales producen un HBsAg modificado que no es reconocido por los anticuerpos utilizados en los kits de ELISA.
Epidemiología
La prevalencia de OBI se ha reportado entre un rango del 1% al 95% alrededor del mundo
- Diferencias geográficas
- Características de los pacientes
- Las diferentes técnicas de
diagnóstico OBI se observo con una mayor incidencia en lugares endemicos como Asia (41%-90% previa exposición a HBV)
La prevalencia de OBI es más alta en paciente con infección por HCV
OBI es más frecuente en pacientes con infecciones o enfermedades concominantes como VIH.
Mecanismos
1. OBI se caracteriza por una baja tasa de replicación in vivo; Sin embargo, las
cepas del HBV oculto son competentes para la replicación in vitro.
2. La reactivación a veces se produce en condiciones de inmunosupresión, gracias
a una ruptura del equilibrio entre el sistema inmune y el virus.
3.Estudios in vitro mostraron respuestas de células T antivirales durante varios
años después de la recuperación clínica de la hepatitis B aguda.
4. También la reacción inmune por células T de memoria, citoquinas y SII ,
son asociadas con OBI
Factores Huésped
Factores Virales
1. Las mutaciones de la región X de HBV reducen la capacidad de la proteína X del anfitrión para transcribir
proteínas celulares que son esenciales para la replicación viral.
2. La mutación de escape en la región S fue otro factor viral posible asociado con OBI, que también disminuye la reactividad en los ensayos de detección de HBsAg .
Figura 2. Estructura del genoma del virus de Hepatitis B.
Diagnostico
El estándar de diagnóstico OBI es la detección de ADN del VHB en la extracción de ADN a partir del hígado, como cccDNA persiste en los hepatocitos.
Una mayor tasa de detección de ADN del VHB se ha obtenido con tejido hepático-snap congelado que con tejido hepático en parafina.
Extractos de ADN deben ser amplificadas por PCR anidada altamente sensible o por PCR en tiempo real que detecte menos de 10 copias de ADN del HBV utilizando los cebadores específicos.
Significancia clínica Transmisión de
OBI
Transfusión de Sangre
Trasplante de Órganos
Hemodiálisis
Herencia parental
Reactivación
Evento frecuente en pacientes inmunocomprometidos con OBI, al incluir hepatitis sintomática y HBsAg re-seroconversión en la reactivación de la OBI
Progresión de la enfermedad
hepática crónica
Los genomas de HBV pueden persistir durante un largo tiempo en el hígado, induciendo leve necro-inflamación
Ocurrencia carcinoma
hepatocelular
VHB se integra en el genoma huésped, produce proteínas con actividades pro-oncogénicos, como las proteínas X y mutantes preS-S.
Conclusión
OBI: se define como la presencia de HV DNA sin el HBsAg detectable, sin embargo
no existe aún un método de detección estandarizado para estos casos. Así mismo
OBI puede ser trasmitido, y causar la reactivación de HBV, contribuir al desarrollo
de enfermedades hepáticas y de HCV
Referencias
• Rios, W., et al. (2013). Infección oculta por el virus de la hepatitis B. Aspectos clínicos epidemiológicos y moleculares. Acta Medica Colombiana, volumen 38, No. 3.• Toro, A., et al. (2011). Hepatitis B. Medicina y laboratorio, volumen
17, números 17 – 18.
