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Viernes 18 de setiembre, I PARTE Dr. Francisco AlvaradoTranscrito por Adriana Cordero

Toxicología Celular

La toxicología celular abarca fenómenos que se dan a nivel específico de cada célula. Dentro de estos fenómenos toxicológicos se encuentran:

Daño a la membrana plasmáticaFormación de puentes disulfuro entre las proteínas: provoca disfunción proteica y disfunción enzimática.Ruptura del Retículo EndoplásmicoInflamación e Hinchamiento de la mitocondriaAumento en los niveles de calcio.

Profesor: ¿De estos fenómenos, cuál es más importante a nivel toxicológico?

R/ Normalmente cuando se da una respuesta tóxica se da una combinación de todo, no es que uno de estos fenómenos va a ser más o menos importante que otro. Por ejemplo, el daño a la membrana plasmática se da cuando hay peroxidación lipídica. Cuando hay peroxidación lipídica, los ácidos grasos se van a ir cortando en fragmentos que son muy polares y la membrana se rompe. La ruptura del retículo endoplásmico es muy común.

Todos estos fenómenos van a generar condiciones de estrés celular. Estas condiciones de estrés activan mecanismos compensatorios que lo que hacen es inhibir esas respuestas. Por ejemplo, las proteínas chaperonas son una respuesta que tiene la célula al estrés.

Los daños a nivel celular no sólo son provocados por agentes tóxicos sino que también pueden ser provocados por:

Cambios de temperatura: por ejemplo las proteínas de choque térmico se producen cuando aumenta la temperatura, de ahí su nombre. Aumento de radicales libres: éste sí está ligado a agentes tóxicosRadiaciones ionizantes: por ejemplo radiación UV o gammaDeficiencia de ATP u otros cofactores importantes como NADH, NADPH, FADH2

La célula es una estructura muy compleja. La clase pasada les hablaba de los peroxisomas que son las organelas encargadas de degradar el peróxido de hidrógeno, el cual es uno de los agentes más tóxicos a nivel celular ya que produce el radical hidroxilo a través de la rxn de Fenton.

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Esta figura resume todas las organelas y todos los compartimentos que pueden sufrir daño, como: la membrana celular, los microtúbulos y filamentos de actina que conforman el citoesqueleto de la célula, las mitocondrias que son muy importantes en procesos como la apoptosis, los lisosomas que contienen enzimas que degradan proteínas y ¿? que ya no están funcionando correctamente

Al ser la célula una estructura tan compleja, podemos pensar que muchos estímulos pueden provocar toxicidad a este nivel.

Daño a la Membrana Celular

La estructura de la membrana la habíamos discutido en la primera clase. Ésta es muy importante porque es la que rodea la célula, es la que mantiene las organelas juntas y mantiene la diferencia en las concentraciones de diferentes iones (Na+, K+, Cl-).

Cualquier daño en la membrana que interrumpa la separación física entre el espacio intracelular y extracelular va a ser sumamente dañino para la célula.

Un ejemplo de esto son las concentraciones de calcio. Las concentraciones de calcio intracelulares son del orden de nanomolar mientras que las extracelulares son del orden micromolar. Si esta estructura se rompe, las concentraciones de este ión se van a estabilizar y esto va a generar toxicidad celular.

El daño a la membrana puede ser generado por muchos agentes, entre ellos:

Detergentes: solubilizan la membranaÁlcalis: destruyen los fosfolípidos que componen la membrana y forman un poro.Proteínas Formadoras de Poros (secretan muchas bacterias): estas proteínas tienen una capacidad enzimática que facilita que se polimericen y formen verdaderos poros a través de la membrana. Estos poros facilitan la entrada o salida de cualquier cosa básicamente.Peroxidación lipídica

Producen un daño

más directo

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Formación de Puentes Disulfuro entre proteínas: Se afecta la estabilidad de la membrana. Recuerden que una membrana puede ser muy rígida o muy fluida, esto depende de la cantidad de proteínas y del colesterol. Entonces si se desestabilizan las proteínas de la membrana, la membrana como un todo se va a desestabilizar.Esto es importante porque hay membranas que tienen mayor concentración de proteínas que otras. La membrana celular presenta un equilibrio entre fosfolípidos y proteínas, pero la membrana mitocondrial (la interna) está compuesta por un 90% de proteínas y un 10% de fosfolípidos. También existen membranas que contienen más fosfolípidos que proteínas.

Daño al Citoesqueleto

Los filamentos de actina y los microtúbulos cumplen funciones muy importantes en la mitosis y en la migración celular. Los microtúbulos además dan sostén a la célula, facilitan la adherencia a matrices extracelulares, facilitan la contracción y el movimiento (por ejemplo, en músculo el citoesqueleto es muy importante debido a que estas células están sujetas a cambios mecánicos de contracción y relajación). Cualquier sustancia que desestabilice estas estructuras proteicas va a tener un efecto importante a nivel celular.

La colchicina, por ejemplo, inhibe la formación de microtúbulos. Esto provoca que la célula se desestabilice y entonces cualquier efecto mecánico que se realice sobre ésta la pueda romper fácilmente debido a que la membrana es sumamente sensible.

Existen sustancias que provocan una alteración en la homeostasis del calcio y esta alteración provoca un daño sobre el citoesqueleto. Se han hecho estudios en los que se induce citotoxicidad en las neuronas y se ve que se forman calcificaciones en los axones de éstas. La alteración en los axones provoca una alteración microtubular que inhibe el transporte de neurotransmisores hasta la sinapsis. Este es otro ejemplo de daño al citoesqueleto.

El citoesqueleto está ligado a la membrana, por lo tanto cualquier agente que dañe el citoesqueleto va a dañar eventualmente la membrana plasmática.

Daño a la Mitocondria

La mitocondria tiene dos membranas (interna y externa), es una fábrica de energía y maneja materiales muy peligrosos como los electrones?. Cualquier salto que haya de los electrones en la cadena del oxígeno (creo que es la cadena respiratoria), genera radicales libres y los radicales lo que hacen es inestabilizar.

La mitocondria no sólo sintetiza energía sino que sirve de buffer para algunas sustancias, como lo que les he estado mencionando de los niveles de calcio que luego lo vamos a ver con más detalle.

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Además, la mitocondria es la iniciadora de una de las vías de apoptosis más importante que hay, que es la vía intrínseca. Cuando alguna sustancia daña la integridad de la membrana de mitocondria, se produce la liberación de factores solubles que son iniciadores de la apoptosis como el citocromo C.

La cadena de transporte de electrones forma parte del ciclo del ácido cítrico o del ciclo de Krebs. La fosforilación oxidativa inicia en el complejo I, donde el NADH le cede electrones al primer complejo. El Complejo II funciona con FADH2, no con NADH. Los electrones luego van a pasar a la Ubiquinona (Q), la Ubiquinona le cede los electrones al Complejo III y el Complejo III transfiere los electrones al Complejo IV a través de Citocromo C. Estos complejos proteicos sacan hidrógenos desde el interior de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.

El citocromo C no forma parte de la membrana, sino que está expuesto en el espacio intermembrana. Por tanto cualquier estímulo que rompa la membrana mitocondrial, va a provocar que el citocromo se salga y al salirse activa la vía de la apoptosis.

Si una sustancia bloquea el Complejo III, los electrones que no pueden transitar a través del Complejo III pasan al oxígeno, que es una de los agentes que está más disponible a nivel mitocondrial, y se van a producir radicales libres. Se va a producir el superóxido que si no es destoxificado rápidamente va a generar radicales libres como el hidroxilo que es el más peligroso.

El radical hidroxilo es el más peligroso porque tiene una vida media muy baja, entonces en el momento en que se encuentra activo se va a combinar con cualquier cosa y cuesta mucho eliminarlo.

TAREA: Buscar los nombres de los Complejos de la Cadena de Transporte de Electrones

Complejo I: NADH Deshidrogenasa o NADH-Q-Oxidoreductasa

Complejo II: Succinato Q Reductasa

Complejo III: Citocromo C Oxidoreductasa o Citocromo Reductasa

Complejo IV: Citocromo C Oxidasa

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Tomado de: http://books.google.co.cr/books?id=HRr4MNH2YssC&pg=PA537&lpg=PA537&dq=complejos+respiratory+chain&source=bl&ots=LSuIM3zrdu&sig=XwVW6KdRTv_du0MHjzONap3515A&hl=es&ei=SrDaSufHOcbR8Qa9tvi2BQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&ved=0CB4Q6AEwAg#v=onepage&q=complejo%20I&f=false

Disminución en los Niveles de ATP y otros Cofactores

El ATP es la moneda energética de la célula, una célula sin ATP no puede realizar ninguna función. Si una célula no tiene suficiente ATP probablemente entre en apoptosis y si la cantidad de ATP no es suficiente para provocar la apoptosis entra en necrosis.

Esto es muy importante porque las sustancias que intervienen con la fosforilación oxidativa van a disminuir inmediatamente la producción de ATP. Si se inhibe la fosforilación oxidativa, el ATP se obtiene por la vía de Fosforilación a Nivel de Sustrato que es la que se produce cuando la célula oxida la glucosa y se producen unas cuantas moléculas de ATP. Además, si se inhibe la fosforilación oxidativa, la célula no va a tener suficiente energía para entrar en apoptosis (proceso activo).

Otro punto importante es la activación masiva de mecanismos de reparación. Todas las proteínas que la célula utiliza para reparar, luego de haber sufrido un daño específico, requieren de ATP. Las Proteínas Chaperonas o las Proteínas de Choque Térmico, de las que se va a hablar más adelante requieren de Energía.

Entonces, si se activan las proteínas de Choque Térmico y los mecanismos de reparación de ADN, Imagínense lo que eso le puede producir a una célula que tiene la fosforilación oxidativa inhibida, cuánto ATP se va a consumir, qué va a pasar con esa célula que está sometida a un estrés muy grande. Todo esto es lo que va a llevar a que se active la necrosis o la apoptosis. Hay otros Cofactores que también son importantes como el NADPH, NADH y UTP.

Por ejemplo, El NADPH es el que le cede los electrones al Paraquat para formar radicales libres. El Paraquat entra en un ciclo redox, le roba los electrones al NADPH y se forma un radical, luego ese radical le cede los electrones al oxígeno. Al darse este ciclo redox una y otra vez, no sólo se van a producir radicales libres sino que también va a provocar una disminución del NADPH. Esta disminución del NADPH hace que la célula se desestabilice metabólicamente, produciendo estrés celular que es lo que finalmente la lleva a la muerte.

El NADPH también se requiere para el mantenimiento del Glutatión. Cuando el Glutatión está oxidado (GSSG) se requiere de una molécula de NADPH para que éste se reduzca a GSH. La disminución del NADPH provoca inhibición de la vía del Glutatión y por lo tanto pueden aumentar la cantidad de radicales libres o de proteínas disfuncionales.

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A manera de resumen, la disminución en los niveles de ATP y Cofactores va a provocar:

Incapacidad de mantener equilibrio iónico: esto debido a que la mayoría de las bombas que mantienen el equilibrio iónico son ATPasasAumento del contenido de agua intracelular: debido a que se está perdiendo el balance iónico que existía gracias a las bombas que se encontraban en las membranas de las diferentes organelas.Incremento en la fosforilación a nivel de sustrato: por lo que les decía anteriormente de que se inhibía la fosforilación oxidativaAcumulación de ADP, H+ y Mg2+: Al acumularse el H+ se produce una disminución del pH y esto va a provocar una desnaturalización de proteínas. Fallo de células excitables: Estas tres cosas? (no sé si se refiere a Acumulación de ADP, H+ y Mg2) producen por ejemplo, un daño en las células que son excitables debido a que las neuronas no se van a despolarizar y va a haber problemas de repolarización ya que ésta última es mediada por la Na+/K+/ATPasa. Si hay deficiencia de ATP la célula no se puede repolarizar y se va a producir excitotoxidad.La excitotoxidad se produce cuando la célula no puede compensar los mecanismos excitatorios a los cuales está siendo sometida, por ejemplo el receptor de Glutamato NMDA es un canal iónico que permite la entrada de calcio, cuando la célula está muy estimulada y no tiene mecanismos para compensar esa entrada de calcio, ésta muere ya que las células son muy sensibles a los niveles de calcio.La falta de energía impide la despolarización y repolarización de la célula, causándole la muerte.

Cambios en las Concentraciones de Calcio

El calcio es uno de los segundos mensajeros más importantes que existen, va a provocar mucha señalización y se va a unir muchas proteínas. Éste está involucrado en muchos procesos como la contracción muscular, liberación de vesículas, cambios conformacionales en el citoesqueleto de la célula y en los huesos.

Dentro de la célula existen muchas proteínas fijadoras de calcio como la Calmodulina. También están las Calpaínas que son proteasas que se activan cuando aumentan mucho los niveles de calcio y provocan una muerte “apoptosis like”, es decir es similar a la apoptosis pero no es exactamente apoptosis.

Las concentraciones de calcio intracelulares son del orden nanomolar mientras que las extracelulares son del orden micromolar.

La célula tiene que regular muy bien las concentraciones de calcio intracelulares. Para esto va a tener transportadores en la membrana que son bombas como la PMCA que es un transportador activo que saca el calcio de la célula. También va a tener canales de calcio que

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pueden ser voltaje dependientes o canales que por transporte facilitado permiten la entrada de calcio (ej: cuando la glucosa se une a su receptor en páncreas, se produce una entrada masiva de calcio que provoca la liberación de vesículas de insulina).

Además, existen intercambiadores Na+/Ca+2, que probablemente sean intercambiadores activos. Éstos estabilizan las concentraciones de ambos iones, sacando calcio y metiendo sodio.

El Retículo Endoplásmico es una de las reservas de calcio más importantes de la célula, de aquí es donde se libera el calcio cuando se va a dar la contracción muscular. Cuando se da una entrada masiva de calcio existen mecanismos que lo vuelven a introducir al retículo, como los SERCA (Sarco Endoplasmic Reticulum Ca+2 ATPasa). El SERCA se encarga de meter en contra de gradiente el Calcio que está aumentado en el espacio intracelular al retículo.

También puede ocurrir el fenómeno Liberación de Calcio inducida por Calcio. En éste un estímulo específico puede provocar la entrada de calcio y esa entrada de calcio va a activar transportadores que están en la membrana del retículo endoplásmico para que liberen más calcio, por eso se llama Liberación de Calcio inducida por Calcio. Los canales RyR (rianodina) se activan ante la presencia de calcio y liberan más calcio a nivel intracelular.

Los receptores de IP3 también son muy importantes. Se acuerdan que la Gq activa a la Fosfolipasa C, la cual corta el fosfatidil inositol en Diacilglicerol (se queda en la membrana) y en Inositol Trifosfato (IP3) que va a ir a retículo a activar estos canales.

La mitocondria es un buffer para la concentración de Calcio. Ésta también va a tener transportadores como los uniportes de Calcio y bombas.

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La mitocondria va a sentir cualquier elevación de calcio que haya a nivel intracelular. Primero va activar ATPasas que van a introducir el Ca+2 en la mitocondria y luego de que se activan las ATPasas si la concentración de calcio sigue elevada se abren canales iónicos para que se siga introduciendo el calcio a la mitocondria.

Un aumento en los niveles de calcio va a provocar que la mitocondria “se trague todo ese calcio”. Cuando hay una cantidad muy grande de calcio, lo primero que va a ocurrir en la mitocondria es que precipita el fosfato de calcio (como la mitocondria sintetiza ATP tiene mucho fosfato disponible) y esto le genera un daño. Esta gran cantidad de calcio también puede provocar que entre mucha agua y ésta se hinche.

A una mitocondria hinchada y llena de cristales de fosfato de calcio se le va a romper la membrana, se va a liberar el Citocromo C y va a entrar en apoptosis. Esto depende del número de mitocondrias dañadas.

A manera de resumen, lo que puede pasar es que se inhiban las bombas de calcio y por ende las concentraciones intracelulares van a aumentar. El influjo de calcio puede provocar daño a la membrana plasmática y este daño puede desencadenar necrosis. (creo que se refiere a lo que pasa si disminuye el ATP según la filmina)

El aumento del calcio puede provocar:

Alteraciones del citoesqueleto: debido a que el calcio provoca cambios conformacionales en el citoesqueleto de la célulaActivación de fosfolipasas ligadas al calcio como la fosfolipasa A2 o la fosfolipasa C.Activación de proteínas ligadas al calcio como las calpaínas, calmodulinas, receptores de rianodinaActivación de endonucleasas ligadas al calcio: Se producen cortes en el ADN los cuales son incompatibles con la vida. La endonucleasa ¿K? es la que se activa cuando se inician los procesos de apoptosis Activación de la expresión genética a través de las MAP quinasas (MAPK): (tarea que son)Entrada de calcio a la mitocondria: puede provocar daño y activación de los procesos de apoptosis.

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TAREA

Las MAP Quinasa o Proteín-Quinasas activadas por Mitógeno (mitogen-activated protein) (MAP)son quinasas de serina treonina. Participan en vías que controlan la embriogénesis, diferenciación celular, proliferación celular y muerte celular.Las cascadas de MAP quinasas están integradas por tres elementos consecutivos: MAPKKK (quinasa de la quinasa de la MAP quinasa), MAPKK (quinasa de la MAP quinasa) y MAPK (MAP quinasa); su secuencia indica el orden en el que los componentes se van activando consecutivamente mediante reacciones de fosforilación..Las MAPKKKs no se encuentran asociadas directamente con el receptor membranal, necesitan activarse por componentes intermediarios. Las MAPKKKs así activadas fosforilan los residuos de Ser/Thr (serina /treonina) catalíticos de las MAPKKs. Las MAPKKs finalmente activan al último miembro de la cascada fosforilando los residuos de Tyr y Thr (Tirosina y Treonina) localizados en la secuencia característica TxY, donde x representa a cualquier residuo. Una vez activada, la MAPK puede fosforilar directamente a proteínas que contengan al motivo fosfo-receptor Ser/Thr.

Tomado de: http://edrv.endojournals.org/cgi/reprint/22/2/153http://www.facmed.unam.mx/publicaciones/ampb/numeros/2005/01/e_4_11_MARIANA_SAUCEDO_GARCIA%5B1%5D.pdf

La entrada de calcio a la célula es normal, si aquí tenemos tiempo y aquí tenemos cn de calcio, la concentración de calcio se va a mantener cercana a la basal pero se van a estar presentando picos en la concentración.

Este esquema resume lo que puede ocurrir en la célula por la entrada masiva de calcio y que no puede ser contrarrestada por otros mecanismos compensadores de las células.

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Pregunta: Qué mecanismos pueden provocar una entrada masiva de calcio

R/ Excitotoxicidad, disfunción de ATP (las bombas no funcionan), sustancias que inhiban el transporte de calcio a través de la membrana

Explicación del Esquema:

Al disminuir el ATP, la función de los transportadores de calcio también disminuye y esto provoca un aumento de la concentración intracelular de calcio. El incremento del calcio genera un aumento de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno.

Los radicales libres formados inhiben la cadena de transporte de electrones y consecuentemente disminuye la glicólisis y la síntesis de ATP.

Entonces, el aumento de la concentración de calcio disminuye la síntesis de ATP y por ende la cantidad de éste último.

Por otro lado, el superóxido puede provocar destrucción del ADN o bien la formación de hebras simples de ADN que activan la proteína PARP, la cual disminuye la síntesis de ATP.

El calcio es un señalizador intracelular muy importante pero también produce citotoxicidad especialmente en la mitocondria.

Vean esta otra figura:

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Un insulto mitocondrial provoca una disminución de ATP y un aumento del Calcio y de las especies reactivas de oxígeno. Estas tres cosas en conjunto van a producir un MPT que es una formación de poros en la mitocondria.

Dependiendo del número de mitocondrias afectadas, puede ocurrir:

o Autofagia de la mitocondria(cuando hay pocas mitocondrias afectadas): la célula se come sus propias mitocondrias (las destruye) para que no se produzcan efectos tóxicos o dañinos a nivel celular.

o Activación de las caspasas (cuando hay más mitocondrias afectadas): se produce apoptosis

o Aumento muy grande del estrés oxidativo (cuando hay demasiadas mitocondrias afectadas): la célula muere por necrosis.

En esta célula se indujo excitotoxicidad, vean que todavía hay algunas mitocondrias enteras pero también hay otras que se alteraron con la entrada masiva de calcio. Lo primero que les ocurre es que se hinchan y se forman estos puntos negros que tiene alta densidad electrónica que pueden ser depósitos de fosfato de calcio.

Muerte Celular

Esta célula que está aquí se está muriendo por apoptosis y vean la morfología que tiene, se forman una serie de vesículas en su interior y la membrana está intacta (imagen de la izquierda). La imagen de la derecha muestra una célula fagocítica comiéndose a la célula que está en apoptosis. En la apoptosis se producen una serie

de fragmentos que se llaman cuerpos apoptóticos, los cuales son fagocitados por células del sistema inmune sin producir inflamación ni citoquinas.

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Esta otra célula murió por necrosis, vean como está la membrana. En necrosis se sale todo el contenido celular y esto genera inflamación. La inflamación es un mecanismo tóxico no sólo porque la célula se está muriendo, sino también porque a nivel local las citoquinas inflamatorias liberadas por las células del sistema inmune inducen muerte en otras células.En necrosis como se liberó todo el contenido celular, cuesta más eliminarlo y se produce inflamación.

Desde hace muchos años existía la pregunta de cómo se morían las células, y a pesar de que desde los años 70 se habían planteado muchas hipótesis fue hasta principios de la década de 1990 que se describió el mecanismo de apoptosis en el organismo C. elegans. Cuando se empezó a estudiar este mecanismo (apoptosis) en humanos se dieron cuenta de que era mucho más complicado.Vean todos los procesos que se pueden dar. Las proteínas BAX/BAK son las que forman los poros en la mitocondria y provocan la liberación del citocromo C.Una vez que se libera el CYP C se forma el Apoptosoma, éste activa la Caspasa 3 y después de ahí sigue toda la cascada hasta la muerte celular.

Existen dos vías de activación de la apoptosis, una de ellas es la vía extrínseca que viene a través de estímulos extracelulares como el TNF. Cuando los macrófagos liberan el TNF, éste se une a su receptor TNF 1 y esto produce señalización para que se dé la activación de las caspasas.

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Otro muy importante es el ligando Fas, el cual se une a su receptor y es capaz de activar a la Caspasa 8. Vean en la figura que está unido a pro-caspasa 8 (PC-8) y luego se libera la caspasa 8.

Por otro lado, la vía intrínseca lo que hace es formar poros en la mitocondria y esto produce activación de la Caspasa 9 que finalmente va a activar la Caspasa 3.

Todos los procesos intrínsecos y extrínsecos convergen en la activación de caspasa 3. Después de que se activa la caspasa 3, se activan la caspasa 7, la caspasa 6 y otra serie de enzimas proteolíticas que van a producir la apoptosis.

Normalmente no son las caspasas las que ejercen los programas de muerte celular, sino que éstas activan a otras proteínas que van a ¿… a otras proteínas?.

La vía extrínseca no tiene tanta importancia a nivel toxicológico, porque es provocada por estímulos que vienen de afuera, que nunca entran a dañar el interior de la célula. Por ejemplo, un linfocito T citotóxico tiene en su membrana un ligando Fas. Cuando éste detecta daño en la célula, lo que hace es unir este ligando al receptor de Fas de la célula dañada. Este receptor tiene unida la caspasa 8 y se activa la apoptosis por la vía extrínseca.

La vía intrínseca involucra daño a la mitocondria. Las proteínas BH 123 (BAX/BAK) se encuentran en la mitocondria en forma inactiva. Cuando éstas se activan, lo que hacen es polimerizarse para formar poros.

Las proteínas Bcl2 mantienen a las proteínas BH123 separadas evitando que se polimericen. Cuando se inhiben las proteínas Bcl2 por un estímulo apoptótico, las proteínas BAX/BAK forman poros en las mitocondria y se libera el CYP C.

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El CYP C se une al factor Apaf (Factor A Activador de Proteasas Apoptóticas). El Apaf unido al CYP C tiene un dominio reclutador de caspasas que se une con otros Apaf Activados y se forma el Apoptosoma.

Luego, el Apoptosoma se liga a Procaspasa 9, la cual se activa y forma Caspasa 9. Al activarse la Caspasa 9 se activan los programas de apoptosis.

NOTA: Las Caspasas son secretadas como zimógenos