verificación y validación del monitor de espectroscopía de...
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA
DIVISIÓN DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA ELÉCTRICA INGENIERÍA BIOMÉDICA
Verificación y Validación del Monitor de Espectroscopía de Impedancia Tisular
(EIT)
Alumna: Asesora: Laura Esther García Quinto Dra. Nohra Elsy Beltrán Vargas
México 2011
Con profundo respeto por la vida…
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por permitirme terminar ésta meta.
A mi familia, pues sin su apoyo no me hubiera sido posible realizar éste trabajo,
para ustedes todo mi amor e infinito y profundo agradecimiento. A ti Mamá todo
mi amor, porque puedes mirar en lo que se ha convertido tu hija, porque puedes
ver hacia atrás todas las dificultades vividas, mi respeto y admiración son tuyos…
A mi universidad, por todo lo invertido, por todo lo aprendido, en particular mi
sincero agradecimiento a mi asesora, por incentivarme, por no permitirme
desistir, por guiarme y por ayudarme, muchas gracias.
A mis amigos, mis hermanitos del corazón, por todas las vivencias, por todos los
recuerdos. De entre ellos a mi mejor amiga, mi hermanita del alma, muchas
gracias por estar siempre ahí para mí, todo mi cariño es tuyo.
A mi novio, por el apoyo y el cariño que me diste, junto a ti cierro una etapa de mi
vida y abro una nueva, llena de esperanzas…
A todas las personas que de una u otra manera me motivaron a seguir sin desistir,
a quien me ofreció un consejo o a quien simplemente me escuchó en los
momentos en los que lo necesité, para ti que me ayudaste tal vez sin saberlo, un
sincero agradecimiento.
Verificación y Validación del EIT
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INDICE
1. Introducción .................................................................................................................................................. 6
2. Objetivos ........................................................................................................................................................7
2.1 Generales ..................................................................................................................................................7
2.2 Particulares ..............................................................................................................................................7
3. Hipótesis .........................................................................................................................................................7
4. Antecedentes ................................................................................................................................................ 8
4.1 Estómago ................................................................................................................................................. 8
4.1.1 Anatomía del tracto digestivo ......................................................................................................... 9
4.1.2 Composición celular de la mucosa gástrica ................................................................................. 10
4.2 Isquemia y Mucosa gástrica ................................................................................................................. 12
4.3 Espectroscopía de Impedancia ............................................................................................................ 13
4.3.1 Estudios Previos de Validación ..................................................................................................... 14
4.4 Seguridad Eléctrica de Dispositivos Electromédicos: IEC 60601-1 ................................................... 15
4.5 Endomicroscopía Confocal .................................................................................................................. 17
4.5.1 Agentes de contraste fluorescentes .............................................................................................. 17
4.5.2 Descripción técnica del endomicroscopio confocal PENTAX. ................................................. 19
5. Metodología ................................................................................................................................................ 20
5.1 Verificación. Seguridad Eléctrica ........................................................................................................ 20
5.1.1 Documentación .............................................................................................................................. 20
5.1.2 Pruebas de Seguridad Eléctrica .................................................................................................... 20
5.2 Validación. Estudios pre-clínicos in-vivo en Ratas de Laboratorio .................................................. 23
5.2.1 Diseño Experimental ...................................................................................................................... 23
5.2.2 Análisis de Datos ........................................................................................................................... 24
Verificación y Validación del EIT
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6. Resultados ................................................................................................................................................... 26
6.1 Resultados de la Verificación. Seguridad Eléctrica ........................................................................... 26
6.1.1 Documentación Generada ............................................................................................................ 26
6.1.2 Resultados de las Pruebas de Seguridad Eléctrica ..................................................................... 26
6.2 Resultados de la Validación. Estudios pre-clínicos en Ratas de Laboratorio ................................ 28
6.2.1 Espectros de Impedancia .............................................................................................................. 28
6.2.2 Imágenes Confocales ..................................................................................................................... 32
6.2.3 Imágenes con Microscopio Óptico y Microscopio de Fluorescencia. ......................................34
7. Discusión. ..................................................................................................................................................... 41
Verificación: Seguridad Eléctrica............................................................................................................... 41
Validación: Estudios pre-clínicos in-vivo en Ratas de Laboratorio ....................................................... 42
8. Conclusiones. .............................................................................................................................................. 45
Trabajos citados .............................................................................................................................................. 46
Verificación y Validación del EIT
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1. Introducción
El daño tisular isquémico de la mucosa gástrica juega un papel determinante en la evolución
de los pacientes en estado crítico, ya que es el primer tejido que sufre un daño isquémico
debido a los mecanismos compensatorios del cuerpo, cuando éste se encuentra en estado de
choque.
Una vez que la barrera intestinal ha sufrido una ruptura, provocada por la isquemia, entran
al torrente sanguíneo depresores del sistema cardiovascular, endotoxinas y bacterias, los
cuales agravan la condición de choque, complicándola hasta causar una falla orgánica
múltiple (FOM) y ocasionar la muerte del paciente. (1) La FOM tiene una etiopatogenia
multifactorial, presenta un cuadro clínico bastante variado, no tiene un tratamiento
específico y no existen actualmente métodos clínicos de monitorización específicos y útiles
para evidenciar el estado de perfusión de los pacientes en estado crítico y así poder apoyar al
equipo médico en la toma de decisiones para establecer la terapia del paciente.
Investigadores de la UAM-I diseñaron y desarrollaron un sistema de monitorización del
daño isquémico tisular de la mucosa gástrica por el método de espectrometría de
impedancia compleja, el cual es útil para observar y determinar cambios en el tejido debidos
a la falta de oxigenación y perfusión.
El proyecto se encuentra en el proceso de validación como una herramienta clínica de gran
utilidad ya que otorga un valor pronóstico en la monitorización de pacientes en estado
crítico. (2)
Paralelamente se está haciendo el rediseño de las tarjetas electrónicas del prototipo,
cambiando los componentes obsoletos por otros integrados con mejores características y
desempeño. Además se busca el cumplimiento de los requerimientos de seguridad que
marca la FDA (Food and Drug Administration) para instrumentos médicos. Así el rediseño
implica, por supuesto, la verificación del prototipo mediante la aplicación de diferentes
pruebas de seguridad eléctrica.
Este proyecto tiene dos propósitos fundamentales, uno de ellos es realizar una serie de
pruebas de seguridad eléctrica al prototipo del espectrómetro de impedancia (EIT) utilizado
para realizar las primeras validaciones clínicas; el segundo es realizar un análisis para
relacionar los espectros de impedancia con el nivel de daño tisular causado por la isquemia
mediante endoscopía microscópica confocal, histología convencional y microscopía de
fluorescencia, con el fin de validar las mediciones de espectrometría de impedancia como un
método para determinar el daño tisular debido al choque.
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2. Objetivos
2.1 Generales
o Verificar que el EIT cumple con los requerimientos de seguridad eléctrica que
establece el estándar internacional EIT 60601-1.
o Cuantificar los cambios que ocurren a nivel tisular en la mucosa gastrointestinal
causados por isquemia y correlacionarlos con los cambios registrados en los
espectros de impedancia de la misma.
2.2 Particulares
Generar documentación básica del EIT.
Realizar pruebas de seguridad eléctrica al EIT.
Cuantificar los cambios en espectros de impedancia e imágenes endoscópicas
confocales de la mucosa gástrica de ratas utilizando diferentes agentes de contraste.
Verificar que la profundidad de los cortes hechos por el endomicroscopio confocal
sean los especificados por el fabricante.
Evaluar el efecto de los agentes de contraste utilizados para obtener las imágenes
confocales sobre las mediciones de espectroscopía de impedancia.
Comparar las diferentes técnicas utilizadas para evaluar el daño tisular.
3. Hipótesis
Los cambios en los espectros de impedancia de la mucosa gástrica entre los estados basal y
de choque presentan cambios estadísticamente significativos y están relacionados con el
nivel de daño tisular generado por isquemia, el cual es observable mediante diferentes
técnicas de imagenología.
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4. Antecedentes
4.1 Estómago
El estómago es una estructura semejante a un saco que en el adulto promedio puede
albergar alrededor de 1500 ml de alimento, aunque tiene una capacidad superior a los 3000
ml. (3) (4)Posee una curva interna cóncava hacia la derecha, llamada curvatura menor y una
convexidad externa hacia la izquierda, llamada curvatura mayor. (3) En el estómago, se
pueden diferenciar cuatro regiones principales (Figura ):
- Cardias. Región estrecha en la unión gastroesofágica, de 2 a 3 cm de ancho, marca la
función peristáltica. (3) (4)
- Fondo. Zona en forma de cúpula a la izquierda del esófago, suele estar llena de gas.
- Cuerpo. La parte más grande, encargada de formar el quimo. (3)
- Píloro. Porción en forma de embudo que incluye un esfínter pilórico grueso que
controla la liberación intermitente del quimo al duodeno. (3)
Figura . Principales regiones del estómago.
Todas las regiones presentan rugosidades, las cuales permiten expandir el estómago cuando
se encuentra lleno. El estómago es el encargado de licuar el alimento y continuar su
digestión mediante la producción de HCl y de la secreción de varias enzimas y hormonas. (3)
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4.1.1 Anatomía del tracto digestivo
La Figura muestra un corte transversal típico del tracto digestivo, formado de afuera hacia
dentro por las capas descritas a continuación.
Figura . Corte transversal del tracto digestivo.
4.1.1.1 Serosa:
Capa de tejido conectivo que envuelve a la capa muscular externa. (3)
4.1.1.2 Capa muscular:
Compuesta de la capa muscular longitudinal externa y la capa muscular circular interna, por
medio de éstas dos capas se logran llevar a cabo los movimientos peristálticos. (3)
4.1.1.3 Submucosa:
Se compone de un tejido conectivo que no contiene glándulas, el cual rodea a la capa
mucosa. (3)
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4.1.1.4 Mucosa
4.1.1.4.1 Muscularis mucosae: Consta de un tejido conectivo laxo. En esta capa se encuentra
una importante vascularización, gran cantidad de glándulas, vasos linfáticos y nódulos
linfoides. (3)
- Glándulas fúndicas o glándulas gástricas: Se encuentran contenidas en la lámina propia,
longitudinalmente, se subdividen en tres regiones: istmo, cuello y base. El epitelio cilíndrico
que la constituye está compuesto por seis tipos de células, las cuales se describirán en la
siguiente sección. (3)
4.1.1.4.3 Epitelio: Tejido que se encuentra en contacto con el bolo alimenticio, se invagina en
la mucosa formando fositas ó foveolas, las cuales son superficiales en el cardias y profundas
en la región pilórica, las foveolas incrementan el área de superficie del estómago. Al fondo
de cada foveola desembocan de cinco a siete glándulas gástricas de la lámina propia. (3)
4.1.2 Composición celular de la mucosa gástrica
La Figura muestra un esquema de las células que componen las glándulas fúndicas.
Células de recubrimiento de la superficie.
Elaboran una capa de moco viscoso, el cual es similar a un gel y protege al estómago de la
autodigestión. Dichas células muestran microvellosidades gruesas y cortas, su citoplasma
apical contiene gránulos homogéneos constituidos con una sustancia homogénea
(precursora del moco), y su núcleo se localiza en la base. Se encuentran en todo el epitelio. (3)
Célula regenerativa (madres).
Se encuentran de manera numerosa en el cuello de las glándulas gástricas, encargadas de
regenerar a todos los demás tipos celulares. Tienen un número importante de ribosomas, su
núcleo se encuentra situado en la base y muestran un nucléolo grande. (3)
Célula mucosa del cuello
Parecidas a las células de recubrimiento, sólo que se encuentra deformadas por la presión de
las células vecinas. Tienen microvellosidades cortas, el núcleo se encuentra situado en la
base y tienen el aparato de Golgi y el Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) bien
desarrollados. Secretan un moco soluble que lubrica el contenido gástrico. (3)
Célula oxintica (parietal)
Son grandes, de forma redonda/piramidal, se localizan en la mitad superior de las glándulas
gástricas, elaboran el HCl y el factor intrínseco gástrico. Tienen núcleos redondos,
localizados en la base. Son ricas en mitocondrias, cuyo volumen constituye casi la mitad del
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citoplasma, tienen el aparato de Golgi y el RER pequeños. Son el grupo celular más
susceptible a la falta de oxígeno. (3)
Figura . Composición celular de la glándula fúndica.
Célula cimógena (principal)
Se encuentran en la base de las glándulas gástricas, tienen RER en abundancia, aparato de
Golgi grande. Muestran microvellosidades cortas. Elaboran el pepsinógeno, renina y lipasa
gástrica. (3)
Célula del sistema neuroendocrino difuso (enteroendocrina)
Secretan hormonas endocrinas, paracrinas y neurocrinas. De manera general, tienen RER y
aparato de Golgi bien desarrollados, y múltiples mitocondrias. (3)
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4.2 Isquemia y Mucosa gástrica
Se conoce como isquemia a la condición clínica en la que falla la oxigenación para satisfacer
los requerimientos del metabolismo tisular. Entre sus causas se encuentran el insuficiente
suministro de oxígeno, la incapacidad de utilizarlo y/o aumento de la demanda debido a un
incremento en el metabolismo. Los fenómenos que caracterizan a la isquemia son los
propios del metabolismo anaeróbico: incremento de la razón ADP/ATP, acidosis por
producción de ácido láctico y acumulación de bióxido de carbono que se traducen en una
disminución del pH. (3) (1)
La manifestación más temprana de la inadecuada perfusión de los tejidos se presenta en la
mucosa gastrointestinal, la cual puede llegar a causar síndrome de gasto cardiaco bajo,
sepsis, falla orgánica múltiple y muerte. (5)
La isquemia de la mucosa gastrointestinal se debe a la acción de los vasoconstrictores los
cuales actúan cuando se presenta alguna descompensación que cause hipotensión arterial.
Limitan la circulación esplácnica para mantener el flujo sanguíneo en los órganos vitales. La
hipoxia afecta a la mucosa gastrointestinal haciéndola susceptible a los efectos de los ácidos,
enzimas proteolíticas y bacterias presentes en el lumen. Una vez dañada la barrera de la
mucosa se presenta la translocación de bacterias y la entrada de endotoxinas, productos de
la necrosis de la mucosa y contenido luminal a la circulación. (5)
Diversos estudios en pacientes críticamente enfermos, sugieren que el daño isquémico de
los órganos esplácnicos es altamente insidioso y al mismo tiempo difícil de detectar,
encontrándose hasta la autopsia. (1) (6) (7)
Debido a esto, se han desarrollado y evaluado varias terapias enfocadas a evitar o limitar los
efectos negativos del daño isquémico en la mucosa. Dependiendo la efectividad de dichas
terapias del estado de la mucosa al momento de la intervención. (8)
Es importante poder determinar si el daño a la mucosa es irreversible y si ha perdido su
función de barrera. Cuando el tiempo de isquemia es corto, se considera que se ha
presentado un daño isquémico todavía reversible, por lo que es óptimo prevenir o limitar
una situación de daño isquémico en la mucosa mediante técnicas de resucitación
hemodinámicas agresivas, vasodilatadores para aumentar la perfusión local, oxigenación
intraluminal y reducción de los requerimientos de oxígeno, eliminando focos de infección y
enfriando el tejido. También se puede prevenir el peligro de bacterias en la luz del tracto
digestivo, mediante antibióticos y lavados gástricos. (8)
Pero si el tiempo de isquemia es prolongado, se puede llegar a un punto en el que el daño
isquémico es suficientemente grave y es importante prevenir daño adicional por reperfusión
recurriendo al aislamiento del tejido, confinando endotoxinas y bacterias, también se debe
pensar en eliminar radicales libres por medios farmacológicos y limitación gradual de la
perfusión (5) (8)
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4.3 Espectroscopía de Impedancia
La espectroscopía de impedancia es un término que consta de la aplicación de corriente
alterna a un material, a diferentes frecuencias y del registro de los cambios de voltaje que
presenta dicho material, es decir su respuesta en frecuencia. (9) (10)
La espectroscopia de impedancia proporciona información útil acerca de la estructura
eléctrica de los tejidos y ha sido utilizada en la evaluación del daño isquémico. (9)
En la UAM-I se ha desarrollado un nuevo método de monitorización clínica del daño
isquémico de la mucosa gástrica (11) (12) (13) (14), el cual utiliza los principios de la espectroscopía
de impedancia compleja para caracterizar las propiedades bioeléctricas del tejido (15) y así
poder evaluar el nivel de daño de la pared gástrica debido a que éste es el primer órgano
afectado por la isquemia y tiene un papel importante en el desarrollo del estado de choque
del paciente en estado crítico.
Se trata de un método mínimamente invasivo, el cual consta de una sonda de
espectrometría de impedancia gástrica (GISP por sus siglas en inglés: Gastric Impedance
Spectroscopy Probe) y del prototipo de espectrometría de impedancia tisular (EIT), los que
se conectan como se muestra en la Figura .
Figura . Conexión del EIT.
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La GISP tiene en la punta 4 electrodos, como se muestra en la Figura . La corriente de
excitación pasa al tejido a través de las interfaces electrodo-tejido de los dos electrodos
externos y se distribuye de forma heterogénea. (16) Las mediciones complejas de voltaje se
realizan mediante los dos electrodos interiores y se obtienen los espectros de impedancia en
los rangos de 215Hz a 1MHz. (17) El EIT se conecta a la GISP y procesa la información
obtenida, mediante el uso de un algoritmo con el que se obtiene una estimación del nivel de
isquemia. (17) Para obtener el prototipo, pre-comercial se ha desarrollado y probado esta
tecnología durante los últimos diez años, la cual actualmente se encuentra patentada. (18)
Figura . Sistema de 4 electrodos de la GISP.
4.3.1 Estudios Previos de Validación
Los estudios realizados para validar esta nueva tecnología incluyen:
o Pruebas en modelos de choque inducido en animales (13) (19) con los que se demostró
que la espectroscopia de impedancia puede ser utilizada clínicamente para
monitorizar el nivel de daño isquémico de la mucosa intestinal, aunque no se
encontraron diferencias estadísticamente significativas entre la terapia guiada
convencionalmente y la guiada por espectroscopía.
o Un estudio para validar la naturaleza de las mediciones de impedancia por medio de
resonancia magnética y espectroscopía en conejos, donde se observó que el aumento
de impedancia refleja disoxia tisular y que no mide directamente la perfusión. (20)
o Un estudio para validar el umbral de seguridad de la corriente aplicada por
histopatología (16), en el cual se demuestra que la estimulación no causa daño al
tejido.
o Ensayos clínicos en voluntarios sanos y pacientes sometidos a cirugía cardiovascular
electiva (14), en donde se caracterizaron los espectros para cada grupo (sanos y
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enfermos) y se concluyó que la progresión del daño tisular no se detecta igual en
todas las frecuencias y se demostró que la alimentación y succión no son
contraindicaciones para el uso del espectrómetro.
o El diseño de un algoritmo para la estimación de los parámetros característicos de los
espectros de impedancia en humanos. (17) El algoritmo es una adaptación del modelo
de Cole y se determinó a partir de los resultados obtenidos de la caracterización de
los espectros de impedancia en humanos (14) en los que se observó que los mayores
cambios de impedancia en el tejido isquémico, ocurren a baja frecuencia. En
concreto, con éste algoritmo se determinó que la reactancia de baja frecuencia (XL),
es el parámetro más sensible y específico al daño tisular.
o Un estudio multicéntrico en unidades de cuidados intensivos de hospitales
diferentes (2) donde se confirma que existe una alteración de las mediciones de
impedancia en pacientes en estado crítico, y que los cambios son mayores en los
pacientes que fallecen.
En conjunto, los resultados de todos los estudios realizados han confirmado el gran
potencial de esta tecnología para convertirse en una herramienta clínica en el pronóstico y el
diagnóstico de los pacientes en estado crítico.
4.4 Seguridad Eléctrica de Dispositivos Electromédicos: IEC 60601-1
La complejidad de los dispositivos electromédicos aumenta de manera paralela al riesgo
asociado a su uso, ya que raramente se utilizan de manera aislada y el paciente en estado
crítico es el más vulnerable, ya que queda conectado a más de un dispositivo.
Debido a que se pretende introducir el uso de esta nueva tecnología para la monitorización
de pacientes en estado crítico, se debe asegurar que los riesgos asociados a su uso son
mínimos. Así mismo, durante el proceso de diseño se debería tener en cuenta el
cumplimiento del estándar IEC (Internacional Electrotechnical Comission, la cual es una
organización de normalización en los campos eléctrico, electrónico y tecnologías
relacionadas) 60601-1 que se relaciona con equipo electromédico.
Es por esto que se evaluó si el EIT cumple con los requerimientos relativos a la seguridad
eléctrica que establece el estándar IEC 60601-1 y/o de sus colaterales, la cual está
estructurada como se muestra en la Figura . De la revisión de la sección 8, que es la que se
evaluó en el presente trabajo, observamos la estructura que se muestra en la Figura .
Las tarjetas del EIT no fueron diseñadas con el propósito de cumplir los requerimientos de
este estándar así que las cláusulas 8.8, 8.9 y 8.10 no se evaluaron.
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Figura . Estructura general de la IEC 60601-1.
Figura . Estructura de la sección 8 de la IEC 60601-1.
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4.5 Endomicroscopía Confocal
La endomicroscopía confocal es una nueva modalidad de imagenología para el tracto
gastrointestinal de alta resolución la cual permite la observación de las estructuras celulares
de la capa mucosa. Con ésta técnica se obtienen imágenes histológicas in-vivo, permitiendo
así el análisis de diferentes enfermedades del tracto y la observación de la interacción celular
en el tejido. (21) En este proyecto se utilizará esta tecnología para observar los cambios
tisulares en la mucosa gastrointestinal con el fin de evidenciar que la sonda del EIT registra
cambios en la impedancia debido a la muerte celular causada por hipoxia.
4.5.1 Agentes de contraste fluorescentes
La fluorescencia ocurre cuando un fotón emitido a determinada longitud de onda incide
sobre los electrones de la capa externa de la sustancia fluorescente, llevándolos a un nivel
energético superior, cuando dichos electrones regresan a su estado basal liberan la energía
contenida por medio de un fotón emitido en una segunda longitud de onda. (22)
Un agente de contraste ideal es aquel que se asocia específicamente con la estructura de
interés, los agentes de contraste fluorescentes se conocen como fluorocromos. (23)
Es importante tener en cuenta diversos aspectos al momento de elegir el fluorocromo con en
el que se va a trabajar ya que cada sustancia tiene diferentes rangos de excitación y emisión.
Lo adecuado es seleccionar aquel fluorocromo que se excite con la longitud de onda de
emisión del láser con el que se va a trabajar. (24)
En una misma muestra, es posible combinar dos o más fluorocromos, siempre que tengan
un rango de excitación similar y un rango de emisión distinto, es decir, se busca que nuestro
instrumento excite a todos los componentes y discrimine los fotones emitidos por ellos. Sin
embargo, hay que tener en cuenta que las tinciones fluorescentes se solapan en la emisión
de los fotones. (24)
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4.5.1.1 Clorhidrato de Acriflavina
Llamado también tripaflavina. El clorhidrato de acriflavina es un fluorocromo que se asocia específicamente con los ácidos nucléicos debido a que es un colorante catiónico que se intercala entre los pares de bases. Es de color amarillo, soluble en agua y parcialmente soluble en etanol (23) (25)
Figura . Molécula de Clorhidrato de Acriflavina
Espectro de excitación (Ex) = 450 nm. (23) Espectro de emisión (Em) = 510 nm. (23)
El clorhidrato de acriflavina hace la tinción de los núcleos celulares en las capas celulares
más cercanas a la superficie hasta aproximadamente 50 µm, su uso aún no se encuentra
plenamente indicado, ya que al realizar el aumento del contraste nuclear puede inducir una
interacción bioquímica que tiene un riesgo de genotoxicidad, incluso con la aplicación
tópica, aunque no se conocen efectos cancerígenos hasta el momento. (26)
4.5.1.2 Fluoresceína sódica
Conocida también como Uranin. Es un fluorocromo con una fluorescencia verde, altamente soluble en agua y uno de los más populares, extensamente utilizado en inmunofluorescencia y en angiografía. Molecularmente, se asocia con el citoplasma celular. Características negativas: es un compuesto sensible al pH (la longitud de onda del espectro de emisión es directamente proporcional al pH) y con un espectro de emisión relativamente ancho, lo cual muchas veces propicia traslapes con otros fluorocromos. (23) (27)
Figura . Molécula de Fluoresceína sódica.
Espectro de excitación (Ex) = 490 nm. (23) Espectro de emisión (Em) = 510 nm. (23)
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La fluoresceína se distribuye con rapidez en el tejido y produce un contraste claro en el
intervalo del eje z. Proporciona un contraste de la arquitectura de los tejidos, permitiendo
visualizar vasos, células y tejido conectivo, aunque debido a sus propiedades no permite la
observación de los núcleos celulares de una manera directa. Algunos de los efectos adversos
de la fluorosceína, observados en aplicaciones oftalmológicas son reacciones alérgicas,
disminución de la presión arterial y complicaciones locales como tromboflebitis. En estudios
endomicroscópicos sólo se ha observado una decoloración transitoria de la piel y la orina. (26)
4.5.1.3 Dosis Administradas
En la mayoría de los estudios de endomicroscopía confocal se utiliza la fluorosceína sódica
(5-10 mL al 10%; aplicación intravenosa) o el clorhidrato de acriflavina (0.05% en solución
salina; aplicación tópica). (28)
En ratas, la dosis reportada en la literatura es de 0.02% de acriflavina disuelta en agua salina
para administración tópica y de 10 µL/g del peso corporal de fluorosceína para
administración sistémica. (29) (30) (31)
La administración sistémica de estos agentes de contraste tiene una respuesta rápida y
estable a través de todo el rango del eje z. (29)
4.5.2 Descripción técnica del endomicroscopio confocal PENTAX.
Para realizar la endomicroscopía confocal, se adaptaron a la parte distal del endoscopio los
componentes del microscopio láser, canales de agua y aire, dos guías de luz y un canal
auxiliar de agua, el cual se utiliza para la aplicación tópica de los agentes de contraste y un
canal de trabajo de 2.8 mm el cual sirve para la obtención de biopsias. Los diámetros de la
parte distal y el tubo de inserción son 13.4 y 12.8 mm, respectivamente. (28)
Durante la exploración endomicroscópica se utiliza un láser de estado sólido, el cual envía
una onda de excitación de 488 nm y detecta la fluorescencia en un rango de 505 a 585 nm (32)
(33), la máxima potencia de salida del láser es menor a 1 µW, en la superficie del tejido. (28) La
profundidad del plano de la imagen (eje z) se controla mediante dos controles situados en el
cabezal del endoscopio, desde la superficie hasta 250 µm. El campo de visión es de 475 x 475
µm, el grosor de la franja óptica es de 7 µm. La resolución (lateral y axial) es de 0.7 µm. (28) Se
pueden capturar series de imágenes con una velocidad de escaneo de 0.8 imágenes/s a 1024 x
1024 pixeles ó de 1.6 imágenes/s a 1024 x 512 pixeles, con una magnificación aproximada de
1000x en una pantalla de 48 cm. Las imágenes obtenidas se encuentran en escala de grises.
Además cabe resaltar que es necesaria la existencia de una interface estable entre el tejido y
la punta del microscopio. (28)
Es importante resaltar que las imágenes obtenidas son cortes transversales de la mucosa, a
diferencia de los cortes histológicos convencionales, los cuales son longitudinales.
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5. Metodología
5.1 Verificación. Seguridad Eléctrica
5.1.1 Documentación
De acuerdo a lo establecido en la CLÁUSULA 7.9.2.1 se generó un manual de usuario, el cual se
redactó en un lenguaje apropiado para el operador y contiene la información que sea más
probable de ser utilizada.
5.1.2 Pruebas de Seguridad Eléctrica
5.1.2.1 Descripción del EIT
5.1.2.1.1 Identificación de las funciones de desempeño esencial del EIT
De acuerdo a lo establecido en la CLÁUSULA 4.3 se identificaron las funciones de desempeño
esencial del EIT.
El EIT mide la impedancia compleja del tejido gástrico en un rango de 215 Hz a 1 MHz, por
medio de una sonda nasogástrica (GISP), a la cual se le adaptaron 4 electrodos que se utilizan
para inyectar una corriente de excitación al tejido y para obtener las mediciones de
impedancia.
La sonda es tipo Levin y posee dos lúmenes: uno para alimentación/succión y otro para el paso
de los cables que van hacia los electrodos. Los electrodos miden 1 mm de ancho y la separación
existente entre ellos es de 1 mm. (14)
La unidad de control se encuentra en una PC, la cual controla la recolección de datos, su
almacenamiento y el análisis de los mismos. La señal de excitación y el muestreo de los datos
son generados por el mismo reloj.
El EIT se encuentra calibrado a una resistencia nominal de 47 Ω y la corriente que se inyecta a
la mucosa gástrica a través de la sonda es de 1 mA. La densidad de la corriente de excitación es
menor que 1 mA/cm2, lo que no causa daños en el tejido y la estimulación aplicada no genera
cambios en las características lineales de la impedancia del tejido. (16)
Clasificación del EIT
El EIT se clasifica como equipo médico CLASE I, de acuerdo a lo establecido en la CLÁUSULA
6.2, debido a que cuenta con un sistema de aislamiento de protección simple.
Verificación y Validación del EIT
Página 21
5.1.2.1.3 Descripción de las Partes que Componen el EIT
- Sonda nasogástrica
Debido a que es una parte aplicada que incluye una conexión a paciente que inyecta una
corriente al paciente, se clasifica como una PARTE APLICADA TIPO BF ya que el
dispositivo tiene contacto con el paciente con una parte conductiva. Hay que resaltar que de
los componentes del EIT, la sonda nasogástrica es la única parte aplicada, según lo
establecido en las CLÁUSULAS 8.3 B) y CLÁUSULA 5.9.1
- Cable de interface eléctrica
Se utiliza para conectar la sonda nasogástrica con el módulo de adquisición/excitación. El
cable en condiciones normales de uso no tiene contacto con el paciente.
- Espectrómetro
Envía la señal de excitación al tejido y para generar la frecuencia de muestreo, éste módulo
se conecta a una PC.
- Convertidor dc
Se utilizan para alimentar el EIT.
5.1.2.2 Evaluación de las Condiciones de Prueba
5.1.2.2.1 Evaluación del Voltaje de Línea: Se realizaron tres distintas mediciones del voltaje
de línea para verificar que el equipo se evaluó en condiciones normales de uso, según lo
establecen: CLÁUSULA 5.5 A) CLÁUSULA 8.5.3 y CLÁUSULA 8.5.4.
5.1.2.2.2 Evaluación de la terminal de tierra del cable de alimentación: Se midió la
impedancia de la terminal a tierra del cable de alimentación, la CLÁUSULA 8.6.4 A) establece
que su valor debe ser menor a 100 mΩ.
5.1.2.3 Evaluación de las Corrientes de Fuga
Una corriente de fuga se define como una corriente que no es funcional. El estándar IEC
60601-1 define tres tipos de corrientes de fuga: corriente de fuga de tierra, corriente de fuga
de toque y corriente de fuga de paciente.
De acuerdo a la CLÁUSULA 8.4.1, los límites establecidos para las corrientes de fuga de
paciente y corriente auxiliar de paciente no aplican en la evaluación del EIT, ya que su
función esencial es inyectar una corriente que estimule el tejido gástrico.
Las pruebas se efectuaron tantas veces como fuera necesario para poder obtener las
mediciones correspondientes al peor caso de uso. Estos casos se simularon en el dispositivo
Verificación y Validación del EIT
Página 22
de medición y consisten en medir las corrientes en condiciones de polaridad normal o
invertida, de neutro y tierra abiertos o cerrados y en todas sus combinaciones.
De acuerdo a la CLÁUSULA 8.7.3 E), ninguna de las siguientes corrientes medidas, debe
exceder el valor de 10 mA r.m.s. bajo ninguna circunstancia.
5.1.2.3.1 Corriente de Fuga de Tierra: Es la corriente que fluye entre la tierra funcional del
equipo y la tierra física de la línea de alimentación a través o alrededor del medio de
aislamiento, de acuerdo a lo definido en la CLÁUSULA 3.25 y SUBCLÁUSULA 8.7.3
Se midió la corriente que fluye en la parte interna del chasis del EIT.
5.1.2.3.2 Corriente de Toque: Es la corriente que fluye del chasis o de partes accesibles al
operador y/o paciente, durante las condiciones normales de uso hacia tierra o cualquier otra
parte del chasis, según la CLÁUSULA 3.129 y SUBCLÁUSULA 8.7.3
Se hicieron diversas mediciones para cubrir las diferentes modalidades en que el operador o
el paciente, en condiciones normales de uso del EIT, puedan estar en contacto con la
corriente de toque. Entonces, se definieron las siguientes pruebas:
o Primer prueba: medir la corriente que fluye entre el chasis y la tierra física. El
paciente/operador debe representar un camino de mayor impedancia hacia tierra
física que el que representa la terminal de tierra de protección.
o Segunda prueba: medir la corriente que fluye en la parte externa del chasis del EIT.
El chasis del EIT deber representar un camino de menor impedancia entre dos
puntos que el que representaría el paciente/operador si toca esos mismos puntos.
o Tercer prueba: medir el valor de la impedancia del chasis externo. Igual que la
anterior.
Verificación y Validación del EIT
Página 23
5.2 Validación. Estudios pre-clínicos in-vivo en Ratas de Laboratorio
5.2.1 Diseño Experimental
5.2.1.1 Infraestructura
Los experimentos se realizaron en el quirófano experimental de la UAM-I. Se utilizó para la
captura de los espectros el prototipo 0013 del EIT y la sonda L002 en todos los experimentos.
Para la obtención de las imágenes confocales se utilizó el endomicroscopio confocal
"PENTAX" propiedad de la UAM-I.
5.2.1.2 Sujetos de Experimentación
Para el estudio, se utilizaron 8 ratas macho, con un peso mayor a 350 gramos en estado de
ayuno mayor a 12 horas.
5.2.1.3 Procedimiento
El experimento consistió en obtener imágenes confocales y espectros de impedancia de la
mucosa gástrica de las ratas en estados basal y de isquemia localizada en el estómago, la cual
se logró en dos tiempos: primero se ocluyó la arteria hepática y después la arteria gástrica.
En la Figura se muestra un diagrama donde se observa su localización dentro del abdomen
de la rata.
Figura . Arterias de la Rata.
Verificación y Validación del EIT
Página 24
El procedimiento quirúrgico constó de los siguientes pasos:
- Pesar la rata
- Anestesiar y amarrar a la rata
- Realizar una incisión abdominal para exponer el estómago de la rata
- Obtener espectros del estómago
- Aplicar agente de contraste, si aplica.
- Obtener imágenes confocales, si aplica.
- Ocluir la arteria hepática.
- Obtener espectros del estómago.
- Ocluir la arteria gástrica.
- Obtener espectros del estómago.
- Obtener imágenes confocales, si aplica.
- Extirpar el estómago de la rata, para su posterior procesamiento histológico.
- Sacrificar a la rata.
5.2.2 Análisis de Datos
Procesamiento de los Espectros
Se obtuvieron los espectros en estado basal y de choque para cada uno de los experimentos.
Después se calcularon los parámetros RL (Resistencia de bajas frecuencias), XL (Reactancia
de bajas frecuencias), RH (Resistencia de altas frecuencias) y XH (Reactancia de altas
frecuencias) para comparar los estados basal y de choque mediante un ANOVA para
determinar de esta manera si existen cambios significativos entre las mediciones realizadas.
Procesamiento de las Imágenes Confocales
Las imágenes obtenidas se agruparon de acuerdo al estado en el que fueron obtenidas y al
agente de contraste utilizado. Se seleccionó una serie de cortes obtenida en estado basal y
una en choque, ambas series teñidas con Acriflavina/Fluorosceína.
Procesamiento de las Muestras Histológicas
El estómago de la Rata 4 se extirpó después de haber sacrificado al sujeto de
experimentación, se identificó la zona que estuvo en contacto con la parte distal del
endomicroscopio, se tomó muestra de dicha zona para procesarla mediante la técnica
histológica de rutina. Primero se pasó el corte por el microscopio de fluorescencia y
posteriormente se tiñó con hematoxilina-eosina para su análisis histológico de rutina.
Verificación y Validación del EIT
Página 25
Figura . Estado basal.
Figura . Estado Isquemia1 (oclusión de la arteria hepática).
Figura . Estado Isquemia2 (oclusión de la arteria gástrica)
Verificación y Validación del EIT
Página 26
6. Resultados
6.1 Resultados de la Verificación. Seguridad Eléctrica
6.1.1 Documentación Generada
Manual de usuario, manual para análisis de datos.
6.1.2 Resultados de las Pruebas de Seguridad Eléctrica
6.1.2.1 Resultados de las Evaluaciones de las Condiciones de Prueba
6.1.2.1.1 Evaluación del Voltaje de Línea
Mediciones realizadas:
- Potencial entre vivo y neutro: 127.9 V r. m. s.
- Potencial entre vivo y tierra: 127 V r. m. s.
- Potencial entre neutro y tierra: 0.1 V r. m. s.
6.1.2.1.2 Evaluación de la Terminal de Tierra del Cable de Alimentación
El dispositivo de medición no dio ningún resultado numérico, ya que el máximo valor que
mide de la impedancia de la terminal a tierra del cable de alimentación es de 2Ω, así que la
impedancia de la terminal de tierra del cable de alimentación excede éste valor.
6.1.2.2 Resultados de las Evaluaciones de las Corrientes de Fuga
6.1.2.2.1 Evaluación de la Corriente de Fuga de Tierra
Tabla . Corriente de Fuga de Tierra.
Objetivo de la prueba Condición a evaluar
Valor Obtenido Polaridad Neutro
Se midieron las corrientes parásitas al
interior del EIT
Normal Abierto 39.7 µA r. m. s.
Cerrado 22.4 µA r. m. s. *
Inversa Abierto 40 µA r. m. s.
Cerrado 22.4 µA r. m. s.
*Medición correspondiente a las condiciones normales de uso
Verificación y Validación del EIT
Página 27
6.1.2.2.2 Evaluación de la Corriente de Toque
Tabla . Corriente de Toque.
Descripción de la prueba Condición a evaluar Valor
Obtenido Polaridad Neutro Tierra
Se realizó la medición entre chasis y tierra física.
Normal
Abierta Abierto 1.2 µA r. m. s.
Cerrado 0.9 µA r. m. s.
Cerrada Abierto 0.6 µA r. m. s.
Cerrado 0.5 µA r. m. s.
*
Inversa
Abierta Abierto 1.2 µA r. m. s.
Cerrado 0.9 µA r. m. s.
Cerrada Abierto 0.6 µA r. m. s.
Cerrado 0.5 µA r. m. s.
Se realizó la medición de la corriente que fluye entre dos
puntos del chasis externo. - - - 0.2 mA r. m. s.
Se medió el valor de la impedancia del chasis externo.
- - - 1.55 Ω
*Medición correspondiente a las condiciones normales de uso
Verificación y Validación del EIT
Página 28
6.2 Resultados de la Validación. Estudios pre-clínicos en Ratas de
Laboratorio
6.2.1 Espectros de Impedancia
Para la obtención de los espectros, se realizaron mediciones en estado basal y de choque,
divididas en cuatro tipos de experimento: en el experimento tipo I no se utilizó ningún
agente de contraste, en el tipo II se utilizó Acriflavina, en el tipo III se utilizó Fluorosceína y
en el tipo IV se utilizó la tinción Acriflavina/Fluorosceína. Lo anterior fue debido a que uno
de los objetivos específicos de este trabajo fue evaluar el efecto de los agentes de contraste
utilizados para obtener las imágenes confocales sobre las mediciones de espectroscopía de
impedancia.
Se realizaron 8 experimentos, de los cuales 3 fueron excluidos debidos a que las mediciones
tuvieron artefactos.
La Rata 1 tuvo un peso de 408 g. Se utilizó Acriflavina/Fluorosceína como agente de
contraste para el experimento en una concentración de 1 µg/Kg para la Acriflavina y de 100
µg/g para la Fluorosceína. Se administraron en total 1.5 mL de anestésico, se realizó un
cambio de sonda debido a que con la primer sonda no se registraron cambios en la
impedancia, al cambiar la sonda se observaron cambios en los valores de la impedancia. Se
ocluyó la arteria hepática a las 1:04 horas después de iniciado el experimento. La duración
del experimento fue de 2 horas.
La Rata 2 tuvo un peso de 360.85 g. Se utilizó Acriflavina con una concentración de 1 µg/Kg.
Se administraron en total 2.1 mL de anestésico. A las 1:53 horas de iniciado el experimento se
realizó una oclusión a la arteria hepática, después de 17 min. se ocluyó la arteria gástrica.
Después de transcurridas 2:42 horas después del inicio del experimento, se reventaron los
vasos obstruidos. Se tomó muestra histológica al final del experimento. La duración del
experimento fue de 4:48 horas.
La Rata 3 tuvo un peso de 424.87 g. Se adormeció a la rata para su traslado del bioterio al
quirófano con éter por inhalación, posteriormente se administraron en total 1.5 mL de
agente anestésico. Se utilizaron en total 0.2 mL de Fluorosceína como agente de contraste,
administrados por la arteria caudal. La Rata tenía alimento, por lo que fue necesario realizar
un lavado gástrico. A las 1:53 horas de iniciado el experimento se realizó una oclusión a la
arteria hepática, después de 12 min. se ocluyó la arteria gástrica. La duración del
experimento fue de 2:10 horas.
La Rata 4 tuvo un peso de 351 g. Se utilizar0n en total 0.45 mL de Fluorosceína
administrados por la arteria caudal y 0.24 mL de Acriflavina como agentes de contraste. Se
Verificación y Validación del EIT
Página 29
administraron en total 2 mL de agente anestésico. A las 1:20 horas después de iniciado el
experimento se realizó una oclusión a la arteria hepática, después de 1 hora se ocluyó la
arteria gástrica. A las 2:30 horas después de iniciado el experimento se realizó un lavado
gástrico debido al exceso de Acriflavina. La duración del experimento fue de 3:15 horas, al
final del mismo se extirpó el estómago para su procesamiento histológico.
A la Rata 7 se le administraron 4 mL de agente anestésico. Se utilizó
Acriflavina/Fluorosceína como agentes de contraste. La duración del experimento fue de 2
horas, al final del mismo se tomó una biopsia. En la Rata 8 se utilizó
Acriflavina/Fluorosceína como agentes de contraste. La duración del experimento fue de
1:48 horas.
Se graficaron los espectros obtenidos en los diferentes animales tanto en estado basal como
de choque, como se observa en la Gráfica y la Gráfica respectivamente. Como otro de los
objetivos era la cuantificación de los cambios de impedancia en el modelo de choque, en la
Gráfica se muestran los espectros de impedancia promedio tanto en resistencia como en
reactancia para las condiciones basal y de choque. Todos los resultados se muestran como
media ± desviación estándar.
Se calcularon los parámetros RL, XL, RH y XH calculados a partir de las variables espectrales
para cada una de las ratas y se realizó un ANOVA por estado. La Tabla corresponde a los
parámetros de la Rata 1, la Tabla corresponde a la Rata 2, la Tabla corresponde a la Rata 3,
la Tabla corresponde a la Rata 4, la Tabla corresponde a la Rata 7 y la Tabla corresponde a
la Rata 8.
Verificación y Validación del EIT
Página 30
Gráfica . Espectros para el estado basal.
Gráfica . Espectros para el estado de choque.
Gráfica . Espectros promedio para el estado basal y el estado de choque.
Verificación y Validación del EIT
Página 31
Tabla . Parámetros para la Rata 1.
Parámetro Basal Choque p
RL 64.5 ± 3.1 60.6 ± 3.2 0.390
RH 30.4 ± 0.9 31.2 ± 1 0.577
XL 7.2 ± 0.6 8.2 ± 0.7 0.287
XH 9.6 ± 0.8 9.2 ± 0.9 0.713
Tabla . Parámetros para la Rata 2.
Parámetro Basal Choque p
RL 75.4 ± 1.7 81.9 ± 1.4 0.006 *
RH 34.3 ± 0.7 35.9 ± 0.5 0.053
XL 7.4 ± 0.5 11.5 ± 0.4 0.000 *
XH 8.9 ± 0.2 8.5 ± 0.1 0.037 * *Estadísticamente significativo.
Tabla . Parámetros para la Rata 3.
Parámetro Basal Choque p
RL 52.9 ± 3.1 109.1 ± 3.4 0.000 *
RH 31.5 ± 1.5 49.2 ± 1.6 0.000 *
XL 3.1 ± 0.3 6.7 ± 0.4 0.000 *
XH 10.9 ± 0.8 31.8 ± 0.8 0.000 * *Estadísticamente significativo.
Tabla . Parámetros para la Rata 4.
Parámetro Basal Choque p
RL 52.7 ± 1.0 63.8 ± 1.5 0.000 *
RH 24.8 ± 0.6 33.3 ± 0.8 0.000 *
XL 9.9 ± 0.3 4.1 ± 0.4 0.000 *
XH 3.9 ± 0.2 15.1 ± 0.3 0.000 * *Estadísticamente significativo.
Tabla . Parámetros para la Rata 7.
Parámetro Basal Choque p
RL 46.4 ± 4.7 63.8 ± 4.5 0.015 *
RH 75.2 ± 4.8 109.2 ±4.6 0.000 *
XL 24.0 ± 1.8 21.1 ± 1.7 0.261
XH 21.2 ± 1.8 20.1 ± 1.7 0.847 *Estadísticamente significativo.
Tabla . Parámetros para la Rata 8.
Parámetro Basal Choque p
RL 70.3 ± 2.1 91.3 ± 1.6 0.000 *
RH 34.7 ± 0.6 35.6 ± 0.5 0.278
XL 7.6 ± 0.4 11.7 ± 0.3 0.000 *
XH 9.4 ± 0.4 16.3 ± 0.3 0.000 * *Estadísticamente significativo.
Verificación y Validación del EIT
Página 32
6.2.2 Imágenes Confocales
Paralelamente a la obtención de los espectros de impedancia para el estado basal y de
choque, utilizando cada uno de los agentes de contraste seleccionados, se realizó la
adquisición de imágenes con el endomicroscopio confocal, se agruparon las imágenes
obtenidas de acuerdo a cada tipo de experimento: experimentos con Acriflavina,
experimentos con Fluorosceína y experimentos con Acriflavina/Fluorosceína.
Los objetivos relacionados con la adquisición de imágenes fueron:
1. Comparar imágenes en estado basal y de choque, según el agente de contraste utilizado
(Acriflavina, Fluorosceína y Acriflavina/Fluorosceína).
2. Correlacionar la imagen del estado basal con el espectro en estado de impedancia para el
estado basal y la imagen del estado de choque con el espectro de impedancia en estado de
choque.
3. Comparar las imágenes de los cortes pertenecientes a diferentes niveles de profundidad en
el tejido para los estados basal y de choque, utilizando la tinción Acriflavina/Fluorosceína.
Se seleccionaron 6 imágenes, una por cada estado (basal y de choque) y cada agente de
contraste (Acriflavina, Fluorosceína y Acriflavina/Fluorosceína) y 2 series de cortes: una para
el estado basal y una para el estado de choque tomadas con la tinción
Acriflavina/Fluorosceína.
Criterios de Inclusión
Se incluyeron en el análisis aquellas imágenes que cumplieron con los siguientes criterios:
1. Que la imagen no tenga artefactos de movimiento, si ninguna imagen de la serie cumple
con dicha condición se elegirá una imagen que tenga una región sin dichos artefactos (a
dicha región la designamos como ROI: región de interés por su acrónimo en inglés).
2. Que la imagen sea nítida, o al menos, que sea nítida en la ROI.
3. Que la imagen no tenga una sobreexposición de agente de contraste (imagen muy blanca
o muy oscura), o al menos que dicha condición se cumpla en la ROI.
Verificación y Validación del EIT
Página 33
Procesamiento
El procesamiento de las imágenes se realizó en el programa Matlab R2009a, el algoritmo del
procesamiento de las imágenes se describe a continuación:
Valoración de la imagen.
En esta etapa se determinó si la imagen cumplió con los criterios de inclusión. Las imágenes
seleccionadas corresponden a:
Tinción con Acriflavina/Fluorosceína: Rata 4
Tinción con Acriflavina: Rata 2
Tinción con Fluorosceína: Rata 3
Pre-procesamiento de la imagen
Con propósitos de comparación de las técnicas de procesamiento de las imágenes, en esta
etapa de pre-procesamiento se creó a partir de la imagen original una imagen ecualizada
para ser procesada de la misma manera que la imagen sin ecualizar. En la Tabla . Imágenes
seleccionadas. se muestran las imágenes seleccionadas, en la columna izquierda se agrupan
las imágenes sin ecualizar con su histograma y en la columna derecha se muestran las
imágenes ecualizadas con su histograma.
Procesamiento y Definición de estado (Basal/Choque).
Esta etapa constó de dos procesos, cada uno con una función específica, la cual se describe a
continuación:
Definición de bordes.
Se aplicaron filtros diferenciales tanto a la imagen sin ecualizar y a la imagen ecualizada. Los
filtros diferenciales detectan cambios bruscos de intensidad en las imágenes y es por esta
razón que se utilizan para detectar y resaltar bordes de imágenes (34). En la Tabla . Definición
de bordes. se muestran los resultados de la aplicación de los filtros diferenciales a las
imágenes. En la columna izquierda se muestran las imágenes filtradas a partir de las
imágenes sin ecualizar y en la columna derecha se muestran las imágenes filtradas a partir
de las imágenes ecualizadas.
Verificación y Validación del EIT
Página 34
Conteo de infiltraciones.
En este segundo proceso la imagen sin ecualizar y las imágenes ecualizadas fueron
sometidas a un proceso de Binarización. Una Binarización consiste en definir un umbral
para el cual todos los valores de intensidad mayores al valor definido como umbral, se
convertirán en blanco y los menores a negro, de ésta manera se resaltaran los puntos que
contengan infiltraciones del agente de contraste (34). En la Tabla se muestran los resultados
de la Binarización de las imágenes. En la columna izquierda se muestran las imágenes
binarizadas a partir de las imágenes sin ecualizar y en la columna derecha se muestran las
imágenes binarizadas a partir de las imágenes ecualizadas. Los números que se encuentran
en la esquina inferior derecha de cada celda indican el número de infiltraciones en la
imagen.
Procesamiento de la serie de cortes para los estados Basal y de Choque.
Para las series de cortes, se utilizaron las imágenes obtenidas de la Rata 4, la cual fue teñida
con Acriflavina/Fluorosceína. En la Tabla se muestran las series de cortes para el estado
basal y para el estado de choque de las imágenes ecualizadas y sin ecualizar.
6.2.3 Imágenes con Microscopio Óptico y Microscopio de Fluorescencia.
El estómago de la Rata 4 fue extirpado al final del experimento para obtener cortes y realizar
su tinción con la técnica histológica tradicional Hematoxilina/Eosina. Debido a que durante
el experimento se utilizaron Acriflavina/Fluorosceína como agentes de contraste, se observó
el mismo corte en el Microscopio de Fluorescencia, y se obtuvo una imagen para la
Acriflavina y una imagen para la Fluorosceína.
En la Figura se muestra el corte teñido con Hematoxilina/Eosina observado en el
Microscopio Óptico, en la Figura se muestra el mismo corte observado en el Microscopio de
Fluorescencia para Acriflavina y en la Figura se muestra el corte observado en el
Microscopio de Fluorescencia para la Fluorosceína.
Verificación y Validación del EIT
Página 35
Tabla . Imágenes seleccionadas.
Sin ecualizar Ecualizada A
crif
lavi
na
Bas
al
1.1 1.2 C
ho
qu
e
2.1 2.2
Flu
oro
sceí
na
Bas
al
3.1 3.2
Ch
oq
ue
4.1 4.2
Acr
ifla
vin
a/F
luo
rosc
eín
a B
asal
5.1 5.2
Ch
oq
ue
6.1 6.2
Verificación y Validación del EIT
Página 36
Tabla . Definición de bordes.
Sin ecualizar Ecualizada A
crif
lavi
na
Bas
al
1.1 1.2 C
ho
qu
e
2.1 2.2
Flu
oro
sceí
na
Bas
al
3.1 3.2
Ch
oq
ue
4.1 4.2
Acr
ifla
vin
a/F
luo
rosc
eín
a B
asal
5.1 5.2
Ch
oq
ue
6.1 6.2
Verificación y Validación del EIT
Página 37
Tabla . Conteo de infiltraciones.
Sin ecualizar Ecualizada
Acr
ifla
vin
a B
asal
1.1
189
1.2
4294
Ch
oq
ue
2.1
81
2.2
4423
Flu
oro
sceí
na
Bas
al
3.1
135
3.2
2349
Ch
oq
ue
4.1
444
4.2
4150
Acr
ifla
vin
a/F
luo
rosc
eín
a B
asal
5.1
9
5.2
691
Ch
oq
ue
6.1
402
6.2
4169
Verificación y Validación del EIT
Página 38
Tabla . Comparación de las series de cortes.
Basal Choque
Sin ecualizar Ecualizada Sin ecualizar Ecualizada
1.1 1.2 1.3 1.4
2.1 2.2 2.3 2.4
3.1 3.2 3.3 3.4
4.1 4.2 4.3 4.4
5.1 5.2 5.3 5.4
6.1 6.2 6.3 6.4
7.1 7.2 7.3 7.4
8.1 8.2 8.3 8.4
Verificación y Validación del EIT
Página 39
Figura . Corte histológico teñido con Hematoxilina/Eosina.
Figura . Corte histológico visto con Acriflavina.
Figura . Corte histológico visto con Fluorosceína.
Verificación y Validación del EIT
Página 40
En la Tabla se correlacionan los parámetros RL y XL, calculados a partir de las variables
espectrales con los resultados obtenidos del conteo de infiltraciones para las imágenes
ecualizadas agrupados por rata y por estado.
Tabla . Tabla de relación entre parámetros espectrales y número de infiltraciones de las imágenes confocales.
RL XL Infiltraciones
Rat
a 2
Acr
ifla
vin
a B
asal
75.4 ± 1.7 7.4 ± 0.5 4294
Ch
oq
ue
81.9 ± 1.4 11.5 ± 0.4 4423
Rat
a 3
Flu
oro
sceí
na
Bas
al
52.9 ± 3.1 3.1 ± 0.3 2349
Ch
oq
ue
109.1 ± 3.4 6.7 ± 0.4 4150
Rat
a 4
A
crif
lavi
na/
Flu
oro
sceí
na
Bas
al
52.7 ± 1.0 3.9 ± 0.2 691
Ch
oq
ue
63.8 ± 1.5 15.1 ± 0.3 4169
Verificación y Validación del EIT
Página 41
7. Discusión.
Verificación: Seguridad Eléctrica
Condiciones de Prueba
Voltaje de Línea
El voltaje de línea se encontró en condiciones óptimas para operar el EIT. El dispositivo
utilizado para evaluar las condiciones de voltaje de línea también simula todas las
condiciones en que se puede encontrar la instalación eléctrica que alimentará el EIT, de ésta
manera se pudieron cubrir todas las posibilidades de evaluación en las pruebas simulando
así cualquier condición de uso del EIT.
Terminal de Tierra del Cable de Alimentación
La impedancia del conductor del cable de alimentación a tierra fue muy alta, lo cual nos
indica que el conductor de tierra no puede cumplir con su función como medio de
protección ya que no representa el mejor camino hacia tierra física, causando que las
corrientes de fuga busquen otros caminos con menor impedancia, representando esto un
riesgo para los pacientes y operadores, es necesario reducir la impedancia del cable de
alimentación.
Corrientes de Fuga
Corriente de Fuga de Tierra
La corriente de fuga de tierra que fluye a través del conductor hacia tierra, no representa un
peligro en sí, ya que el paciente y el operador se encuentran protegidos por los límites
establecidos para las corrientes de fuga de paciente y de corriente de toque, en condiciones
de uso normal o de falla simple. Sin embargo, un valor excesivo, puede plantear problemas
para la toma de tierra de la instalación.
Corriente de Toque
Los valores obtenidos de las corrientes, no excedieron el valor límite establecido en el
estándar, aún en condiciones de falla simple. Adicionalmente a las pruebas sugeridas en el
estándar, se diseñó una prueba que consistió en medir el valor de la impedancia entre dos
puntos externos del chasis, con el fin de evaluar si éste presenta una impedancia
relativamente menor que la que representaría una persona si toca dichos puntos, para
asegurar que la corriente de toque seguirá fluyendo a través del chasis y no a través del
operador/paciente. Valores bajos de impedancia del chasis nos asegurarán que la corriente
viajará a través de éste siguiendo el camino hacia tierra, entonces, de acuerdo al valor
obtenido, la impedancia del chasis resulta muy alta.
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Validación: Estudios pre-clínicos in-vivo en Ratas de Laboratorio
Con los resultados obtenidos de las mediciones hechas con el EIT, se pudo obtener una
caracterización para el estado basal y para el estado de choque de los espectros de
impedancia de las ratas de laboratorio, los espectros comparados se muestran en la Gráfica ,
en ella podemos apreciar un aumento en la impedancia adquirida para el estado de choque.
Con respecto al análisis estadístico, se generó un manual de usuario en el que se detalla el
procedimiento de adecuación de los datos para su posterior análisis, para la Rata 1 no se
observaron cambios estadísticamente significativos, ver Tabla , debido a dificultades con la
sonda de adquisición ya que no se obtuvieron mediciones con esta sonda, identificando el
problema la sonda se cambió y se pudieron realizar las adquisiciones. Para las Ratas 2 y 8
(Tabla y Tabla ) no se presentaron cambios en los valores de RH para los estados basal y de
choque, para la Rata 7 (Tabla ) sólo hubo cambios estadísticamente significativos en los
valores RL, y RH para los estados basal y de choque aunque las mediciones de reactancia
presentaron valores elevados desde el inicio del experimento, lo cual puede ser debido a que
la Rata tenía daño en la mucosa desde el inicio del experimento debido a la ruptura de los
vasos sanguíneos del estómago. Las Ratas 3 y 4 (Tabla y Tabla ) presentaron cambios
estadísticamente significativos en todos los parámetros analizados, siendo éstos
experimentos los que nos muestran que las adquisiciones hechas con el EIT son indicadores
directos del cambio en la mucosa gástrica de las ratas relacionado al tiempo de isquemia.
Es importante resaltar que se observa dicho comportamiento espectral en todas las ratas del
experimento, por lo que podemos decir que los agentes de contraste utilizados en el
experimento no influyen en las mediciones espectrales y que existe repetibilidad en las
mediciones realizadas independientemente del agente de contraste utilizado para el
experimento.
La caracterización espectral realizada es factible de mejorar si se aumenta el número de
ratas utilizadas para la promediación de los espectros, también convendría evaluar el diseño
de una sonda de adquisición del EIT más pequeña, adecuada para el estómago de la rata,
aunque de igual manera se pudiera considerar el uso de animales de experimentación más
grandes, como conejos o lechones.
Con respecto a la adquisición de imágenes con el endomicroscopio confocal existieron
algunos problemas para lograr la adquisición de las imágenes debido a que la punta distal
del endomicroscopio confocal es demasiado grande para el estómago de las ratas, otra
dificultad presente fue la ruptura de los vasos sanguíneos debido a que los mismos se
encontraron pinzados durante un tiempo prolongado y su ruptura ocasionó un
sangramiento en el estómago de la rata, hay que tener en consideración que las ratas son
animales con una gran resistencia física y aun con una interrupción localizada del
Verificación y Validación del EIT
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suministro sanguíneo al estómago fue necesario esperar mucho tiempo hasta ver los
cambios espectrales.
La Tabla nos muestra las series de cortes hechas por el endomicroscopio confocal, en las
series mostradas en la tabla encontramos útiles los primeros 5 cortes, a partir del sexto se
encuentran muy oscuras las imágenes, aún con el proceso de ecualización, por lo que se
propondría la utilización de un agente de contraste que permita adquirir imágenes a mayor
profundidad es decir, es necesaria la utilización de un fluorocromo con una mayor
penetración en el tejido. Los contrastes utilizados presentaron algunas incompatibilidades
con la naturaleza del experimento, teniendo en consideración el modo de administración de
los agentes de contraste para este experimento, las dificultades presentes fueron por una
parte que la acriflavina tiene una administración tópica, lo que favorece la adquisición de
imágenes en la parte más superficial de la mucosa gástrica pero es insuficiente para poder
observar las capas más profundas como la capa muscular y la fluorosceína es de
administración intravenosa y permite ver capas más profundas de la mucosa, la dificultad
con este agente de contraste reside en que para lograr la isquemia en este experimento se
pinzaron las dos arterias que irrigan al estómago lo que interrumpió el flujo del agente de
contraste al estómago.
Para el procesamiento de imágenes, primero se tuvieron que adecuar las mismas, mediante
un aumento en el contraste ya que esto mejora los resultados del procesamiento de las
mismas, se pueden observar los efectos del aumento de contraste de las imágenes en la
Tabla en ésta tabla las imágenes de la columna 2 fueron ecualizadas lo que permite
visualizar las imágenes con mayor detalle. Es importante siempre verificar que el
endomicroscopio tenga la resolución más alta durante la adquisición de las imágenes ya que
esto favorece.
El procesamiento para la detección de bordes presento una mayor sensibilidad a la
Acriflavina ya que claramente se observa que para el estado de choque utilizando Acriflavina
no hay una definición de bordes en la imagen, la imagen correspondiente se muestra en la
celda 2.2 de la Tabla , lo que nos indica que las membranas celulares se han roto, suceso que
tiene lugar durante la isquemia. Observamos en esta misma tabla que para el mismo estado
de choque pero utilizando Fluorosceína y Acriflavina/Fluorosceína, celdas 4.2 y 6.2
respectivamente, si se encuentran definidos los bordes, lo que no nos permite en estos casos
discriminar entre el estado basal y de choque.
El procesamiento para el conteo del número de infiltraciones tuvo una mayor sensibilidad a
la tinción hecha con Acriflavina/Fluorosceína, ya que presenta una mayor diferencia entre el
número de infiltraciones contadas para el estado basal que fue de 9 para la imagen sin
ecualizar y 691 en la imagen ecualizada, contra el numero de infiltraciones en estado de
choque el cual fue de 402 para la imagen sin ecualizar y de 4169 para la imagen ecualizada.
El número de infiltraciones, que parecen como puntos blancos en la imagen son el resultado
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de la entada del agente en los huecos dejados por las células que se han desprendido del
epitelio. Es muy probable que las primeras células que murieron y se desprendieron del
epitelio fueran las células parietales debido a su alta sensibilidad a la falta de oxígeno.
Es importante mencionar que el procesamiento se realizó en la capa R de la imagen, sería
bueno probar si se obtienen mejores resultados trabajando en las capas G o B, ya que
podrían relacionarse con el agente de contraste, de modo tal que como la Acriflavina
fluoresce en azul es probable que trabajar en la capa B nos muestre un mejor resultado en la
definición de bordes y de la misma manera para la Fluorosceína en la capa G para el conteo
de infiltraciones, ya que ésta fluoresce en verde.
La Figura nos muestra que efectivamente existe un daño en el tejido, en esta figura se
pueden apreciar las infiltraciones como puntos rojos y una deficiencia en la definición de las
membranas celulares. La Figura y la Figura nos muestran el mismo corte visto con
Acriflavina y con Fluorosceína respectivamente, y en ambas se pueden apreciar
infiltraciones, es por esto que me parece que el método que puede ser más efectivo para
poder discriminar entre estado basal y de choque en imágenes de fluorescencia es por
conteo de infiltraciones.
En la Tabla se correlacionaron los resultados obtenidos del procesamiento de los
parámetros espectrales con los resultados obtenidos del procesamiento de imágenes, a partir
de ésta tabla podemos afirmar que es posible cuantificar los daños ocurridos en la mucosa
gástrica a causa de la isquemia ya que los valores RL y XL presentan cambios
estadísticamente significativos entre el estado basal y de choque (p = 0.000) y que éstos
cambios se pueden observar si las imágenes adquiridas con el endomicroscopio se ecualizan
y se realiza un conteo de infiltraciones del agente de contraste en los huecos dejados por las
células que sufren desprendimientos del epitelio, siendo este conteo de 691 para el estado
basal y de 4169 para el estado de choque, dichas cifras nos muestran un cambio importante
en el número de células desprendidas del epitelio lo cual se encuentra relacionado a la
isquemia del tejido.
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8. Conclusiones.
En éste trabajo se tuvieron dos objetivos principales. Uno de ellos referente a evaluar la
seguridad eléctrica del EIT, el cual de acuerdo a las pruebas a que fue sometido no paso los
requerimientos que establece el estándar IEC 60601-1, esto es debido a que el EIT es un
prototipo no diseñado de acuerdo a las características establecidas en el estándar.
El otro objetivo del proyecto fue cuantificar los cambios debidos a la isquemia y
correlacionarlos con los datos adquiridos por el EIT, lo cual después de aplicar varias
técnicas de procesamiento fue posible mediante un aumento de contraste de la imagen
(ecualización) y el conteo del número de infiltraciones del agente en el tejido, de los agentes
de contraste utilizados, la tinción Acriflavina/Fluorosceína fue la más sensible al cambio
debido a isquemia. Comprobándose de esta manera nuestra hipótesis de trabajo.
También se pudo verificar la profundidad de los cortes hechos por el endomicroscopio
confocal, se encontró que se puede trabajar con las imágenes adquiridas a niveles
superficiales de la mucosa para determinar si existe o no daño celular, pero para realizar un
estudio más completo sobre los efectos de la isquemia en la mucosa gástrica será necesario
la utilización de un fluorocromo adecuado a la naturaleza del experimento, es decir que
tenga un poder de penetración hasta las capas profundas de la mucosa, y que el suministro
del agente sea constante durante todo el experimento.
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