vectores basales del virus 2 · pdf filede adn tales como los parvovirus, adenovirus,...
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k19 OFICINA ESPANOLA DEPATENTES Y MARCAS
ESPANA
k11 Numero de publicacion: 2 192 555k51 Int. Cl.7: C12N 15/861
C12N 15/12
A61K 48/00
k12 TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3
k86 Numero de solicitud europea: 92925180.9k86 Fecha de presentacion: 06.11.1992k87 Numero de publicacion de la solicitud: 0 566 732k87 Fecha de publicacion de la solicitud: 27.10.1993
k54 Tıtulo: Vectores basales del virus 2 adenoasociado.
k30 Prioridad: 08.11.1991 US 789917 k73 Titular/es:Research Corporation Technologies, Inc.Suite 600, 101 North Wilmot RoadTucson, AZ 85711-3365, US
k45 Fecha de la publicacion de la mencion BOPI:16.10.2003
k72 Inventor/es: Srivastava, Arun
k45 Fecha de la publicacion del folleto de patente:16.10.2003
k74 Agente: Curell Sunol, Marcelino
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacion en el Boletın europeo de patentes,de la mencion de concesion de la patente europea, cualquier persona podra oponerse ante la OficinaEuropea de Patentes a la patente concedida. La oposicion debera formularse por escrito y estarmotivada; solo se considerara como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa deoposicion (art. 99.1 del Convenio sobre concesion de Patentes Europeas).
Venta de fascıculos: Oficina Espanola de Patentes y Marcas. C/Panama, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Vectores basales del virus 2 adenoasociado.
La terapia genica implica la transferencia e insercion estable de nueva informacion genetica en lascelulas. La presente invencion se refiere a un vector seguro para la terapia genica y proporciona vectoreshıbridos de parvovirus capaces de integracion en lugares especıficos en los cromosomas de los mamıferossin citoxicidad sustancial y que pueden dirigir la expresion de los productos genicos deseados en celulasespecıficas. Los vectores hıbridos son utiles en la terapia genica, particularmente para el tratamiento delas hemoglobinopatıas.
Tambien se proporciona la utilizacion de vectores para la preparacion de una composicion para su-ministrar un producto farmaceutico. La presente invencion tambien proporciona la utilizacion de losvectores para la preparacion de una composicion para conferir resistencia a multiples farmacos a celulasespecıficas.
El tratamiento terapeutico de las enfermedades y los trastornos por terapia genica implica la trans-ferencia y la insercion estable de informacion genetica nueva en las celulas. La correccion de los defectosgeneticos por la reintroduccion del alelo de un gen normal que codifica la funcion deseada ha demostradoque dicho concepto es clınicamente posible [Rosenberg et al., New Eng. J. Med. 323:570 (1990)].
Las celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas progenitores pluripotentes son particularmenteutiles en los estudios de terapia genica ya que, aunque son celulas somaticas, se diferencian para pro-ducir todos los linajes de las celulas de la sangre. por consiguiente, la introduccion de un nuevo gen enuna celula germinal o progenitora resulta en la produccion de varios linajes que potencialmente puedenexpresar el gen exogeno o alterar el control de los productos de los genes nativos. La introduccion deun gen exogeno en una celula progenitora o cualquier otra celula adecuada requiere un procedimiento detransferencia genica para integrar el gen exogeno en el genoma celular. Aunque se han desarrollado unamultiplicidad de procedimientos fısicos y quımicos para introducir ADN exogeno en las celulas eucariotas,se ha demostrado que los virus son mucho mas eficaces para este proposito. Se han utilizado varios virusde ADN tales como los parvovirus, adenovirus, herpesvirus y poxvirus y virus de ARN, tales como losretrovirus, para desarrollar vectores eucariotas de expresion y clonaje. El problema fundamental con losretrovirus es que o son agentes etiologicos de o estan ıntimamente ligados a la malignidad. Los retrovirusse integran al azar en el genoma celular y ası pueden activar protooncogenes celulares o pueden desorgani-zar secuencias crıticas para la funcion celular. En consecuencia, la utilizacion de vectores retrovıricos parala transferencia genica representa un problema por que existe una posibilidad finita de que tales vectorespuedan inducir neoplasias. En consecuencia, existe la necesidad de vectores adicionales y mejorados parala transferencia genica.
Mientras que los retrovirus son frecuentemente los agentes etiologicos de las enfermedades malignas,los parvovirus constituyen el unico grupo de virus de ADN que no ha sido asociados todavıa con nin-guna enfermedad maligna. Aunque los parvovirus son frecuentemente patogenos para los animales, unparvovirus de origen humano, el virus adenoasociado 2 (AAV), no ha sido todavıa asociado con ningunaenfermedad humana conocida, incluso cuando el 90 % de la poblacion humana ha estado expuesta alAAV. [Blacklow, N. R. (1988) en: Parvovirus and Human Disease, CRC Press, Boca Raton]. Ademas,la mayorıa de los retrovirus utilizados para la transferencia genica son de origen murino, mientras queel AAV, un virus humano, es fisiologicamente mas relevante para la transferencia genica en los sereshumanos. Ademas, los retrovirus son susceptibles a la inactivacion por el calor y por los disolventesorganicos, mientras que el AAV es estable al calor, extremadamente resistente a los disolventes de loslıpidos y estable entre los pHs 3,0 y 9,0. En consecuencia como vehıculos para la transferencia genica, losparvovirus proporcionan muchas ventajas sobre los retrovirus.
En el documento WO 91/18088 se describen vectores eucarioticos basados en el virus adenoasociado(AAV) utiles para reprimir cualquier gen vırico o celular diana cuya secuencia sea conocida. En el do-cumento WO 88/08450 se dan a conocer vectores basados en AAV utiles para la terapia genica. Talesvectores comprenden el gen de resistencia a la neomicina bajo el control del promotor temprano del SV40flanqueado por los ITRs del AAV. El vector se esta empaquetado en un virion y se transduce en lascelulas de la medula osea del huesped.
Vincent et al. (Vaccines 90:353-359, 1990) ha descrito un sistema de vector de virus adenoasociadoutilizado para la replicacion y el empaquetamiento de los genes del sobre del HIV. El vector contieneel promotor 1 temprano inmediato del citomegalovirus. Srivastava et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:8078-8082, 1989) describe vectores que contienen las repeticiones terminales invertidas completas del
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AAV. Tales vectores contienen ademas la secuencia genomica casi completa del parvovirus humano B19.Ohi et al., Gene 89:279-282, 1990) construyo un vector de expresion de virus adenoasociado que contieneel cADN de la β-globina humana.
Los retrovirus recombinantes tienen tıtulos vıricos bajos (105-106 viriones/ml) (Rosenberg) en con-traste con los elevados tıtulos del AAV recombinante (108-109 viriones/ml) [Srivastava et al., Blood 76:1997(1990)].
En consecuencia, generalmente no es posible conseguir una eficacia de infeccion con retrovirus recom-binante de mas del 10 al 50 % de la poblacion de celulas diana, necesitandose para las infecciones exitosascelulas replicandose activamente. Por el contrario, se ha reportado una eficacia de infeccion del 70 % paraun AAV recombinante [Samulski et al., J. Virol. 63:3822 (1989)] y es posible conseguir una infectividaddel 100 % de las celulas diana con un virus AAV de tipo silvestre [Nahreini et al., Intervirol. 30:74 (1989)].Es mas, incluso si los vectores retrovıricos recombinantes se han hecho incompetentes para la replicacion,persiste una baja probabilidad de recombinacion entre el vector y las secuencias retrovıricas endogenas.Por el contrario, entre el 60 y el 90 % de la poblacion es seropositiva para los parvovirus humanos y nose han detectado todavıa secuencias vıricas endogenas en los donantes voluntarios. Sin embargo, en losvectores AAV recombinantes, todas las secuencias AAV codificantes han, sido eliminadas.
Quizas la ventaja mas significativa de los vectores con base en AAV es que se integran de forma estableen secuencias especıficas del ADN cromosomico del huesped. Los genomas retrovıricos, a continuacion dela transcripcion reversa, se integran en el ADN cromosomico del huesped con un patron de integraciontotalmente al azar. El AAV establece una infeccion latente en un lugar especıfico. El lugar de integracionha sido localizado en el cromosoma humano numero 19. (Kotin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:2211) (1990). Por consiguiente en las celulas de los mamıferos ha sido posible conseguir la insercionde ADN exogeno en un lugar especıfico. Mientras que los vectores retrovıricos median la integracion delas secuencias no vıricas en el cromosoma del huesped, el patron de integracion no siempre es estable.Frecuentemente el provirus retrovırico integrado se escinde de la celula. El AAV, por otra parte, estableceuna integracion estable.
A pesar de las ventajas potenciales remarcadas anteriormente, los vectores con base en parvovirussufren de una limitacion, que es el tamano de las secuencias de ADN que se pueden empaquetar en losviriones maduros. Por ejemplo, mientras que en un vector retrovırico se puede empaquetar un fragmentode ADN de hasta 8,0 a 9,0 kilo pares de bases (kbp), en un AAV se puede empaquetar un maximo de5,0 kbp de ADN. Tal limitacion de tamano, sin embargo, no impide el clonaje y el empaquetamiento dela mayorıa de las moleculas de cADN.
Los vectores con base en parvovirus ofrecen una alternativa de exitosa a los vectores retrovıricos parala terapia genica en los seres humanos. Mientras que los vectores con base en AAV permiten una inte-gracion de los genes transferidos estable en lugares especıficos, la transcripcion indiscriminada del gentransferido en todos los linajes celulares presenta problemas importantes. Por consiguiente, existe la ne-cesidad de vectores AAV que expresen el gene transferido de forma especıfica. De acuerdo con la presenteinvencion, un procedimiento, por ejemplo, para resolver este problema es mediante una combinacion delas caracterısticas del AAV y otro parvovirus, el B19.
Mientras que el AAV no causa ninguna enfermedad, se conoce que el B19 es el agente etiologico deenfermedades clınicas en los seres humanos. El B19 es el agente causante de crisis aplasicas transitoriasasociadas con varias anemias hemolıticas, el eritema infeccioso o la “quinta enfermedad”, la poliartralgiapost infecciosa y la trombocitopenia en los adultos, de algunos casos de fallo cronico de la medula oseay de hidrops fetalis.
El AAV depende de virus ayudantes, tales como los adenovirus, los virus herpes o los virus vacinia,para su replicacion optima. En ausencia del virus ayudante, el AAV establece una infeccion latente enla que el genoma del virus se integra en un sitio especıfico del cromosoma. El B19, por otra parte, es unvirus de replicacion autonoma que se conoce se replica solamente en las celulas hematopoyeticas humanasdel linaje eritroide. Tanto el AAV como el B19 contienen genomas de ADN lineal de cadena simple, perosus genomas no muestran homologıa al nivel de la secuencia nucleotıdica. Las secuencias nucleotıdicasde ambos genomas son conocidas. [Lusby et al., J. Virol. 34:402, (1980); Srivastava et al., J. Virol.45:555 (1983); Shade et al., J.Virol. 58:921 (1986)]. El genoma del AAV contiene repeticiones terminalesinvertidas (ITRs) de 145 nucleotidos, de los cuales 125 nucleotidos forman una horquilla palindromica quejuega un papel crıtico durante la replicacion del ADN del AAV. Las secuencias de los ITRs se muestranen la Fig. 1 y como SEC. ID n◦: 1. En las celulas con infecciones latentes, los terminos del AAV se
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encuentran en la conexion con las secuencias celulares y por consiguiente los terminos tambien facilitanla integracion y el rescate.
Las caracterısticas notables de los dos parvovirus humanos se pueden combinar, por ejemplo, en unvector hıbrido AAV-B19, para proporcionar los vectores segun la presente invencion. Los vectores de lapresente invencion son particularmente utiles para la transferencia genica en las celulas de medula osea yotras celulas hematopoyeticas. Tales vectores vıricos hıbridos median la integracion en lugares especıficosası como tambien la expresion especıfica del tejido de los genes heterologos en las celulas hematopoyeticas.
La presente invencion se refiere a vectores parvovirus hıbridos capaces de integrarse en un lugar es-pecıfico de un cromosoma de mamıfero sin sustancialmente producir citotoxicidad y que pueden dirigirla expresion especıfica en el tejido de un gene heterologo, es decir, un gen que no es de parvovirus. Masparticularmente, la presente invencion proporciona vectores que comprenden dos repeticiones terminalesinvertidas de virus adenoasociado 2 y por lo menos un cassette genetico que comprende un promotor ca-paz de producir la expresion en celulas especıficas operacionalmente unida a un gen heterologo, en el queel cassette reside entre las dos repeticiones terminales invertidas. En una forma de realizacion preferida,el promotor es el promotor p6 del parvovirus B19 y dirige la expresion especıfica del gen heterologo encelulas eritroides.
En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan celulas huesped transducidas por los vec-tores hıbridos de la presente invencion.
Otro aspecto de la presente invencion proporciona la utilizacion del vector segun la invencion parala preparacion de una composicion que comprende celulas de medula osea transducidas para el uso enla terapia genica, por ejemplo, para el tratamiento de las enfermedades hematopoyeticas, en particularlas hemoglobinopatıas. La composicion obtenida por transduccion de celulas germinales o progenitorashematopoyeticas con un vector de la presente invencion se introduce en un paciente, en el que se expresael gen heterologo.
Todavıa otro aspecto de la presente invencion proporciona la utilizacion del vector segun la invencionpara la preparacion de una composicion que comprende celulas de medula osea transducidas para la libe-racion de productos farmaceuticos en un mamıfero por transduccion de celulas germinales o progenitorashematopoyeticas con un vector hıbrido de la presente invencion e introducir las celulas transducidas enun mamıfero. El gen heterologo se expresa y el eritrocito maduro proporciona el vehıculo para liberar elproducto del gen heterologo a traves del torrente sanguıneo, al hıgado o al bazo.
Todavıa otro aspecto de la presente invencion proporciona el uso del vector segun la presente invencionpara la preparacion de una composicion que comprende celulas de medula osea transducidas para conferira celulas especıficas resistencia a multiples farmacos por transduciendo las celulas con un vector hıbridode la presente invencion en el que el gen heterologo es un gen para la resistencia a multiples farmacose introducir las celulas transducidas en un mamıfero. En una forma de realizacion preferida, el vectorhıbrido contiene el promotor B19p6 y, por consiguiente, confiere a las celulas eritroides el fenotipo deresistencia a multiples farmacos.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, transduccion significa un proceso por el cual las celulasadquieren ADN heterologo e integran dicho ADN heterologo en sus cromosomas. La transduccion sepuede lograr, por ejemplo, por transfeccion, que se refiere a varios procedimientos descritos mas adelantepor los que las celulas adquieren ADN, o infeccion, para la cual se utilizan virus para transferir ADN alas celulas.
La Figura 1 describe la secuencia de nucleotidos de un ITR del genoma de un AAV 2.
La Figura 2 describe la secuencia de nucleotidos del B19 desde el nucleotido numero 200 al nucleotidonumero 424 tal como lo numeran Shade et al., (1986).
La Figura 3 es un diagrama de la construccion del vector hıbrido de la presente invencion.
La Figura 4 demuestra la integracion locus especıfica del genoma del AAV de tipo silvestre en el ADNcromosomico diploide humano normal por analisis por transferencia Sauthern.
La Figura 5 demuestra la integracion locus especıfica del genoma de AAV recombinante en celulas demedula osea normal humanas por analisis de transferencia de Southern.
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La Figura 6 es un diagrama de la construccion del plasmido recombinante pWP-7A (Panel A) ypWP-19 (Panel B).
La Figura 7 es un diagrama de la construccion del plasmido recombinante pWN-1.
La Figura 8 es un diagrama de la construccion del plasmido recombinante pWP-21 y pWP-22 (PanelA) y pWP-16 y pWP-17 (Panel B).
La Figura 9 muestra el analisis por transferencia Southern del rescate y la replicacion del gen neor
recombinante en celulas humanas. Panel A: Rescate a partir del plasmido pWP-8A; Panel B: Rescate apartir del plasmido pWP-21; Panel C: Rescate a partir del plasmido pWP-22; Panel D: Rescate a partirdel plasmido pWP-16; Pane E: Rescate a partir del plasmido pWP-17. Se transfectaron independiente-mente los plasmidos recombinantes en celulas humanas KB infectadas con adenovirus (Carriles 1, 3, 5,7, 9), o cotransfectadas con plasmido ayudante pAAV/Ad (Carriles 2, 4, 6, 8, 10). m y d indican lasformas monomericas y dimericas, respectivamente, de los intermedios de replicacion del ADN de AAVrecombinante.
La Figura 10 es un diagrama de la construccion de un vector hıbrido en el que el gen de la resistenciaa la neomicina (Neor) se encuentra bajo el control del promotor del B19p6.
La Figura 11 es una grafica que describe la viabilidad celular despues de la transferencia de Neor
mediada por AAV a celulas germinales hematopoyeticas humanas. El Panel A ilustra la expresion delgen Neor bajo el control del promotor TK. El Panel B ilustra la expresion del gen Neor bajo el controldel promotor B19p6.
La Figura 12 describe los vectores recombinantes AAV de la presente invencion que contienen genesseleccionables bajo el control del promotor B19p6 y un amplificador eritroide especıfico humano (HS-2).
La Figura 13 describe los vectores recombinantes AAV de la presente invencion que expresan el gende la β-globina humana y el gen Neor .
La Figura 14 proporciona una transferencia Southern de ADN aislado de celulas K562 infectadas convHS2/β-globin-Neo.
La Figura 15 proporciona una transferencia Northern de ARN de celulas K562 infectadas con vHS2/β-globin-Neo y vHS2/B19-globin-Neo.
La presente invencion se refiere a vectores provıricos hıbridos que comprenden un par de repeticionesterminales invertidas (ITRs) de AAV que flanquean a por lo menos un cassette que contiene un promotorque dirige la expresion celular especıfica ligada operacionalmente a un gen heterologo. En este contextoheterologo significa cualquier secuencia de nucleotidos o gen que no es nativo de los parvovirus AAV oB19. Segun la presente invencion, las regiones codificantes AAV y B19 han sido eliminadas, produciendoun vector seguro no citotoxico. Mas adelante se describen genes heterologos representativos. Los ITRsde AAV, o las modificaciones de estos, confieren infectividad e integracion en un locus especıfico, perono citotoxicidad y el promotor dirige la expresion celular especıfica y preferiblemente la expresion encelulas eritroides utilizando el promotor p6 del parvovirus B19. Los vectores hıbridos de la presenteinvencion, proporcionan por consiguiente, moleculas de ADN capaces de integrarse en el cromosoma delos mamıferos sin toxicidad substancial. Dichos vectores hıbridos permiten la integracion segura del ADNen el genoma celular, ya que las partes del ADN responsables de la replicacion del parvovirus han sidoeliminadas y por consiguiente dichos vectores no pueden autorreplicarse.
Segun la presente invencion, el vector hıbrido comprende una primera y segunda repeticion terminalque flanquean un promotor conectado a un gen heterologo. Las repeticiones terminales pueden compren-der todas o parte de los ITRs del AAV. Las repeticiones terminales son responsables de la integracionestable de las secuencias de ADN en un lugar especıfico de un cromosoma en particular, p. ej. el cromo-soma 19. La secuencia de ADN completa, incluyendo los ITRs, el promotor y el gen heterologo se puedenintegrar en el genoma celular.
Las repeticiones terminales del vector hıbrido de la presente invencion se pueden obtener por digestioncon endonucleasas de restriccion del AAV o de un plasmido tal como el psub201, que contiene una genomamodificado del AAV [Samulski et al., J. Virol. 61:3096 (1987)] o por otros procedimientos conocidos por
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los expertos en la tecnica, incluyendo pero no quedando limitados a la sıntesis quımica o enzimatica de lasrepeticiones terminales con base en la secuencia publicada del AAV. El experto en la materia ordinariopuede determinar, por procedimientos bien conocidos tales como el analisis por deleccion, la secuenciamınima o que parte del ITR de AAV son necesarios para permitir la funcion, es decir, la integracionestable y en un locus especıfico.
Preferiblemente, cada una de las repeticiones terminales invertidas contenidas en el vector segun lapresente invencion comprende los nucleotidos de la secuencia SEC ID n◦:1. Mas preferiblemente, cadauna de dichas repeticiones terminales comprende los nucleotidos 1 a 125 de la SEC ID n◦:1.
El experto en la materia ordinario tambien puede determinar que modificaciones menores de la secuen-cia pueden ser toleradas a la vez que se mantiene la capacidad de las repeticiones terminarles para dirigirla integracion estable y locus especıfica. La integracion locus especıfica se puede valorar, por ejemplo, poranalisis por transferencia Southern. Se aısla ADN de las celulas transducidas por el vector de la presenteinvencion, digerido con una variedad de enzimas de restriccion y se analiza por transferencia Southerncon una sonda especıfica para AAV. Una banda de hibridacion unica pone en evidencia la integracionen un lugar especıfico. Se pueden utilizar otros procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica,tales como el analisis del ADN cromosomico por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) paradeterminar una integracion estable.
Los vectores de la presente invencion contienen un promotor que dirige la expresion en un tejidoespecıfico. Por ejemplo, el parvovirus silvestre B19 tiene un rango de huespedes limitado y muestra unnotable tropismo tisular por los componentes eritroides de la medula osea. En una forma de realizacionpreferida, el vector hıbrido de la presente invencion utiliza un promotor de transcripcion del B19 paraproducir la expresion especıfica en un tejido de las secuencias heterologas. En una forma de realizacionmas preferida el promotor es un promotor p6 del B19, activo en celulas progenitoras eritroides. La secuen-cia nucleotıdica del B19 desde el nucleotido numero 200 al nucleotido numero 424 tal como los enumeranShade et al., (1986) contiene el promotor p6 y esta descrita en la Figura 2 y en la SEC ID n◦: 2. En unaforma de realizacion preferida de los vectores segun la presente invencion el promotor de parvovirus B19comprende los nucleotidos de la SEC ID n◦:2.
La secuencia consensus similar a la de un promotor TATATATA se encuentra en el nucleotido 320 enel B19 (tal como los enumera Shade et al.) y por consiguiente es posible que la transcripcion se inicie 30nucleotidos corriente abajo. Se ha descubierto segun la presente invencion que los fragmentos de B19 quecontienen dichas secuencias dirigen la expresion especıfica en las celulas germinales eritroides y que laeliminacion de las secuencias codificantes del B19 corriente abajo del promotor evitan la replicacion delB19. Tal como se explico anteriormente, un experto en la tecnica puede determinar la secuencia mınimay las modificaciones del promotor p6 que proporcionan expresion celular especıfica, no citotoxica. Ellose puede determinar infectando celulas eritroides y no eritroides con vectores que contienen el promotorB19p6 y valorando la expresion del gen heterologo. La secuencia del promotor se puede obtener pordigestion del B19 o un plasmido de B19 clonado tal como el pYT103 o el pYT107 con endonucleasas derestriccion [Cotmore et al., Science 226:1161(1984)] o por cualquier otro procedimiento conocido por losexpertos en la tecnica, incluyendo pero no quedando limitado a la sıntesis quımica o enzimatica con baseen la secuencia publicada del B19. Se pueden obtener otros promotores de celulas especıficas por proce-dimientos analogos y la especificidad de tales promotores se puede determinar valorando la expresion enel tipo celular adecuado.
El promotor del vector hıbrido esta operacionalmente conectado con el gen heterologo. Cualquier genque se transcriba en dicha construccion esta contemplado en la presente invencion. En una forma derealizacion preferida, el gen heterologo codifica una proteına biologicamente funcional activa, es decir,un polipeptido o proteına que afecta el mecanismo celular de la celula en la que se expresa la proteınabiologicamente funcional. Por ejemplo, la proteına biologicamente funcional puede ser una proteına esen-cial para el crecimiento normal de la celula o para mantener la salud de un mamıfero. La proteınabiologicamente funcional tambien puede ser una proteına que mejore la salud de un mamıfero por supliruna proteına que falta o por proporcionar un mayor cantidad de una proteına que esta subproducidaen el mamıfero o por proveer una proteına que inhibe o contrarresta una molecula indeseable que puedeencontrarse en el mamıfero. La proteına biologicamente funcional tambien puede ser una proteına utilpara la investigacion de nuevas terapias genicas o para estudiar mecanismos celulares.
La proteına biologicamente funcional puede ser una proteına que sea esencial para el crecimiento nor-mal o la reparacion del cuerpo humano. La proteına biologicamente funcional tambien puede ser una quesea util para combatir una enfermedad tal como el cancer, la arteriosclerosis, la anemia falciforme y las ta-
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lasemeias. Son ejemplos de tales proteınas biologicamente funcionales la hemoglobina (α, β o γ-globina),factores de crecimiento hematopoyeticos tales como el factor estimulador de colonias de granulocitosmacrofagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de macrofagos (M-CSF), factor estimulador decolonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de los mastocitos, insulina y eritropoyetina (EPO).Otro ejemplo es el factor de necrosis tumoral (TNF), que es una molecula que puede ser utilizada paratratar el cancer y en particular, los tumores. Tambien se contemplan los supresores de tumores p53 yretinoblastoma (RB). Tambien son contempladas por la presente invencion varias citocinas como el factorde crecimiento de los mastocitos (MGS) y las interleucinas 1-11. La proteına biologicamente funcionaltambien puede ser un marcador de resistencia a antibioticos tal como el marcador selectivo para resis-tencia a neomicina en los eucariotas. Tambien se incluyen marcadores tales como la adenina fosforribosiltransferasa (APRT) en celulas deficientes en APRT, adenosin desaminasa o el gen de la luciferasa deluciernaga. Los genes heterologos que codifican tales proteınas se pueden proporcionar por una variedadde procedimientos, tales como los procedimientos rutinarios de clonaje (Sambrook et al.), excision devectores que tienen el gen de interes, o por sıntesis quımica o enzimatica con base en informacion delas secuencias publicadas. En muchos casos el ADN que codifica las proteınas de interes esta disponiblecomercialmente.
La proteına biologicamente funcional puede afectar los mecanismos celulares proporcionando unafuncion celular nueva o modificada. Por ejemplo, el gen heterologo puede ser un gen de resistencia amultiples farmacos (mdr) que codifica la glicoproteına P. La glicoproteına P es una glicoproteına de lamembrana celular que afecta la acumulacion intracelular de farmacos y es responsable del fenomeno deresistencia a multiples farmacos (ver como revision Biedler, Cancer 70:1799 (1992)].
En otra forma de realizacion el gen heterologo puede codificar una proteına no biologicamente funcio-nal. Por ejemplo, un gen hıbrido que comprende varios dominios y funciones de una variedad de fuentesse puede disenar y producir por procedimientos recombinantes o por sıntesis enzimatica o quımica.
En otra forma de realizacion preferida el gen heterologo se puede transcribir en una molecula de ARNque sea suficientemente complementaria para hibridarse a un mARN o ADN de interes. A partir deaquı, se referira a tal molecula de ARN como un ARN antisentido y tiene utilidad al evitar o limitar laexpresion de moleculas defectuosas o de otro modo indeseables. El vector de la presente invencion puedecomprender, como gen heterologo, una secuencia que codifica un ARN antisentido que es suficientementecomplementario a una secuencia diana como para unirse a la secuencia diana. Por ejemplo, la secuenciadiana puede ser parte del mARN codificante de un polipeptido de tal forma que se une a, y evita latraslacion del mARN que codifica al polipeptido. En otra forma de realizacion, la secuencia diana es unsegmento de un gen que es esencial para la transcripcion, de tal forma que el ARN antisentido se une alsegmento (p. ej. un promotor o region codificante) y evita o limita la transcripcion. Por consiguiente,el ARN antisentido debe ser lo suficientemente largo y complementario como para evitar la traslacion desu mARN diana o la transcripcion de su ADN diana.
En una forma de realizacion preferida el ARN antisentido es un 15mero y exhibe 100 % complemen-tariedad con la secuencia diana. Un experto en la tecnica puede determinar secuencias antisentido maso menos largas con suficiente complementariedad a una secuencia diana de tal forma que la moleculaantisentido es capaz de unirse a la diana y ası inhibir la traslacion o transcripcion. El gen heterologo sepuede proporcionar, por ejemplo, por sıntesis quımica o enzimatica, o de fuentes comerciales.
En otra forma de realizacion el ARN antisentido es complementario a un segmento del ADN o ARNque codifica la α-globina.
Es preferible que la longitud del gen heterologo sea tal que el tamano general del vector hıbrido tengaaproximadamente 5 kilobases (kb), ya que el lımite de empaquetamiento de los viriones de AAV es deaproximadamente 5 kb (Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984)).
Se puede proporcionar el vector hıbrido de la presente invencion insertando un gen heterologo y elpromotor especıfico de celula entre un par de repeticiones terminales derivados de AAV. A la combinacionde un promotor y un gen heterologo se la referira en la presente solicitud como a un cassette. Por consi-guiente, la invencion proporciona un vector en el que: 1) las repeticiones terminales median la integracionestable y especıfica en un lugar del genoma celular; y 2) el promotor media la expresion celular especıficade un gen heterologo, p. ej., en celulas eritroides, o el promotor media la transcripcion de un ARNantisentido o un ARN sentido codificante de un polipeptido de interes. La secuencia del promotor estaoperacionalmente unida al gen heterologo de forma que afecta la expresion del gen. Por consiguiente,la secuencia del promotor puede estar en uno cualquiera de los extremos o en los dos extremos de la
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secuencia heterologa o region codificante. Ademas, en un vector puede haber mas de un promotor y genheterologo, es decir, puede haber dos o mas cassettes entre los ITRs. En consecuencia, un vector puedeexpresar mas de un gen heterologo.
Los procedimientos estandar para la construccion de tales vectores hıbridos son bien conocidas porlos expertos en la tecnica y se pueden encontrar en referencias tales como Sambrook et al., (1989) enMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, o cualquiera de los multiplesmanuales de laboratorio sobre tecnologıa de ADN recombinante, que estan ampliamente disponibles. Sedispone de una multiplicidad de estrategias para ligar fragmentos de ADN, cuya eleccion depende de lanaturaleza de los extremos del fragmento de ADN y se puede decidir facilmente por un experto en latecnica.
Se contempla ademas de acuerdo con la presente invencion incluir en los vectores hıbridos otra se-cuencia de nucleotidos que facilitara la integracion del ADN en los cromosomas, la expresion del ADNy el clonaje del vector. Por ejemplo, la presencia de amplificadores corriente arriba o de terminadorescorriente abajo de la region codificante puede facilitar la expresion. En otro ejemplo, los estudios re-cientes han identificado lugares hipersensibles a la DNasa I (HS-2) corriente arriba del grupo de genesde la globina humana que incrementan significativamente la expresion especıfica en celulas eritroides delos genes de la globina. [Tuan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6384 (1985)]. En los vectoreshıbridos de la presente invencion, la presencia de HS-2 corriente arriba del promotor B19p6 incrementala expresion especıfica del tejido.
Tal como se describio anteriormente, los vectores de la presente invencion pueden ser construidos poruna multiplicidad de procedimientos bien conocidos y el orden de la ligacion de los elementos puede variar.En una forma de realizacion preferida el promotor especıfico de celula y el gen heterologo estan ligadosjuntos para proporcionar un cassette que se puede insertar entre dos ITRs de AAV. Por ejemplo, paraproporcionar un cassette que contiene el promotor de B19p6 y un gen heterologo, se inserta un fragmentoque contiene el promotor p6 en el plasmido pUC19, a continuacion de lo cual el plasmido que contiene elp6 se lineariza por corte con enzimas de restriccion corriente abajo del promotor p6. A continuacion elgen heterologo se inserta inmediatamente corriente abajo del promotor p6. Un fragmento que contienetanto el promotor p6 como el gen heterologo se escinde del plasmido y se insertan entre los ITRs del AAVen un plasmido AAV del que se han eliminado las regiones codificantes del AAV. El plasmido resultantecomprende el promotor p6 y el gen heterologo flanqueado por un par de ITRs de AAV. La construccionse describe mas especıficamente tal como sigue y se diagrama en la Figura 3. Para generar un plasmidoque contiene p6, se aısla un fragmento que contiene el promotor p6 de B19 del ADN de B19 o del B19clonado [ver, por ejemplo, Cotmore et al., (1984); Shade et al., (1986)]. En una forma de realizacionpreferida dicho fragmento de B19 corresponde a los nucleotidos 200 a 480 tal como los enumeran Shadeet al, (1986) y contiene la region 5’ no codificante completa y el promotor p6 de B19. Dicho fragmentode 280 pares de bases esta flanqueado por los lugares de restriccion EcoRI y XbaI y se puede generarpor corte con dichos enzimas de restriccion. Dicho fragmento se clona en los lugares EcoRI-XbaI depUC19 para generar el plasmido pB19p6. Los expertos en la tecnica reconoceran que se pueden utilizarotros plasmidos y lugares de restriccion para generar un vector que comprende un promotor B19p6. Porel contrario, se puede sintetizar el promotor B19p6 quımicamente o enzimaticamente con base en lassecuencias publicadas y ligarlo al gen heterologo.
Un gen heterologo se puede unir operativamente corriente abajo del fragmento del promotor B19p6como sigue. El plasmido pB19p6 se corta con HincII, que corta el ADN de B19 corriente abajo delpromotor p6 (es decir en el nucleotido 424) y tambien en el lugar de clonaje multiple de pUC19. Elgen heterologo deseado se liga por los extremos romos corriente abajo del promotor B19p6 entre los doslugares HinCII para generar un inserto del plasmido pB19p6. El tecnico experto en la materia reconocerauna multiplicidad de procedimientos, tal como se ejemplifican, p.ej. Sambrook et al., (1989), para ligarun fragmento que contiene un promotor especıfico de celula con un fragmento que contiene el gen he-terologo. Segun la presente invencion, se han utilizado como genes heterologos las secuencia codificantesde GM-CSF, APRT, neor , el gen de retinoblastoma, α-globina, β-globina y γ-globina, resultando enla construccion de vectores hıbridos, designados AAV-B19-GM-CSF, AAV-B19-APRT, AAV-B19-neor ,AAV-B19-RB, AAV-B19-α-globina, AAV-B19-β-globina y AAV-B-19-globina, respectivamente. Tambiense contempla especıficamente un gen de resistencia a multiples farmacos codificante de la glicoproteınaP como el gen heterologo. Las secuencias codificantes de los respectivos genes son conocidas [Lee et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4360 (1985) (GM-CSF); Broderick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:3349 (1987) (APRT); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985) (Neo∗); Huang et al., Science242:1563 (1988) (RB-1); Liebhaber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7054 (1980) (α-globin); Lawnet al., Cell, 21:647 (1980) (β-globin); Enver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7033 (1989) (γ-
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globin); Roninson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4538 (1986); Roninson et al., en Molecularand Cellular Biology of Moltidrug Resıstanse in Tumor Cells (ed. Roninson, Plenum Press, NY) 91-106(1991); Schinkel et al., Cancer Res. 51:2628 (1991); Chen et al., J. Biol. Chem. 265:506 (1990) (mdr)] y,por consiguiente, se pueden proporcionar facilmente tal como se describio anteriormente en la presentesolicitud.
El plasmido del inserto pB19p6 ejemplifica un cassette promotor-gen heterologo que se puede aislarpor digestion del plasmido, por ejemplo, con EcoRI y HindIII u otros enzimas de restriccion adecuadosy luego ligar entre dos ITRs de AAV. Los ITRs de AAV se proporcionan por, por ejemplo, digestion conenzimas de restriccion del ADN de AAV o del ADN de AAV clonado, o por sıntesis quımica o enzimaticacon base en las secuencias de los ITRs de AAV publicadas [Lusby et al., (1980)]. En una forma derealizacion preferida, los ITRs de AAV comprenden los 145 nucleotidos mostrados en la Figura 1. Losfragmentos que contienen los 125 nucleotidos que forman la horquilla palindromica (nucleotidos 1-125de la Figura 1) o fragmentos mas largos que contienen los 191 nucleotidos terminales del cromosomavırico tambien son utiles. Tambien se pueden utilizar en la construccion secuencias endogenas terminalesadicionales, por ejemplo conectores para facilitar el clonaje y la ligacion. En una forma de realizacionpreferida, los ITRs del AAV son proporcionados por un plasmido, p.ej. psub201 [Samulski et al., (1987)]que tambien es un derivado de AAV en el que se han introducido lugares de corte XbaI en las posiciones190 y 4484 de la secuencia y los 191 pares de bases del extremo derecho del genoma vırico han sidosustituidos por el dominio de 190 pares de bases del extremo terminal izquierdo normal. Tal modificacionresulta en la extension de las repeticiones terminales psub201 a 191 pares de bases. Los lugares de corteXbaI permiten la sustitucion de las regiones codificantes de AAV con secuencias exogenas, por ejemplo,del promotor de B19 y un gen heterologo, de forma que las secuencias exogenas quedan flanqueadas porlos ITRs del AAV. Los derivados del psub201 disenadas para contener otros lugares de restriccion, talcomo se demuestra en los Ejemplos 2 y 3, tambien son utiles para proporcionar los ITRs de AAV.
Para sustituir el inserto B19p6, es decir, el cassette, por las regiones codificantes de AAV, se digierepsub201 con XbaI para eliminar las regiones codificantes de AAV. El ADN de vector plasmıdico quecontiene el ITRs de AAV se aısla y se liga a la construccion del inserto B19p6. Se puede facilitar laligacion anadiendo adaptadores a los ITRs de AAV y conectores al inserto de B19-p6.
Por ejemplo, en otra forma de realizacion proferida los vectores de la presente invencion se construyenpor modificacion de los lugares XbaI introducidos del psub201 para proporcionar lugares de restriccionadicionales, eliminando las regiones codificantes de AAV por digestion con los enzimas de restriccionapropiados y ligando el inserto de cassette B19p6 al ADN del plasmido que contiene los ITRs de AAV.La construccion de vectores plasmıdicos prototipo que contienen los ITRs de AAV pero no las regionescodificantes de AAV y que ademas contienen lugares de clonaje para facilitar la insercion de cassettescon promotores de genes heterologos, se ejemplifican en los Ejemplos 2 y 3.
El plasmido resultante comprende un promotor con especificidad celular corriente arriba de la secuen-cia heterologa, tanto uno como el otro flanqueados por los ITRs de AAV. El orden de las ligaciones, lanaturaleza de los extremos complementarios, el uso de conectores y adaptadores y otros detalles puedenser modificados segun sea necesario por un experto en la tecnica para proporcionar el vector hıbridoAAV-B19 de la presente invencion.
Para establecer la integracion del ADN del vector en el cromosoma de la celula huesped, se transfectanlas celulas huesped con el vector o se infectan con viriones maduros que contienen los vectores hıbridos.Los procedimientos para la transfeccion de ADN son bien conocidos por los expertos en la tecnica e in-cluyen, por ejemplo, la transfeccion con ADN desnudo, la micro inyeccion y la fusion celular. Se consigueuna integracion mas efectiva por infeccion con viriones que contienen los vectores hıbridos.
Los viriones se pueden producir por coinfeccion con un virus ayudante tal como un adenovirus, virushepes o virus vacinia. A continuacion de la coinfeccion las celulas huesped con el vector sujeto y el virusayudante, se aıslan los viriones y se inactiva el virus ayudante. Los stocks de viriones resultantes libres devirus ayudantes se utilizan para infectar a las celulas huesped. En otra forma de realizacion, los virionesse producen cotransfectando las celulas infectadas con el virus ayudante con el vector de la presente in-vencion y un plasmido ayudante. Por ejemplo, la construccion hıbrida de la presente invencion se puedeempaquetar en un virion de AAV maduro por contrafeccion con el vector de la presente invencion de lascelulas infectadas con adenovirus y un plasmido que proporciona el gen rep de parvovirus y los extremosdel adenovirus. Un ejemplo de tal plasmido es el pAAV/Ad, que contiene la secuencia codificante com-pleta del AAV y las repeticiones terminales del adenovirus tipo 5 en lugar de las repeticiones terminalesdel AAV normal. [Samulski et al., (1989)].
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A continuacion de la transfeccion, los viriones maduros se aıslan por procedimientos estandar, p. ej.por centrifugacion en cloruro de cesio y calentamiento a 56◦C durante una hora para inactivar cualquieradenovirus contaminante. Los viriones maduros resultantes contienen el vector de la presente invenciony se utilizan para infecta las celulas huesped en ausencia de virus ayudante.
La funcion del vector hıbrido de la presente invencion, es decir, la capacidad para mediar la trans-ferencia y la expresion del gen heterologo en un tipo celular especıfico, se puede evaluar verificando laexpresion del gen heterologo en las celulas transducidas. Por ejemplo, se aıslan las celulas de medula oseay se enriquecen en celulas germinales hematopoyeticas (HSC), p. eje, por fraccionamiento de celula porfluorescencia activada, tal como describen Srivastava et al., J. Virol. 62:3059 (1988). HSC son capacesde auto renovacion ası como de iniciar hematopoyesis a largo plazo y diferenciacion en multiples linajeshematopoyeticos in vitro. Se transfectan las HSC con el vector de la presente invencion o se infectan conmultiples concentraciones de viriones que contienen el vector hıbrido sujeto y a continuacion se valora laexpresion del gen heterologo.
El ensayo de expresion depende de la naturaleza de los genes heterologos. La expresion se puedeverificar por una multiplicidad de procedimientos que incluyen los inmunologicos, histoquımicos o losensayos de actividad. Por ejemplo, el analisis Northern se puede utilizar para valorar la transcripcionutilizando sondas de ADN o ARN propietarias. Si se dispone de anticuerpos a los polipeptidos codificadospor el gen heterologo, se pueden utilizar, analisis por transferencias de Western, inmunohistoquımica uotros procedimientos inmunologicos para valorar la produccion de polipeptido. Tambien se pueden utili-zar ensayos bioquımicos adecuados si el gen heterologo es un enzima. Por ejemplo, si el gen heterologocodifica la resistencia a un antibiotico, se puede utilizar una determinacion de la resistencia de las celulasinfectadas al antibiotico para evaluar la expresion del gen de resistencia a antibiotico.
Ademas, de evaluar que el gen heterologo se expresa en las celulas apropiadas, se puede evaluar lacorreccion de la especificidad del promotor del vector hıbrido evaluando la expresion del gen heterologo, ola falta de expresion, en celulas en las que el promotor no se espera que este activo. Por ejemplo, cuandolas celulas de una lınea celular nasofarıngea, KB, son transducidas con un vector hıbrido que contieneel promotor B19p6, el gen heterologo no se expresa, ya que el promotor B19p6 es especıfico para lascelulas eritroides. La deteccion del producto del gen heterologo a niveles de las celulas no transducidaso inferiores confirma que el promotor B19p6 del vector hıbrido no dirige la expresion del gen heterologoen las celulas no hematopoyeticas.
Los vectores hıbridos de la presente invencion son utiles para la terapia genica. En particular, losvectores de la presente invencion pueden dirigir la expresion de los genes deseados especıficamente en lascelulas eritroides y por tanto son utiles para el tratamiento de las hemoglobinopatıas.
Se contempla de acuerdo con la presente invencion utilizar el vector hıbrido para preparar una compo-sicion que comprende transducir celulas de medula osea para utilizarlas en terapia genica, en particular,para el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluyendo las talasemias, la anemia falciforme, ladiabetes y el cancer. El gen heterologo puede ser la pareja normal de uno que se produce anormalmenteen el estado de enfermedad, por ejemplo la β-globina para el tratamiento de la anemia falciforme y laα-globina, β-globina o γ-globina en el tratamiento de la talasemia. El gen heterologo puede codificar unARN antisentido tal como se describio anteriormente en la presente solicitud. Por ejemplo, la α-globinase produce en exceso sobre la β-globina en la β-talasemia. En consecuencia, la β-talasemia se puedetratar por terapia genica con una composicion que comprende celulas de medula osea transducidas conun vector en el que el gen heterologo codifica un ARN antisentido. El ARN antisentido se seleccionade tal forma que se une a una secuencia diana del mARN de la α-globina para evitar las translacion deα-globina, o a una secuencia diana del ADN de la α-globina, de forma que la union evita la transcripciondel ADN de la α-globina. En el tratamiento del cancer el gen heterologo puede ser un gen asociado con lasupresion de tumores, tal como el gen retinoblastoma, el antioncogen p53, o el gen que codifica el factorde la necrosis tumoral.
La utilizacion de los vectores hıbridos de la presente invencion para preparar una composicion parael tratamiento de las enfermedades implica transducir las HSC o las celulas progenitoras con el vectorhıbrido. La transduccion se logra por transfeccion con el vector o la preparacion de viriones madurosque contienen el vector hıbrido y la infeccion de las HSC o las celulas progenitoras con los viriones ma-duros. Las celulas transducidas se introducen en el paciente, p. ej. por transfusion intravenosa (ver,por ejemplo, Rosenberg, 1990). Las HSC o las celulas progenitoras se proporcionan obteniendo celulasde medula osea de los pacientes y opcionalmente enriqueciendo las HSC en la poblacion de celulas de
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medula osea. Las HSC se pueden transducir por procedimientos estandar de transfeccion o se puedeninfectar con viriones maduros durante una o dos horas a aproximadamente 37◦C. La integracion establedel genoma vırico se logra por incubacion de las HSC a aproximadamente 37◦C durante entre una semanay un mes. La integracion estable en un lugar especıfico y la expresion especıfica en celulas eritroides seensaya tal como se describio anteriormente. Despues de que se han introducido las celulas transducidasen el paciente, la presencia del producto del gen heterologo se puede verificar o valorar por un ensayoapropiado del producto del gen en el paciente, por ejemplo en las celulas rojas de la sangre periferica o enla medula osea del paciente cuando la expresion es especıfica de celulas eritroides. Tal como se describioanteriormente, el ensayo especıfico depende de la naturaleza del producto del gen heterologo y se puededetectar facilmente por un experto en la tecnica.
Por ejemplo, la β-talasemia representa un grupo de sındromes clınicos heterologos que se heredancomo alelos mutados de genes que codifican la cadena de la β-globina humana. Dichas mutaciones afec-tan a todos los aspectos de la expresion del gen de la β-globina incluyendo la transcripcion, el empalme,la poliadenilacion, la translacion y la estabilidad de la proteına. La caracterıstica de la β-talasemia es lamarcada reduccion o la ausencia total de sıntesis de hemoglobina normal adulta (HbA; α2β2). A pesar delos significativos avances en el conocimiento de los mecanismos subyacentes basicos de la β-talasemia, eltratamiento esta limitado a la transfusion de eritrocitos normales y a la terapia por quelacion del hierro.El tratamiento por trasplante de medula osea tambien se ha intentado [Thomas et al., Lancet, ii, 227(1982)], pero no se ha encontrado una cura efectiva.
En consecuencia, los vectores de la presente invencion son utiles para preparar composiciones parael tratamiento de la β-talasemia. Se construye un vector AAV-B19 en el que el gen heterologo es elgen humano normal de la β-globina, el vector AAV-B19-β-globina permite la transferencia mediada porparvovirus, la integracion en un lugar especıfico y la expresion especıfica en celulas eritroides del gennormal de la β-globina en celulas hematopoyeticas humanas.
La talasemia con expresion anormal de β-globina resulta en la sobreabundancia de mARN de α-globina relativa al mARN de β-globina. La presente invencion no solamente puede proporcionar un gennormal de β-globina, tal como se describio anteriormente, pero puede ademas ser utilizada para depri-mir la produccion del exceso de α-globina proporcionando un vector con un ARN antisentido como genheterologo. Se construye un vector hıbrido AAV-B19 en el que la secuencia heterologa codifica un ARNantisentido que es suficientemente complementario a una region del mARN que codifica la cadena α, talque se une a, y evita la translacion del mARN de la α-globina, o a una region del ADN que codifica laα-globina de tal forma que se une a, y evita la transcripcion del gen de la α-globina. En consecuencia,la presente invencion contempla la utilizacion del vector segun la presente invencion para preparar unacomposicion que comprenden celulas de medula osea transducidas para utilizar en la terapia genica dela β-talasemia. La preparacion de la composicion comprende la transduccion de celulas germinales oprogenitoras hematopoyeticas con un vector hıbrido que codifica las cadenas normales de la β-globina, ola transduccion simultanea con un vector que codifica una cadena normal de β-globina y un vector quecodifica un ARN antisentido al mARN de la α-globina o ADN. Por el contrario, una construccion conmas de un promotor B19p6, tal como se describio anteriormente, permite la expresion coincidente de laβ-globina y α-globina antisentido. En consecuencia, la transduccion con un unico vector afecta tanto laprovision de un gen de β-globina normal y la depresion de exceso de cadenas α. Mas especıficamente, setransfectan celulas de medula osea con el vector sujeto y las celulas transducidas se introducen, p. ej. portransfusion intravenosa, en un paciente. La integracion estable del vector se puede ensayar por PCR opor analisis por transferencia Southern y la expresion del gen heterologo se puede valorar por ensayo delproducto del gen heterologo en las celulas de la sangre periferica del paciente o en las celulas de la medulaosea. Tal como se describio anteriormente, el ensayo particular depende de la naturaleza del productodel gen heterologo.
Los vectores de la presente invencion tambien son utiles para preparar una composicion para el tra-tamiento de las enfermedades hematopoyeticas, las hemoglobinopatıas o el cancer. Los vectores de lapresente invencion tambien son utiles para preparar una composicion para conferir resistencia a multiplesfarmacos a celulas especıficas. Se construye un vector AAV para que contenga el promotor especıficode una celula y el gen de resistencia a multiples farmacos, el vector resultante permite la transferenciamediada por parvovirus, la integracion en un lugar especıfico y la expresion en celulas especıficas del genmdr en el tipo celular seleccionado. En una forma de realizacion preferida, el vector es AAV-B19-mdr yconfiere el fenotipo de resistencia a multiples farmacos a las celulas eritroides.
Cualquiera de los numerosos genes mdr que se conoce confieren el fenotipo mdr son utiles como genheterologo. Los genes mdr son conocidos por los expertos en la tecnica y los dan a conocer, por ejemplo,
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Roninson et al., en Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells, 1991 (ed.Roninson, Plenum Press, NY) 91-106. En consecuencia, la presente invencion proporciona la utilizaciondel vector de la presente invencion para preparar una composicion para conferir resistencia a multiplesfarmacos a celulas especıficas. La preparacion de tal composicion comprende transducir celulas con lelvector hıbrido de la presente invencion que contiene un promotor de celulas especıficas y un gen de mdr.En una forma de realizacion preferida, la presente invencion proporciona la utilizacion de un vector dela invencion para preparar una composicion para conferir resistencia a multiples farmacos a las celulaseritroides de un paciente que comprende obtener celulas de medula osea o celulas progenitoras de unpaciente, transducir las celulas de medula osea o celulas germinales con el vector hıbrido AAV-B19 de lapresente invencion que contiene un gen mdr como gen heterologo y reintroducir las celulas transducidasen un paciente. La expresion del gen mdr se puede evaluar por ensayo del producto del gen mdr, es decir,la glicoproteına P, en las celulas de la sangre periferica del paciente o en las celulas de la medula osea. Porejemplo, la glicoproteına P se puede detectar con ensayos inmunologicos conocidos usando un anticuerpocontra la glicoproteına P. Dichos anticuerpos son conocidos y estan disponibles para los expertos en latecnica y estan descritos, por ejemplo, por Meyers et al., Cancer Res. 49:3209 (1989) y Georges et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:152 (1990). La utilizacion de la composicion preparada utilizando elvector segun la invencion es particularmente util como un adyuvante en la quimioterapia del cancer yaque protege efectivamente a las celulas eritroides de los efectos de los agentes quimioterapeuticos dirigidosa otros tejidos.
Todavıa otro aspecto de la presente invencion proporciona la utilizacion de un vector segun la in-vencion para preparar una composicion que comprende celulas de medula osea para la entrega de unfarmaco. Ya que la diferenciacion de dichas celulas progenitoras resulta en la produccion de eritroci-tos maduros, la transduccion del las celulas progenitoras con el vector sujeto finalmente produce unapoblacion de vesıculas anucleares circulantes que contienen el producto del gen. La utilizacion de lacomposicion comprende transducir las celulas germinales hematopoyeticas o las celulas progenitoras conel vector hıbrido de la presente invencion e introducir, p. ej. por transfusion intravenosa o inyeccion, lascelulas transducidas en un mamıfero.
La transfusion se puede lograr transfectando las celulas con el vector hıbrido por procedimientosestandar para infectar celulas con viriones maduros de AAV que contienen el vector hıbrido a aproxima-damente 37◦C durante una o dos horas. La integracion estable del genoma vırico recombinante se lograincubando las celulas a aproximadamente 37◦C durante entre una semana y aproximadamente un mes.Las celulas transducidas se reconocen por ensayo de la expresion del gen heterologo, tal como se describioanteriormente en la presente solicitud. En la presente forma de realizacion, el producto farmaceuticoesta codificado por el gen heterologo del vector hıbrido y puede ser cualquier producto farmaceuticocapaz de ser expresado por el vector hıbrido. Dichos productos incluyen las globinas α, β y γ, insulina,GM-CSF, M-CSF, G-CSF, EPO, TNF, MGF, iterleucinas, el producto del gen del retinoblastoma, p53 oadenosin desaminasa. Por consiguiente, la presente invencion puede proporcionar la produccion de nivelesconstitutivos de los productos de genes heterologos dentro de las vesıculas membranosas, especıficamenteglobulos rojos, para el tratamiento in situ de la enfermedad. Opcionalmente, el vector hıbrido puedeademas comprender una secuencia que codifica un peptido senal u otra parte que facilita la secreciondel producto del gen de la celula eritroide. Tales secuencias son bien conocidas por los expertos en latecnica [ver, por ejemplo, Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol. 36:435 (1982)] y se pueden insertar enlos vectores sujeto entre el promotor y la region codificante por procedimientos descritos en la presentesolicitud. Se puede utilizar dicho procedimiento para tratar una multiplicidad de enfermedades y tras-tornos y no queda limitado al tratamiento de las hemoglobinopatıas, ya que el gen heterologo se expresaconstitutivamente y se puede liberar de los hematıes en virtud de la secuencia de secrecion, o se liberacuando los hematıes se destruyen en el hıgado o bazo.
La presente invencion proporciona tambien un vector de expresion que comprende dos repeticionesterminales invertidas de virus adenoasociado 2 y por lo menos un cassette que comprende un promotorcapaz de inducir expresion especıfica de una celula en la que dicho promotor esta funcionalmente unidoa un gen heterologo, y en el que dicho cassette reside entre dichas repeticiones terminales invertidas.Dicho vector se puede utilizar para preparar una composicion que comprende celulas de medula oseatransducidas para la terapia genica o para la entrega de un producto farmaceutico en un mamıfero.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invencion
Ejemplo 1
Integracion del genoma recombinante de AAV en un lugar especıfico
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La integracion del genoma de AAV en un lugar especıfico se confirmo usando una estrategia en laque fibroblastos diploides humanos normales (HDF) se infectaron de forma simulada o se infectaron conmultiplicidades de infeccion crecientes (moi) con AAV de tipo silvestre. A continuacion de multiplespasajes en serie de dichas celulas en cultivo, se aislo el ADN total genomico, se digirio con una variedadde endonucleasas de restriccion y se analizo por trasferencia Southern utilizando una sonda de ADNespecıfica para AAV. En la Figura 4 se muestra una transferencia Southern representativa. Los enzimasde restriccion se indican en la parte de arriba de la figura. El moi se indica en la parte de arriba de cadacarril, donde 0,0 indica la infeccion simulada. La predominante unica banda de hibridacion es evidenciade que el genoma de AAV silvestre se integra en un lugar especıfico del ADN cromosomico de la celuladiploide humana normal. La diana se saturo solamente con un moi de AAV muy elevado y no se utilizoningun procedimiento para seleccionar la poblacion de celulas con el provirus integrado.
La integracion especıfica en un lugar del genoma del AAV recombinante se demuestra utilizandocelulas de medula osea humana, que son las celulas diana en la terapia de las hemoglobinopatıas.
Las celulas de medula osea se obtuvieron de donantes voluntarios hematologicamente normales y lascelulas de medula osea de baja densidad, celulas mononucleares de medula osea (LDBM) se aislaron porcentrifugacion de densidad en Ficoll-Hypaque. Las celulas LDBM se infectaron con viriones de AAV-Neorecombinante (vSV40-Neo), en los que el gen Neo, bajo el control de promotor temprano del SV40, seencuentra encapsulado en los viriones del AAV y se incubaron en presencia de varias citocinas tales comoGM-CSF (1 ng/ml) y IL-3 (1 ng/ml) durante 48 horas. Las celulas se incubaron en cultivos lıquidosen presencia de G418 a 37◦C durante 10 dıas, se aislo el ADN genomico total, se corto con BamHI yse analizo por transferencia de Southern utilizando una sonda de ADN especıfica para Neo tal como semuestra en la Figura 5. La concentracion de G418 se indica en la parte de arriba de cada carril. Launica banda de hibridacion indicada por la flecha demuestra que el genoma vırico recombinante de AAVse integra en un lugar especıfico del ADN cromosomico de las celulas de medula osea humanas.
Ejemplo 2
Construccion de los plasmidos recombinantes pWP-7A y pWP-19
La estrategia general utilizada para construir los vectores plasmıdicos prototipo, designados pWP-7Ay pWP-19, respectivamente, se indica en la Figura 6. Los lugares XbaI en el plasmido psub201 se convir-tieron en lugares EcoRI ligando adaptadores sinteticos XbaI-EcoRI-XbaI tal como describen Srivastava etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8078 (1989). La region codificante del AAV se elimino a continuacionde la digestion con EcoRI y el ADN del vector que contiene los dos ITRs de AAV se aislo de geles deagarosa preparativos [Seth, Gene Anal. Tech., 1:99 (1984)] y se trato con PolIk para generara extremosromos. De forma similar, el ADN de pBR322 se corto con EcoRI y PvuII y los extremos del fragmentode 2066 pb que contiene la region codificante del gen de resistencia a tetraciclina (Tcr) completa tambiense hicieron romos con PolIk. Se ligaron estos dos fragmentos y se utilizaron para transformar celulascompetentes de E. coli HB 101 por los procedimientos estandar descritos en Sambrook et al., (1989)para generar el plasmido, designado pWP-7A. Ya que la ligacion de fragmentos de ADN con extremosromos que contienen extremos EcoRI y PvuII reparados regenera un lugar EcoRI, el plasmido pWP-7Ase puede cortar con EcoRI corriente abajo del gen TcR para clonar un gen o cassette de interes. Elgen neor bajo el control del promotor de la timidina kinasa (TK) del virus herpes se aislo del plasmidopSHL-172 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5:3251 (1985)] por ditestion parcial con PvuII y ligacionde los extremos romos del ADN de pWP-7A tratado con PolIk. El plasmido recombinante resultante,designado pWP-8A, se muestra en la Figura 6-A. El plasmido pWP-19 se construyo tal como sigue. Selinearizo el plasmido pWP-8A con HindIII, que corta en los extremos 5’ del gen TcR y se corto parcial-mente con XmnI para eliminar el gen TcR. El plasmido pGBOR que contiene un gen de resistencia aampicilina (ApR) y las secuencias del operador del bacteriofago lambda (OR1/OR2; λo) (Samulski etal., EMBO J. 10:3941 (1991)) fueron cortadas con EcoRI y XbaI y los fragmentos con la secuencia λo seligo por los extremos romos con el ADN pWP-8A tratado con PolIk descrito anteriormente. El plasmidorecombinante resultante pWP-19 se muestra en la Figura 6-B.
Los vectores plasmıdicos pWP-7A y pWP-19 son utiles para construir genomas AAV recombinantesporque tanto en uno como en el otro es posible la insercion directa de un inserto de interes y la presenciade un gen neoR ya incluido en el pWP-19 proporciona un fuerte marcador de seleccion en las celulashumanas. El vector plasmıdico pWN-1 es particularmente util porque ofrece varias caracterısticas. Enlas celulas bacterianas, estas incluyen: 1) La disponibilidad de una multiplicidad de lugares de clonaje(EcoRI, BamHI, SacI, KpnI, XbaI, SalI, AccI, HicII, PstI, SphI y HindIII), incluyendo el lugar NdeI; 2)
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Los ITRs deAAV que se encuentran bien separados de los lugares de clonaje; y 3) la utilizacion tantode TcR como de ApR como marcadores selectivos. En las celulas de los mamıferos, a continuacion de latransfeccion en presencia del plasmido ayudante AAV y Ad, el inserto de interes, que ahora se encuentraflanqueado por los dos ITRs de AAV en una orientacion adecuada (ver la Figura 7), puede ser rescatadoeficazmente del gen TcR seguido de la replicacion de ADN y el empaquetamiento en la progenie de virio-nes AAV.
Mientras que el plasmido pWP-7A es util para clonar insertos de un tamano de hasta 2,5 kb en ellugar EcoRI unico, el plasmido pWP-19 ofrece un gen marcador neoR incluido ası como tambien unavariedad de lugares de clonaje tales como BamHI, SacI y KpnI y se pueden insertar insertos de hasta 2,6kb de tamano entre los dos ITRs del AAV.
Ejemplo 3
Construccion del plasmido recombinante pWN-1
La estrategia para construir el plasmido recombinante pWN-1 se muestra en la Figura 7. En breve,el ADN del plasmido p sub201se digirio por completo con XbaI y PvuII y se aislo el fragmento de 191 pbXbaI-PvuII que contiene la secuencia completa de los ITRs del AAV tal como se describe en el Ejemplo2. De forma similar, se corto con EcoRI y AvaI el ADN del plasmido pBR322 para aislar un fragmentode 1425 pb que contiene el gen TcR pero le falta la secuencia del origen de replicacion del ADN (“ori”).Dicho fragmento fue tratado con PolIk para generar extremos romos. Se mezclo el fragmento EcoRI-AvaIde extremos romos con un gran exceso del fragmento XbaI-PvuII que contiene los ITRs de AAV, seligo por los extremos romos utilizando ADN ligasa T4 y luego se digirio exhaustivamente con XbaI. Elloresulto en la produccion del gen TcR flanqueado por solamente uno de los ITRs del AAV en cada extremopero en orientacion opuesta (ver las flechas pequenas en los ITRs enmarcados). A continuacion se ligodicho fragmento en el lugar unico XbaI en el plasmido pGBOR descrito anteriormente y se utilizo el TcR
para seleccionar el plasmido recombinante pWN-1.
Ejemplo 4
Rescate y replicacion de un inserto clonado de un plasmido basados en AAV recombinante
Las secuencias de ADN flanqueadas por los dos ITRs de AAV se pueden rescatar de los plasmidosrecombinantes de los Ejemplos 2 y 3 a continuacion de la transfeccion en celulas humanas en presenciade las proteınas de AAV y Ad como preludio al exito del empaquetamiento de dichos genes en los virio-nes de AAV maduros. El tamano del inserto entre los dos TTRs del AAV en el plasmido pWP-8A essimilar al tamano del genoma del AAV de tipo wt. El gen rep de AAV, el plasmido paterno psub201, asıcomo tambien la secuencias OR1/OR2 de λ del plasmido pGBOR se aislaron e insertaron en el plasmidopWP-19 utilizando la estrategia mostrada en la Figura 8-A. Se generaron dos plasmidos recombinantes,pWP-21 y pWP-22 que contienen el gen rep-AAV en orientaciones diferentes con respecto al gen neoR.Dichos plasmidos se describen en la Figura 8-A. De forma similar, el tamano del inserto entre los dosAAV-ITRs en el plasmido pWN-1 se incremento por la adicion del gen neoR tanto en el lugar NdeI comoen el lugar PstI para generara dos plasmidos recombinantes, pWP-16 y pWP-17, respectivamente, que semuestran en la Figura 8-B.
Los plasmidos pWP-8A, pWP-21, pWP-22, pWP-16 y pWP-17 fueron transfectados solos o se cotran-sfectaron con el plasmido AAV ayudante (pAAV/Ad) por separado, en celulas KB humanas infectadascon Ad [Samulski et al., J. Virol., 63:3822 (1989); Srivastava et al., (1989); Srivastava, Blood, 76:1997(1990)]. Se digirieron con DnpI las muestras de ADN de bajo MR aisladas por el procedimiento de Hirt,J. Mol. Biol., 26:365 (1967), y se analizaron por transferencia Southern [Southern, J. Mol. Biol.,. 98:503(1975)] utilizando una sonda de ADN especıfica para neo tal como se describio anteriormente [Samulskiet al., (1989)]. Los resultados se presentan en la Figura 9. No se produjo rescate/replicacion del genneoR recombinante del plasmido pWP-8A en ausencia del plasmido ayudante pAAV/Ad (carril 1); sinduda, tuvieron exito el rescate y la replicacion cuando se suplieron las proteınas de AAV-Rep en posiciontrans (carril 2), tal como se detecto por la presencia de los intermediarios de replicacion monomericos ydimericos caracterısticos del genoma recombinante de AAV. De forma similar, el rescate y la replicacionocurrieron a partir de los plasmidos pWP-21 (carriles 3 y 4) y pWP-22 (carriles 5 y 6) incluso en ausen-cia del plasmido ayudante porque dichos plasmidos contienen el gen AAV-rep en posicion cis. Tambientuvieron lugar el rescate y la replica a partir de los plasmidos pWP-16 y pWP-17, pero solamente enpresencia del plasmido ayudante AAV (carriles 8 y 10).
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A continuacion del rescate y la replicacion, el gen neoR tambien se pudo empaquetar en la progeniede viriones maduros AAV en presencia de las proteınas de AAV-Cap. Los viriones progenie AAV recom-binantes fueron biologicamente activos e infecciosos. Por ejemplo, los viriones recombinantes AAV-neofueron utilizados para transducir e integrar el gen neoR de forma estable en una multiplicidad de celulasdiploides y poliploides humanas. El gen neoR transducido fue biologicamente activo, tal como se deter-mino por el analisis de la expresion genica en transferencias Northern, ası como por el facil aislamientode poblaciones clonales de celulas humanas resistentes a la geneticina.
Ejemplo 5
Construccion de un vector parvovirus hıbrido AAV-B19 para expresion y clonaje
Se construyo como sigue a continuacion un vector hıbrido que contiene los ITRs de AAV el promotorB19p6 y el gen neor como gen heterologo. La estrategia general par la construccion de tal vector, desig-nado pB19-p6-neor-AAV-ITR, se muestra en la figura 10.
Un clon de ADN de B19 de casi toda longitud (por ejemplo el pYT104v en que B19 se encuentracorriente abajo del promotor bacteriano SP6) se corto con SacI y DraI y se descarto el fragmento deADN pequeno que contiene el ITR izquierdo. A continuacion de la religacion por los extremos romos delfragmento mayor, el plasmido de ADN se corto con EcoRI y XbaI para aislar el fragmento de 280 pbque contiene la region no codificante completa 5’ y el promotor p6 del B19. Se clono dicho fragmentoen el lugar EcoRI-XbaI de pUC19 para generar el plasmido pB19p6. Dicho plasmido fue cortado conHincII que digiere el ADN de B19 corriente abajo del promotor p6 y tambien al ADN de pUC19 en ellugar de clonaje multiple. El gen bacteriano Neor (Tratschin et al., 1985) se ligo por los extremos romoscorriente abajo del promotor B19p6 entre los dos lugares HincII para generar el plasmido pB19p6-Neor .Dicho plasmido fue digerido con EcoRI y HindIII y el inserto B19p6-Neo se aislo y se ligo entre losdos AAV-ITRs del psub201 digerido con XbaI. El vector fue empaquetado en viriones maduros de AAV(vB19-Neo) por cotrafeccion de celulas infectadas con pAAV/Ad, que contienen la secuencia codificantede AAV y las secuencias terminales del adenovirus tipo 5 (Samulski et al., 1989).
Ejemplo 6
Transferencia del gen bacteriano Neor mediante parvovirus recombinante a celulasgerminales hemato-poyeticas humanas
Se aislaron celulas germinales hematopoyeticas de donantes humanos normales seguido de separacioncon anticuerpos monoclonales contra los antıgenos CD34 y DR segun el procedimiento de Lu et al. ,J. Immunol. 139:1823(1987) para producir una poblacion de celulas CD34+DR− . Dicha poblacioncelular se conoce que contiene varias clases de celulas germinales hematopoyeticas humanas primitivasincluyendo blastocitos formadores de unidades de colonia (CFU-B1), celulas formadoras de colonias deelevado potencial proliferativo (HPP-CFC) y celulas responsables de iniciar hematopoyesis in vitro a largoplazo (LTBMIC).
Aproximadamente 1 x 103 celulas CD34+DR− aisladas de diferentes donantes fueron infectadas simu-ladamente o infectadas con viriones a multiples moi con vTK-Neo o vB19-Neo. (vTK-Neo es un virionde AAV recombinante que contiene el gen Neor bajo el control del promotor del gen de la timidinakinasa (TK)). Las celulas fueron incubadas a 37◦C durante una semana en presencia de las citocinasinterleucina-3 (1 ng/ml), factor estimulador de colonias de granulocito macrofago (1 ng/ml) y un factorpara el ligando c-kit denominado factor de proliferacion de celulas mastocıticas (50 ng/ml). Se anadioG418 a una concentracion final de 250 µg/ml. El numero total de celulas viables fue contado a con-tinuacion de una semana de exposicion al farmaco. A continuacion se incremento la concentracion deG418 a 500 µg/ml y se obtuvieron contajes de celulas viables despues de dos semanas para las celulasinfectadas con vTK-Neo y despues de una semana para las celulas infectadas con vB19-Neo. Tales datosse muestran en la Figura 11.
La exposicion a los viriones vTK-Neo resulto en una poblacion de celulas hematopoyeticas con unaresistencia a G418 cerca de 10 veces superior comparada con las celulas simuladamente infectadas, mien-tras que la exposicion a los viriones vB19-Neo resulto en un incremento de aproximadamente 4 veces, almoi mas elevado, en comparacion con las celulas simuladamente infectadas. Tales resultados demuestranque el promotor de B19p6 es activo en las poblaciones de celulas enriquecidas en HSC, aunque a un nivelinferior en comparacion con el promotor TK.
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Ejemplo 7
Evaluacion de la especificidad tisular del promotor B19p6
Se infectaron celulas no eritroides para determinar si el promotor B19p6 en las construcciones hıbridasse ha vuelto indiscriminado o ha mantenido la especificidad eritroide.
Celulas KB humanas fueron infectadas de forma simulada o infectadas por separado con multiplesmoi de vTK-Neo y vB19-Neo. A las 48 horas post infeccion las celulas se expusieron a multiples concen-traciones de G418. A continuacion de un perıodo de incubacion de 14 dıas a 37◦C, se conto el numeroaproximado de colonias resistentes a G418. Se define una colonia como un grupo de ocho o mas celulas.Estos datos se presentan en la Tabla 1, y demuestra que bajo las condiciones de infeccion vırica, el pro-motor B19p6 retiene su especificidad eritroide.
TABLA 1
Numero aproximado de colonias resistentes a G418 en las celulas KB transducidas con virionesAAV-Neo
Virus recombinantes 200 µg/ml G418 400 µg/ml G418 600 µg/ml G418
1. ninguna 10-20 0 02. vTK-Neo TMTC∗ 100-200 50-100
3. vB19-Neo 10-20 0 0
∗TMTC = Demasiadas como para contar
Ejemplo 8
Construccion de vectores parvovirus con un amplificador eritroide especıfico
Para incrementar todavıa mas la expresion en tejidos especıficos dirigida por el promotor B19p6, seinserto en los vectores hıbridos de la presente invencion el Locus-2 (HS-2) de DNasa1-hipersensible dela Region de Control de Locus (LCR), (Tuan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6384 (1985), unamplificador eritroide especıfico. Tal como se diagrama en la Figura 12, se inserto el gen HS-2 corrientearriba del promotor B19p6 y el gen de la luciferasa para proporcionar un vector vHS2/B19-Luc. Loslugares de restriccion utilizados para facilitar la construccion del vector se muestran en la Figura 12.Tales construcciones fueron empaquetadas en viriones maduros AAV.
Ejemplo 9
Construccion de vectores parvovirus que contienen el gen normal de la β-globina humana
Para proporcionar vectores para la transferencia genica en casos clınicos de β-talasemia y anemiafalciforme, se construyeron dos vectores plasmıdicos que contienen el gen normal de la β-globina y se em-paquetaron en viriones recombinantes AAV. La construccion pHS2/β-globina-Neo contiene el promotorde la β-globina y el amplificador HS-2 corriente arriba, junto con el gen Neor bajo el control del promotorTK y la construccion pHS2/B19-globina-Neor tambien contiene el promotor B19p6. Tales construccionesse muestran en la Figura 13.
El vector pHS2/β-globina-Neo se construyo como sigue. Se construyo un plasmido (pWP19) quecontiene el gen Neor bajo el control del promotor TK entre los dos AAV-ITRs. Se linearizo pWP19 conSacI. Se ligo en orientacion invertida el fragmento SnaBI-PstI que contiene el clon genomico del gen de laβ-globina humana corriente arriba del promotor TK. Se linearizo el plasmido resultante por digestion conKpnI y el fragmento HindIII-XbaI que contiene el amplificador HS2 se ligo corriente arriba del promotorde la β-globina.
El vector pHS2/B-19-globina-Neo fue construido como sigue. En primer lugar el fragmento HindIII-XbaI que contiene el amplificador HS2 se clono corriente arriba del promotor B19p6 en el plasmidopB19p6 linearizandolo con EcoRI. El fragmento HS2-B19p6 se aislo digiriendo dicho plasmido con PvuIIy HincII. El fragmento PvuII-HincII se ligo al plasmido pWP19 linearizado con SacI. En segundo lugar,la region codificante de la β-globina sin el promotor de la β-globina se escindio por digestion del plasmido
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con NcoI y PstI. Tal fragmento NcoI-PstI se ligo al el plasmido descrito anteriormente linearizandolo conKpnI.
De forma similar, los vectores que contiene el gen de la α-globina humana en las dos orientacionesfueron construidos y empaquetado en viriones recombinantes AAV. Se ligo un fragmento HinfI-PvuII delgen de la α-blobina clonada (Liebhaber, 1980) corriente abajo del promotor B19p6 despues de linearizarel ADN del plasmido pB19p6. El plasmido resultante se linearizo con FspI y se ligo con el plasmidopWP19 en el lugar SacI antes de empaquetarlo en viriones AAV.
Ejemplo 10
Transduccion de celulas humanas AAV con el gen de resistencia a multiples farmacos
Para valorar la capacidad de los vectores AAV para conferir el fenotipo de resistencia a multiplesfarmacos a celulas humanas sensibles a farmacos, se transducen celulas humanas KB sensibles a farmacoscon el vector AAV que contiene el gen mdr bajo el control del promotor de la timidina kinasa. La ex-presion del fenotipo mdr se valora detectando la glicoproteına P con un anticuerpo especıfico para dichaproteına. Ademas, la capacidad de las celulas transducidas para reducir la acumulacion intracelular deciertos farmacos antitumorales se evalua cultivando las celulas transducidas en una serie de medios decultivo que contienen incrementos graduales en la concentracion del farmaco seleccionado. Un incrementoen la viabilidad de las celulas transducidas relativo a las celulas control (celulas no transducidas) es in-dicativo de la expresion del gen mdr.
Para valorar la capacidad de los vectores AAV de la presente invencion para conferir resistencia amultiples farmacos a celulas especıficas, se transducen con el vector AAV que contiene un gen mdr bajoel control del promotor B19p6 (AAV-B19p6-mdr) tanto celulas eritroides como no eritroides (p. ej. KBsensibles a farmacos). Las celulas KB se transducen y se valoran tal como se describio anteriormente. Yaque el promotor B19p6 dirige la expresion especıfica en celulas eritroides, el gen mdr no se expresa portransduccion de las celulas KB con AAV-B19p6-mdr.
La capacidad de AAV-B19p6-mdr para conferir resistencia a multiples farmacos especıfica de celulaseritroides se valora como sigue. Se extrae medula osea del paciente, se enriquece en celulas CD34+y setransducen con AAV-B19p6-mdr. Se establecen entonces cultivos primarios y se mantienen hasta quese las colonias focales se pueden transferir a bandejas para cultivo de tejidos. El desarrollo de dichascolonias permite valorar la resistencia a una gama de farmacos antitumorales.
El vector AAV-B19p6-mdr es util en la quimioterapia del cancer. Por ejemplo, se extrae medula oseade la cresta ilıaca del paciente de cancer y se enriquece en celulas CD34+. Se transforman las celulasenriquecidas con AAV-B19p6-mdr y se reinfunden en el paciente.
Se puede sustituir el promotor B19p6 por otros elementos promotores de celulas especıficas para per-mitir la expresion del fenotipo de resistencia a multiples farmacos en otros linajes celulares.
Ejemplo 11
Se infectaron celulas de la lınea celular de eritroleucemia, K562 (ATCC CCL-243) con vHS2/B19-globina-Neo (ver el Ejemplo 9 y la figura 13) para valorar la capacidad del vector para proporcionar laexpresion del gen de la β-globina en las celulas huesped que no exhiben expresion del gen de la β-globina.
Las celulas K562 fueron infectadas de forma simulada o infectadas independientemente con el numeroequivalente de moi de vHS2/B19-globina-Neo y vHS2/β-globina-Neo. Se aislo el ADN de las celulas in-fectadas, se digirio con NcoI y se sujeto a analisis por transferencia Southern. La Figura 14 proporcionaun Southern blot en el que en el Carril 1 corresponde al ADN aislado de las celulas infectadas de formasimulada y el Carril 2 corresponde al ADN aislado de las celulas infectadas con vHS2/β-globin-Neo. Lastransferencias se sondearon con una sonda de γ-globina (panel izquierdo) y con una sonda de β-globina(panel derecho). La flecha muestra el alelo transducido del gen de la β-globina en celulas K562 infec-tadas con vHS2/β-globina-Neo. Se obtuvieron resultados similares con las celulas K562 infectadas convHS2/B19-globina-Neo.
El gen de la β-globina se encuentra presente pero no se expresa en las celulas K562. Las transferenciasNorthern de ARN total de las celulas infectadas de forma simulada y de las celulas infectadas descritasanteriormente se sondearon con una sonda de neomicina (Figura 15, panel izquierdo) y con una sonda de
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β-globina (Figura 15, panel derecho). El panel central de la Figura 15 presenta un gel tenido con bromurode etidio. El carril 1 en cada panel representa el ARN de las celulas infectadas de forma simulada; loscarriles 2 y 3 corresponden al ARN de las celulas infectadas con vHS2/β-globina-Neo; los carriles 4 y 5corresponden al ARN de las celulas infectadas con vHS2/B19-globina-Neo. Los signos mas y menos indi-can la presencia o ausencia, respectivamente, de hemina, un inductor del gen de la γ-globina que pareceno tener efecto en la expresion de la β-globina. El analisis Northern indica que el gen de la β-globinase expresa en las celulas infectadas K562 infectadas con vHS2/β-globina-Neo y vHS2/B19-globina-Neo,pero no en las celulas infectadas de forma simulada.
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REIVINDICACIONES
1. Vector de expresion para la integracion en un lugar especıfico y expresion genica en celulas es-pecıficas que comprende dos repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado 2 y por lo menosun cassette que comprende un promotor capaz de producir expresion en celulas especıficas, en el quedicho promotor esta unido operacionalmente a un gen heterologo y en el que dicho cassette reside entredichas repeticiones terminales invertidas.
2. Vector segun la reivindicacion 1, en el que cada una de dichas repeticiones terminales invertidascomprende los nucleotidos de la SEC ID n◦:1
3. Vector segun la reivindicacion 1, en el que dichas repeticiones terminales invertidas comprendenlos nucleotidos 1 a 125 de la SEC ID n◦:1.
4. Vector segun la reivindicacion 1, en el que dicho promotor es un promotor de parvovirus B19.
5. Vector segun la reivindicacion 4, en el que dicho promotor de parvovirus B19 es el promotor p6.
6. Vector segun la reivindicacion 4, en el que dicho promotor de parvovirus B19 comprende los nu-cleotidos de la SEC ID n◦:2
7. Vector segun la reivindicacion 1, en el que dicho gen heterologo codifica una proteına biologicamentefuncional.
8. Vector segun la reivindicacion 1, en el que dicho gen heterologo codifica una proteına biologicamenteno funcional.
9. Vector segun la reivindicacion 1, en el que dicho gen heterologo codifica un ARN antisentido.
10. Vector segun la reivindicacion 1, en el que dicho gen heterologo esta seleccionado de entre el grupoque comprende los genes que codifican α-globina, β-globina, γ-globina, factor estimulador de colonias degranulocitos macrofagos (GM-GSF), factor de necrosis tumoral (TNF), cualquiera de entre interleucinas1-11, resistencia a la neomicina, luciferasa, adenosin fosforribosil transferasa (APRT), retinoblastoma,insulina, factor de crecimiento de mastocitos, p53, adenosin desaminasa.
11. Vector segun la reivindicacion 1, en el que dicho gen heterologo codifica la glicoproteına P.
12. Vector segun la reivindicacion 9, en el que dicho ARN antisentido es complementario de un seg-mento del ADN o ARN que codifican α-globina.
13. Vector segun la reivindicacion 5, en el que el gen heterologo en dicho vector se selecciona de entreel grupo que comprende GM-CSF, APRT, neor , RB, β-globina, α-globina o γ-globina.
14. Vector segun la reivindicacion 5, en el que el gen heterologo en dicho vector es mdr.
15. Celula huesped que contiene el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Virion que contiene el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
17. Celula huesped que contiene el vector segun la reivindicacion 16.
18. Celula hematopoyetica germinal o celula progenitora que contiene el vector segun las reivindica-ciones 15 o 17.
19. Utilizacion de los vectores segun la reivindicacion 1, para la preparacion de una composicion quecomprende celulas de medula osea transducidas para uso en terapia genica.
20. Utilizacion segun la reivindicacion 19, en la que dicha transduccion se logra por transfeccion condicho vector o por infeccion con viriones que contienen dicho vector.
21. Utilizacion segun la reivindicacion 19, en la que dicha terapia genica comprende el tratamientode la anemia falciforme o la diabetes.
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22. Utilizacion segun la reivindicacion 19, en la que dicha terapia genica comprende el tratamientode la talasemia.
23. Utilizacion segun la reivindicacion 22, en la que el gen heterologo en dicho vector es la α-globinao la β-globina.
24. Utilizacion segun la reivindicacion 19, en la que dicha terapia genica comprende el tratamientode las enfermedades hematopoyeticas.
25. Utilizacion segun la reivindicacion 24, en la que el gen heterologo en dicho vector es GM-CSF.
26. Utilizacion segun la reivindicacion 24, en la que dicha terapia genica comprende el tratamientodel cancer.
27. Utilizacion segun la reivindicacion 26, en la que el gen heterologo en dicho vector es RB.
28. Utilizacion segun la reivindicacion 19, en la que dicha terapia genica comprende el tratamientode las hemoglobinopatıas.
29. Utilizacion segun la reivindicacion 28, en la que el gen heterologo en dicho vector se selecciona deentre el grupo que comprende α-globina, β-globina o γ-globina.
30. Utilizacion del vector segun la reivindicacion 1, para la preparacion de una composicion, que com-prende transducir celulas de medula osea para suministrar un producto farmaceutico en un mamıfero.
31. Utilizacion segun la reivindicacion 30, en la que dicha transduccion se logra por transfeccion opor infeccion con un virion que contiene dicho vector.
32. Utilizacion segun la reivindicacion 30, en la que dicho producto es γ-globina, insulina, factorestimulante de colonias de macrofagos, factor estimulador de colonias de granulocitos, eritropoyetina,factor de necrosis tumoral, factor de crecimiento de mastocitos, cualquiera de las interleucinas 1-11, p53,adenosina desaminasa o cualquier molecula de ARN antisentido.
33. Utilizacion segun la reivindicacion 30, en la que dicho producto es el factor estimulante de coloniasde granulocitos macrofagos.
34. Utilizacion segun la reivindicacion 33, en la que el gen heterologo en dicho vector es GM-CSF.
35. Utilizacion segun la reivindicacion 30, en la que dicho producto es α-globina.
36. Utilizacion segun la reivindicacion 35, en la que el gen heterologo en dicho vector es el gen de laα-globina.
37. Utilizacion segun la reivindicacion 30, en la que dicho producto es β-globina.
38. Utilizacion segun la reivindicacion 37, en la que el gen heterologo en dicho vector es β-globina.
39. Utilizacion segun la reivindicacion 30, en la que dicho producto es retinoblastoma.
40. Utilizacion segun la reivindicacion 39, en la que el gen heterologo en dicho vector es RB.
41. Utilizacion segun la reivindicacion 11, para la preparacion de una composicion que comprendecelulas de medula osea transducidas para conferir a un paciente resistencia a multiples farmacos en celulasespecıficas.
42. Utilizacion del vector segun la reivindicacion 14, para la preparacion de un medicamento quecomprende celulas de medula osea transducida para conferir resistencia a multiples farmacos a las celulaseritroides de un paciente.
43. Utilizacion segun las reivindicaciones 41 o 42, en la que dicha transduccion se logra por trans-feccion de dicho vector o por infeccion con viriones que contienen dicho vector.
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44. Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 19, 30, 41 o 42, en la que dichas celulas demedula osea estan enriquecidas en celulas germinales antes de la transduccion.
45. Vector de expresion que comprende dos repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado2 y por lo menos un cassette que comprende un promotor capaz de producir expresion en celulas es-pecıficas, en el que dicho promotor se encuentra operacionalmente unido a un gen heterologo y en el quedicho cassette reside entre dichas repeticiones terminales invertidas.
46. Utilizacion del vector segun la reivindicacion 45, para la preparacion de una composicion quecomprende celulas de medula osea transducidas para la terapia genica.
47. Utilizacion del vector segun la reivindicacion 45, para la preparacion de una composicion que com-prende celulas de medula osea transducidas para suministrar un producto farmaceutico en un mamıfero.
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)y a la Disposicion Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a laaplicacion del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen aEspana y solicitadas antes del 7-10-1992, no produciran ningun efecto en Espana enla medida en que confieran proteccion a productos quımicos y farmaceuticos comotales.
Esta informacion no prejuzga que la patente este o no incluıda en la mencionadareserva.
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LISTAS DE SECUENCIAS
(1) INFORMACION GENERAL
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC.
(B) CALLE: 101 N. Wilmot Road, Suite 600
(C) CIUDAD: Tucson
(D) ESTADO: Arizona
(E) PAIS: Estados Unidos de America
(F) CODIGO POSTAL (ZIP): 85711-3335
(ii) TITULO DE LA INVENCION: VECTOR SEGURO PARA LA TERAPIA GENICA
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2
(iv) FORMA LEIBLE POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE MEDIO: Disquete de 31/2
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) PROGRAMA: PatentIn Version n◦ 1.0, Version n◦ 1.25 (EPO)
(v) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
NUMERO DE SOLICITUD: US PCT/US92/09769
(2) INFORMACION DE SEC ID n◦:1
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 145 pares de bases
(B) TIPO: acido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: unica
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genomico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID n◦:1
TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC 60CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG 120GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCT 145
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID n◦:2
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 225 pares de bases
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(B) TIPO: acido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: unica
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genomico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID n◦:2
TTTTAGCGGG CTTTTTTCCC GCCTTATGCA AATGGGCAGC CATTTTAAGT GTTTTACTAT 60AATTTTATTG GTTAGTTTTG TAACGGTTAA AATGGGCGGA GCGTAGGCGG GGACTACAGT 120ATATATAGCA CGGTACTGCC GCAGCTCTTT CTTTCTGGGC TGCTTTTTCC TGGACTTTCT 180TGCTGTTTTT TGTGAGCTAA CTAACAGGTA TTTATACTAC TTGTT 225
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