variaciones de la hormona hipofisaria somatolactina en
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Variaciones de la hormona hipofisariasomatolactina en la adaptación a los cambios decoloración del entorno en Cichlasoma dimerus
Cánepa, Maximiliano Martín2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires
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Contacto: [email protected]
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Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental
“VARIACIONES DE LA HORMONA HIPOFISARIA SOMATOLACTINA EN LA ADAPTACIÓN A LOS CAMBIOS DE COLORACIÓN DEL ENTORNO EN
Cichlasoma dimerus”
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Ciencias Biológicas
Maximiliano Martín Cánepa
Director de Tesis: Dra. Paula Gabriela Vissio
Consejero de Estudios: Dr. Dante Agustín Paz
Buenos Aires, 2010
Resumen
“VARIACIONES DE LA HORMONA HIPOFISARIA
SOMATOLACTINA EN LA ADAPTACIÓN A LOS CAMBIOS DE
COLORACIÓN DEL ENTORNO EN Cichlasoma dimerus”
En peces, el control de la coloración corporal está regulada por múltiples
hormonas y por el sistema nervioso autónomo (SNA). En esta Tesis se propone
también a Somatolactina (SL) como factor involucrado en este proceso. En
primer lugar se clonó y secuenció a SL y su receptor putativo, el receptor de
hormona de crecimiento tipo 1 (RGH1) en el pez cíclido, Cichlasoma dimerus.
El análisis filogenético de ambos indica que se encuentran altamente
conservados entre los peces del superorden Acanthopterygii tales como
medaka, Oryzias latipes, y tilapia, Oreochromis mossambicus. Posteriormente,
se evaluó la expresión de SL en hipófisis y el RGH1 en el tegumento
mostrando que la expresión de ambos es mayor en animales mantenidos en un
entorno negro. A continuación, se observó que las fibras inmunoreactivas (ir-) a
MCH (hormona concentradora de melanina) y fibras ir-GnRH (hormona
liberadora de gonadotrofinas) están relacionadas morfológicamente con las
células de SL. Por último, estudios de liberación de SL a partir de hipófisis
intactas en cultivo mostraron que tanto MCH como GnRH actúan como factores
liberadores de SL. A partir de los resultados de esta Tesis se concluye que SL
forma parte de un sistema multifactorial de regulación de la adaptación de la
coloración del entorno actuando directamente sobre el tegumento.
Palabras claves: Hormonas hipofisarias, teleósteos, hipófisis, GnRH, MCH
Abstract
“SOMATOLACTIN AND BACKGROUND COLOR ADAPTATION
IN THE CICHLID FISH Cichlasoma dimerus”
In fish, background color adaptation is regulated by multiple hormones
and the autonomic nervous system. In this Thesis somatolactin is proposed as
a factor involved in such process. Firstly, Cichlasoma dimerus SL and its
putative receptor, growth hormone receptor type 1 (GHR1) were cloned and
sequenced. The phylogenetic analysis showed that both proteins were highly
conserved among species from the superorder Acanthopterygii such as the
medaka, Oryzias latipes, and the Tilapia, Oreochromis mossambicus. Secondly,
the expression of both was assessed under black and white background
showing a higher expression in animals maintained in the black one. Then, a
close association between immunoreactive (ir-) MCH (melanin concentrating
hormone) or ir-GnRH (gonadotropin-releasing hormone) fibers and SL cells was
found. Finally, MCH and GnRH increased somatolactin release in pituitary
cultures. The results obtained in this Thesis suggest that SL takes part of a
multifactorial regulation system of background color adaptation having probably
a direct effect on the integument color.
Keywords: Pituitary hormones, teleosts, pituitary, GnRH, MCH.
Esta Tesis no hubiera sido posible sin el apoyo de las siguientes instituciones:
El CONICET del cual recibí la financiación para cursar mis estudios de postgrado.
El Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental de la Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires.
La Universidad de Buenos Aires.
Agradecimientos:
A Paula, mi directora de tesis, por depositar tanta confianza en mí y en mis ideas
dándome aliento para concretarlas. Por ayudarme a analizar los resultados desde otra
perspectiva. Por tu mirada crítica sobre los resultados y por respetar mis decisiones.
Por el inmenso aporte a esta Tesis y a mi formación profesional. En especial quiero
agradecerte por brindarme tu hermosa amistad, escucharme siempre, por haber
compartido muchos momentos juntos ya sean de los buenos como de los malos y por
brindarte desinteresadamente.
A Mati por confiar en mí para trabajar en el laboratorio, por hacerme formar parte de
tus proyectos y por haber sido parte muy importante en mi formación. Además quisiera
agradecerte por todo este tiempo compartido en el laboratorio, el cual hizo que
transitáramos por un montón de etapas que ayudaron a que se formara nuestra
amistad.
Al Dr. Yong Zhu por todas sus enseñanzas que enriquecieron mi formación profesional
y a esta Tesis. Además, por brindarme la posibilidad de trabajar en su laboratorio.
A Dante, por tu desinteresada generosidad, por estar siempre disponible y pendiente de
que todo salga bien. Porque sin tu ayuda, gran parte de esta Tesis no se podría haber
realizado.
A Andrea, por su aporte en parte de esta Tesis. Por tu generosidad y predisposición
para ayudar. Por tu aporte a mi formación y la visión crítica hacia mi trabajo. También
por su cariño y amistad.
A Cristina por haberme dado la oportunidad de trabajar en el laboratorio.
A Dani, por mostrar ese entusiasmo y sencillez día a día que contagia. Por el cariño
que nos dás y las ganas de trabajar y aprender que traes todos los días.
A Richard y Sophia por su generosidad y confianza durante mi visita al lab. del Dr Zhu.
A los integrantes del lab. de Biología del Desarrollo, en especial a Lucas y Carola por
la amistad, la generosidad y por su disposición a darme una mano siempre que lo
necesite.
Al Dr. Valdivia por el asesoramiento en los experimentos de cultivos de hipófisis.
A Abel por haberme ayudado en mis comienzos en la biología molecular.
A Fabi, por ofrecer siempre tu ayuda y estar siempre pendiente de todo.
A los integrantes del laboratorio de Embriología Animal.
A mis amigos por acompañarme y estar siempre.
Mi Familia, por desearme siempre lo mejor en mis proyectos y brindarme tanto cariño.
A mi hermana, Leo y mis sobrinos por el aliento a la distancia. Los quiero mucho.
A mis viejos, por alentarme siempre en lo que sea. Por estar siempre y por haberme
inculcado los valores que más aprecio. Por ser los mejores padres del mundo y mi
ejemplo también. Los quiero muchísimo.
A Chi, por estar siempre a mi lado, por compartir cada instante conmigo, aconsejarme,
alentarme en todo, entenderme y porque siento que me haces la persona más feliz del
mundo. Por el esfuerzo que hicimos para que esta Tesis sea lo que es. Por esa sonrisa
tan linda, el amor y belleza que me brindas cada día. Te amo con todo mi corazón.
ÍNDICE
Introducción……………………………………………………………………….………. 1
La hipófisis……………………………………………………..………………………. 1
Hipófisis en peces…………………………………………………………………. 4
Hormonas hipofisarias……………………………………………....................... 5
Somatolactina (SL)...…………………………………….……………………………. 5
Receptor putativo de SL………….……………………………………..................... 6
Neuropéptidos en la hipófisis de peces…………………………………………….. 8
Hormona concentradora de melanina (MCH)………………………...………... 8
Hormona liberadora de las gonadotrofinas (GnRH)………………………..…. 9
Regulación de SL.…………………………………………………………….…… 11
Modelo biológico: Cichlasoma dimerus…………………………………………….. 12
Hipófisis de C. dimerus…………………………………………………...………. 16
Cambios de coloración……………………………………………………………….. 18
Hipótesis y objetivos…………… …………………………………………………... 20
Capítulo I………………………………… ……………………………………….……….... 23
Materiales y métodos… ………………………………………………………...…... 24
Secuencia de SL de C. dimerus…………………………………………………. 24
Secuencia del receptor putativo de SL de C. dimerus……………………...…. 26
Reconstrucción filogenética…………………………………………...…………. 28
Predicción de la estructura protéica………………………………..…………… 28
Resultados……………………………………………………………………………. 29
Secuencia de SL de C. dimerus………………..…….…………………...…….. 29
Secuencia del receptor putativo de SL de C. dimerus..……………….………. 34
Discusión…..…………………………………………………………….……………. 38
Secuencia de SL de C. dimerus….…………………………………...………… 38
Secuencia del receptor putativo de SL de C. dimerus …………………..……. 40
Capítulo II.…………………………………………………………………………..………. 42
Materiales y métodos… …………………………………………………...………... 43
Animales……………………………………………………………...……..……… 43
Efecto de la coloración del entorno sobre la expresión de SL…………….…. 43
RGH1 en piel de C. dimerus…………………………………………………..…. 44
Efecto de la coloración del entorno sobre la expresión del RGH1 en piel de
C. dimerus…………………………..……………….………………....................
46
Efecto de la coloración del entorno sobre la cantidad y morfología de los
melanóforos en piel de C. dimerus………………………………………………
47
Análisis estadístico………………………………………………..……………… 47
Resultados……………………………………………………………………………. 48
Efecto de la coloración del entorno sobre la expresión de SL……………...... 48
Presencia en la piel del RGH1……….…………………………………………. 52
Efecto de la coloración del entorno sobre los niveles de expresión del
RGH1 en piel de C. dimerus ………………..……………………………….. 52
Efecto de la coloración del entorno sobre la cantidad y morfología de los
melanóforos en piel de C. dimerus……………………………………..……. 54
Discusión.…..…………………………………………………………………………. 57
Efecto de la coloración del entorno sobre la expresión de SL…..…………… 57
Presencia del RGH1 en la piel de C. dimerus.......................................…….. 58
Efecto de la coloración del entorno sobre los niveles de expresión del
RGH1 y sobre el número y morfología de melanóforos en piel de C.
dimerus………………………….…...………………………………………..… 59
Capítulo III.……………………………… …………….…………………….……………… 64
Materiales y métodos… …………………………………………...………………... 65
Animales………………………..………………………..………………………… 65
Relaciones morfológicas entre MCH, GnRH y SL……………..…….……...... 65
Procesamiento de las muestras para inmunofluorescencia…………….... 65
Doble inmunofluorescencia SL-MCH…………………………………..….... 65
Doble immunofluorescencia SL-GnRH………………………………..…..... 66
Relación funcional entre GnRH, MCH y SL……………………….. 67
Ensayo in vitro de liberación de SL de hipófisis de C. dimerus…………... 67
Análisis por Western blot……………………………………………..………. 71
Controles de viabilidad de hipófisis en cultivo………………………..…….. 72
Análisis estadístico……………………………………………………..……... 73
Resultados……………………………………………………………………………. 74
Relaciones morfológicas entre MCH, GnRH y SL…………………..………… 74
Relación funcional entre GnRH, MCH y SL...…………………..……………... 77
Discusión…………………………… ………………………………………………... 83
Regulación de la liberación de SL…………………………………….…………. 83
Conclusiones finales……………………………………………………………………… 88
Bibliografía………………………………………………………………………………….. 91
Introducción
Página 1
“VARIACIONES DE LA HORMONA HIPOFISARIA
SOMATOLACTINA EN LA ADAPTACIÓN A LOS CAMBIOS DE
COLORACIÓN DEL ENTORNO EN Cichlasoma dimerus”
INTRODUCCIÓN
La hipófisis
La hipófisis es una glándula endocrina presente en todos los vertebrados que
se localiza en la región ventral del cerebro. Representa el vínculo
neuroendocrino entre el sistema nervioso y el sistema endocrino tradicional. La
teoría clásica indica que su origen es ectodérmico a partir de una invaginación
del estomodeo que se pone en contacto con una evaginación del piso del
diencéfalo. El mesodermo entre ellos dará origen a los vasos sanguíneos (Ball
y Baker, 1969). El techo de la región oral forma la bolsa de Rathke y se
convierte en la región glandular de la hipófisis (adenohipófisis), por otro lado, el
piso del diencéfalo se evagina dando origen a la neurohipófisis (Fig. 1). Por lo
tanto la hipófisis tiene un origen doble el cual se refleja en las funciones del
adulto (Gilbert, 2000).
Figura 1. Esquema clásico de la embriología de la hipófisis. A: anterior, P:
posterior (adaptado de Nussey y Whitehead, 2001).
A P
Introducción
Página 2
Otros autores como Kawamura y col. (2002) proponen que la región glandular
se formaría a partir de un placode adenohipofisario (células de la cresta neural)
que se desprende del neuroectodermo, migra antero-posteriormente y
finalmente se adhiere al extremo del infundíbulo (Fig. 2).
Figura 2: Localización inicial y migración del primordio adenohipofisario en un
embrión de anfibio. El primordio está marcado de negro. (a) Vista frontal del
estadio de néurula abierta. (b) Inmediatamente después del cierre del tubo neural.
(c) Estadio de esbozo caudal. Notar que el primordio hipofisario toma una
morfología similar a la bolsa de Rathke. La porción caudal se adhiere al intestino
anterior. (d) Fin del estadio de brote caudal. El primordio de hipófisis se ha
desprendido del intestino anterior y se ha establecido una conexión con el
infundíbulo. CB: cerebro, I: intestino anterior; PN: placa neural. Adaptado de
Kawamura y col. (2002).
La hipófisis puede dividirse en diferentes regiones según el criterio que se
utilice. Según un criterio anatómico, se la puede dividir en un lóbulo anterior y
en uno posterior; según el criterio histológico en pars distalis, pars intermedia y
pars nervosa, y por último, también se puede utilizar un criterio embriológico y
dividirse en adenohipófisis y en otra región denominada neurohipófisis (Fig
3ab).
Tomando el criterio embriológico según el cual la hipófisis se divide en una
adenohipófisis (ADH) y en una neurohipófisis (NH), la ADH se divide en tres
regiones: pars distalis, pars tuberalis y pars intermedia. En todos los
vertebrados la pars distalis es la mayor de las tres regiones y es donde se
localizan las células productoras de la mayoría de las hormonas hipofisarias. La
I I I
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pars tuberalis se ubica en una posición anterior a la pars distalis y su función no
es aún muy clara, solo está presente en tetrápodos y parecería estar
relacionada con procesos reproductivos relacionados con variaciones del
fotoperiodo (Dardente 2007). La pars intermedia, ausente en aves y algunos
mamíferos, está íntimamente relacionada con la NH y en algunos vertebrados
presenta un surco que se corresponde, según la descripción clásica, a un resto
del lúmen de la “bolsa de Rathke”. La NH se la puede dividir en dos regiones:
pars nervosa y eminencia media.
Figura 3. Anatomía de la hipófisis y relación funcional entre la hipófisis y el
hipotálamo en mamíferos. LA, lóbulo anterior; LP, lóbulo posterior; OC, quiasma
óptico; CM, cuerpos mamilares; CN, células neurosecretoras; TNH, tracto
neurohipofisario; FLI, factores liberadores e inhibidores, NP neurona parvocelular;
NM, neurona magnocelular; CPH, circulación portal hipofisaria. Adaptado de
Nussey y Whitehead (2001). A: anterior, B: posterior
a b
A P
PA
CM
Introducción
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Hipófisis en Peces
Los peces teleósteos, a diferencia de los mamíferos (Fig 3b), no poseen
eminencia media ni sistema porta y las fibras nerviosas que se originan en el
sistema nervioso se encuentran en contacto con las células hipofisarias.
Estudios inmunocitoquímicos demostraron que las fibras y sus terminales, que
contienen neurohormonas o neuropéptidos, están localizadas especialmente en
la hipófisis en asociación estrecha con células endocrinas. A causa de esta
disposición anatómica particular, los peces teleósteos representan un modelo
experimental único para identificar péptidos cerebrales y monoaminas
involucrados en la regulación de la síntesis y liberación de hormonas
hipofisarias (Peter y col. 1990).
En teleósteos, la NH consiste de un tallo hipofisario suspendido de la región
ventral hipotalámica que contiene una extensión del tercer ventrículo (receso
infundibular). A diferencia de los tetrápodos, la parte distal del tallo se engrosa
e interdigita con todas las regiones de la ADH. La NH anterior, homóloga a la
eminencia media, inerva la pars distalis rostral y la proximal (PDR y PDP)
(Peter y col. 1990). Por otro lado, las interdigitaciones en la pars intermedia (PI)
son más profundas que aquellas de la PDR y la PDP (Fig. 4) (Ball y Baker,
1969).
Figura 4: Relación entre la hipófisis y el cerebro en peces teleósteos. Las
proyecciones de la NH penetran en la ADH y los axones hacen sinapsis con las
células de la ADH o se encuentran en proximidad, creándose una difusión
parácrina. PDR: pars distalis rostral, PDP: pars distalis proximal, PI: pars
intermedia, en negro: pars nervosa. A: anterior, P: posterior. Adaptado de Kardong
(1998)
A P
Introducción
Página 5
Hormonas hipofisarias
La ADH es sitio de síntesis, almacenamiento y liberación de las hormonas
hipofisarias. Particularmente, en la pars distalis se encuentran diversos tipos
celulares responsables de la secreción de hormonas tales como: corticotrofina
u hormona adrenocorticotrofica (ACTH); tirotrofina u hormona estimulante de la
tiroides (TSH); hormona de crecimiento o somatotrofina (GH); prolactina (PRL)
y dos gonadotropinas, u hormonas gonadotroficas (GTHs): la hormona folículo
estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH).
Por otro lado, en la pars intermedia se encuentra un tipo celular que sintetiza la
hormona melanocito estimulante o melanotrofina (MSH) la cual estimula la
síntesis de melanina y el movimiento de los melanosomas dentro de los
melanóforos. En peces, se encuentra otro tipo celular en donde se sintetiza la
hormona somatolactina la cual será descripta en detalle más adelante.
Somatolactina
Somatolactina (SL) es una hormona hipofisaria que pertenece a la familia de la
hormona de crecimiento y prolactina y está solo presente en peces
Actinopterygii y en el Sarcopterygii, Protopterus annectens (pez pulmonado)
(Kawauchi y Sower 2006). Su síntesis y secreción se restringe a un grupo de
células de la pars intermedia, generalmente células positivas para la reacción
de PAS (ácido peryódico de Schiff). SL está más conservada que GH y PRL
entre los Actinopterygii y los Sarcopterygii (Amemiya y col. 1999).
Generalmente consiste de 204 a 209 aa, un péptido señal de 23 aa, 3 puentes
disulfuro intracatenarios y un potencial sitio de glicosilación (NKT) cuya
posición está usualmente conservada. Zhu y col. (2004) demostraron la
existencia de un par de genes parálogos de SL en zebrafish, Danio rerio, los
cuales fueron designadas como SLα y SLβ. La variante α de zebrafish mostró
una alta similitud con la mayoría de las SLs encontradas en las especies de
peces teleósteos, mientras que la variante β solo comparte un 40–50% de
identidad aminoacídica.
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SL ha sido involucrada en diversos procesos fisiológicos como la regulación de
algunos aspectos de la reproducción y la respuesta al estrés (Planas y col.
1992, Rand-Weaver y Swanson 1993, Rand-Weaver y col. 1993, Johnson y col.
1997, Mousa y Mousa 2000, Vissio y col. 2002, Benedet y col. 2008, Laiz-
Carrión y col. 2009). Otros estudios han informado una relación entre SL y el
balance ácido base (Kakizawa y col. 1995, 1997a), la regulación del calcio
(Kaneko y Hirano 1993) y diferentes condiciones de salinidad (Laiz-Carrión y
col. 2009). Por otro lado, se han correlacionado variaciones en los niveles de
SL en diferentes condiciones de fotoperiodo, temperatura y de ayuno
prolongado (Uchida y col. 2009, Vargas-Chacoff y col. 2009). También se ha
observado una correlación entre la coloración del entorno y los niveles
hipofisarios de SL en diferentes especies de peces (Kakizawa y col. 1995, Zhu
y Thomas 1995, 1996, 1997, 1998; Zhu y col. 1999, Fukamachi y col. 2004,
Cánepa y col. 2006).
Receptor putativo de SL
En comparación con GH y PRL, la estructura primaria de SL está altamente
conservada entre especies de peces muy divergentes, esto sugiere que tiene
una importante función y además un receptor relativamente específico capaz
de discriminar entre las diferentes hormonas de la familia. Recientemente, en el
salmon, Oncorhynchus masou, se ha clonado un receptor putativo para SL con
características que lo ubicaron en el tipo de receptores de citoquinas, el cual
sería homologo a los de GH y PRL (Fukada y col. 2005). Tanto el receptor
putativo de SL, como los de GH y PRL, pertenecen a la superfamilia de los
receptores de citoquinas clase 1 el cual también incluye, entre otros, los de
erytropoyetina y leptina. Esta familia de receptores actúan a través de las
proteínas JAKs (Janus kinasas) y de STATs (del inglés: signal transducers and
activators of transcription) regulando procesos de proliferación, diferenciación
celular y apoptosis (Krauss, 2003). Fukada y col. (2005) postulan al receptor de
SL clonado como específico debido a la alta afinidad por SL y la baja por PRL y
GH cuando se realizaron ensayos de unión a ligando. Posteriormente,
Fukamachi y Meyer (2007) a través de un trabajo de análisis filogenético de los
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receptores de GH (RGH) de peces (tipo 1 y 2) hasta ese momento encontrados
y, el clonado del receptor de GH del pez pulmonado y el esturión, postularon
que los receptores de GH tipo 1, a excepción de salmónidos, en realidad son
receptores para SL. Luego, Pierce y col. (2007) basados en el análisis
filogenético y en los patrones de distribución postularon que el RGH tipo 1 de
tilapia, Oreochromis mossambicus, sería el receptor de SL mientras que el
RGH tipo 2 sería, de hecho, el receptor primario para GH.
Las características principales de los miembros de este grupo incluyen: (a)
presencia de un dominio transmembrana, (b) baja homología aminoacídica en
el dominio extracelular de alrededor de 210 aa (corresponde a dos dominios
fibronectina 3 de tamaño similar), (c) residuos cisteína conservados en el
dominio extracelular y un residuo triptofano adyacente a la segunda cisteína en
el dominio N-terminal fibronectina, (d) un motivo WSXWS (trp, ser, X, trp, ser)
en el dominio fibronectina C-terminal (reemplazado por YXXFS en el receptor
GH de peces), (e) la ausencia de una secuencia consenso canónica tirosina
kinasa y (f) dos dominios homólogos cortos (ricos en prolina), llamados Box 1 y
Box 2 en el dominio intracelular (Zhu y col. 2001). La secuencia consenso Box
1 consiste de 8 residuos de longitud y está localizado dentro de los 20 residuos
siguientes al dominio transmembrana. Box 1 muestra una secuencia consenso
al-CPX-al-PXP o CXXXalPXP donde “al” es cualquier residuo alifático, C es
cualquier residuo hidrofóbico y P es prolina. Box 1 es un sitio de asociación de
asociación de Janus Kinasa (JAK) con el receptor GH y es crítico para la
mayoría de las funciones celulares estimuladas por GH. La deleción o mutación
de estas secuencias consenso neutraliza la activación por JAK y la
subsiguiente transducción de la señal que conduce a, entre otros procesos,
proliferación celular (Zhu y col. 2001). Box 2 es menos conocida y comprende
aproximadamente 15 aminoácidos situados aproximadamente a 30 distales de
Box 1. Consiste de un grupo de residuos hidrofóbicos y ácidos finalizando con
1 o 2 básicos y no sería fundamental para la interacción de JAK con el receptor
y se encontró que incluye una secuencia consenso para la endocitosis
dependiente de ubiquitina aunque no sería fundamental para dicho proceso
(Huang y col. 2001, Gent y col. 2002).
Introducción
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Neuropéptidos en la hipófisis de peces.
Hormona concentradora de melanina (MCH)
La hormona concentradora de melanina es un neuropéptido cíclico de 17 aa,
con una función neuromoduladora aparente, presente en todos los vertebrados.
Esta hormona se aisló originalmente de un salmónido, el salmón chum
Oncorhynchus keta, (Kawauchi y col. 1983). En peces teleósteos, además de
haber sido descripta inicialmente como una hormona neurohipofisaria con una
función de empalidecimiento del tegumento, se ha propuesto que posee una
función de neurotransmisor o neuromodulador en base a la amplia distribución
de la fibras en el cerebro (Baker y Bird 2002). Particularmente, ha sido también
propuesta como un regulador de la liberación de hormonas hipofisarias (Baker
y col. 1985, Balm y Groneveld 1998). La caracterización de MCH de mamíferos
ha demostrado que este neuropéptido se encuentra altamente conservado a
través de la evolución (Nahon 1994). En mamíferos se ha observado que MCH
tiene funciones centrales actuando como neurotransmisor o neuromodulador.
En este grupo se ha propuesto que está involucrada en la regulación de la
ingesta, la homeostasis energética, el estrés, reproducción, comportamiento,
percepción sensitiva, y respuestas neuroendócrinas (Griffond y Baker 2002,
Forray 2003, Pissios y Maratos-Flier 2003, Whitlock y col. 2005).
Recientemente, se han realizado estudios que indican que MCH actuaría como
regulador de la liberación de hormonas hipofisarias. En rata, Rattus rattus,
mediante ensayos in vitro se observó que MCH podría regular la liberación de
gonadotrofinas además de afectar la liberación de GnRH (Chiocchio y col.
2001). A su vez, se observó que MCH estimula la liberación de GH en cultivos
de somatotropos provenientes de hipófisis de ratón e hipófisis de fetos
humanos. En ese mismo trabajo se encontró que las células productoras de
GH expresan un receptor de MCH denominado receptor de MCH tipo 1 (MCH-
1) pero no el denominado MCH-2 (Segal-Lieberman y col. 2006). En peces
teleósteos, MCH también tendría un papael como regulador de hormonas
hipofisarias. En estudios realizados en tilapia, Oreochromis mossambicus, se
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observó que MCH afecta la liberación de αMSH hipofisaria indicando una
interacción entre ambos en relación con la adaptación a la coloración del
entorno (Gröneveld y col. 1995). Por otro lado, se ha propuesto que MCH
regularía péptidos relacionados con la ingesta como orexina, grelina, αMSH y
NPY teniendo, y por lo tanto, un rol en este proceso (Shimakura y col. 2008,
Matsuda 2009, Amano y Takahashi 2009). Del mismo modo, diversos estudios
realizados en peces telósteos indican que MCH estaría involucrada en el
crecimiento somático ya que se observó que animales mantenidos en
condiciones de alta expresión de MCH (entorno blanco) poseen una mayor tasa
de crecimiento, posiblemente estimulando directamente la ingesta o
indirectamente actuando a través de hormonas involucradas en el crecimiento y
la ingesta como lo son GH y Orexina (Takahashi y col. 2004, Yamamone y col.
2005, Perez Sirkin y col. 2009). Además en goldfish, Carassius auratus, se ha
observado que MCH estimula la liberación de LH en cultivo de células
dispersas involucrando a este neuropéptido en el eje reproductivo de peces
teleósteos el cual es bien sabido que está estrechamente relacionado con el
balance energético (Cerdá-Reverter y col. 2006). En peces, a diferencia de
mamíferos, los efectos de MCH sobre las hormonas hipofisarias estarían
mediados por el receptor MCH-2 presente en la hipófisis del lenguado,
Verasper moseri, mientras que la expresión del receptor MCH-1 estaría
confinada al cerebro (Amano y Takahashi 2009).
Hormona liberadora de las gonadotrofinas (GnRH)
La hormona liberadora de las gonadotrofinas es un decapéptido que se
sintetizado por neuronas dentro del sistema nervioso central. Su principal
función biológica es inducir la síntesis y liberación de gonadotrofinas. Se han
identificado más de 20 variantes de GnRH. En peces teleósteos se han
encontrado 8 de las 14 formas de GnRH encontradas en vertebrados, 6 de las
cuales fueron descubiertas por primera vez en peces (Kah y col. 2007). El
análisis de filogenia molecular del ADNc correspondiente a GnRH agrupó las
variantes en 3 ramas diferentes las cuales fueron nombradas GnRH tipo I, II y
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III (White y Fernald 1998). En particular, los peces teleósteos del orden
Perciformes presentan los tres tipos de GnRH mientras que en tetrápodos
aparentemente solo se expresan dos de ellas (Kah y col. 2007). En teleósteos
GnRH I se expresa siempre en el área preóptica, desde donde se proyectan
fibras hacia la hipófisis, y actúa principalmente como una hormona
hipofisotrópica; GnRH II se expresa en el cerebro medio (Weltzien y col. 2004),
mientras que GnRH III, se expresa en el bulbo olfatorio ventromedial y está
solo presente en peces teleósteos. En el pez cíclido Astatotilapia burtoni se
observó que cambios en la actividad de las neuronas GnRH I podrían estar
relacionados con la cascada molecular de señales que conlleva a una mejora
en aspectos reproductivos y a otros cambios fisiológicos de largo término
asociados con la dominancia como lo son los cambios de coloración corporal
(Burmeister y col. 2005). Por otro lado, se observó que en Oreochromis
niloticus es posible que GnRH III regule los comportamiento reproductivos ya
que inmunoneutralizando esta variante se modifica el comportamiento agresivo
el cual incluye cambios en la coloración corporal (Ogawa y col. 2006).
Por otro lado, en mamíferos se han encontrado dos tipos de receptores de
GnRH con diferencias tales como la falta del fragmento intracelular que facilita
la internalización en uno de ellos y la alta respuesta a la variante GnRHII
chicken en el otro. Sin embargo, en peces se han encontrado hasta 5 tipos de
receptores y todavía no es clara la conformación de los diferentes grupos de
receptores y su filogenia (Kah y col. 2007, Chen y Fernald 2008). En A. burtoni,
por medio de hibridación in situ se encontraron dos tipos de receptores de
GnRH los cuales se expresan en diversas áreas del cerebro y en la hipófisis
(Chen y Fernald 2006). A su vez, en O. niloticus, se encontró que las células
productoras de MSH y las de SL expresan tres tipos de receptores diferentes
de GnRH dependiendo del grado de madurez sexual del animal. Esto indicaría
que ambas hormonas podrían estar bajo la regulación de GnRH. Del mismo
modo, se encontraron receptores en otros tipos celulares además de los
gonadótropos por lo cual GnRH tendría un amplio rol en el control
neuroendócrino de diferentes hormonas adenohipofisarias (Stefano y col. 1999,
Parhar y col. 2005).
Introducción
Página 11
En general, todos los tipos de receptores pueden unir los tres tipos de variantes
de GnRH, y todas muestran una alta afinidad por GnRH II. A su vez, se
observó que no existe una relación única entre un tipo de GnRH y un receptor
(Chen y Fernald 2008). De esta manera es necesario conocer si existe una
asociación morfológica en una variante de GnRH y un dado receptor ya que por
ejemplo en A. burtoni GnRH I proyecta hacia la hipófisis y actúa sobre dos
receptores distintos mientras que en Lithobates catesbeianus GnRH1 y 2
proyectan a la hipófisis pero actúan solo sobre un receptor (Chen y Fernald
2008). En particular, Kah y col. (revisión 2007) compara la respuestas
evocadas por los diferentes tipos de receptores y los diferentes ligandos y en
general los tres tipos de GnRH son capaces de evocar respuestas, algunas
veces, con igual biopotencia (Kah y col. 2007) dejando en evidencia la alta
promiscuidad de los receptores de GnRH por los 3 tipos de GnRH.
Regulación de SL
Se han realizado diversos estudios con el objetivo de dilucidar la función de SL,
sin embargo, existe poca información acerca de la regulación de la secreción
de SL. Kakizawa y col. (1997b) han demostrado que la variante GnRH salmón
(tipo III), el factor liberador de corticotrofinas y la serotonina, estimulan la
liberación de SL en cultivos de hipófisis de la trucha arco iris, Oncorhynchus
mykiss. En otra especie de salmónido, Oncorhynchus masou (salmon masu),
se observó que GnRH salmón aumenta la expresión del ARNm de SL en
cultivos primarios de células hipofisarias (Onuma y col. 2005). Recientemente,
en goldfish se encontró que MCH es capaz de inhibir la liberación de SL en
cultivo de células, que ese efecto era específico y que probablemente las
células de SL expresen un receptor para MCH ya que el tratamiento con
antagonistas de ese receptor, bloqueó el efecto inhibitorio de MCH (Tanaka y
col. 2009). Asimismo, el mismo grupo de investigación, encontró que PACAP
(del inglés: pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide) podría estimular
la liberación de SL probablemente a través del receptor PAC1R (del inglés:
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type 1 receptor) (Azuma y col.
2009)
Introducción
Página 12
Modelo biológico: Cichlasoma dimerus
Ubicación taxonómica
La clasificación taxonómica de C. dimerus es la siguiente (Según Kardong
1998, Fig. 5)
Chordata
Craniata
Vertebrata
Gnathostomata
Osteichthyes
Actinopterygii
Teleostei
Acanthopterygii
Perciformes
Cichlidae
Cichlasoma dimerus (Heckel, 1840)
Introducción
Página 13
Figura 5. Árbol filogenético de los peces teleósteos. La flecha indica el orden al
que pertenece C .dimerus. Adaptado de Nelson 1994.
Introducción
Página 14
Cichlasoma dimerus es un pez de talla mediana (largo promedio estándar de
una ejemplar adulto: 12 cm) el cual es fácil de criar y mantener bajo
condiciones de laboratorio donde tolera un amplio rango de temperatura (10 a
30°C, la condición de temperatura opt ima de cría es de 26°C) (Meijide y
Guerrero 2000). La distribución natural de esta especie abarca la totalidad del
sistema del río Paraguay, la región inferior del Alto Paraná y el resto del Rio
Paraná hasta la proximidad de la Ciudad de Buenos Aires (Kullander, 1983). Se
conocen registros de cuatro países (Bolivia, Brasil, Paraguay y Argentina) y en
una amplia variedad de ambientes lóticos y lénticos. Sus nombres comunes
son Chanchita (español) y Acará (portugués) (Staeck y Linke 1995, Casciotta y
col. 2005). Esta coloración es muy variable dependiendo de la jerarquía social y
el estado fisiológico. La coloración puede variar desde un grisáceo hasta un
negro brillante u oscuro y puede mostrar también reflejos amarillos-dorados o
azules. Muestra además varias bandas verticales oscuras en determinados
momentos del ciclo reproductivo y dos manchas, una en la región media del
tronco y la otra en el pedúnculo caudal. Los ojos pueden mostrar un borde rojo
brillante, particularmente en individuos reproductivamente activos. Además,
estas diferentes condiciones de coloración son dependientes de la coloración
del entorno. Esta especie tiene desarrollado un moderado dimorfismo sexual,
con los machos mostrando una tasa de crecimiento más alta que las hembras.
En los machos, los radios del borde distal de las aletas dorsal y ventral pueden
estar extendidos como filamentos. Como muchos cíclidos, C. dimerus tiene
actividades de desove altamente organizadas, y éstas pueden ser observadas
en el laboratorio. Unos pocos días después de haber sido transferidos a un
nuevo acuario, se establecen progresivamente los territorios, los cuales son
defendidos tanto por los machos como por hembras. La pareja dominante
defenderá agresivamente el sitio prospectivo de puesta (usualmente un
sustrato plano) y comenzará a evidenciar actividades de prepuesta
estereotipadas tales como movimientos sacádicos, cavar en la grava y
mordisqueo del sustrato de puesta. Eventualmente comenzará la puesta con la
hembra frotando su papila genital sobre el sustrato depositando los huevos
pegajosos en hileras. Después que la hembra deposita los huevos, el macho
Introducción
Página 15
desliza su papila genital sobre ellos, liberando gametas, alcanzándose así la
fecundación. Al final del proceso de puesta, el cual puede durar hasta 90 min,
se han depositado alrededor de 1500 huevos como una capa uniforme sobre el
sustrato. La puesta es seguida de un periodo de cuidado parental durante el
cual la pareja cuida cooperativamente los huevos abanicándolos y removiendo
los huevos muertos, los cuales son usualmente atacados por hongos. Durante
este periodo la pareja muestra el mayor grado de agresividad y tanto el macho
como la hembra despliegan un patrón de coloración mostrando un
oscurecimiento de la región ventral anterior como cambio más notorio.
Figura 6. Ejemplar adulto hembra de Cichlasoma dimerus mostrando líneas
verticales oscuras, generalmente inducidas por alguna situación de estrés, un
borde de color rojo en la región dorsal del ojo y una coloración oscura en la región
ventral del cuerpo generalmente asociada a períodos reproductivos.
Introducción
Página 16
Hipófisis de C. dimerus
La estructura general de la hipófisis de los adultos de C. dimerus sigue un
patrón similar al descripto para otros teleósteos. Presenta una forma alargada
con un gran desarrollo del receso infundibular. La NH se encuentra en la parte
medio-dorsal con ramas que penetran y se interdigitan en la ADH. Esta última
está dividida en las tres regiones: PDR, PDP y PI (Fig. 7)
Figura 7. Corte sagital de una hipófisis de un macho de Cichlasoma dimerus
coloreada con hematoxilina-eosina. Se indican los lóbulos de la hipófisis (pars
distalis rostral-PDR y proximal PDP, y pars intermedia-PI). Se muestra el tallo
infundibular (TI) conectando el hipotálamo (HPT) a la hipofisis (flecha). La
neurohipofisis (NH) además muestra sus numerosas interdigitaciones y profundas
dentro de la pars intermedia como así también las interdigitaciones en la pars
distales rostral y pars distalis proximal. Barra = 50 µm. Adaptado de Pandolfi y col.
(2009).
Como se mencionó en secciones anteriores, la ADH de peces es el sitio de
síntesis, almacenamiento y liberación al torrente sanguíneo de distintas
hormonas peptídicas: prolactina (PRL), adrenocorticotropina (ACTH), tirotropina
(TSH), gonadotrofinas (GtHs), hormona de crecimiento (GH), hormona alfa
melanocito estimulante (αMSH) y somatolactina (SL) (Fig. 8). La distribución de
Introducción
Página 17
estas células endócrinas y la ontogenia de las productoras de PRL, GH y SL en
C. dimerus se llevó a cabo previamente (Pandolfi y col. 2001a y b).
Figura 8: Esquema de una sección sagital de la hipófisis de C. dimerus mostrando
los distintos tipos celulares en la adenohipófisis. PDR pars distalis rostral, PDP
pars distalis proximal, PI pars intermedia, NH neurohipófisis, células ir-PRL ( ), ir-
ACTH en PDR y αMSH en PI ( ), ir-TSH ( ), ir-GTH ( ), ir-SL ( ) e ir-GH ( ).
Adaptado de Pandolfi y col. (2009)
Además, se describió la distribución en el cerebro de las células (ir-) a la
hormona alfa melanocito estimulante (αMSH), GnRH y MCH (Pandolfi y col.
2002, 2003, 2005). En particular se observó que fibras ir-GnRH y MCH
alcanzan las tres regiones de la adenohipófisis, especialmente la pars
intermedia (Pandolfi y col. 2002, 2003) en la cual las células SL y MSH están
localizadas (Pandolfi y col. 2001a).
Introducción
Página 18
Cambios de coloración
La piel está compuesta por una epidermis y debajo de ella una dermis
ambas separadas por una membrana basal. Mientras la primera es un derivado
del ectodermo la segunda deriva del mesodermo. La dermis en los peces
óseos se divide en una capa superficial de tejido conectivo laxo y una más
profunda de tejido conectivo denso y el producto estructural más importante de
la dermis es la escama. La epidermis está formada por un epitelio estratificado
y entre las células que lo forman se hallan glándulas unicelulares, células
secretoras y células pigmentarias derivadas de la cresta neural denominadas
cromatóforos. En la dermis, se pueden encontrar cromatóforos por encima o
debajo de las escamas, que son de mayor tamaño respecto de los epidérmicos
y poseen gran cantidad de procesos dendríticos (Fig. 9; Kardong 1998).
Figura 9: Esquema de piel de un pez óseo. Se observan las escamas en la dermis
en proximidad a ambos, la epidermis y los paquetes musculares. Los
cromatóforos, especialmente los melanóforos se localizan principalmente en la
dermis.
Los peces teleósteos tienen la capacidad de cambiar de coloración
corporal en respuesta a varios estímulos del ambiente. Los cambios de
coloración son llevados a cabo por los cromatóforos. Estos incluyen a los
melanóforos (pardo-marrón), eritróforos (rojo), xantóforos (amarillo), cianóforos
(azul), leucóforos e iridóforos (ambos reflectivos). Por ejemplo, los melanóforos
son un tipo de cromatóforo que contiene organelas con melanina llamadas
melanosomas y que produce el oscurecimiento de la piel.
Introducción
Página 19
La dispersión y agregación de pigmentos en los cromatóforos de los
peces está controlada por múltiples hormonas y por el sistema nervioso
autónomo (Fujii, 1993). En particular, MCH es la que produce la agregación de
la melanina, mientras que la dispersión está dada por la acción de αMSH
(Baker, 1991). Se ha observado que MCH, a bajas concentraciones, produce la
agregación de pigmentos en los melanóforos de casi todos los teleósteos,
produciendo en consecuencia, el empalidecimiento del tegumento (Kawauchi y
col. 1983, Oshima y col. 1985, Nagai y col. 1986, Baker y col. 1986), mientras
que αMSH, responsable del oscurecimiento, causa la dispersión del mismo
(Fujii y Oshima 1986). Sin embargo, estos no son los únicos factores
involucrados en la dispersión y agregación de la melanina: la norepinefrina
(NE), la adenosina trifosfato (ATP), PRL y SL han sido descriptos también
como potenciales reguladores de los cambios de coloración en teleósteos
(Baker 1991, Kitta y col. 1993, Zhu y Thomas 1997).
En peces cíclidos se observó que la selección de la pareja está
generalmente basada en la coloración del macho y que esto puede conllevar a
aislamiento reproductivo. Además, se cree que la rápida radiación de las
especies de cíclidos se debe a selección sexual actuando sobre la coloración
de los machos (Mann y col. 2004). Por otro lado, se observó que en A. burtoni
los animales machos cambian de patrón de coloración como estrategia
comportamental, evidenciando de esa manera, las diferentes jerarquías
sociales (Korzan y col. 2008). Recientemente, se observó en medaka, Oryzias
latipes, que la sobre-expresión de SL modifica el patrón de coloración y que la
coloración corporal afecta las preferencias de elección de pareja (Fukamachi y
col. 2009a)
C. dimerus presenta, como la mayoría de los cíclidos, un
comportamiento social muy complejo con distintas jerarquías sociales y éstas
se correlacionan con diferentes patrones de coloración. A su vez, la pareja
dominante presenta un despliegue comportamental y fundamentalmente un
patrón de coloración que es característico de periodos de peripuesta y que se
extiende hasta que las crias se independizan de sus progenitores. En trabajos
previos a esta Tesis Doctoral, se demostró por inmunohistoquímica (IHQ) que
Introducción
Página 20
animales adaptados a un entorno negro poseen un mayor número de células ir-
SL y una mayor área celular que aquellos adaptados a un entorno blanco.
Además, por la técnica de western blot, se demostró que las hipófisis de
animales adaptados a un entorno negro poseen mayor contenido de SL que
aquellas provenientes de animales adaptados a un entorno blanco. Esto
resultados indicarían que esta hormona tiene un papel en la regulación de la
coloración corporal junto con los péptidos, también evaluados en C. dimerus y
clásicamente involucrados en este proceso, αMSH y MCH (Cánepa y col.
2006).
Sobre la base de resultados obtenidos previamente en C. dimerus y las
evidencias presentadas en otras especies de peces teleósteos, se plantea la
siguiente hipótesis general:
“En Cichlasoma dimerus SL está involucrada en la adaptación
a variaciones experimentales de la coloración del entorno”
En el primer capítulo de esta Tesis Doctoral y como un primer paso para
comprender la función de SL se obtuvo la secuencia de ambos, la hormona SL
y el receptor putativo de SL (RGH1), se caracterizaron y se realizó un análisis
estructural para luego comparar esta secuencia con la de otras especies de
peces. Para ello se plantearon los siguientes objetivos:
1. Obtener la secuencia total de SL y del RGH1 de C. dimerus
2. Analizar las estructuras de ADNc de SL y el RGH1. Realizar un análisis
filogenético en relación con las secuencias publicadas de otras especies
de peces.
Introducción
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En la segunda parte de esta Tesis Doctoral, se estableció la relación entre la
expresión del ARNm de SL y del RGH1 con la coloración del entorno y se
analizó un posible efecto de SL sobre el tegumento. Se planteó la siguiente
hipótesis:
Hipótesis 1:
“La expresión de SL se modifica en relación con la coloración del
entorno. El receptor putativo de SL (RGH1) se expresa en el tegumento y
su expresión será dependiente de las condiciones de coloración del
entorno”.
Objetivos:
1. Determinar el efecto de la coloración del entorno sobre los niveles de
ARNm de SL en hipófisis.
2. Determinar si el ARNm del RGH1 se expresa en el tegumento de C.
dimerus y analizar las posibles variaciones en su expresión en relación
con la coloración del entorno.
Como se menciona en la introducción, el cambio de coloración en cíclidos, y en
particular en C. dimerus, es característico del periodo reproductivo. Si en la
hipótesis anterior se postula a SL como una hormona involucrada en la
regulación de la coloración, un interrogante que se plantea es el papel que
juegan los neuropéptidos cerebrales en el control de la síntesis y/o liberación
de esta hormona.
Se sabe que MCH es un neuropéptido involucrado en los cambios de
coloración en peces y GnRH el principal neuropéptido involucrado en los
procesos reproductivos. Por otro lado en C. dimerus y en otras especies
descriptas se observa que ambos neuropéptidos se encuentran inervando la
pars intermedia, en donde se encuentran las células productoras de SL. En
base a esto se postula la siguiente hipótesis de trabajo:
Introducción
Página 22
Hipótesis 2
“MCH y GnRH están morfológica y func ionalmente relacionados con las
células productoras de SL”
Objetivos:
1. Determinar si las fibras hipofisarias de MCH y GnRH están relacionadas
morfológicamente con las células productoras de SL.
2. Determinar si MCH y GnRH están relacionados funcionalmente con la
secreción de SL.
Materiales y Métodos – Capítulo I
Página 23
CAPITULO I
Caracterización de la hormona SL y del RGH1 de
Cichlasoma dimerus
Objetivos:
1. Obtener la secuencia total de SL y del RGH1 de C. dimerus
2. Analizar las estructuras de ADNc de SL y el RGH1. Realizar un análisis
filogenético en relación con las secuencias publicadas de otras especies
de peces.
Materiales y Métodos – Capítulo I
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MATERIALES Y MÉTODOS
Secuencia de Somatolactina de C. dimerus
Para obtener la secuencia parcial de SL de C. dimerus se anestesiaron 5
animales adultos con solución de benzocaina 0,1% y se sacrificaron por
decapitación. Se extrajo ARN total de hipofisis utilizando Trizol (Invitrogen)
según las instrucciones del fabricante con posterior tratamiento de ADNasa
libre de RNasas (RQ1 Promega). Luego, se realizó la transcripcion reversa
usando la enzima AMV (Promega) y oligo (dT)-20. Se diseñaron primers
degenerados a partir de especies relacionadas filogenéticamente (degSLf,
degSLr; tabla 1, Fig. 10). Se realizó una primer PCR en alícuotas de 20 µl
utilizando la termocicladora gradient Eppendorf Mastercycler y la enzima
GoTaq Flexi DNA polimerasa (Promega). Después de 2 min. de
desnaturalización inicial a 94°C, los ciclos de la PCR se repitieron por 40 veces
con una desnaturalización a 94°C por 30 s, un annealing a 45–55°C por 30 s y
una elongación a 72ºC por 1 min. El resultado de la reacción de PCR se
observó en un gel de agarosa 1%, mostrando una banda de aproximadamente
900 pb, se purificó y se secuenció (Unidad de Genómica-Instituto de
Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina). Se obtuvo finalmente un fragmento
de 879 pb. Los correspondientes extremos 5’ y 3’ se obtuvieron por la técnica
de “rapid amplification of cDNA ends (RACE)” y “RNA ligase-mediated (RLM-
RACE)” del kit Generacer (Invitrogen) a partir de una nueva extracción de ARN
total de 5 hipófisis de C. dimerus utilizando 1 ml de Trizol. Luego de la
homogenización se agregó 200 µl de cloroformo y se mezcló vigorosamente en
vortex. La mezcla se centrifugó y la fase acuosa se transfirió a un tubo libre de
RNasas, se precipitó el ARN y se resuspendió en 20 µl de agua. La primer
cadena de ADNc se sintetizó de acuerdo a las indicaciones del fabricante a
partir de 1,5 µg de ARNm. Se diseñaron primers específicos a partir de la
secuencia parcial obtenida para llevar a cabo la RACE de los extremos 5´ y 3´
según las instrucciones del fabricante. Se realizó PCR anidada utilizando los
primers específicos (cdSLf1, cdSLf2, cdSLr1, cdSLr2, tabla 1, Fig. 10), se
Materiales y Métodos – Capítulo I
Página 25
separaron los productos en geles de agarosa y se ligaron en el vector TOPO
TA (Invitrogen). Luego se transformaron E. coli One Shot® TOP10 Chemically
Competent y se seleccionaron los clones. Se purificaron los plásmidos
utilizando el kit QIAprep Spin Plasmid kit (Qiagen). Todos los plásmidos se
secuenciaron con primers forward y reverse universales usando el kit Big-Dye
Terminator y un secuenciador de ADN ABI Prism 377 (Perkin-Elmer, Wellesley,
MA, USA). Se seleccionaron múltiples clones para secuenciar. Los resultados
de secuenciación se compilaron en utilizando el software Sequencher, Gene
Codes corporation
Tabla 1. Secuencias de primers SL
Nombre Secuencia (5’å3’) notas
degSLf TGCTCTGGCCCYATYTRMTWAC Secuencia parcial
degSLr TAAAATAACAACTGAGCAGGG
cdSLf1 CCATGCCTTAGCGAATCAACCTTG Secuencia del transcripto
completo cdSLf2 GCCCGTTCCAGTATGATGTGC
cdSLr1 TGAGATGGAGGGGCAGCGAGT
cdSLr2 GGAGAGGGAGTGGGATGAACA
Primers degenerados para obtener la secuencia parcial de SL de C. dimerus y los primers
específicos para obtener el transcripto completo
Figura 10. Esquema que muestra la posición relativa de los primers utilizados y los
fragmentos obtenidos del transcrito de SL. GRK oligo: oligonucleótido acoplado
por el kit generacer.
Materiales y Métodos – Capítulo I
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Secuencia del receptor putativo de SL de C. dimerus.
Para obtener la secuencia del RGH1 se anestesiaron 5 animales adultos de C.
dimerus con solución de benzocaina 0,1%, se sacrificaron por decapitación y
se extrajo ARN total de hígado utilizando 1 ml de Trizol. Se utilizó hígado ya
que se observó que en otras especies este receptor se encuentra expresado en
cantidades relativas altas. Luego de la homogenización se agregó 200 µl de
cloroformo y se mezcló en vortex vigorosamente. La mezcla se centrifugó y la
fase acuosa se transfirió a un tubo libre de ARNasas, se precipitó el ARN y se
resuspendió en 40 µl de agua. La primer cadena de ADNc se sintetizó de
acuerdo a las indicaciones del fabricante a partir de 2 µg de ARN total. Se
realizó una primer PCR para obtener la secuencia parcial del receptor
utilizando primers degenerados cuando fue necesario y diseñados a partir de
secuencias depositadas en el genebank de otras especies del orden
perciformes incluyendo la de Oreochromis niloticus, con el objetivo de
amplificar 3 fragmentos superpuestos (degSLRf1, degSLRf2, degSLRf3,
degSLRr1, degSLRr2, degSLRr3, Tabla 2, Fig. 11). La primer PCR se
desarrolló en alícuotas de 20 µl utilizando la termocicladora gradient Eppendorf
Mastercycler. Después de 2 min de desnaturalización a 94ºC, los ciclos de la
PCR se repitieron por 40 veces con una desnaturalización a 94ºC por 30 s, un
annealing de 45–55ºC por 30 s y una elongación a 72ºC por 1 min. Los
productos parciales se separaron en geles de agarosa y se ligaron en el vector
TOPO TA (Invitrogen). Luego se transformaron E. coli One Shot® TOP10
Chemically Competent (Invitrogen) y se seleccionaron clones. Se purificaron los
plásmidos utilizando el kit QIAprep Spin Plasmid kit (Qiagen). Todos los
plásmidos se secuenciaron con primers forward y reverse universales usando
el kit Big-Dye Terminator y un secuenciador de ADN ABI Prism 377 (Perkin-
Elmer, Wellesley, MA, USA). Después de ello se diseñaron primers específicos
a partir de la secuencia parcial obtenida para obtener el transcripto completo
(cdSLRf1, cdSLRf2, cdSLRr1, cdSLRr2; Tabla 2, Fig. 11). Se llevó a cabo la
RACE de los extremos 5´y 3´según las instrucciones del fabricante. Se realizó
PCR anidada utilizando los primers específicos y se separaron en geles de
Materiales y Métodos – Capítulo I
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agarosa. Los productos fueron ligados dentro del vector TOPO TA (Invitrogen)
y secuenciados como se describió previamente. Se seleccionaron múltiples
clones para secuenciar. Los resultados de secuenciación se compilaron
utilizando el software Sequencher, Gene Codes corporation.
Tabla 2. Secuencia de primers para el receptor putativo de SL (RGH1)
Nombre Secuencia (5’ å3’) notas
degSLRf1 CTTCTCATCCTTTCCTSC Secuencia parcial
degSLRf2 AAACTGGACCCTGCTGAA
degSLRf3 CTCAGACACCCAGARRCT
degSLRr1 GTCCAATGCTTCCAGTT
degSLRr2 TGACCTGAGCGTAGAAGT
degSLRr3 ATTGTGAGAGGTTCCCCA
cdSLRf1 CAGTGGTTCAGGAGTTAGACAG Secuencia del transcripto
cdSLRf2 CACAGCACCCACTCAAGGCA completo
cdSLRr1 TACCCACAGTCCCAAACACAAGAACC
cdSLRr2 CACGCATCCATCCCAACCCAACAT
Primers, degenerados cuando fue necesario, para obtener la secuencia parcial del receptor
putativo de SL (RGH1) de C. dimerus y primers específicos para obtener el transcripto
completo
Figura 11. Esquema que muestra la posición relativa de los primers utilizados y los
fragmentos obtenidos del transcrito del RGH1. GRK oligo: oligonucleótido
acoplado por el kit generacer.
Transcripto de RGH1
Materiales y Métodos – Capítulo I
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Reconstruccion filogenética
Se obtuvieron las secuencias aminoacídicas deducidas de ambos, la hormona
SL y del RGH1 C. dimerus y se alinearon con secuencias previamente
publicadas en el GenBank de SL y de su receptor respectivamente utilizando
ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Los análisis filogenéticos y de
evolución molecular se llevaron a cabo utilizando el sofware MEGA version 4
(Tamura y col. 2007). Para el análisis filogenético y de evolución molecular de
la hormona Somatolactina se ingresaron manualmente las secuencias de SL y
SLP de Oncorhyncus mykiss ya que éstas no se encuentran depositadas en el
genebank. Se utilizó el método de reconstrucción filogenética “neighbour
joining” y se evaluó estadísticamente utilizando el test de bootstrap (1000
repeticiones)
Predicción de la estructura protéica
Para predecir la estructura protéica tanto de SL como del RGH1 de C. dimerus,
se utilizó el software SOSUIsignal (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/ sosui/) y el
NetNGlyc 1.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) para predecir
los peptidos señal N-terminales, las regiones transmembranas y los potenciales
sitio de N-glicosilaciones.
Para estimar los pesos moleculares de las proteínas se utilizó la herramienta
“Compute pI/Mw program” del servidor ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/
pi_tool.html)
Para localizar las secuencias consenso de interacción de proteínas presentes
en el RGH1 se llevó a cabo un alineamiento utilizando la herramienta clustalw
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) de la secuencia deducida obtenida y las
previamente publicadas
Resultados – Capítulo I
Página 29
RESULTADOS
Secuencia de Somatolactina de C. dimerus
Para obtener la secuencia del transcripto completo de SL, se amplificó por PCR
un fragmento parcial de SL de 879 pb. utilizando primers degenerados
diseñados a partir de especies filogenéticamente relacionadas (peces del orden
Perciformes). Posteriormente, se obtuvo la secuencia total de SL de C. dimerus
utilizando primers específicos para realizar la amplificación de los extremos 5’ y
3’ del ARNm. El ARNm de SL de C. dimerus consistió de 1549 pares de bases
(número de acceso de Genbank EF192603) excluyendo la cola de polyA.
Específicamente, la secuencia completa de ARNm de SL contiene 31 pb en la
región 5’ no traducible, 69 pb que codifican para un péptido señal, 621 pb que
codifican para la hormona madura y 828 pb en la región 3’ no traducible (Fig.
12). Además, se localizó una secuencia típica de poliadenilación (AATAAA) 14
nucleótidos en dirección 5’ de la cola de poly(A). A su vez, el marco de lectura
abierto codifica para una prehormona de 230 aminoácidos (aa) conteniendo un
péptido señal de 23 aa. y una hormona madura de 207 aa con un peso
molecular estimado de 23,81 kDa. Posee siete residuos Cisteína en las
posiciones 5, 15, 42, 65, 181, 198 y 206, y un potencial sitio de glicosilación en
las posición 121 (Asp-Lys-Thr, N-K-T).
La secuencia de aminoácidos deducida de C. dimerus fue comparable con la
de otras especies de peces mostrando una alta homología (Tabla 3). A su vez,
muestra al menos un 80 % de identidad aminoacídica con las SL de un
representante de la serie Atherinomorpha (medaka, Oryzias latipes) y las de
especies de la serie Percomorpha (las series se indican en la figura 5).
Además, mostró alrededor de un 70% de identidad con las SLs del clado α del
grupo de especies que poseen ambas variantes (α y β) tales como Salmo salar,
Ctenopharyngodon idella, Carassius auratus, Danio rerio y alrededor de un
50% de identidad con las secuencias de la variante β descriptas en las
nombradas especies (Tabla 3).
El análisis filogenético de SL de C. dimerus (cdSL) la agrupó con la mayoría de
Resultados – Capítulo I
Página 30
las secuencias publicadas de SL en lo que era esperable en cuanto a la
filogenia de peces. Es decir que la cdSL se ubica en lo que se ha denominado
el clado de SLα. A su vez, se observó otro clado distante a la cdSL, que
contiene las variantes de SLβ que incluye las SL de goldfish (Carassius
auratus), la anguila (Anguilla anguilla) y la rtSLP (del inglés: Somatolactin like
protein, en Oncorhynchus keta). Ambos clados, poseen fuerte sustento
estadístico por el test de bootstrap. (Fig. 13).
Resu
ltados – C
apítulo I
Página 31
Secuencia de la hormona SL de C. dimerus GAAAAGGAAAAACTTGAAGAAGACAGATAGAATGAGCATGACTGGCATCCAGCGAGGTGTGTGGGGTCTACTGCTCTGGCCTTATATTCTTACTGTAAGCATGCCACTAGACTGTAAAGA 120 M S M T G I Q R G V W G L L L W P Y I L T V S M P L D C K E AGAGCCGGGCAGCTTTACTCGCTGCCCCTCCATCTCACAAGAGAAACTTCTCGACAGAGTCATCCATCATGCTGAGCTCATCTACCGTGTCTCAGAAGAAGCGTGTTCCTTATTTGAGGA 240 E P G S F T R C P S I S Q E K L L D R V I H H A E L I Y R V S E E A C S L F E E GATGTTCATCCCACTCCCTCTCCGACTTCAGAGTAACCAGGCTGGCTATGCGTGTATCACCAATGCATTACCGATCCCCAGCTCCAAAAGTGAAATTCAACAGATATCCGATAGATGGTT 360 M F I P L P L R L Q S N Q A G Y A C I T N A L P I P S S K S E I Q Q I S D R W L GCTCCACTCTGTGCTGATGCTGGTTCAGTCATGGATTGAGCCCTTGGTCTACCTGCAAACAACACTGGATCGCTACGATCATGCTCCTGAAATGCTGCTCAACAAGACAAAATGGGTTTC 480 L H S V L M L V Q S W I E P L V Y L Q T T L D R Y D H A P E M L L N K T K W V S TGAGAAGCTGGTCAGTCTGGAGCAAGGGGTGGTTGCCCTCATTAAAAAGATGCTGGATGAAGGGACGTTTACCACAACCTACAGTGAACAAGGCCCGTTCCAGTATGATGTGCTGCCAGA 600 E K L V S L E Q G V V A L I K K M L D E G T F T T T Y S E Q G P F Q Y D V L P D TATGCTGGAATCTGTTATGAGAGACTATACCTTGCTCAGCTGCTTCAAAAAGGATGCTCATAAGATGGAGACTTTCCTCAAGCTTCTTAAGTGTCGTCAGGCTGACAACTACAACTGTGC 720 M L E S V M R D Y T L L S C F K K D A H K M E T F L K L L K C R Q A D N Y N C A ATAAAATATAAACTGCAGCTAATAAATAATACAGTGCTTAGCTTTAAATGAATTCCTAAAGTTGGTAGTGTGCACTTAAAGATATGACCATGCCTTAGCGAATCAACCTTGCTTGTAATG 840 * CAGTGCATTCCTTATTGATTGTTTTGGAACACCTTCACACAAAACTAAGTAGATGTAATGCTTTGCCCTTTCTTCAACATACTGCATTTTATATTTTTTTTTCCCTGCTTAGTTGCTATT 960 TTAACCTTGCAAAGGAAGCAGAGAGCGAACTCTCAAAAGATTATTTGTGTGTTGAGTTGTCAAAAAAAATCTGCATATGGTGCCATTGATTTCCATTTCCTTTGTTCCTGACTGGTGTTT 1080 CTATTCCTTGCTGGGTCTTGCAGTGTTGTGATTATTCTCACAGCCCCTAGAGTACTGAGCGAGACGCTCATTTTTAATGGAGCTGGTTTCACCTCTGCATTAGTGAAATGAAACACTTTC 1200 ACCAAAGATCGCAGACACACAGAGCGCAATCACTATTAAAAATTCGATATATTTTGATTGGTGAAAGAGAGTGTGGATGAGACAGAGACAAAATAAATATCAGTCAAATTGAGAGCCTAA 1320 ATGTGTATAATTTATCATGAATATAACATATATAAAGAATGTGCCTTATTTACTTAAATTGTTCAGGGAATAAACAAGTTAAATGTATATTGTTAGATGTTATAAATACATGATGCAGAG 1440 CATAAAAAATACCTTTATCTTGTCAACAAAAGAACCTTATGGTGTACTCTCGATGCATTTCCATGCAACTGCTGTTCATTTAAGAGGCTAATAAAGCAAGACACAAAGCAAAAAAAAAAA 1560 AAAAAAAAAA
Figura 12. Secuencia nucleotídica de SL de C. dimerus y secuencia protéica deducida. En la secuencia se indica un peptido
señal de 23aa (subrayado), siete residuos cisteína (indicado en rojo) y un probable sitio de glicosilación (indicado en amarillo)
dado por la secuencia NKT. En la región 3’ no traducible se puede observar una secuencia característica de poliadenilación
(indicado en verde). * representa el codón stop.
Resultados – Capítulo I
Página 32
Tabla 3. Análisis de identidad aa. de SL de C. dimerus vs. las SL publicadas en
otras especies de peces.
Número de acceso en
Genbank Especies de peces Orden
Nº aa Identicos
% Nº de
cambios positivos
%
BAG50585 Oreochromis mossambicus SL Perc 193 93 201 97
BAE45637 Thunnus thynnus SL Perc 181 87 189 91
NP_001098260 Oryzias latipes SL Belon 179 86 190 91
AAP93859 Perca flavescens SL Perc 179 86 190 91
AAA49444 Paralichthys olivaceus SL Pleu 179 86 190 91
CAC16116 Dicentrarchus labrax SL Perc 178 85 189 91
AAC38003 Hippoglossus hippoglossus SL Pleu 177 85 190 92
BAE43855 Pagrus major SL Perc 174 84 185 89
AAN18040 Epinephelus coioides SL Perc 175 84 188 90
AAD17534 Sciaenops ocellatus SL Perc 172 83 183 88
BAA83467 Siganus guttatus SL Perc 171 82 184 88
AAU43768 Acanthopagrus schlegelii SL Perc 170 82 185 89
AAB34574 Sparus aurata SL Perc 171 82 183 88
AAA61873 Solea senegalensis SL Pleu 169 82 185 90
AAC38004 Cyclopterus lumpus SL Scorp 166 80 181 87
BAA01485 Oncorhynchus keta SL Salm 157 76 177 85
ABY76177 Salmo salar alfa SL Salm 156 75 179 86
BAA01486 Gadus morhua SL Gad 146 70 173 83
ABN46996 Ctenopharyngodon idella alfa SL Cyp 147 70 170 81
ACB69758 Carassius auratus alfa SL Cyp 144 69 166 80
BAA32608 Acipenser transmontanus SL Acip 140 68 166 80
AAR25695 Tetraodon nigroviridis SL Tet 142 68 166 80
AAR25212 Danio rerio alfa SL Cyp 143 68 169 80
BAA33422 Protopterus annectens SL Lep 128 62 157 76
ABY76178 Salmo salar beta SL Salm 122 60 153 76
AAB53035 Anguilla anguilla SL Ang 122 59 158 77
AAF78945 Ictalurus punctatus SL Sil 117 57 150 73
AAP50851 Danio rerio beta SL Cyp 106 51 139 67
ABN46997 Ctenopharyngodon idella beta SL Cyp 105 50 138 66
AAC60098 Carassius auratus beta SL Cyp 96 46 136 66
Ordenes: Perc: perciformes, Belon: beloniforms, Tet: tetraodontiforme, salm: salmoniforme,
ang: anguiliformes, Sil: siluriformes, Cyp: cipriniformes, Gad: gafiformes, Pleu:
pleuronectiformes, Scorp: Scorpaeniformes, Acip: Acipenseriformes, Lep: Lepidosireniformes
Resultados – Capítulo I
Página 33
Figura 13. Análisis filogenético de las secuencias de SL. Filograma de las
secuencias aminoacícidas de SL de peces el cual muestra los cambios genéticos
por el método de neighbour joining. La SL de Protopterus annectens es el grupo
externo y los valores de bootstrap se muestran sobre las ramas como %.
Resultados – Capítulo I
Página 34
Secuencia del receptor putativo de SL de C. dimerus
La secuencia del RGH1 de C. dimerus consistió de 2679 pb., incluyendo 70 pb.
en la región 5’ no traducible y 557 pb. en la región 3’ no traducible (número de
acceso de Genbank: FJ208943). El marco abierto de lectura de 1893
nucleótidos tradujo para 630 aa., incluyendo un péptido señal de 26 aa., un
dominio extracelular de 231 aa., uno transmembrana de 22 y un dominio
intracelular de 351 aa. El peso molecular estimado para el receptor maduro fue
de 67,75 kDa. Además el receptor clonado comparte características y dominios
presentes en el receptor para GH: el típico motivo FGEGS en el dominio
extracelular y los dominios Box 1 (PPVPAPKIKGI) y Box 2 (EPWVELIEVDVE)
levemente diferentes en el dominio intracelular. Presenta los 5 residuos
característicos de cisteína en el dominio extracelular presentes en la mayoría
de los receptores GH y PRL de teleósteos, sin embargo posee dos residuos
adicionales haciendo un total de 7 cisteínas. Tiene 5 sitios potenciales de N-
glicosilación en el dominio extracelular y 9 residuos intracelulares de tirosina
(Fig. 14).
La secuencia aminoacídica del RGH1 posee una alta similitud, como era
esperable, a las descriptas para otras especies de Cíclidos del género
Oreochromis (85%) y con especies del grupo de las Series Percomorpha y
Atherinomorpha (ver figura 5) (>60%). Por otro lado, el análisis filogenético
muestra que el RGH1 de C. dimerus se agrupa dentro de un clado bien definido
conformado por las secuencias de peces del grupo de los Acanthopterygii (ver
fig. 5) quedando por fuera de éste las secuencias de salmónidos, la anguila y
de zebrafish entre otros peces (Tabla 4, Fig. 15). Se comparó la secuencia del
RGH1 de C. dimerus con la secuencia del receptor tipo 2 de GH de
Oreochromis niloticus y éste quedó por fuera del clado del receptor del RGH1.
A su vez, la única copia de receptor de GH que poseen el esturión (Huso
dauricus) y el pez pulmonado (Protopterus dolloi) mostraron una identidad
similar al receptor de GH de Oreochromis niloticus
Resu
ltados – C
apítulo I
Página 35
Secuencia del receptor putativo de SL de C. dimerus GAAAAGCAAATAAGGCAAAAACCTCGCCAGGAAAGCACGCACCCGATTCTGAGATTGAGTGATATGTAAAAAATCGTCCCGGGGAGATCTGACYCGGGCCGAACAGTCTGCAGTGAGGAA ACAGGACTTGTACCCGTTAGAGCTTGCGCTTGCCATCAGATGAGCAACTTCTGAAAAGTAAATCTGCGCTGTGCTTGCAGTTTTCAGCTCAACACTTCGGAAGAACATCATGGCTCTCTC M A L S 5 GCCCTCCGCTAATCTCCTGATTCTTCTCATTCTTTCCTCCCTGGATTGGCTGCCCTCTCCAGGATCGACATTTCTCACCGACTGGGACCACATGACATCACCCGCTCCCATTGAGCCTCA P S A N L L I L L I L S S L D W L P S P G S T F L T D W D H M T S P A P I E P H 45 TTTTTCTGAGTGCATATCAAGGGACCAGGCGACGTTCCGCTGTTGGTGGAGTCCGGGCAGCTTCCAAAACCTGTCCTCCCCTGGAGCGCTCAGAGtCTtCTACCTGAAGAAAGACTCTCA F S E C I S R D Q A T F R C W W S P G S F Q N L S S P G A L R V F Y L K K D S H 85 TGCCAGCCAATGGAAGGAGTGTCCTGtGTATATCCATTCAAGCAGGGAATGTTTCTTTGATGAAAACCACACATCTATTTGGATCACTTACTGCATGCAGCTTCGCACTCAAAACAACGT A S Q W K E C P V Y I H S S R E C F F D E N H T S I W I T Y C M Q L R T Q N N V 125 CACCTATTTCAATGAAGATGACTGTTTCACTGTGGAGAATATTGTACGTCCTGACCCACCAGTGTCTCTAAACTGGACCCTGCTGAATATAAGTCCTTCTGGGCTAAATTATGATGTCAA T Y F N E D D C F T V E N I V R P D P P V S L N W T L L N I S P S G L N Y D V K 165 AGTTAACTGGGAGCCCCCGCCCACTGCTGATGTTGGGTTGGGATGGATGCGTGTTGAGTATGAGCTGCAGTACAGAGGGAGAAATACCACAAACTGGGAAGCAATGGAGATTCAGCGAAA V N W E P P P T A D V G L G W M R V E Y E L Q Y R G R N T T N W E A M E I Q R N 205 CACTCATCAGACAATCTACGGTCTGCACTTGGGAAAAGAATATGAAGTACACATCCGCTGCAGGATGCAGGCCTTCATTAAGTTTGGGGAGTTCAGCGACTCCATCTTCATTCAAGTGAC T H Q T I Y G L H L G K E Y E V H I R C R M Q A F I K F G E F S D S I F I Q V T 245 TGAGATTCCTAGCGCAGAGTCTGCTGTCCATCTCACAGTGGTTCTTGTGTTTGGGACTGTGGGTATCCTCATACTCTTCATGCTCATAGTCATCTCTCAGCAGAACCGATTAATGATATT E I P S A E S A V H L T V V L V F G T V G I L I L F M L I V I S Q Q N R L M I F 285 TCTGCTGCCGCCTGTTCCTGCACCCAAAATCAAAGGCATCGATTCAGAGCTATTAAAGAAGGGGAAACTGGATGAGCTGAATTTTATGCTGAGTGGTGGAGGAATCGACTGCCTACCCAC L L P P V P A P K I K G I D S E L L K K G K L D E L N F M L S G G G I D C L P T 325 TTACGCACCAGATTTCTACCAAGATGAGCCATGGGTGGAGCTAATCGAGGTGGATGTGGAGGATGAAGATAGTGGAGGGAAGGAGGATAACCGAGGCTCAGACACCCAGAAGCTCCTGGG Y A P D F Y Q D E P W V E L I E V D V E D E D S G G K E D N R G S D T Q K L L G 365 TCAGCCCCAGCACATCAACATAGGCTGCTCCAATGCAGTCAGTGGCCCTGATGCTGACTCAGGGCGGGCCGGCTGTTACGACACAGATCTGCCTGAACAAGAAACCCTAATGCTGATGGC Q P Q H I N I G C S N A V S G P D A D S G R A G C Y D T D L P E Q E T L M L M A 405 CACCCTTCTGCCAGGACAACCTGATGACAAAGAAGCCTCCCTTGATGTTGTAGAAAGATCCTCAGCCTCTGAGACAGGTGATAGGCCTCTCATCCAAACCCAAACTAGAGGGCCCCAGAC T L L P G Q P D D K E A S L D V V E R S S A S E T G D R P L I Q T Q T R G P Q T 445 CTGGGTCAACACAGACTTCTATGCTCAGGTCAGCAATGTTATGCCCTCTGGTGGTGTGGTGTTGTCTCCTGGACAGCAACTCAGAATCCAGGAGAGCATCTCAGCCACCGAGGAGGAAAC W V N T D F Y A Q V S N V M P S G G V V L S P G Q Q L R I Q E S I S A T E E E T 485 AAAAAAGAAGCGAAAGGGAAATGGAGACAGTGAGGAGTCTGAGGAGCGGAAGCAAAAAGAGCTGCAGTTTCGGCTGATAGTAGTGGATCCAGAGGGGAATGGCTACACTACAGAGAGCAA K K K R K G N G D S E E S E E R K Q K E L Q F R L I V V D P E G N G Y T T E S N 525 TGTCCAGCAGATCAGCACTCCTCCCCCCAGCTCTCTCATGCCTGGTGAGGGGTACCATATTATTCACCCTCAGCCAGTGGAGCCTAGACCTACAGTTACAACAGAGGTTAATCTGTCACC V Q Q I S T P P P S S L M P G E G Y H I I H P Q P V E P R P T V T T E V N L S P 565 TTACATTCTTCCTGACTCTTCCCAGTCTTTTGCTCCTGTTGCAGACTACACAGTGGTTCAGGAGTTAGACAGTCATCACAGTCTGCTCCTTAACCCATCTACCCACCACACACCCCCTCC Y I L P D S S Q S F A P V A D Y T V V Q E L D S H H S L L L N P S T H H T P P P 605 CTGCCTGCCACAGCACCCATTCAAGGCACCTATGCCTGTGGGGTACATTACCCCAGACTTGCTGGGGAACCTCTCACAATGAAATGACAATGGCATCAGATATAAGGCTGATTTACCAGG C L P Q H P F K A P M P V G Y I T P D L L G N L S Q * AAGTTCCCCACAGTCGTCCTACCTGATTCTTGCTGGAAACCAAGTAACCGGGTGGATGAGATGTGTACGGGTGTCTGTTTTCAGAGGATGCTGAAAGGCAGATATAAAAAGCTGCGAGCT ATTCTCTTAACTTCTTTGCATCTGCTCGAACAGTTTTTTTTTGAGCCAGGCAAATAACATCACGTACCAAATCCACAGTTTGCTCTTGTCAATATATTCATGCATCCTTGCATGATTGTA ATGAGTCAAACAAGCATAATGTCAGCGCTTAACTGCCTTGTGTCACATTGCAGCTCTGGCTTATTGTGTTCAGAGCAATGACACCATTACAGTCTTAATTTTACAGAGCACTGTCAGCGT ATGATTGATGGTGTATGATTTCATCAAACATCAAACAGAAGCCRCTGATGTTTACACCACCGAGGTACTTTGTCAGTTTTATTTTCTTATAGGAGATCGTTCTTATCCTTCTTATCYCAT CATGTCATGTTAGTACTTCACTAGAGATATATTTTTTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Figura 14. Secuencia nucleotídica del RGH1 y secuencia protéica codificada. Se indican: posibles sitios de glicosilacion (amarillo), péptido señal de 23 aa (subrayado), residuos cisteína (rojo), la secuencia FGEFS, secuencia transmembrana (celeste), las secuencias consenso Box 1 y Box 2 (celeste y subrayado), 9 residuos tirosina (verde) en la región intracelular. En la región 3’ se pueden observar secuencias características de poliadenilación (nucleótidos en rojo). * representa el codón stop
Resultados – Capítulo I
Página 36
Tabla 4. Análisis de identidad de aa. del RGH1 de C. dimerus vs los RGHs
publicados de especies de peces
Número de acceso a Genbank Especies Nº de aa idénticos % Nº de cambios de aa positivos % BADぱぬははぱ Oreochromis mossambicus RSL のねば ぱは のぱぬ ひな ABNなぬねにど Oreochromis urolepis RSL のねの ぱの のぱに ひな AAYぱはばはひ Oreochromis niloticus RSL のねね ぱの のぱな ひな BACばはぬひぱ Paralichthys olivaceus RSL ねのど ぱな のどば ぱな AAMどどねぬな Sparus aurata RSL ねのひ ばね のなど ぱぬ AANばばにぱは Acanthopagrus schlegelii RSL ねのぬ ばね のどは ぱぬ AAKばにひのに Scophthalmus maximus RSL ねねひ ばぬ のどね ぱな ABSにひぬにの Paralichthys adspersus RSL ねはど ばに のなぱ ぱな AAZなねばぱの Hippoglossus hippoglossus RSL ねねひ ばに のなど ぱな AAYのばのには Oryzias latipes RSL ねなぱ はば ねぱの ばぱ ACMねぬにぱぱ Cynoglossus semilaevis RSL ねどな はの ねぱの ばぱ ABYばはなばひ Salmo salar RSL ぬのど のね ねぬば はぱ BADのなひひぱ Oncorhynchus masou RSL ぬねな のぬ ねぬど はは AAKはどねひの Carassius auratus RSL ぬどど ねば ぬひひ はぬ AAUひぬぱひば Cirrhinus mrigala RSL にひの ねば ぬひね はぬ AAPぬばどぬぬ Ctenopharyngodon idella RSL にひぬ ねば ぬひど はぬ AAUひぬぱひは Catla catla RSL にひぬ ねば ぬぱの はぬ ABVばなひひは Morulius calbasu RSL にぱひ ねば ぬぱね はに AAUひぬぱひの Labeo rohita RSL にぱひ ねば ぬぱぬ はに BADにどばどは Anguilla japonica RSL にひな ねば ぬぱは はに CAIひひなのは Danio rerio RSL にねね ねば ぬにば はぬ AATひにののの Cyprinus carpio RSL にひぬ ねは ぬひは はに AAPひばどなな Silurus meridionalis RSL にはど ねぬ ぬのは のひ ABOばどぬねの Huso dauricus RGH にのは ねど ぬはば のぱ ABKねなぬはは Oreochromis niloticus RGH になぱ ぬは ぬぬね のは ABOばどぬねね Protopterus dolloi RGH にぬど ぬの ぬねは のね
Nota: RSL= receptor putativo de SL, nomenclatura tomada de Fukamachi y col. 2007
Resultados – Capítulo I
Página 37
Figura 15. Análisis filogenético de las secuencia RGH1 de C. dimerus. Filograma
de las secuencias aminoacícidas de peces mostrando los cambios genéticos por el
método de neighbour joining. El RGH de Protopterus dolloi es el grupo externo y
los valores de bootstrap se muestran sobre las ramas como %. Nótese que la
ubicación en el filograma del RGH2 de O. niloticus está de acuerdo con lo
propuesto por Fukamachi y Meyer (2007). RSL= receptor putativo de SL (RGH1),
nomenclatura tomada de Fukamachi y col. 2007
Discusión – Capítulo I
Página 38
DISCUSIÓN
Secuencia de Somatolactina de C. dimerus
En los primeros años de los 90’s se identificó en la hipófisis del lenguado,
Paralichthys olivaceus, (Ono y col. 1990) y en el bacalao, Gadus morhua,
(Rand-Weaver y col. 1991) la hormona Somatolactina. Desde entonces se la ha
identificado en numerosas especies de peces teleósteos y también en el pez
pulmonado (Protopterus annectens) y en el esturión (Acipenser
transmontanus). Dichos hallazgos sugieren que ha existido en el ancestro de
los tetrápodos pero que se ha perdido en ese linaje (Kawauchi y Sower 2006).
Dos formas distintas, codificadas por genes parálogos y probablemente
producidas en diferentes células de la pars intermedia, han sido aisladas: la
variante α, la cual está presente en todos los peces estudiados y SLβ, solo
presente en un número limitado de especies incluyendo zebrafish, goldfish, la
anguila europea, la segunda variante encontrada en la trucha arco iris (SLP:
somatolactin like protein) y la de catfish, Ictalurus punctatus (Zhu y col. 2004).
Posteriomente, se encontró la variante β en otras especies como Salmo salar y
Ctenopharyngodon idella, especies que también poseen la variante α (Benedet
y col 2008). Kawauchi y Sower (2006) sugieren que la duplicación génica
habría ocurrido durante la diversificaión de los teleósteos ya que las SL de
Protopterus annectens y Acipenser transmontanus tienen mayor identidad con
el grupo de las SLα. Basándose en la identidad de secuencia de la SL de C.
dimerus presentada en esta Tesis, ésta parece pertenecer al clado de las α. C.
dimerus es una especie del grupo de los Acanthopterygii (ver fig. 5), y en este
grupo de especies no se ha detectado una segunda variante como se ha
demostrado con el análisis del genoma de Fugu rubripes, Tetraodon nigroviridis
y Oryzias latipes (Zhu y col 2004, Fukamachi y col 2004). Por esta razón, es
poco probable que se exprese dicha variante en esta especie. Sin embargo, se
requiere de mayor cantidad de estudios para afirmar que un grupo en particular
de peces posea una sola copia de los genes parálogos o ambas (α y β).
Discusión – Capítulo I
Página 39
Como era de esperar, la SL de C. dimerus mostró una alta similitud de
secuencia de aa. (>90%) con la SL de otro cíclido, Oreochromis mossambicus.
La SL de C. dimerus mostró ambos, el sitio característico de N-glicosilación que
es encontrado en todas las descriptas pero que no se está presente en la
variante β y, los 7 residuos cisteína presentes en el grupo de la variante α.
Como se ha encontrado en la mayoría de las SLs, la SL de C. dimerus muestra
dos residuos cisteína próximos al extremo N-terminal y 4 próximos al C-
terminal los cuales formarían puentes disulfuro intracatenarios, que son
homólogos a aquellos encontrados en PRL y GH, mientras que el tercer
residuo cisteína no estaría involucrada en la formación de puentes disulfuro
dentro del péptido (Rand-Weaver y col. 1991). Se ha postulado que la tercer
cisteína podría estar involucrada en algún tipo de regulación de la función de
esta hormona a través de una rápida dimerización de la hormona (Zhu y col.
2004). Se observó una alta identidad entre la SL de C. dimerus y la de medaka
por encima de otras especies de peces del orden Perciformes. Esta
agrupamiento filogenético tal vez sea debido a una presión selectiva
relacionada con los similares hábitats naturales de ambas especies y la posible
función de SL sobre la pigmentación (Canepa y col 2006, Fukamachi y col
2004). Sin embargo, en tilapia, la especie que mostró mayor identidad de
secuencia (93%) y que está altamente emparentada filogenéticamente con C.
dimerus, no se han realizado estudios acerca de la regulación de la dinámica
pigmentaria que incluyan a SL. El porcentaje de identidad de la SL de C.
dimerus con la SL del pez pulmonado (62%) y la baja identidad de la variante β
de Goldfish (46%) indican que el clado α tiene una función muy importante para
los peces manteniéndose altamente conservada mientras que una segunda
variante no tendría tal presión de selección y de allí su baja identidad incluso
dentro de una misma especie. Los resultados obtenidos de la secuencia de SL
de C. dimerus abren un campo para estudiar ambos, la regulación de su
expresión como así también el primer paso para obtener la SL recombinante de
C. dimerus y llevar a cabo experimentos in vivo e in vitro con el fin de
esclarecer su función.
Discusión – Capítulo I
Página 40
Secuencia del receptor putativo de SL de C. dimerus
Los resultados obtenidos por Fukada y col (2005), Pierce y col (2007) en tilapia
y la posterior revisión realizada por Fukamachi y Meyer (2007), indican que los
receptores de GH tipo 1 de diferentes especies, a excepcion de los salmónidos,
podrían ser en realidad el receptor primario de SL. En la presente Tesis se
encontró que la secuencia total del receptor GH1 de C. dimerus clonado es
similar (86% de identidad) al ya caracterizado para tres especies de tilapias,
Oreochromis sp. Posee básicamente la misma estructura y dominios del
receptor de GH pero comparte solo un 36% de identidad aminoacídica con el
RGH2 de Oreochromis niloticus y un 35% de identidad con el receptor de GH
de Protopterus dolloi el cual posee una sola copia del mismo (Fukamachi y
Meyer 2007).
El RGH1 de C. dimerus presenta 7 residuos cisteínas en el dominio extracelular
los cuales pueden formar tres puentes disulfuro. El dominio intracelular es algo
más largo y tiene 9 residuos tirosina capaces de ser fosforilados. Estos
residuos tirosinas estarían involucrados en la señalización intracelular junto con
los dominios Box1 y Box 2 los cuales son, generalmente, diferentes entre los
dos tipos de receptores de GH (tipo 1 y 2). Particularmente, es bien sabido que
las proteínas JAK se unen a los de receptores de la familia de citoquinas a
través de las secuencias consenso Box 1 y Box 2. Estas proteínas JAK son
capaces de fosforilar diferentes proteínas involucradas en diferentes vías de
señalización. Entre estas vías se encuentran las proteínas STAT, que regulan
la transcripción de genes dependientes de GH; la proteína IRS (sustrato del
receptor de insulina) que involucra la fosfatidiliositol 3´ kinasa (PI3K) que puede
regular el metabolismo celular y la vía de las MAPK (Mitogen-activated protein
kinases) las cuales regulan una variedad de procesos celulares (Carter-Su y col
2000). Las diferencias entre los receptores de GH (tipo 1 y 2) podrían ser muy
grandes en términos de reconocimiento intracelular específico y de
señalización intracelular por lo que deberían llevarse a cabo ensayos de unión
al ligando y transducción de señales para establecer las vías involucradas en
estos receptores.
Discusión – Capítulo I
Página 41
El análisis filogenético del receptor putativo de SL de C. dimerus revela que
éste forma un clado con los receptores putativos de SL previamente agrupados
por Fukamachi y Meyer (2007). Es de destacar que tanto en el esturión como
en el pez pulmonado se ha encontrado un solo tipo de receptor de GH siendo
probablemente la condición ancestral. En estos dos últimos grupos
probablemente el RGH sea el receptor para ambos, SL y GH mientras que
peces teleósteos el RGH1 sea el de SL y el RGH2 el de GH. Al igual que lo
observado para la hormona SL, se observó un clado que contiene las especies
de las series Percomorpha y Atherinomorpha dentro del clado RGH1
(nombrado RSL en la fig. 15) reflejando nuevamente la filogenia de las
especies. Estas relaciones filogenéticas son de gran utilidad para comparar la
distribución como así también las funciones vinculadas con este receptor. Si
bien año a año se reportan nuevas evidencias acerca de la función de SL, la
amplia distribución del receptor putativo de SL y las numerosas funciones que
le han atribuido a SL deberían ser revisadas ya que un aumento en la
expresión del gen de la hormona no necesariamente conllevaría a una
respuesta en el órgano blanco, ya sea por ausencia del receptor o por que la
cantidad de hormona circulante pueda no ser suficiente para evocar una
respuesta. Por lo tanto, es necesario realizar estudios in vitro e in vivo
evaluando ambos, la hormona, como así también, su receptor.
Materiales y Métodos – Capítulo II
Página 42
CAPITULO II
Hipótesis
“La expresión de SL se modifica en relación con la coloración del
entorno. El receptor putativo de SL (RGH1) se expresa en el tegumento y
su expresión será dependiente de las condiciones de coloración del
entorno”.
Objetivos:
1. Determinar el efecto de la coloración del entorno sobre los niveles de
ARNm de SL en hipófisis.
2. Determinar si el ARNm del RGH1 se expresa en el tegumento de C.
dimerus y analizar las posibles variaciones en su expresión en relación
con la coloración del entorno.
Materiales y Métodos – Capítulo II
Página 43
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Se utilizaron 20 C. dimerus adultos (machos LT: 12,63 ± 0,45, peso 49,69 ±
5,15; hembras: 12,45 ± 0,37 peso: 44,69 ± 4,29) capturados en Esteros del
Riachuelo, Corrientes, Argentina (27°12 ’50’’S, 58°11’50’’W). Todos los
experimentos se realizaron en acuarios de 20 litros, bien aireados y con
filtración externa a 27°±1 y un fotoperiodo de 12hs luz -12hs osc. Los peces
fueron alimentados con alimento comercial.
Efecto de la coloración del entorno s obre la expresión hipofisaria de SL
en C. dimerus.
Se transfirieron animales machos (6) y hembras (6) indivicualmente y
separadamente a acuarios experimentales con las siguientes características:
acuario de entorno negro (EN) fue cubierto completamente con una bolsa de
polietileno negro, excepto la cara superior, acuario de entorno blanco (EB) fue
completamente cubierto con una bolsa de polietileno de color blanco, excepto
la cara superior (Fig. 16). Por lo tanto, 3 ejemplares hembras y 3 machos se
mantuvieron en EN y un número igual de ejemplares se mantuvieron en EB, en
ambos casos durante 10 días.
Figura 16: Esquema que muestra las características de los acuarios
experimentales. EN: acuario de entorno negro, EB: acuario de entorno blanco.
Materiales y Métodos – Capítulo II
Página 44
Al cabo de ese tiempo, los peces fueron anestesiados con solución de
benzocaína 0,1%, se les extrajo sangre por punción caudal con jeringa
heparinizada con el objetivo de cuantificar los niveles de cortisol, y luego se
sacrificaron por decapitación. El cerebro de cada animal fue expuesto y se
extrajo ARN total de cada hipofisis usando Trizol (Invitrogen) con posterior
tratamiento ADNasa libre de ARNasa (RQ1 Promega). Se realizó la
transcripcion reversa (0,5 µg de ARN) usando la enzima AMV (Promega) y
oligo (dT)-20. Utilizando primers específicos para SL de C. dimerus (Tabla 5) se
amplificó un fragmento de 500 pb con el objetivo de semicuantificar SL entre
los dos tratamientos. Se realizó una PCR en alícuotas de 20 µl utilizando la
termocicladora gradient Eppendorf Mastercycler utilizando GoTaq Flexi DNA
polimerasa (Promega). Después de 2 min de desnaturalización a 94ºC, los
ciclos de la PCR se repitieron 35 veces con una desnaturalización a 94 C por
30 s, un annealing a 55ºC por 30 s y una elongación a 72ºC por 30 s. El
resultado de la reacción de PCR se observó en un gel de agarosa al 1%, se
digitalizó y se cuantificó utilizando el software Image Gauge versión 3.12 (Fuji
Photo Software). Por otro lado se amplificaron fragmentos de 500 pb aprox. de
fosfoproteina acidica ribosomal (ARP) y de Actina (ACT) como genes de
referencia (números de acceso al genbank: GU244484, EU158257
respectivamente). Tanto para SL, como para ARP y ACT, se realizaron curvas
de ciclos de amplificación (20, 25, 30,35, 40) para establecer el número de
ciclos óptimos para observar diferencias entre los tratamientos (35 ciclos para
SL, 30 para ARP y ACT).
Además se pesaron y fijaron las gónadas, el hígado y el bazo de cada animal y
se calcularon los índices gonadosomáticos (IGS), hepatosomáticos (IHS) y
bazosomáticos (IBS) como: (peso del órgano/peso del animal)*100
Presencia del RGH1 en piel de C. dimerus
Con el objetivo de evaluar la presencia del RGH1 en la piel, se anestesiaron
ejemplares adultos (3) de C. dimerus con solución de benzocaína 0,1% y se
extrajeron aproximadamente 20 escamas de cada uno de la región media
Materiales y Métodos – Capítulo II
Página 45
dorsal por encima del canal de la línea lateral. Se utilizaron escamas minimizar
una posible contaminación de células musculares donde se ha reportado que
existe una alta expresión del receptor. Las escamas, de cada animal por
separado, se mantuvieron en agitación en tubos tipo eppendorf por 30 minutos
a temperatura ambiente en Trizol (Invitrogen) con el objetivo de remover la piel
adherida a las mismas (Fig. 17). Se removieron las escamas, se homogeneizó
la solución utilizando micropestles (Eppendorf) y se procedió con la extracción
de ARN total según indicaciones del fabricante. El ARN obtenido se cuantificó
y se trató con ADNasa libre de ARNasas (Sigma). Se realizó la transcripcion
reversa usando la enzima AMV (Promega), oligo (dT)-20 y 1 µg de ARN.
Utilizando primers específicos para RGH1 de C. dimerus (Tabla 5) se amplificó
por PCR un fragmento parcial específico del receptor a partir de: ADNc de piel,
ADNc de hígado como control positivo y ARN tratado con ADNasa para
descartar contaminación con ADN genómico. El producto de PCR esperado fue
de 300 pb y las condiciones de amplificación como se describen a
continuación: 94ºC 3 min. de desnaturalización inicial, 40 ciclos de 94° por 30 s,
55° por 30 s y 72° por 30 s usando GoTa q Flexi DNA polimerasa (Promega). El
producto de PCR se observó en un gel de agarosa 1%.
Tabla 5. Secuencia de primers para PCR
Nombre Secuencia (5’ å3’) notas
cdSLf ATGCCACTAGACTGTAAAGA Somatolactina
cdSLr TATGCACAGTTGTAGTTGTCAGC
cdSLRf GTGGTTCAGGAGTTAGAC RGH1
cdSLRr AACAGACACCCGTACACA
cdARPf TTTGAAAATCATCCAACTTTTGGAT Gen de referencia
cdARPr GCAGGGACAGACGGATGGT
ACTf GGATGATATGGAGAAGATCTG Gen de referencia
ACTr ATGGTGATGACCTGTCCGTC
Primers diseñados para evaluar las variaciones de SL y del receptor GH1 en diferentes
condiciones de coloración del entorno y primers para evaluar la presencia del receptor en la piel
de C. dimerus.
Materiales y Métodos – Capítulo II
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Figura 17. Remoción de piel de escamas de C. dimerus. Se indica la región de la
cual se removieron las escamas para evaluar la presencia del receptor de C.
dimerus y el resultado de la remoción de la piel de una escama. A: aspecto de la
escama antes de la extracción de ARN y B) luego de la extracción.
Efecto de la coloración del entorno sobre los niveles de expresión del
RGH1 en piel de C. dimerus
Se mantuvieron individualmente ejemplares de C. dimerus en las condiciones
de entorno ya descriptas (EN y EB, N=8) por 15 días. Se anestesiaron los
ejemplares con solución de benzocaína 0,1 % y se tomaron escamas de la
región dorsal como fuese descripto en la sección anterior. Se extrajo ARN, se
cuantificó, se trató con ADNasa y se evaluaron los niveles de ARNm del RGH1
por RT-PCR a partir de 1 µg de ARN total. El ADNc se sintetizó utilizando el kit
“Enhanced Avian First Strand Synthesis kit” (Sigma). En estos ensayos se
utilizó ARP como gen de referencia ya que se observaron variaciones en la
expresión de actina entre los tratamientos. Esto último era esperable ya que la
actina es una molécula que forma parte del citoesqueleto, seguramente
a b
Materiales y Métodos – Capítulo II
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involucrada en los cambios de coloración de la piel.
Efecto de la coloración del entorno sobre el número y morfología de los
melanóforos en piel de C. dimerus
Se tomaron 3 escamas adicionales por cada animal expuesto a cada coloración
de entorno, se incubaron en solución salina (NaCl, 16mM; KCl, 8,6 mM; CaCl2,
3 mM; MgCl2, 2,5 mM; NaHCO3, 1mM; Na2HPO4, 1,3 mM; D-glucosa 5 mM), se
fotografiaron en microscopio NIKON Microphot FX con una cámara Nikon
Coolpix 4500 acoplada y se cuantificó el número de melanóforos y de
xantóforos por conteo manual en un área de 70 x 45 µm (3000 µm2 aprox.). En
peces cíclidos es posible alcanzar la completa agregación de los melanóforos
utilizando noradrenalina como estímulo, la cual actúa a través de los
adrenoreceptores α2 (Mårtensson y col. 1999). En la presente Tesis para
facilitar el conteo de los melanóforos, se utilizó dopamina (10 µM) ya que se
observó que es capaz de unirse a los receptores α2 y evocar la misma
respuesta que noradrenalina, es decir producir la agregación de los
melanóforos (Cornil y col. 2008, Ruuskanen y col. 2005, Nyrönen y col. 2001)
Análisis estadístico
Los datos de niveles de SL hipofisarios se analizaron utilizando el análisis de
varianza (ANOVA) de dos factores (sexo y condición de entorno). Los datos de
IGS, IHS y IBS se analizaron de igual manera.
Los datos de expresión del receptor en la piel se analizaron mediante una
prueba de t de student.
El número de cromatóforos se analizó mediante un test de ANOVA anidado
(nivel escama anidado en cada animal).
Se estableció un nivel de p<0,05 para detectar diferencias significativas.
Los datos se presentan como la media ± ESM (error estandard medio).
Resultados – Capítulo II
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RESULTADOS
Efecto de la coloración del entorno s obre la expresión hipofisaria de SL
en C. dimerus.
Como se describió anteriormente para C. dimerus, la coloración del entorno
tiene un marcado efecto sobre el patrón general de la coloración de esta
especie. Los peces expuestos a un entorno negro mostraron una coloración
corporal general más oscura que los expuestos al entorno blanco (Fig. 18).
Figura 18. Efecto del entorno negro (a) y del entorno blanco (b) sobre el patrón
general de coloración de C. dimerus. Los peces expuestos a un entorno negro
muestran una coloración más oscura que los expuestos a un entorno blanco.
El análisis por RT-PCR para SL de C. dimerus, mostró un aumento significativo
del ARNm de SL en animales adaptados a un entorno negro con respecto a
aquellos adaptados al blanco (Tabla 6, p=0,032; Fig. 19-20). A su vez, no se
observaron diferencias significativas respecto al sexo en el presente diseño
experimental (Tabla 6).
a b
Resultados – Capítulo II
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Figura 19. Imagen representativa que muestra el efecto de la coloración del
entorno sobre la expresión de SL. 1-2: RT-PCR representativa de SL de ADNc de
hipófisis de C. dimerus macho y hembra, respectivamente, expuestos 10 días a un
entorno negro. 3-4 RT-PCR de SL de ADNc de hipófisis de C. dimerus macho y
hembra, respectivamente, expuestos 10 días a un entorno blanco. Se muestran los
respectivos productos de PCR de ARP como gen de referencia. EN: entorno
negro, EB: entorno blanco.
Tabla 6. Tabla de ANOVA
Efecto SC GL CM F p
CE 0,173765 1 0,173765 6,7374 0,031833*
sexo 0,002589 1 0,002589 0,1004 0,759497
CE*sexo 0,008463 1 0,008463 0,3281 0,582506
Error 0,206330 8 0,025791
ANOVA de dos factores para evaluar los efectos del sexo y la coloración del
entorno (CE) sobre la expresión de SL hipofisaria en C. dimerus adaptados 10
días a una coloración del entorno negra o blanca. CE: factor coloración del
entorno. SC: suma de cuadrados, GL: grados de libertad, CM: cuadrados medios,
F: estadístico de Fisher, p: valor de probabilidad de la prueba
Resultados – Capítulo II
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Figura 20. Análisis de la expresión de SL relativo a ARP en animales expuestos a
un entorno negro (N) y a uno blanco (B). Se observan diferencias significativas
entre los tratamiento (ANOVA para el efecto principal de coloración del entorno:
p=0,0318). n=6 por tratamiento.
El análisis estadístico de los índices hepatosomáticos (Tabla 7),
gonadosomáticos (Tabla 8) y bazosomáticos (Tabla 9) no mostró diferencias
significativas entre las dos condiciones de coloración del entorno. Sin embargo,
cuando se comparó entre sexos se detectó una diferencia significativa para el
índice hepatosomático siendo mayor para los machos respecto de las hembras
(1,84±0,11 vs. 1,46±0,11, p=0,022 Tabla 7). Los valores de cortisol (EN: 28,5 ±
7,36, EB: 32,41 ± 8,52ng/ml) y los de glucosa (EN: 50 ± 3,2, EB:
47,6±11,3mg/dl) no mostraron diferencias significativas entre los animales
mantenidos en un entorno negro comparado con los animales mantenidos en
un entorno blanco.
*
Resultados – Capítulo II
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Tabla 7. Tabla de ANOVA
Efecto SC GL CM F P
CE 0,03330 1 0,03330 0,2098 0,659129
Sexo 1,27674 1 1,27674 8,0430 0,021946*
CE*sexo 0,49763 1 0,49763 3,1349 0,114589
error 1,26991 8 0,15874
ANOVA de dos factores para evaluar los efectos del sexo y la coloración del
entorno (CE) sobre el índice hepatosomático (IHS) en C. dimerus adaptados 10
días a una coloración del entorno negra o blanca. CE: factor coloración del
entorno. SC: suma de cuadrados, GL: grados de libertad, CM: cuadrados medios,
F: estadístico de Fisher, p: valor de probabilidad de la prueba
Tabla 8. Tabla de ANOVA
Efecto SC GL CM F P
CE 0,05176 1 0,05176 3,026 0,120112
Sexo 24,73778 1 24,73778 1446,355 2,51x10-10
CE*sexo 0,00368 1 0,00368 0,215 0,655178
error 0,13683 8 0,01710
ANOVA de dos factores para evaluar los efectos del sexo y la coloración del
entorno (CE) sobre el índice gonadosomático (IGS) en C. dimerus adaptados 10
días a una coloración del entorno negra o blanca. CE: factor coloración del
entorno. SC: suma de cuadrados, GL: grados de libertad, CM: cuadrados medios,
F: estadístico de Fisher, p: valor de probabilidad de la prueba
Tabla 9. Tabla de ANOVA
IEfecto SC GL CM F P
CE 0,000464 1 0,000464 0,31102 0,592313
Sexo 0,000606 1 0,000606 0,40586 0,541875
CE*sexo 0,006486 1 0,006486 4,34470 0,070631
error 0,011943 8 0,001493
ANOVA de dos factores para evaluar los efectos del sexo y la coloración del
entorno (CE) sobre el índice bazosomático (IHS) en C. dimerus adaptados 10 días
a una coloración del entorno negra o blanca. CE: factor coloración del entorno.
SC: suma de cuadrados, GL: grados de libertad, CM: cuadrados medios, F:
estadístico de Fisher, p: valor de probabilidad de la prueba.
Resultados – Capítulo II
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Presencia del RGH1 en piel de C. dimerus
Se amplificó un producto específico del RGH1 por RT-PCR a partir de ADNc
obtenido de piel removida de escamas de la región dorsal de adultos de C.
dimerus. No se observó producto de PCR en ausencia de transcriptasa reversa
indicando que no hubo contaminación de ADN genómico en las muestras (Fig.
21). Este resultado se observó tanto para ejemplares machos como para
hembras (Datos no mostrados).
Figura 21. Presencia del ARNm del RGH1 en tegumento de C. dimerus usando
RT-PCR. -RT: control negativo sin la enzima transcriptasa reversa, H: ADNc de
hígado, P: ADNc de piel
Efecto de la coloración del entorno sobre los niveles de expresión del
RGH1 en piel de C. dimerus
El análisis por RT-PCR para el RGH1 en piel de C. dimerus, mostró un mayor
nivel de ARNm en piel de escamas provenientes de animales adaptados a un
entorno negro respecto de aquellos adaptados al blanco (p=0,04; fig. 22-24).
RGH1
Resultados – Capítulo II
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Figura 22. Escamas de C. dimerus de animales que fueron adaptados a un acuario
negro (a) y a un acuario blanco (b) antes de ser procesadas para extracción de
ARN.
Figura 23. Imagen representativa que muestra el efecto de la coloración del entorno
sobre la expresión del RGH1. EN: RT-PCR representativa del RGH1 de ADNc de
piel de C. dimerus adaptados a un entorno negro RT-PCR representativa del RGH1
de ADNc de piel de C. dimerus adaptados a un entorno blanco. Se muestran los
respectivos productos de PCR de ARP como gen de referencia.
Figura 24. Niveles de expresión del RGH1 en piel de C .dimerus. El asterisco
indica diferencias significativas. p<0,05. N=negro, B=blanco. D.O.R.=densidad
óptica relativa. n=3 por tratamiento.
a b
*
RGH1
ARP
Resultados – Capítulo II
Página 54
Efecto de la coloración del entorno sobre el número y morfología de los
melanóforos en piel de C. dimerus.
Las escamas de la región media dorsal de C. dimerus muestran que los
animales expuestos a una condición de entorno negro tienen una mayor
cantidad de melanóforos por área con respecto a aquellos expuestos a entorno
blanco (p<0,0001) (Fig. 25-26). Por otra parte, al analizar el número de
xantóforos, se observó que la cantidad de estos cromatóforos no varía bajo las
condiciones de coloración de entorno utilizadas en este diseño experimental
(Fig. 25 y 27). Es importante destacar que el número de cromatóforos se
analizó en escamas de la región dorsal del cuerpo de C. dimerus.
Figura 25. Escamas de animales expuestos a entornos negro (a,c) y blanco (b,d).
Se observa un mayor número de melanóforos en las escamas provenientes de
animales expuestos a entorno negro con respecto a las provenientes de un animal
expuesto a un entorno blanco (a vs. b). Para cuantificar número de melanóforos
las escamas se incubaron con dopamina 10 µM por 5 minutos (Fig. c-d) para
lograr la completa agregación de los mismo, poder individualizarlos y realizar el
conteo. Barra: 100 µm
Resultados – Capítulo II
Página 55
Figura 26. Número de melanóforos por área en las dos condiciones de coloración
de entorno utilizadas. La diferencia significativa esta indicada por el asterisco (*).
n=3 por tratamiento.
Figura 27. Número de xantóforos por área en escamas de la region media dorsal de C.
dimerus. n=3 por tratamiento.
Se observaron escamas provenientes de ambos tratamientos en detalle y se
encontró que aquellas provenientes de animales de entorno blanco mostraron
melanóforos con una reducción en sus procesos dendríticos en comparación a
*
Resultados – Capítulo II
Página 56
aquellos presentes en escamas de animales provenientes de un entorno negro
(Fig. 28).
Figura 28. Fotografias representativas en las cuales se observa la morfología de
los melanoforos en las dos condiciones de coloración del entorno. En animales
provenientes de un entorno blanco (b) se observa una reduccion en los procesos
dendríticos de los melanoforos en comparación con los provenientes de animales
adaptados a un entorno negro (a).
Discusión – Capítulo II
Página 57
DISCUSIÓN
Efecto de la coloración del entorno s obre la expresión hipofisaria de SL
en C. dimerus.
Como fuera anteriormente descripto para C. dimerus, la coloración del entorno
afecta significativamente la coloración corporal en esta especie lo que indica la
facilidad para adaptarse a diferentes condiciones de coloración por largos
periodos de tiempo, situación que ocurre frecuentemente debido a los diversos
hábitats que son ocupados por estas especies. En esta Tesis se ha observado
que los cambios en el patrón de coloración general se correlacionan con
diferentes niveles de expresión de SL hipofisarios, siendo éstos
significativamente mayores en los animales expuestos a un entorno negro con
respecto a aquellos expuestos a un entorno blanco. Estos resultados también
se observan en otros peces del Perciformes como “red drum”, Sciaenops
ocellatus, “Atlantic croaker”, Micropogonias undulatus y medaka, Oryzias
latipes, lo que indicaría una correlación entre los niveles de expresión de SL y
la coloración del entorno en peces teleósteos (Zhu y Thomas 1999, Zhu y col.
1999, Fukamachi y col. 2004). En C. dimerus no se han observado diferencias
significativas en los niveles hipofisarios de ARNm de SL entre ejemplares
machos y hembras, sugiriendo que, en esta especie, el efecto de la coloración
del entorno en animales aislados es un estímulo que no depende del sexo. En
trabajos previos se ha observado que los peces mantenidos en acuarios negros
muestran mayores niveles de SL (medido por western blot) y un mayor número
de células productoras de SL con un mayor área inmunoreactiva (medido por
IHQ) respecto a aquellos mantenidos en entornos blancos (Cánepa y col.
2006). En esta Tesis se ha demostrado que los niveles de ARNm siguen el
mismo patrón que la proteína lo que sugiere una participación de SL en la
adaptación a la coloración del entorno. En red drum y atlantic croaker se
observó que los niveles plasmáticos de SL también se ven afectados en
condiciones de entorno oscuro (Zhu y Thomas, 1996). Las evidencias
reportadas en otras especies sugieren que los niveles de ARNm y el contenido
Discusión – Capítulo II
Página 58
protéico de SL hipofisario se correlacionarían con los niveles plasmáticos de SL
que afectan, posiblemente, la dinámica pigmentaria. Si bien en C. dimerus no
se han medido los niveles plasmáticos de SL es de esperar que exista dicha
correlación.
Entre las numerosas funciones que le han atribuido a SL se encuentran el
control de la lipólisis, la movilización de energía y la regulación de la coloración
corporal previamente mencionada. A su vez, parece tener también un rol en el
balance acido base, la homeostasis del fosfato, el calcio y sodio, el estrés, el
sistema inmune y la maduración gonadal (Kawauchi y Sower 2006). Una
posible explicación a las múltiples funciones de SL propuestas es que tal vez
se hayan evaluado indistintamente las formas α y β de SL. Por ejemplo, y como
ya se mencionó anteriormente, medaka y Fugu parecen poseer solo una copia
de SL de acuerdo a la base de datos genómica y mientras que la SLβ ha sido
encontrada solamente en un pequeño grupo de especies y varias pertenecen a
ordenes diferentes como el catfish, (Ictalurus punctatus), la carpa
(Ctenopharyngodon idella), zebrafish, goldfish, la anguila europea (Anguilla
anguilla), la trucha arco iris y el salmon del atlántico. Dada la presencia de la
variante β en dichas especies y la homología, aunque baja, entre las dos
variantes, los resultados obtenidos utilizando anticuerpos policlonales
desarrollados contra la proteína completa deberían ser revisados teniendo en
cuenta la posibilidad de una reacción cruzada de los anticuerpos por ambas
variantes. Por otro lado, aún no se le puede atribuir una función a esta segunda
variante ya que solo se ha observado que induce, in vitro, la agregación de los
melanosomas en zebrafish (Nguyen y col. 2005). Se requieren mayor cantidad
de estudios para poder explicar una posible función de esta variante.
Presencia del RGH1 en piel de C. dimerus
En pocas especies se llevo a cabo la distribución del RGH1. En tilapia se
encontró que el receptor se expresa en el cerebro, la hipófisis, las branquias, el
corazón, el estómago, el hígado, la vejiga natatoria, el intestino, en grasa,
riñón, bazo, ovario, testículos, musculo y piel (Pierce y col. 2007).
Discusión – Capítulo II
Página 59
Particularmente, en esa especie, se extrajo piel por el método clásico que
consiste en extraer escamas y luego remover la piel remanente del animal
(comunicación personal). En la presente Tesis se procedió de manera similar,
es decir, se removieron escamas de la región dorsal y posteriormente se
disecaron fragmentos de piel del cuerpo del animal y se extrajo el ARN. Se
observó que durante ese procedimiento era muy probable que se contamine la
muestra con tejido muscular donde se sabe que hay RGH1 (Pierce y col. 2007,
Benedet y col. 2008). Por este motivo se introdujo una variación al
procedimiento de extracción de ARN de piel; se extrajeron escamas de la
misma región y se las colocó en una solución de Trizol en agitación. De esta
manera se evitó una posible contaminación de tejido muscular en las muestras.
Estos resultados confirmaron la expresión del RGH1 en piel de C. dimerus,
posiblemente en los melanóforos y descartan cualquier tipo de contaminación
con tejido muscular.
Efecto de la coloración del entorno sobre los niveles de expresión del
RGH1 y sobre el número y morfología de los me lanóforos en piel de C.
dimerus
Como se mencionó anteriormente, en C. dimerus se observan cambios de
coloración corporal correlacionados con la coloración del entorno
(Negro/Blanco). Este cambio podría ser debido a modificaciones en el grado de
dispersión de los cromatóforos involucrados en este proceso de adaptación y/o
a una variación en la cantidad de los mismos por unidad de área. En C.
dimerus, se observó que el número de melanóforos presentes en las escamas
de la región dorsal del tronco de los animales adaptados durante 15 días a un
entorno negro duplica al número de los presentes en los animales adaptados a
un entorno blanco. A su vez, el número de xantóforos presentes en esta región
no se modifica, lo que sugiere que estos cromatóforos no estarían involucrados
en la adaptación a la condición experimental evaluada, como se ha observado
también para medaka, zebrafish y tilapia (Sugimoto 2002). Es importante
mencionar que se observaron diferencias en la morfología de los melanóforos
Discusión – Capítulo II
Página 60
de C. dimerus entre los dos tratamientos. Los melanóforos de animales
adaptados a un entorno negro mostraron mayor cantidad de procesos
dendríticos respecto a aquellos de animales adaptados a un entorno blanco.
Aunque los melanóforos de animales adaptados a un entorno blanco presentan
menos procesos dendríticos que los adaptados a un entorno negro, estudios en
otras especies demostraron que los mismos son capaces de recuperar su
forma y, eventualmente el tamaño, si la coloración del entorno se modificara
(Sugimoto 2002). La organización de los filamentos de actina y microtúbulos
permite a los melanóforos tomar forma dendrítica y también movilizar los
melanosomas dentro de la célula. Se observó que αMSH es capaz de estimular
la formación de procesos dendríticos y es esperable que tanto noradrenalina,
MCH, como así también otros factores involucrados en los cambios de
coloración tales como SL estén involucrados en las vías responsables de
dichos cambios. (Sugimoto 2000). Previamente, se observó que, tanto en red
drum como en zebrafish, es altamente probable que exista un receptor capaz
de reconocer SL en los melanóforos ya que ensayos in vitro mostraron
movimiento pigmentario de los melanosomas al incubar escamas con SL y éste
fue un efecto dosis dependiente, específico y reversible (Zhu y Thomas 1997,
Nguyen y col. 2005). Sin embargo, estos experimentos in vitro en conjunto con
experimentos in vivo (Zhu y Thomas 1997) arrojaron resultados contradictorios.
Se encontró una relación dosis dependiente pero inversa a lo esperado. En
ambos ensayos se observó que SL agrega los melanóforos dando como
consecuencia un empalideciendo del tegumento. Por otro lado, se observó que
una preincubación con SL afectaría la dispersión de los melanóforos inducida
por MSH en cultivos de escamas (Zhu y Thomas 1997). En Labrus
bimaculatus, se observó que el inhibidor LY-294002 de fosfatidiliositol 3´ kinasa
(PI3K) inhibe la agregación de los melanóforos por parte de NA, vinculando la
vía de PI3K con la dinámica pigmentaria (Andersson y col. 2003). A su vez,
como se describió en el capítulo 1 de la presente Tesis, el RGH1 es un
receptor de la familia de las citoquinas que posiblemente involucre la vía de
transducción de señales del sustrato del receptor de insulina 1 (IRS-1) y 2 que
interaccionan con la PI3K a través de la proteína JAK; vía que incluye la
Discusión – Capítulo II
Página 61
regulación de la actividad de MAPK (Mitogen-activated protein kinases) y la
progresión del ciclo celular (Carter-Su y col. 2000). De esta manera, se sugiere
que SL estaría actuando a través de PI3K afectando la dinámica pigmentaria.
Aunque en esta Tesis se sugiere el rol de SL en la dinámica pigmentaria, es
importante recalcar que actuaría en conjunto con MCH, MSH y catecolaminas
del sistema nervioso autónomo. Por lo tanto se propone la inclusión de SL en el
sistema multifactorial que regula la dinámica pigmentaria y/o la proliferación,
crecimiento y/o diferenciación de los cromatóforos.
El patrón general de coloración de ejemplares de C. dimerus con respecto a la
adaptación a la coloración del entorno no es homogéneo (Figura 18); la región
dorsal por encima de una línea lateral es ligeramente más oscura que la región
ventral. Por otro lado, en C. dimerus (observaciones personales) se observa un
complejo despliegue de patrones de coloración en condiciones sociales donde
se establecen diferentes jerarquías y con ellas cambios en el grado de
oscurecimiento del animal. Además, se observó que en periodos de peridesove
tanto los animales machos como hembras exhiben la región ventral con una
coloración oscura, especialmente la región anterior. De esta manera, al llevar a
cabo los experimentos bajo condiciones de aislamiento se descartan posibles
efectos “sociales” y “reproductivos” sobre la variación en el número de
cromatóforos y niveles de expresión ya sea del receptor como de la hormona
SL. Por otro lado, la coloración del entorno podría inducir un efecto de estrés
diferencial entre los tratamientos. Sin embargo, los valores obtenidos de
glucosa plasmática como de cortisol en animales seleccionados al azar para
ambos tratamientos no mostraron diferencias significativas. Para ambos
tratamientos, los niveles de cortisol fueron altos con respecto a los valores
normales indicando que, probablemente, el efecto estresante de aislar un
animal marcadamente social es mucho mayor que un posible efecto dado por
la coloración del entorno. Es de destacar que tanto los animales machos como
hembras no mostraron diferencias en lo que refiere a ingesta de alimento
(observación directa de ingesta de pellet comercial). Sin embargo, el análisis
estadístico mostró diferencias significativas con respecto al índice
hepatosomático, siendo mayor en los animales machos aunque sin observarse
Discusión – Capítulo II
Página 62
diferencias respecto a la coloración del entorno para ambos sexos. Es
importante destacar que los animales provenientes del campo no muestran
diferencias en los índices órgano somático entre sexos. La diferencia
observada puede ser consecuencia de la disminución en la actividad
locomotora observada en los animales machos en condiciones de aislamiento y
por lo tanto menor movilidad de energía en contraste con lo observado en las
hembras las cuales no disminuyen dicha actividad (Observación personal). Se
deben llevar a cabo experimentos que correlacionen los índices organo-
somáticos con las variaciones estacionales, diferentes estados de actividad
locomotora y estados reproductivos lo que permitiría esclarecer lo observado
en la presente Tesis.
Por otro lado, Fukamachi y col (2004), utilizando medaka como modelo
experimental y particularmente con series transgénicas para SL, ha obtenido
resultados que la involucran con la diferenciación y proliferación de los
cromatóforos. Una variante de medaka denominada “color interfere (ci)”
presenta una SL trunca, de solo 91 aa y como único cambio morfológico
presenta anomalías en el número de cromatóforos. Esta variante “ci” presenta
un aumento de leucoforos y una disminución en el número de xantóforos y
ninguna modificación en el numero de melanóforos (Fukamachi y col. 2004).
Posteriormente, Fukamachi y col. (2009b), introdujeron una SL bajo regulación
del promotor de β-actina en la variante ci y se revirtieron los cambios que
poseía, es decir, disminuyó el número de leucoforos, aumentó el número de
xantóforos e inesperadamente, aumentó el número de melanóforos, lo que
indicaría que SL cumple un papel preponderante en la regulación de la
proliferación y/diferenciación de las células pigmentarias. En C. dimerus se
observó que los animales adaptados a un entorno negro, además de poseer
mayores niveles hipofisarios de SL (Canepa y col. 2006), de ARNm de SL, el
número y procesos dendríticos de melanóforos aumentados y expresar el
RGH1 en la piel, poseen mayor expresión del RGH1 en la piel. Aunque, no se
puede descartar que SL pueda estar regulando la diferenciación y/o
proliferación vía contactos célula-célula, éstos resultados sugieren que una de
las principales funciónes de SL es la regulación de la coloración posiblemente a
Discusión – Capítulo II
Página 63
través del RGH1 afectando los procesos de proliferación y/o de sobrevida de
los melanóforos.
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 64
CAPITULO III
Hipótesis
“MCH y GnRH están morfológica y func ionalmente relacionados con las
células productoras de SL”
Objetivos:
1. Determinar si las fibras hipofisarias de MCH y GnRH están relacionadas
morfológicamente con las células productoras de SL.
2. Determinar si MCH y GnRH están relacionados funcionalmente con la
secreción de SL.
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 65
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Peces adultos de C. dimerus (n=95; largo estándar promedio de hembras
9,4±0,3 cm, machos 9,6±0,2; peso promedio hembras 45,6±1,2 g, machos
48,1±0,9 g índice gonadosomático (IGS) hembras 3,19±0,15, machos
0,090±0,003) fueron capturados en Esteros del Riachuelo, Corrientes,
Argentina, se mantuvieron en acuarios bien aireados con filtro externo a una
temperatura de 27±1°C bajo condiciones de fotoperíodo de 12:12hs y fueron
alimentados con alimento comercial hasta su procesamiento. Para los ensayos
de cultivos de hipófisis se tuvo en cuenta de no incluir machos dominantes o
hembras reproductivas ya que probablemente posean diferentes niveles
hormonales basales. Por lo tanto, aquellos con un IGS extremadamente altos
fueron descartados.
Relaciones morfológicas entre MCH, GnRH y SL
Procesamiento de las muestras para inmunofluorescencia
Se anestesiaron 10 animales con solución de benzocaina 0,1% y se
sacrificaron por decapitación. Se disecaron los cerebros con cuidado de
mantener la hipófisis adheridas y se fijaron en solución de Bouin a 4°C por 24
hs. Las muestras fueron luego deshidratadas, embebidas en Paraplast
(Fisherbrand, Fisher, Wash., USA), seccionadas transversalmente a 7 µm en
micrótomo y montadas en portaobjetos gelatinizados.
Doble inmunofluorescencia SL-MCH
Los cortes se desparafinaron en xilol, se rehidrataron a través de un gradiente
decreciente de etanol hasta buffer fosfato salino (PBS, pH 7,4) y se incubaron
en solución de bloqueo (leche descremada 5% en PBS) a temperatura
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 66
ambiente (t.a.). Posteriormente se incubaron con antisuero anti-SL de Sparus
aurata (saSL) (Astola y col. 1996) toda la noche a 4°C (dilución 1:1000; Canepa
y col. 2006), se lavaron en PBS e incubaron con anti-rabbit fluoresceína como
anticuerpo secundario por 40 min a t.a. A continuación, las secciones se
incubaron a 4°C toda la noche con anticuerpo hecho en conejo anti-MCH de
rata (Donado por Dr. B.I. Baker, University of Bath, UK; dilución 1:1000). Las
secciones se lavaron en PBS, se incubaron por 40 minutos a t.a. en anticuerpo
secundario anti-rabbit acoplado a rodamina, y se analizaron en microscopio
laser confocal (Olympus FV-3 unido a un microscopio Olympus Bx-61). Este
sistema con dos anticuerpos primarios hechos en conejo se pudo llevar a cabo
debido a que SL no co-localiza con MCH. Mientras que el antisuero anti-SL
marca células hipofisarias, el antisuero anti-MCH marca fibras en la
neurohipófisis. Se obtuvieron entonces 2 micrografías, una que muestra las
células de SL (verde) y la otra mostrando las fibras inmunoreactivas a MCH
(rojo). Finalmente estas imágenes fueron digitalmente superpuestas.
Doble immunofluorescencia SL-GnRH
Se llevó a cabo una doble immunofluorescencia utilizando los siguientes
anticuerpos primarios: LRH13, anticuerpo monoclonal que reconoce las
diferentes variantes de GnRH (anti-GnRH) y anti saSL. Las células productoras
de SL se marcaron como se mencionó anteriormente para la doble
inmunofluorescencia de SL-MCH. Por otra parte, las fibras reactivas a GnRH se
revelaron con un sistema de amplificación de la señal con una estreptavidina
acoplada a rodamina bajo condiciones recomendadas por el fabricante (Kit de
Amplificacion CSA, DAKO). Todas las incubaciones se realizaron a
temperatura ambiente. La doble inmunofluorescencia se analizó posteriormente
por microscopia láser confocal como se describió anteriormente. Además, se
llevó a cabo una doble immunomarcación para evidenciar GnRH junto con
MCH utilizando los anticuerpos previamente mencionados. Como se mencionó
anteriormente la señal de GnRH se amplificó utilizando un sistema de
amplificación (Kit de amplificación CSA) y una rodamina acoplada a
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 67
estreptavidina y para esta doble inmunomarcación el anti-MCH se evidenció
utilizando un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a fluoresceína.
Los tests de especificidad para anti-SL fueron previamente realizados en C.
dimerus para las técnicas de inmunohistoquímica y para western blot. Para el
anticuerpo monoclonal LRH13 y el antisuero MCH solo fueron realizados para
las técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Los controles de
especificidad se realizaron como se describe a continuación. Los antisueros y
anticuerpos se preadsorvieron con un exceso de antigeno según corresponda y
luego estas soluciones se usaron como anticuerpos primarios. Además, en
todos los casos se omitieron los anticuerpos primarios tanto para
immunohistoquímica como para western blot. Todos los tests de especificidad
demostraron que los anticuerpos utilizados son específicos. (Pandolfi y col.
2001b, 2002, Cánepa y col. 2006).
Relación funcional entre GnRH, MCH y SL
Ensayo in vitro de liberación de SL de hipófisis de C. dimerus
Se anestesiaron adultos de C. dimerus (machos: 40, hembras: 40) (benzocaína
0,1 %) y se removieron las hipófisis en condiciones asépticas bajo flujo laminar.
Se utilizaron cinco glándulas de cada sexo por tratamiento. Éstas se incubaron
individualmente en medio Leibovitz L15 80% (v/v) (gibco), pH 7,4, conteniendo
suero fetal bovino 10%, HEPES 1mM, penicilina 10U/ml y streptomicina 10g/ml
y se mantuvieron bajo condiciones de oscuridad en un incubador a 27ºC. Se
incubaron individualmente por 1 día (24h) en medio de cultivo con el objetivo de
establecer las condiciones basales de liberación de SL. Subsecuentemente, se
removió el medio y se guardó a -20ºC para un análisis posterior. Luego de
remover el medio, se agregó medio fresco conteniendo MCH de salmon o
GnRH de mamíferos (0,1; 1,0; 10,0 µM) o sin MCH de salmon/GnRH de
mamífero como control interno. Como los ensayos de cultivos de hipófisis se
llevaron a cabo sobre glándulas intactas, se utilizó una concentración máxima
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 68
aumentada en 1 órden de magnitud con respecto a las máximas utilizadas por
otros autores en cultivos de células dispersas para asegurar que los péptidos
alcancen las células productoras de SL que se localizan en la porción interna
de la pars intermedia bordeando la neurohipófisis (Fig. 29). Despues de 24
horas de tratamiento (día 2), se removió el medio y se guardó a -20ºC.
Finalmente, se fijaron las hipófisis en solución de Bouin a 4ºC por 24 hrs, se
deshidrataron y embebieron en parafina con el objetivo de evaluar la morfología
de las células de productoras de SL y la integridad del tejido glandular.
Figura 29 Corte transversal de hipófisis de C. dimerus a nivel de la pars intermedia
luego de inmunohistoquímica contra SL. Las células de SL (flechas) se localizan
rodeando la neurohipófisis hacia el interior de la glándula.
Debido a que las hormonas utilizadas son heterólogas se realizaron ensayos
de actividad biológica con el objetivo de validar su uso. En primer lugar se
evaluó la actividad biológica de MCH de salmón sobre escamas en cultivo en
solución salina (NaCl, 16mM; KCl, 8,6 mM; CaCl2, 3 mM; MgCl2, 2,5 mM;
NaHCO3, 1mM; Na2HPO4, 1,3 mM; D-glucosa 5 mM) utilizando
concentraciones crecientes desde 0,1 a 10 nM. Se tomaron fotografias de la
misma zona de una escama proveniente de la región dorsal del tronco. Se
obtuvieron los resultados esperados, mientras los cultivos de escamas sin MCH
mostraron los granulos de pigmento dispersos en los melanóforos, MCH
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 69
provocó la agregación en un manera dosis dependiente (Fig. 30 y 32a).
Además se evaluó el efecto de la inyección de MCH (ctrl, 1, 10, 100 pM) en
animales adaptados a entornos negros obteniéndose también una respuesta
dosis dependiente (Fig. 31 y 32b).
Figura 30. Ensayo de in vitro de actividad biológica de MCH de salmón sobre
melanóforos de C. dimerus. Concentraciones de MCH de salmón: a) control b) 0,1
nM c) 1 nM d) 10 nM e) 100 nM. Se observa un aumento en la agregación de los
melanóforos que correlaciona con el aumento de concentración de MCH. Barra: 50
µm
Figura 31. Efecto de inyecciones de MCH de salmón sobre la dinámica
pigmentaria in vivo de C. dimerus. Se observa que la coloración de C .dimerus se
empalidece a medida que la dosis de MCH inyectada es mayor. Nótese que en la
dosis más alta de MCH, la mancha circular en la región media lateral se hace
imperceptible y que además se modifica el patrón de coloración ocular. Barra 1 cm
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 70
Figura 32. Densidad óptica de los ensayos in vivo (a) e in vitro (b) con MCH de
salmón. Diferentes letras indican diferencias significativas (p<0,05).
Para validar el uso de la variante GnRH de mamífero (GnRH tipo 1), se llevó a
cabo un ensayo de cultivo de hipófisis estimuladas con esta variante de GnRH
utilizando concentraciones crecientes (0,01 a 1 µM) seguido de western blot
para la hormona luteinizante (LH). Es conocido el efecto estimulatorio de GnRH
sobre las células hipofisarias de LH, y por lo tanto se evaluó la liberación de
esta hormona como control de bioactividad del neuropéptido. Los resultados
mostraron un claro efecto sobre la liberación de LH (Fig. 33) utilizando
antisuero contra βLH de Fundulus heteroclitus desarrollado para identificar una
región conservada en los peces acanthopterigios cuya especificidad se ha
caracterizado previamente en C. dimerus (Pandolfi y col. 2006).
Figura 33 Test control para el uso de GnRH de mamífero. Análisis por western blot
de la βLH liberada de hipófisis en cultivo (d1: día 1, d2: día 2) con concentraciones
crecientes de GnRH de mamifero (0,01-1 µM)
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 71
Análisis por Western blot
Se examinó la presencia de SL en la hipófisis en medios de cultivo de hipófisis
de C. dimerus por western blot utilizando antisuero contra SL de Sparus aurata
(saSL) hecho en conejo como anticuerpo primario. Brevemente, se separaron
las muestras (15 µl) de cada medio de cultivo de hipófisis por electroforesis
utilizando geles de sodio dodecilsulfatopoliacrilamida al 15% (SDS-PAGE). Se
transfirieron las proteínas y los marcadores de peso molecular (SeeBlue Plus2
PreStained Standard, Invitrogen) a una membrana de nitrocelulosa (Amersham
Biosciences, UK) por 75 min a 75 Volts como se ha establecido previamente
para SL de C. dimerus (Canepa y col. 2006). Se lavaron las membranas en
buffer salino Tris con Tween, pH 7,5 (10mM TRIS-HCl, 0.9% NaCl, 0.1%
Tween-20) y se bloquearon los sitios de unión a proteínas inespecíficas
utilizando una solución 3% de leche descremada y 3% de albúmina sérica
bovina a 4ºC toda la noche. Posteriormente, se incubaron las membranas a t.a.
en anti-saSL por 3 horas (dilución: 1:2000; Canepa y col. 2006). Después de
tres lavados en TBST, se incubaron las membranas con anti-rabbit IgG
acoplado a peroxidasa (1:5000) por 45 minutos a t.a. y nuevamente se lavó con
TBST. Se visualizó la reacción sobre la membrana de nitrocelulosa con un
sistema de deteccion de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences) y se
capturó la imagen con un analizador de imágenes Luminescent Image Analyzer
LAS-1000 plus (Fuji Photo Film). En todos los casos, se repitieron las
condiciones para el blotting y el desarrollo de la immunomarca.
Con el objetivo de determinar si este método semicuantitativo fue lo
suficientemente sensible para detectar diferencias significativas, se diluyó
serialmente medio de cultivo de hipófisis (5, 10, 15, 20 µl) y posteriormente se
analizaron por western blot. La liberación de SL se semicuantificó por medio de
un análisis de densitrometria y se normalizó a una proteína solo presente en el
medio de cultivo con el objetivo de evitar posibles errores de carga en el SDS-
PAGE. Esta proteína se visualizó a través de tinción de la membrana de
nitrocelulosa con Rojo Ponceau-S, se digitalizó y semicuantificó. Se cuantificó
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 72
la densidad óptica de ambas bandas de SL, 28 kDa (datos no mostrados), 32
kDa y la de 148 kDa usando el software Image Gauge versión 3.12 (Fuji Photo
Software). Los valores se expresaron en unidades arbitrarias como la media ±
error estándar medio (SEM). La liberación de SL de cada hipófisis se evaluó
como se describe a continuación: medio de cultivo del día 1 (primeras 24 hrs de
incubación) y día 2 (las siguientes 24 hrs) de cada tratamiento se sembraron en
calles adjacentes en un gel SDS-PAGE (Fig. 34). Se consideró al día 1 como
un indicador del estado de liberación basal hormonal de cada glándula y por lo
tanto, la liberación de SL del día 2 se normalizó al del día 1. Esta normalización
permitió independizarse de las variaciones debidas a la heterogeneidad de los
animales en la liberación de cada hipófisis.
Figura 34. Diseño experimental de los ensayos de liberación de SL a partir de
cultivos de hipófisis
Controles de viabilidad de hipófisis en cultivo
Para ambos sexos se realizaron controles de viabilidad del cultivo de hipófisis
como se describe a continuación.
1- Se seleccionaron cultivos al azar después de incubar con medio conteniendo
MCH de salmon o GnRH de mamífero, se removieron los medios e
inmediatamente se agregó medio fresco. Luego de un tercer día de incubación
Dia 1 Dia 2
Medio Medio + estímulo
Remoción del medio y posterior análisis por western blot
Materiales y Métodos – Capitulo III
Página 73
(24hr) se removió el medio nuevamente y se almacenó a -20ºC. Se analizó el
medio del tercer día de incubación para evaluar que la liberación de SL
retornara a los niveles basales observados en los tratamientos control, y que el
efecto de estimulatorio de ambos péptidos no se deba a efectos inespecíficos
de activación.
2- Por otro lado, se examinaron hipófisis correspondientes a los días 1, 2 y 3 de
cultivo por inmunohistoquímica y se colorearon suavemente con hematoxilina
con el objetivo de evaluar la morfología general de la glándula, y en particular
de las células productoras de SL luego del tratamiento con GnRH o MCH.
3- Por último, se removieron 5 hipófisis de C. dimerus adultos y se
homogeneizaron individualmente en 100 µl de buffer Tris-HCl 50mM (pH 7,4).
Se realizó un western blot como se mencionó anteriormente para comparar la
relación de densidad óptica de las bandas obtenidas de contenido de hipófisis y
medio de cultivo, para las bandas inmunoreactivas de 32 kDa y 28 kDa.
Análisis estadístico
Se realizó el analisis estadístico de los datos utilizando el análisis de la
varianza (ANOVA) seguido del test de Tukey. Cuando los datos no reunieron
los supuestos de homogeneidad de varianza, se transformaron los datos
utilizando la función log. Se estableció un nivel de p<0,05 para detectar
diferencias significativas. Por otro lado, se realizó un análisis de regresión lineal
aplicando la transformación log10 (concentración + 1).
Cuando la transformación de los datos no fue posible se utilizó el test de
Kruskal Wallis.
Los datos se presentan como la media ± SEM (error estandard medio).
Resultados – Capítulo III
Página 74
RESULTADOS
Relaciones morfológicas entre MCH, GnRH y SL
La doble inmunofluorescencia mostró una evidente asociación morfológica
entre las células productoras de SL y las fibras inmunoreactivas a MCH y
GnRH (Fig. 35a-36a). Se encontró una alta densidad de fibras ir-MCH a niveles
de la PI. En particular, la marcación de MCH en esta región mostró la mayor
inmunoreactividad en la proximidad de las células ir-SL (Fig. 35b). Por el
contrario, se encontraron fibras ir-GnRH mayormente en la región dorsal de la
pars intermedia, y solo una menor cantidad de ellas alcanzó la región ventral
(Fig 36a). Comparado con las fibras ir-MCH, un menor número de fibras ir-
GnRH alcanzó las células productoras de SL de la región ventral de la hipófisis,
aunque también se observó una asociación morfológica de fibras GnRH con
células ir-SL en esta región (Fig. 36b).
Figura 35. Asociación morfológica de SL-MCH observada por doble
inmunofluorescencia en secciones transversales de cebrebro de C. dimerus a nivel
de la hipófisis (ADH adenohipófisis, NH neurohipófisis). A) Microfotografia confocal
de una doble inmunofluorescencia de MCH (rojo) y SL (verde) mostrando fibras
MCH en estrecha asociación con células SL a nivel de la pars intermedia. B)
Magnificación en donde se observa con mayor detalle la asociación entre las fibras
de MCH (rojo) y las células de SL (verde).
Resultados – Capítulo III
Página 75
Figura 36. Asociación morfológica de SL-GnRH observada por doble
inmunofluorescencia en secciones transversales de cerebro de C. dimerus a nivel
de la hipófisis (ADH adenohipófisis, NH neurohipófisis). A) Microfotografía confocal
de una doble inmunofluorescencia de GnRH (rojo) y SL (verde) mostrando
asociación morfológica en la región ventral (punta de flecha) pero principalmente
en la región dorsal (flechas) de la pars intermedia. D) Detalle de la asociación
morfológica de SL con las fibras GnRH (flecha).
Dado que se observaron diferencias en la distribución de fibras de GnRH y
MCH, se llevó a cabo doble inmunofluorescencia para GnRH y MCH con el
objetivo de comparar dicha distribución en la pars intermedia. Se observó que
MCH se localiza principalmente en la región ventral de la neurohipófisis,
mientras que las fibras de GnRH predominaron en la dorsal (Fig 37a). Se
encontró además una asociación morfológica entre las fibras de MCH y las de
GnRH a lo largo del hipotálamo. Por otro lado, las neuronas magnocelulares de
MCH del nucleus lateralis tuberis se encuentran profundamente inervadas por
fibras de GnRH (Fig 37 bc)
Resultados – Capítulo III
Página 76
Figura 37: Asociación morfológica GnRH-MCH observada por doble
inmunofluorescencia en secciones transversales de cebrebro de C. dimerus a nivel
de la hipófisis (ADH adenohipófisis, NH neurohipófisis, V ventrículo). a)
Microfotografía confocal de una doble inmunofluorescencia de MCH (verde) y
GnRH (Rojo) comparando la distribución de ambos péptidos en la hipófisis y el
hipotalalamo (HPT). Las fibras MCH se localizan en toda la pars intermedia, sin
embargo la inmunofluorescencia más intensa se observa en la región ventral. Las
fibras GnRH se localizan principalmente en la región dorsal, y como se describió
anteriormente, unas pocas fibras se localizan en la region ventral (punta de
flecha). En el hipotálamo, se puede observar una asociación entre MCH y GnRH
(flechas). Se demarcó el contorno de la hipófisis para facilitar la observación de la
morfología. b) Detalle del area delimitada por un recuadro en “a” del NLT en el cual
se observan neuronas magnocelulares de MCH (verde) en estrecha asociación
morfológica con fibras GnRH (rojo) (flechas). C) Microfotografía fluorescente
mostrando neuronas MCH magnocelulares (verde) en contacto con fibras GnRH
(rojo).
Resultados – Capítulo III
Página 77
Relación funcional entre GnRH, MCH y SL
Los análisis de inmunoblots mostraron que hipófisis incubadas con 100 µl de
medio mínimo esencial por el transcurso de 1 día (24h), liberaron SL a niveles
detectables por western blot. Estos ensayos también mostraron que las
hipófisis de C. dimerus liberaron 2 formas ir-SL con pesos moleculares de 32 y
28 kDa. Estos pesos moleculares de las bandas ir-SL de los medios de cultivo
se corresponden a aquellos obtenidos de homogenatos de hipófisis que fueran
previamente descriptos para C. dimerus (Canepa y col. 2006). Más aún,
cuando se analizó la relación entre la densidad óptica de las bandas de 32 y 28
kDa (32 kDa / 28 kDa) de homogenatos de hipófisis y medio de cultivos de
hipófisis se observó que éstas mostraron valores similares. Esto indicó que
ambas formas de SL (32 y 28 kDa) se liberan siguiendo el patrón observado en
el contenido hipofisario (Fig. 38; 1,118 ± 0,036 homogenato vs 1,136 ± 0,055
SL liberada; densidad óptica relativa). Por esta razón, solo se analizó la banda
de 32 kDa para semicuantificar la cantidad de SL liberada en los ensayos de
cultivo de hipófisis (Fig. 38).
Figura 38. Densidad óptica (D.O.) en unidades arbitrarias (u.a.) entre las formas de
32-kDa y 28-kDa de SL. No se observaron diferencias significativas entre la
relación de las dos formas de SL liberada al medio y el contenido.
Resultados – Capítulo III
Página 78
Por otro lado, los análisis por inmunoblot de SL de medios de cultivo
serialmente diluidos demostraron que esta metodología fue lo suficientemente
sensible para detectar diferencias entre los tratamientos (Fig. 39).
Figura 39. Medio de cultivo de hipófisis serialmente diluido de hipófisis individuales
mostrando la confiabilidad del western blot como un método lo suficientemente
sensible para detectar diferencias en la liberación. La imagen superior muestra las
proteínas totales evidenciadas por Ponceau-S mostrando una banda de 148kDa
solo presente en el medio de cultivo, en concentraciones crecientes de medio. El
panel inferior muestra un inmunoblot de SL de diluciones crecientes de medio de
cultivo de hipófisis.
La SL liberada desde la hipófisis de machos aumentó en una forma dosis
dependiente luego de ser incubadas en medio de cultivo conteniendo MCH de
salmón (día 2; regresión lineal, p=0,025; ANOVA, p=0,031; Fig. 40a,b). Sin
embargo, las hipófisis de hembras incubadas con concentraciones crecientes
de MCH de salmón no mostraron diferencias significativas en la liberación de
SL entre tratamientos (Fig 40c). Los valores de densidad óptica fueron: control,
0,678±0,108; 0,1 µM, 0,859±0,010; 1,0 µM, 0,881±0,087; 10,0 µM,
1,398±0,238. Hembras: control, 0,831±0,063; 0,1 µM, 0,870±0,047; 1,0 µM,
0,849±0,016; 10,0 µM, 0,964±0,192.
Resultados – Capítulo III
Página 79
Figura 40 a) Inmunoblot representativo de SL liberada al medio de cultivo a partir de hipófisis
de machos de C. dimerus. d1 indica la liberación luego de 24hs en medio de cultivo y d2 la
liberación luego de 24hs con estímulo (concentraciones crecientes de MCH de salmón excepto
en el control). b, c) SL liberada de hipófisis de machos y hembras de C. dimerus
respectivamente después de un tratamiento con concentraciones crecientes de MCH de
salmon (0,1–10 µM). Los valores se expresan en unidades arbitrarias (u.a.) como la media ±
ESM de la densidad óptica de la SL liberada en el día 2 respecto de la liberada en el día 1
(DOR: densidad óptica relativa). Se observó un efecto estimulatorio de MCH sobre la liberación
de SL en las hipófisis de machos pero no en las hembras. El análisis de regresion lineal indicó
diferencias significativas en los ensayos de machos (p<0,05, las letras diferentes indican
diferencias significativas). n=5 por tratamiento.
Resultados – Capítulo III
Página 80
Por otro lado, la incubación con GnRH de mamíferos mostró resultados
similares a los obtenidos en el ensayo con MCH de salmón; la SL liberada de
hipófisis de C. dimerus machos aumento significativamente en una forma dosis
dependiente (p=0.046; ANOVA, p=0.021; Fig. 41 ab). Aunque las hipófisis de
hembras no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos, se
observó un aumento en relación con la concentración del estímulo (Fig 41c).
Los valores de la densidad óptica relativa (DOR) de los machos fueron: control,
0,648±0,109; 0,1 µM, 0,972±0,112; 1,0 µM, 1,403±0,249; 10,0 µM,
1,761±0,509). Los valores de las hembras fueron: control, 0,921± 0,059; 0,1
µM, 1,212±0,106; 1,0 µM, 1,238±0,514; 10,0 µM, 1,430±0,440.
Resultados – Capítulo III
Página 81
Figura 41 a) Inmunoblot representativo de SL liberada al medio de cultivo a partir de hipófisis
de machos de C. dimerus. d1 indica la liberación luego de 24hs con medio de cultivo y d2 la
liberación luego de 24hs con estímulo (concentraciones crecientes de MCH de salmón excepto
en el control). b, c) Análisis de la SL liberada de hipófisis de machos y hembras de C. dimerus
respectivamente después de un tratamiento con concentraciones crecientes de GnRH de
mamíferos (0,1–10 µM). Los valores se expresan en u.a. como la media ± ESM de la densidad
óptica de la SL liberada en el día 2 respecto de la liberada en el día 1 (DOR: densidad óptica
relativa). La SL liberada a partir de hipófisis de machos (b) aumentó de manera concentración
dependiente (regresión lineal p<0,05). La SL liberada a partir de hipófisis de hembras (c) no
mostró diferencias significativas aunque se observa una tendencia de concentración
dependiencia. Las letras diferentes indican diferencias significativas. n=5 por tratamiento.
Resultados – Capítulo III
Página 82
La IHQ de las hipófisis usadas en los ensayos in vitro mostraron una
citoarquitectura normal de las células ir-SL confirmando la viabilidad de la
glándula (Fig 42a). Después de 3 días de cultivo in vitro, la cantidad de SL
liberada de las hipófisis retornó a niveles basales similares a aquellos
observados en los tratamientos control (Fig 42b) aún después de incubar con
GnRH de mamífero o MCH de salmón. Estos resultados validan al cultivo de
hípofisis como un sistema óptimo para este tipo de ensayos ya que se observó
que las hipófisis no pierden su capacidad de responder.
Figura 42 Cultivos de tres días de hipófisis. a) Inmunohistoquimica representativa mostrando la
citoarquitectura normal de las células ir-SL (NH neurohipofisis, ADH adenohipofisis). Barra 10
µm. b) Western blot representativo de SL demostrando que las hipófisis retornan al los niveles
basales de liberación después de tratamientos con 10µM de MCH
Discusión – Capítulo III
Página 83
DISCUSIÓN
Regulación de la liberación de SL
Los resultados obtenidos en el presente capítulo de esta Tesis sugieren la
existencia de una relación morfológico-funcional entre las células productoras
de SL de la hipófisis y las neuronas MCH y GnRH del hipotálamo. Esta relación
se confirmó a través de dos técnicas diferentes, doble inmunofluorescencia y
ensayos de cultivo in vitro de hipófisis intactas.
Como se reportó previamente para hipófisis de C. dimerus, las fibras MCH
están distribuidas a través de toda la neurohipófisis y están confinadas a ella,
principalmente a nivel de la pars intermedia (Pandolfi y col. 2003). Las células
de somatolactina se localizan en las pars intermedia rodeando estrechamente
la neurohipófisis (Pandolfi y col. 2001a). En la presente Tesis, se demostró que
las células ir-SL están en contacto con fibras MCH provenientes de las
neuronas magnocelulares del núcleo laterales tuberis (NLT). Particularmente
en C. dimerus, las neuronas ir-MCH del NLT, las neuronas ir-MCH del núcleo
del receso lateral (Cánepa, sin publicar) y las células ir-MSH hipofisarias han
sido relacionadas con la adaptación a la coloración del entorno junto con las
células ir-SL (Cánepa y col. 2006). Mientras que los animales adaptados a un
entorno negro presentan una mayor área inmunomarcada y un mayor número
de células productoras de SL, mientras que los animales adaptados a un
entorno blanco presentan una mayor actividad en las neuronas MCH
evidenciada por una mayor área nuclear. A su vez se ha sugerido que MCH
cumpliría un papel regulatorio sobre las hormonas hipofisarias (Baker y Bird
2002). Esta hipótesis se ve sustentada por el hecho que en el lenguado
(Verasper moseri) y en goldfish se han identificado receptores para MCH en la
hipófisis (Takahashi y col. 2007, Mizusawa y col. 2009). Aunque el clonado del
receptor de MCH y la consecuente distribución en los órganos no se ha llevado
a cabo aún en C. dimerus, la estrecha asociación morfológica observaba por
microscopía confocal entre las células de SL y las fibras MCH sugiere que ellas
podrían interactuar a través de receptores específicos localizados en los
Discusión – Capítulo III
Página 84
somatolactotropos. En la presente Tesis, también se encontró una asociación
estrecha entre células ir-SL y fibras ir-GnRH por doble immunofluorescencia. A
nivel de la pars intermedia, las fibras GnRH se localizan principalmente en la
region dorsal de la neurohipófisis, donde también se han visualizado células ir-
SL, y en la misma región en la cual las células immunoreactivas para la
hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH) han sido
previamente localizadas en C. dimerus. (Pandolfi y col. 2006). En esta región,
las células ir-SL se marcan más débilmente con respecto a aquellas que se
localizan en la región ventral. Sin embargo, se han observado fibras GnRH en
contacto con células productoras de SL en la región ventral de la
neurohipófisis, donde también ha sido observada una estrecha asociación entre
SL y MCH. Esta asociación morfológica se encuentra en concordancia con
estudios previos llevados a cabo en otras especies de teleósteos que
reportaron la localización del receptor para GnRH y las células ir SL. En el
pejerrey, Odontesthes bonariensis, se han encontrado sitios de unión para
GnRH en las células de expresan SL (Stefano y col. 1999); asímismo en esa
misma especie se encontró una estrecha asociación morfológica entre las
fibras GnRH y las células que expresan SL (Vissio y col. 1999). En tilapia,
Oreochromis niloticus, un pez cíclido al igual que C. dimerus, se localizó el
receptor de GnRH y en células ir-SL (Parhar y col. 2005). La existencia de una
asociación estrecha entre fibras ir-GnRH y células ir-SL en C. dimerus sugiere
que las células de SL también son reguladas por GnRH en esta especie.
Es sabido que una asociación morfológica no necesariamente implica una
relación funciónal. Con el objetivo de analizar una posible función tanto de
MCH como de GnRH, se llevaron a cabo experimentos de cultivo de hipófisis
estimuladas con estos péptidos. Como resultados de estos experimentos se
encontró que MCH de salmón, la cual tiene igual secuencia aa. que la
secuencia deducida de MCH de C. dimerus (número de acceso de genbank:
GQ253057), estimuló la liberación de SL de hipófisis de machos de C. dimerus
en una relación dosis dependiente, y tales efectos no se observaron en las
hembras. El hecho que MCH estimulara la liberación de SL podría resultar en
un principio opuesto a lo esperado, ya que MCH se encuentra aumentada en
Discusión – Capítulo III
Página 85
los animales mantenidos en acuarios blancos, contrario a lo que sucede con
SL. Uno esperaría que al estimular con MCH se inhiba la liberación de SL (si
esta tiene acción sobre la dinámica pigmentaria o algún evento asociado a
ello). Sin embargo en estos procesos participan numerosos factores por lo que
los resultados obtenidos en un cultivo solo indicarían la participación de un
factor en la regulación de dicho proceso. A su vez, debido a que se utilizaron
hipófisis intactas se eligió una concentració máxima de 10µM de MCH para
asegurar que ésta alcance las células localizadas en la porción más interna de
la hipófisis. En un trabajo previo de Kakizawa y col. (1997) MCH a una
concentración de 0,1 µM, estimuló la liberación de SL de cultivos in vitro de
hipófisis de Oncorhynchus mykiss sin observar una dosis dependencia. Más
aún, en O. mykiss, MCH a una concentración final de 1 µM estimulo la
liberación de SL de cultivos in vitro de hipófisis (Balm y Gröneveld 1998). En
estos dos estudios mencionados, los niveles de SL se cuantificaron por
radioinmunoensayo, una metodología más sensible que la utilizada en la
presente Tesis, pero ambos trabajos mostraron resultados dados por el uso de
una sola concentración de MCH. Las concentraciones usadas en el presente
trabajo podrían representar la encontrada en la vecindad de las terminales
MCH y las células SL. Por otro lado, se asume que la concentración de 10µM
de MCH de salmón no estimuló la liberación de SL inespecíficamente, ya que
no se observó un efecto en las hembras usando las mismas concentraciones.
Las células SL se localizan en la pars intermedia junto con las células
hipofisarias ir-MSH. Ambas hormonas estarían involucradas en la adaptación a
la coloración del entorno en C. dimerus. Los machos de C. dimerus exhiben un
patrón de coloración particular en las situaciones de cortejo, comportamiento
territorial y de dominancia previo al establecimiento de la pareja; en hembras,
esta coloración no es tan evidente. Esto podría explicar las diferentes
respuestas de machos y hembras. En tilapia, Oreochromis mossambicus, MCH
afecta la liberación de MSH desde la hipófisis mostrando una respuesta
bifásica por lo que la incubación con MCH desde 10nM a 1µM resulta en una
inhibición dosis dependiente, mientras que las concentraciones finales de 1 µM
y 35µM aumentan la liberación de MSH (Gröneveld y col. 1995). Si bien el
Discusión – Capítulo III
Página 86
ensayo de cultivo in vitro ha mostrado resultados contundentes acerca del
efecto de MCH sobre la liberación de SL no se puede descartar un efecto
parácrino. Se requieren estudios complementarios con el objetivo de
determinar la presencia del receptor de MCH en células productoras de SL.
Por otra parte, cuando se evaluó el efecto de GnRH de mamífero sobre la
liberación de SL por el ensayo de cultivo in vitro se demostró que GnRH afecta
la liberación de SL en machos de C. dimerus. En este ensayo se utilizó GnRH
de mamíferos que pertenece al grupo tipo 1 de GnRH al igual que GnRH de
salmón. Si bien no se utilizó la variante salmón de GnRH, en trabajos previos
se demostró que cualquier tipo de variante es capaz de evocar una respuesta
sobre los diferentes tipos de receptores (Kah y col. 2007) y el objetivo último en
este punto era evaluar la respuesta de las células de SL ante un estímulo de
GnRH. En la presente Tesis, las hipófisis de machos de C. dimerus incubadas
con GnRH de mamífero dio como respuesta una dosis dependencia y una
tendencia de dosis dependencia en las hembras. Como se mencionó
anteriormente para MCH, se utilizó una concentración máxima de 10 µM de
GnRH de mamífero para asegurar que esta alcance las células localizadas en
la región interna de la glándula. Los resultados obtenidos estuvieron de
acuerdo con aquellos observados en la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss,
donde se realizaron ensayos similares utilizandose GnRH a concentraciones de
10, 100, y 1000 nM. En dichos ensayos se observó que GnRH estimuló la
liberación de SL en una forma dosis dependiente (Kakizawa y col. 1997). En el
salmón sockeye, Oncorhynchis nerka, se implantó una cápsula de GnRH en la
musculatura dorsal de animales sexualmente maduros causando un aumento
en el ARN mensajero de SL (Taniyama y col. 2000). Los resultados obtenidos
en esta Tesis demostraron claramente que GnRH de mamífero estimula la
liberación de SL, validando de esta manera el resultado dado por marcación
por doble inmunofluorescencia. Estos resultados sentarán la base para futuros
experimentos que analizarán la expresión de SL ante un estímulo de GnRH o
MCH.
La distribución de las fibras ir-GnRH ha sido bien descripta en C. dimerus. Las
fibras de GnRH de salmón y la mayoría de las fibras seabream inervan la
Discusión – Capítulo III
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hipofisis a nivel de la pars intermedia junto con las fibras MCH (Pandolfi y col.
2003, 2005). Se comparó la distribución de las fibras GnRH y las de MCH a
nivel de la pars intermedia. Por medio de doble marcación inmunofluorescente
se observó que en la región ventral de la pars intermedia, las fibras ir-MCH
exhibieron una inmunoreactividad mucho más intensa y más numerosa que la
observada para las fibras ir-GnRH. Se observó una estrecha asociación
morfológica entre fibras ir-GnRH y tanto somas como fibras ir-MCH en el
núcleo lateralis tuberis por doble marcación inmunofluorescente. Este hallazgo
es consistente con los resultados obtenidos en el lenguado Verasper moseri
donde se observan fibras ir- GnRH en estrecho contacto con los cuerpos
celulares ir-MCH en el núcleo lateralis tuberis del hipotálamo (Amiya y col.
2008). En el lenguado, los niveles ir-GnRH de la variante chicken II en peces
adaptados a acuario negros son mayores que en aquellos adaptados a
acuarios blancos (Amiya et al 2008). Los resultados de Amiya y col. junto con
los resultados previamente descriptos en C. dimerus de los niveles de MCH
relacionados a la adaptación a la coloración del entorno (Canepa y col. 2006) y
la doble inmunomarcación fluorescente obtenida en la presente Tesis sugieren
que MCH y GnRH interactúan en el cerebro posiblemente vinculando la
fisiología reproductiva con la regulación de la coloración del animal.
Conclusiones finales
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CONCLUSIONES FINALES
En el primer capítulo de esta Tesis se realizó la caracterización de la hormona
SL y del receptor putativo de la misma (RGH1). Se presentan en las figuras 12
y 14 la secuencia de SL de C. dimerus del RGH1 respectivamente y se las
compara con otras publicadas (tabla 3 y 4, figuras 13 y 15).
Luego se plantearon 2 hipótesis:
Hipótesis 1: “La expresión de SL se modifica en relación con la coloración
del entorno. El receptor putativo de SL (RGH1) se expresa en el
tegumento y su expresión será depe ndiente de las condiciones de
coloración del entorno”.
En el capítulo 2 se resumen los resultados que permiten darle validez a esta
hipótesis. En las figuras 19 y 20 se muestra el aumento en los niveles de
ARNm de SL en animales mantenidos en un entorno negro comparado con
aquellos mantenidos en un entorno blanco. En la figura 21 se muestra la
presencia del ARNm del RGH1 en la piel y, en las figuras 23 y 24, se observa
un aumento del mismo en animales mantenidos en entorno negro.
Hipótesis 2: “MCH y GnRH están morfológ ica y funcionalmente
relacionados con las células productoras de SL”
Esta hipótesis se valida por los resultados obtenidos que se resumen en las
figuras 35 y 36 en las cuales se observa la relación morfológica entre las
células de SL y las fibras de GnRH y MCH. En las figuras 40 y 41 se muestra
que MCH y GnRH estimulan la liberación de SL de explantes de hipófisis de
peces machos.
Los resultados presentados en esta Tesis dan sustento a la hipótesis general
planteada:
“En Cichlasoma dimerus SL está involucrada en la adaptación
a variaciones experimentales de la coloración del entorno”
Conclusiones finales
Página 89
Por último se conluye que SL formaría parte de un sistema multifactorial de
regulación de la coloración corporal en C. dimerus. Esta conclusión está
sustentada por: (1) la cantidad de ARNm de SL está fuertemente
correlacionado con la coloración del entorno, al igual que el contenido proteico
de SL previamente observado en C. dimerus (Canepa y col 2006); (2) la
hormona tiene receptores en la piel, lo que indica, una posible regulación
directa de la misma en la coloración del tegumento. La expresión del ARNm del
RGH1 es dependiente de la coloración del entorno (3) En la regulación de la
liberación de SL participarían los neuropéptidos GnRH y MCH. Por lo tanto se
sugiere que estos neuropéptidos estarían involucrados en los cambios de la
coloración corporal que se manifiestan según la jerarquía social y el estado
reproductivo. Finalmente, en esta Tesis doctoral se sentaron las bases para
elucidar la función de SL, como así también para el estudio del control
neuroendócrino de su liberación.
Se requieren de estudios complementarios que permitan resolver diferentes
interrogantes, a saber:
- Aislar melanóforos de la piel y corroborar la presencia del RGH1 en los
mismos.
- Determinar si SL está involucrada en el oscurecimiento de la piel
actuando sobre la proliferación de los melanóforos y/o sobre la
dispersión de los mismos.
- Determinar la presencia de receptores a MCH y GnRH en células de SL
y, de estar presentes, que variantes se expresan.
Conclusiones finales
Página 90
- Determinar el papel de otros factores hipotalámicos posiblemente
asociados a cambios de coloración corporal en peces, tales como CRF,
αMSH y dopamina.
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