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VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE

FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JULIO DE 2007

2




TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al titulo de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JULIO DE 2007

3

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el

anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

4




APROBADO

______________________________ ____________________________

Viviana Peña Paez, Cindy Fernández, Microbióloga Industrial Microbióloga Industrial

DIRECTOR ASESOR ______________________________ ____________________________

Gineth Fajardo, Jeinny Romero, Microbióloga Industrial Microbióloga Industrial

JURADO JURADO

5




APROBADO

______________________________ ______________________________ Angela Umaña Muñoz. M. Phil. David Gómez Mendez M. Sc. DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA

6

A Dios y

A mis padres por su apoyo y amor incondicional.

7

AGRADECIMIENTOS

A Viviana Peña, directora del trabajo por su tiempo, colaboración, apoyo y

compromiso durante la ejecución del proyecto, al igual que por su amistad.

A Cindy Fernández por su compromiso, responsabilidad, y aportes realizados para

la elaboración de éste trabajo de grado

A la Doctora Blanca Cecilia Suárez, gerente de AQM Ltda., por el préstamo de las

instalaciones y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo.

A AQM Ltda., especialmente al área de microbiología por su colaboración y apoyo.

viii

TABLA DE CONTENIDO

PÁG1. INTRODUCCIÓN 1

2. MARCO TEORICO 2

2.1. VALIDACIÓN 2

2.1.1. Protocolo de validación 4

2.1.2. TIPOS DE VALIDACIÓN 5

2.1.2.1. Validación prospectiva 5

2.1.2.2. Validación concurrente 5

2.1.2.3. Validación retrospectiva 5

2.1.2.4. Revalidación 6

2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE

METODOLOGIAS

6

2.1.3.1. Precisión 6

2.1.3.2. Especificidad 7

2.1.3.3. Selectividad 7

2.1.3.4. Exactitud 7

2.1.3.5. Límite de detección 7

2.1.3.6. Límite de cuantificación 7

2.1.3.7. Linealidad 8

2.1.3.8. Robustez 8

2.1.4. CALIFICACIÓN 8

2.1.4.1. Tipos de calificación 8

2.1.4.1.1. Calificación de las instalaciones - IQ 8

2.1.4.1.2. Calificación de desempeño - PQ 9

2.1.4.1.3. Calificación operacional - OQ 9

ix

2.2. FILTROS DE MEMBRANA 10

2.2.1. Tipos de filtros de membrana 11

2.2.1.1. Filtros de profundidad 11

2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana 12

2.2.1.2.1. Membrana nitrato de celulosa 13

2.2.1.2.2. Membrana de acetato de celulosa 14

2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD 16

2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO 16

2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato 16

2.3.1.2. Medio de Digerido Caseína-Soja 18

2.3.1.3. Líquidos de dilución y lavado para la filtración por membrana 19

2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD 20

2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo 20

2.3.2.2. Prueba de promoción del crecimiento de organismos aerobios,

anaerobios y hongos

20

2.3.3. MÉTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD 22

2.3.3.1. Filtración por membrana 22

2.3.3.2. Inoculación directa 24

2.3.4. Interpretación de resultados 25

2.3.5. Condiciones del área estéril de trabajo 28

2.4. ESPECTROFOTOMETRÍA 31

2.4.1. Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción: Ley de Beer-

Bouguer-Lambert

31

2.4.2. Tratamientos de los datos espectrofotométricos 32

2.4.2.1. Curvas espectrales 32

2.4.2.2. Curvas de calibrado 32

3. JUSTIFICACIÓN 33

x

4. OBJETIVOS 35

4.1. Objetivo general 35

4.2. Objetivos específicos 35

5. MATERIALES Y MÉTODOS 36

5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN 36

5.1.1. Población de estudio y muestra 36

5.1.2. Materiales utilizados durante la validación 37

5.1.2.1. Pruebas preliminares 37

5.1.2.1.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 37

5.1.2.1.2. Prueba de promoción de crecimiento 38

5.1.2.2. Técnica de filtración por membrana 38

5.1.2.2.1. Controles para el proceso 38

5.1.2.2.2. Control negativo 38

5.1.2.2.3. Filtración por membrana 39

5.2. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN 40

5.2.1. Recopilación de la información 40

5.2.2. Calibración y mantenimiento de los equipos 41

5.3. Pruebas preliminares 41

5.3.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 42

5.3.2. Prueba de promoción de crecimiento 42

5.4. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA UTILIZADA EN LA

PRUEBA DE ESTERILIDAD

45

6. RESULTADOS 50

6.1. Calibración y mantenimiento de equipos 50

6.2. Pruebas preliminares 51

6.2.1. Prueba organoléptica 51

6.2.2. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 52

6.2.3. Prueba de promoción de crecimiento 52

6.2.3.1. Método turbidimétrico 56

6.3. Técnica de filtración por membrana utilizada en la prueba de esterilidad 80

xi

6.3.1. Controles para el proceso 80

6.3.1.1. Control ambiental y de personal 80

6.3.1.2. Control negativo de la prueba 81

6.3.2. Técnica de filtración por membrana 81

6.3.3. Líquido filtrado 84

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 87

8. CONCLUSIONES 94

9. RECOMENDACIONES 96

10. BIBLIOGRAFÍA 97

11. ANEXOS 101

xii

LISTA DE TABLAS

PÁG

Tabla Nº 1. Composición del medio Fluido de Tioglicolato 17

Tabla Nº 2. Composición del medio de Digerido Caseína-Soja 18

Tabla Nº 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la

prueba de promoción de crecimiento

20

Tabla Nº 4. Comparación de los sistemas abierto y cerrado para técnica de

filtración por membrana

23

Tabla Nº 5. Clasificación de ambientes controlados para la industria

farmacéutica 30

Tabla Nº 6. Límites microbiológicos para el área aséptica manejados por

AQM Ltda. 30

Tabla Nº 7. Límites microbiológicos para el control de personal. 30

Tabla Nº 8. Programa de calibración y mantenimiento de los equipos

utilizados en la validación 50

Tabla Nº 9. Análisis organoléptico de los medios de cultivo 51

Tabla Nº 10. Resultados de la Prueba de esterilidad de los medios de

cultivo líquidos 52

Tabla Nº 11. Recuentos obtenidos en la Prueba de promoción de

crecimiento 52

Tabla 12. Resultados obtenidos en la Prueba de promoción de crecimiento

para medios de cultivo líquidos en los tres ensayos realizados 55

Tabla Nº 13. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium

sporogenes en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante

espectrofotometría

56

Tabla Nº 14. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium

sporogenes en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante

espectrofotometría

58

Tabla Nº 15. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus

aureus en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante

espectrofotometría

60

xiii

Tabla Nº 16. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus

aureus en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante

espectrofotometría

62

Tabla Nº 17. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas

aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante

espectrofotometría

64

Tabla Nº 18. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas

aeruginosa en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante

espectrofotometría

66

Tabla Nº 19. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en

medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría 68

Tabla Nº 20. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en

medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría 70

Tabla Nº 21. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans

en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría 72

Tabla Nº 22. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans

en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría 74

Tabla Nº 23. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en

medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría 76

Tabla Nº 24. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en

medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría

78

Tabla Nº 25. Resultados del control ambiental durante la prueba de

esterilidad 80

Tabla Nº 26. Resultados del control de personal durante la prueba de

esterilidad 80

Tabla Nº 27. Resultados obtenidos para el control negativo de la técnica de

filtración de membrana durante los 5 montajes realizados.

81

Tabla Nº 28. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana

durante el Montaje 1, abril 14 de 2007 81



xiv




durante el Montaje 4, mayo 12 de 2007

83


durante el Montaje 5, mayo 19 de 2007 84

Tabla Nº 33. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del

líquido filtrado del montaje 1 84





xv

LISTA DE FIGURAS

PÁG

Figura Nº 1. Filtro de profundidad 12

Figura Nº 2. Filtro de superficie o de membrana 12

Figura Nº 3. Filtros de nitrato de celulosa 13

Figura Nº 4. Filtro de acetato de celulosa 15

Figura Nº 5. Medio Fluido de Tioglicolato 17

Figura Nº 6. Medio Digerido Caseína-Soja 18

Figura Nº 7. Equipo de filtración 23

Figura Nº 8. Interpretación del ensayo de esterilidad. 27

Figura Nº 9. Validación de procedimientos. 40

Figura Nº 10. Pruebas preliminares 41

Figura Nº 11. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 42

Figura Nº 12. Diagrama de las diluciones empleadas en la prueba de

promoción de crecimiento.

43

Figura Nº 13. Prueba de promoción de crecimiento. 45

Figura Nº 14. Controles para el proceso en la técnica de filtración por

membrana.

48

Figura Nº 15. Control negativo de la técnica de filtración por membrana. 48

Figura Nº 16. Técnica de Filtración por membrana. 49

Figura Nº 17. Bacillus subtilis en agar Casoy 53

Figura Nº 18. Clostridium sporogenes en agar Casoy 53

Figura Nº 19. Staphylococcus aureus en agar Casoy 54

Figura Nº 20. Pseudomas aeruginosa en agar Casoy 54

Figura Nº 21. Candida albicans en agar HC 54

Figura Nº 22. Aspergillus niger en agar HC 55

Figura Nº 23. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio

Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de

crecimiento

57

Figura Nº 24. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio

Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de

crecimiento

59

xvi

Figura Nº 25. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio


crecimiento

61

Figura Nº 26. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio


crecimiento

63

Figura Nº 27. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio


crecimiento

65

Figura. Nº 28. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio


crecimiento

67

Figura Nº 29. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Fluido de

Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento 69

Figura Nº 30. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Digerido

Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento 71

Figura Nº 31. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Fluido de

Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento 73

Figura Nº 32. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Digerido


Figura Nº 33. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Fluido de

Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento

77

Figura Nº 34. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Digerido


xvii

RESUMEN

La validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa

en la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad tuvo como

propósito la eficacia de los filtros de membrana para optimizar esta técnica en el

laboratorio de Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., siguiendo los

parámetros establecidos por la USP 29 y basándose en la necesidad de realizar un

montaje que garantice resultados confiables y la disminución de los riesgos de

repetición que aumentan el tiempo de análisis y los costos.

Al inicio de la validación se verificó la calibración y mantenimiento de los equipos

para así garantizar los procedimientos realizados y los resultados obtenidos.

Luego se realizaron las pruebas preliminares en las cuales se evaluó la calidad de

los medios de cultivo Fluido de tioglicolato, Digerido caseína-soja, agar Casoy y

agar HC. Se verificó en los medios de cultivo líquidos que contienen los nutrientes

necesarios para el crecimiento de los microorganismos mediante la prueba de

promoción de crecimiento inoculados con cepas ATCC de Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Bacillus

subtilis y Aspergillus niger; estos resultados se complementarón por

espectrofotometría determinando para cada microorganismo su curva de

crecimiento en un tiempo de 100 horas.

Después de obtener resultados satisfactorios en las pruebas preliminares que

indican la ausencia de resultados falsos negativos o positivos, se realizó la

metodología de filtración por membrana en la cual se determinó la retención de los

microorganismos contaminantes en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un

tamaño de poro de 0,45 µm.

Con los resultados obtenidos se ajustó el procedimiento de la prueba de esterilidad

mediante la técnica de filtración por membrana para el laboratorio AQM Ltda., como

fundamento para obtener resultados confiables, oportunos y con calidad que logren

la satisfacción del cliente.

xviii

ABSTRACT

The validation of the microbial retention in the cellulose acetate filters and cellulose

nitrate filters in the filtration technique used in sterility testing had the purpose to

verified the effectiveness of membrane filters to optimize this technique in the

laboratory Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., following the established

parameters by the USP 29 and based on the necessity to do a test with guarantee of

reliable results, and the diminution of repetition risk which increases the analysis

time and the cost.

At the beginning of the validation the machine calibration and maintenance was

verified to guarantee the process and results.

Later the preliminaries tests was done to evaluate the quality of media, Fluid

Thioglycolate medium, Soybean-casein digest medium, Casoy agar and HC agar.

For the liquid media it was observed they had the necessary nutrients for the growth

of microorganism by the growth promotion test inoculating microorganisms ATCC of

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes,

Candida albicans, Bacillus subtilis y Aspergillus niger. Furthermore this test

complemented by spectrofotometric method determining for each microorganism its

growth curve in a time of 100 hours.

After obtaining satisfactory results in the preliminary test that indicated the lack of

false negative or false positive results, the membrane filtration methodology was

done which determined the satisfactory retention of microorganism in cellulose

nitrate filters and cellulose acetate filters with a pore size of 0,45 µm.

With the results was fitted the process of sterility testing by membrane for the

laboratory AQM Ltda., like fundament to obtain reliable results with quality to obtain

the client satisfaction.

1

1. INTRODUCCIÓN

El control de calidad de productos farmacéuticos garantiza la seguridad y eficacia de

cada uno, certificando que estos cumplen con los parámetros y normas reguladas

por organizaciones nacionales e internacionales. Estas especificaciones constituyen

un elemento importante para asegurar la calidad de los productos y sirven de base

para el análisis de éstos en el laboratorio.

Este control de calidad se debe realizar desde el inicio, durante y al final de la

elaboración del producto para asegurar que el proceso se ha realizado bajo estrictas

normas y controles. Al final del proceso de producción se deben realizar pruebas

microbiológicas de acuerdo a la naturaleza y finalidad del producto, dentro de estas

se encuentra la prueba de esterilidad, la cual demuestra la calidad de un producto

referido a la ausencia de contaminantes microbianos, permitiendo su uso para

humanos y animales sin ningún riesgo de infección.

Dada la necesidad de optimizar la técnica para desarrollar la prueba de esterilidad,

obtener resultados confiables, realizar un buen montaje que garantice los

resultados, la disminución de los riesgos de repetición que aumentan el tiempo de

análisis y la reducción de costos, este proyecto que tiene como finalidad validar la

retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en la

técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad, y así asegurar que

la efectividad de la filtración como principal proceso de esta técnica en el laboratorio

de Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., logre obtener resultados

confiables, oportunos y con calidad para la satisfacción del cliente.

2

2. MARCO TEORICO

2.1. VALIDACIÓN

Validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y

permanente productos que reunirán las características de calidad predefinidas.

(CORTES, A. et al. 2003) Mediante el proceso de validación se demuestra que el

método es lo suficientemente fiable para producir el resultado; proporcionando

confianza y seguridad del proceso productivo o del método analítico, así como

también en la calidad de los resultados. (GARCIA, et al. 2005)

La validación de un método analítico es el proceso que establece, mediante

estudios de laboratorio, que las características de desempeño del método cumplen

los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas (USP 29, 2006); teniendo

como objetivo confirmar y documentar que los resultados producidos son confiables.

(CORTES, A. et al. 2003)

El principal objetivo de una validación analítica es asegurar que el procedimiento

analítico seleccionado va a dar resultados reproducibles y confiables que son

adecuados para el propósito deseado. De esta manera es necesario definir

apropiadamente las condiciones en las cuales va a ser realizado el procedimiento y

su objetivo. Estos objetivos aplican a todos los procedimientos descritos o no en una

Farmacopea los cuales son usados en una compañía manufacturera. (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 1997)

Igualmente establece las características de desempeño y las limitaciones de un

método, la identificación de variables que influyen y pueden cambiar estas

características determinado hasta que punto pueden ser cambiadas. (FDA, 2005)

Para llevar a cabo una validación se debe tener clara la metodología analítica, la

cual va de lo general a lo particular, se inicia con la valoración de la técnica, que es

el principio científico que puede ser útil para suministrar información sobre la

composición de una muestra; seguida del método que es la adaptación de la técnica

3

para un propósito específico, que para ser utilizado correctamente debe ir descrito

en un procedimiento y finalmente a partir de la información recopilada se obtiene el

protocolo en donde se suministran una serie de direcciones precisas y definitivas

que deben seguirse si se quiere que los resultados analíticos se acepten, este es la

evidencia objetiva de la validación. (BARRAGÁN y GARCÍA, 2001)

Dentro de un proceso de validación se deben validar:

- Método analítico en el cual se evalúan y analizan parámetros como

sensibilidad, exactitud, linealidad, selectividad, etc.

- Sistema analítico incluye instrumentos, ordenador y método, con este se

concluye que el conjunto funciona como se espera.

- Análisis de la muestra donde se evidencia por medio de la documentación la

comprobación de los datos primarios. (USP 29, 2006)

La importancia de la validación radica en la obtención de métodos estándar los

cuales son parte integral del sistema de calidad de un laboratorio. Los métodos

estándar son usados siempre que sea posible a menos que se especifique su no

uso. (FDA, 2005)

Además tiene ventajas como la optimización y estandarización de los procesos, el

incremento de la productividad, la reducción de costos, la reducción de la

probabilidad de fallas en el proceso y así la reducción de repeticiones y rechazos.

Para realizar validaciones en microbiología es importante:

- Conocer los métodos compatibles con los requerimientos, la compatibilidad

de los métodos es revisada y confirmada por comparación con

requerimientos típicos para realizar la prueba.

- Incluir un medio control sin inocular para evaluar la contaminación a partir del

laboratorio y no de la prueba. Este control es considerado un blanco y no

muestra crecimiento.

4

- Preparar y analizar visualmente controles positivos y negativos. Un control

negativo no presenta crecimiento y el control positivo muestra crecimiento

microbiano.

- Evaluar interferencias. Esto asegura la selectividad y la especificidad del

método.

- Realizar documentación de la validación. (FDA, 2005)

De esta forma después de la validación se demuestra que el laboratorio es capaz de

repetir con un nivel aceptable de ejecución el método estándar. Esto en condiciones

específicas establecidas por el método, además de la demostración de exactitud y

precisión o de otros parámetros dependiendo el tipo de método. (FDA, 2003)

2.1.1. Protocolo de validación

Los protocolos de validación incluyen la definición clara del sistema a validar, la

identificación de las variables operativas y los probables parámetros de control. En

ellos se describe el proceso a validar, los objetivos de la validación, los métodos y el

personal responsable de la validación, además de indicar el número de réplicas que

se consideran adecuadas para la evaluación de un determinado parámetro para que

los resultados sean estadísticamente confiables. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)

Dentro de un protocolo de validación también se encuentra el procedimiento

operativo estándar (POE) del sistema validado, donde se describe el procedimiento

de cómo deben realizarse determinados métodos analíticos, cómo deben manejarse

los instrumentos o realizarse otras actividades de laboratorio cuyo seguimiento

puntual es de obligatorio cumplimiento. (MEDINA y QUINTANA, 2002)

Los laboratorios documentan sus protocolos, las características y medidas de

ejecución y los límites aceptables para la validación de sus métodos. La magnitud

de la validación depende de las limitaciones que se imponen como lo son el tiempo,

el costo, la cantidad de muestras o estándares, el uso posterior del método o el tipo

de información (cuantitativa, cualitativa).

5

De esta forma la buena documentación es una parte esencial del sistema de

garantía de calidad y por lo tanto es importante en un proceso de validación.

2.1.2. TIPOS DE VALIDACIÓN 2.1.2.1. Validación prospectiva

Se basa en la información obtenida antes de implantar el proceso de validación.

Utiliza información generada durante todas las etapas de desarrollo del proceso y se

puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que

proporciona un alto grado de seguridad que un proceso específico producirá

consistentemente una forma farmacéutica que lleva las especificaciones

predeterminadas y los atributos de calidad y que se basa en el análisis de los datos

obtenidos a través del diseño y desarrollo de un protocolo de validación.

(HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)

2.1.2.2. Validación concurrente

La información se obtiene durante la implementación del proceso, se debe tener en

cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas que demuestre que el

proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en

estado productivo. (CORTES, A. et al. 2003)

Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que

proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico producirá


predeterminadas y atributos de calidad y que se sustentan en datos o información

obtenidos a partir de un proceso que se encuentra en marcha o en el cual se haya

introducido alguna variación. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)

2.1.2.3. Validación retrospectiva

Es aquella donde se trabaja con los antecedentes históricos, obtenidos a partir de

registros del proceso y control de calidad. Con esta recopilación de datos históricos

6

se obtiene documentación útil para la determinación de la reproducibilidad de dicho

proceso. Por esto, para la obtención de información no es necesario aplicar ensayos

analíticos o supervisión del proceso en forma explícita. (GONZALES, 2005)

Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que

proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico producirá


predeterminadas, atributos de calidad y que se sustenta en el análisis de datos de

lotes que han sido elaborados con anterioridad. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)

2.1.2.4. Revalidación

Este tipo de estudio se utiliza cuando se ha introducido alguna variable en algún

procedimiento o metodología ya validado anteriormente, por lo que se alteran las

características finales. (GONZALES, 2005)

2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE METODOLOGIAS

No todas las características analíticas son aplicables a todos los procedimientos o a

todos los materiales; depende del objetivo requerido.

2.1.3.1. Precisión

Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando

se aplica el método repetidamente a muestras separadas e idénticas, obtenidas del

mismo lote de material homogéneo. (USP 29, 2006) El parámetro estadístico que

caracteriza a este estudio es la desviación estándar o preferiblemente el coeficiente

de variación (desviación estándar relativa). Este parámetro permite evaluar la

incertidumbre en la estimación de la media, es decir, el error aleatorio que

corresponde con la dispersión de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y

GONZÁLES, 1996)

Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetibilidad del método

analítico en condiciones normales de operación. (USP 29, 2006)

7

Reproducibilidad es la medida de la precisión de los resultados de ensayos

realizados sobre la misma muestra homogénea, pero ejecutados por diferentes

analistas, en días diferentes y con diferentes instrumentos.

Repetibilidad: refleja la precisión de un método, cuando se desarrolla bajo las

mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista,

en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma

sesión de trabajo en un período corto. (CASTILLO Y GONZÁLES, 1996)

2.1.3.2. Especificidad

Es la capacidad de evaluar de manera inequívoca el compuesto de interés en

presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como

impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. (USP 29, 2006)

2.1.3.3. Selectividad

Un método selectivo aporta resultados para todos los analitos de interés, mientras

que uno específico produce resultados exactos para un analito, al tiempo que los

otros analitos de interés se pueden interferir los unos con los otros. (CORTES, A. et

al. 2003)

2.1.3.4. Exactitud

Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos

posibles al valor verdadero. A diferencia de la precisión, que refleja el error aleatorio,

la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. (CASTILLO Y

GONZÁLES, 1996)

2.1.3.5. Límite de detección

Es la cantidad mínima de analito en una muestra que puede detectarse, aunque no

necesariamente detectarse, en las condiciones experimentales indicadas.

2.1.3.6. Límite de cuantificación

Es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se

encuentran en baja concentración en la matriz de una muestra. Es la mínima

8

cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y

exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. (USP 29, 2006)

2.1.3.7. Linealidad

Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente

proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un intervalo definido. Se

determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el

análisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. (CASTILLO Y

GONZÁLES, 1996)

2.1.3.8. Robustez

Es la medida de la capacidad del método para no resultar afectado por pequeñas

pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y proporciona una

indicación de su confiabilidad durante su uso normal. (USP 29, 2006)

2.1.4. CALIFICACIÓN

Consiste en la realización de pruebas que determine si un componente de un

proceso de fabricación posee los atributos requeridos para obtener un producto con

una calidad determinada. (JAIME, 2002)

2.1.4.1. Tipos de calificación 2.1.4.1.1. Calificación de las instalaciones - IQ

Verificación documentada de que todos los aspectos claves de la instalación están

de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y corresponden a las

especificaciones aprobadas en el diseño. (CORTES, A. et al. 2003)

Se incluyen todos los equipos, instrumentos y aparatos que son utilizados en

proceso productivo y en los métodos de análisis. Además es necesario considerar

que éstos se encuentran localizados en instalaciones físicas que deben ser

evaluadas. Otros aspectos son la calibración de equipos y el mantenimiento

preventivo de los equipos.

9

Calibración de equipos: La calibración es la comparación de un estándar de medida

o instrumento de exactitud conocida con otro estándar o instrumento, sirve para

detectar, correlacionar y/o reportar por ajuste cualquier variación en la exactitud del

instrumento que está siendo comparado. (JAIME, 2002)

2.1.4.1.2. Calificación de desempeño - PQ

Demostrar la efectividad y reproducibilidad del proceso, bajo condiciones normales

de operación y bajo condiciones límite de operación. (JAIME, 2002)

2.1.4.1.3. Calificación operacional - OQ

Verificación de que los equipos funcionan en la forma esperada y son capaces de

operar satisfactoriamente los parámetros operacionales para los que han sido

diseñados. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)

10

2.2. FILTROS DE MEMBRANA

Los filtros de membrana son un avance consecuente de los desarrollados por el

premio Nóbel Richard Zsigmondy en 1925. La primera producción comercial en el

mundo se llevó a cabo en Göttingen en 1927, el uso de los filtros de membrana se

conoce desde los años cuarenta, cuando fueron utilizados para el control de agua

potable. (AVENDANO y MOYANO, 1997)

Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cerámica y de

ésteres de celulosa. Las membranas están compuestas por ésteres de celulosa

biológicamente inertes. Los poros varían desde 0.025 µm a 25 µm de diámetro,

siendo los de 0.22 µm los más utilizados ya que son lo suficientemente pequeños

para retener a todas las bacterias. Dado que las membranas son inertes,

proporcionan un buen medio para retener microorganismos, por ejemplo para

cultivar bacterias que se encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen

de líquido.

El mecanismo de acción es bastante simple: retienen todas las partículas que

posean un tamaño mayor que los poros. Estos poros quedan formados por los

espacios que resultan de la superposición de las fibras de las distintas capas que

forman la membrana. Así, algunas partículas de menor tamaño son retenidas por

otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partículas

retenidas previamente. (PEARCE, 2007)

Los filtros de membrana son utilizados para el control microbiológico de diversos

productos, por ello requieren un control de calidad que se obtiene con una excelente

uniformidad de un lote a otro manteniendo una técnica de producción

cuidadosamente elaborada y por controles rígidos como:

a) El examen de la materia prima con cromatógrafo de gas.

b) Control durante el proceso de producción.

c) Control de calidad:

- Comportamiento de autoclavado.

- Punto de burbuja.

d) Control óptico de los rollos de membrana.

11

e) Control microbiológico (Prueba de desafío). (AVENDANO y MOYANO, 1997)

Para realizar la prueba de esterilidad es necesario usar filtros de membrana con un

tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm y un diámetro de aproximadamente

50mm.

Se utilizan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo

contenido alcohólico y filtros de acetato de celulosa para soluciones con alto

contenido alcohólico. (USP 29, 2006)

Los filtros de membrana con este tamaño de poro han sido reconocidos como un

estándar para el crecimiento de microorganismos. Este tamaño de poro es usado

para recuperar bacterias y otros microorganismos de muchas muestras y ambientes.

(MILLPORE, 2000)

2.2.1. Tipos de filtros de membrana

Hay varios tipos de filtros, entre ellos los que más se usan son los filtros de

profundidad y los filtros de superficie o filtros de membrana.

2.2.1.1. Filtros de profundidad Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de

vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean

vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes

presentes.

Entre sus ventajas se encuentran su alta capacidad de retención de partículas sobre

su superficie y a través de toda su estructura y que permiten filtrar grandes

volúmenes. Sin embargo, tienen como desventajas que no presentan un tamaño de

poro uniforme y existe la posibilidad de liberación, hacia el material filtrado, de

partículas y microorganismos que hayan crecido dentro del filtro.

Dadas sus características los filtros de profundidad se usan principalmente como

prefiltros, ya que permiten eliminar las partículas grandes pero no la eliminación total

de los microorganismos.

http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf

12

Figura Nº 1. Filtro de profundidad.

2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana

Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y

contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que al

conocer exactamente el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar

filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una

solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de filtración a través

de ellos es lenta. Para la filtración esterilizante se pueden usar combinaciones de un

filtro de profundidad con un filtro de superficie que tenga un tamaño de poro de

0.22µm. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en

autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo. http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf

Figura Nº 2. Filtro de superficie o de membrana

13

2.2.1.1. Membrana de nitrato de celulosa

La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricación de

filtros de membrana.

Estas membranas son de naturaleza hidrofílica, con una microestructura muy

uniforme lo que permite excelentes niveles de retención de partículas y un

comportamiento perfecto en pruebas microbiológicas. En esos casos pueden ser de

utilidad membranas cuadriculadas con el fondo de color verde o negro, así mediante

contraste, mejorar la visualización y el conteo de colonias.

Otra característica importante de estas membranas es su elevada adsorción. Por

ello, y en combinación con papeles de cromatografía FILTERLAB serie PC están

especialmente indicados en procedimientos de identificación de los componentes en

muestras de ácidos nucleicos y proteínas mediante técnicas de transferencia.

http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf

Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente

retención y un óptimo crecimiento microbiológico en muestras de agua, bebidas,

fármacos. (PEARCE, 2007)

Figura Nº 3. Filtros de nitrato de celulosa Fuente: www.whatman.com

14

Aplicaciones de los filtros de nitrato de celulosa

Filtración de aguas.

Análisis microbiológico.

Análisis gravimétricos.

Análisis cualitativos de partículas.

Esterilización de muestras.

Determinación de proteínas.

Identificación de ácidos nucleicos.

Prefiltración de muestras.

Clarificación de muestras.

2.2.1.2. Membrana de acetato de celulosa

Los filtros de membrana de celulosa son de naturaleza hidrofílica. Presentan una

excelente estabilidad térmica y una bajo nivel de adsorción, por lo que son

especialmente indicados para la esterilización de soluciones biológicas., además

estas membranas permiten gran capacidad de carga y altas velocidades de flujo,

por lo que resultan apropiados para la esterilización y clarificación de soluciones

acuosas, alcohólicas y aceites.

Es un material muy fiable como filtro membrana por su excelente estabilidad

química frente a soluciones acuosas con pH entre 4 y 8, la mayoría de los alcoholes,

hidrocarburos y aceites. El tamaño de poro en la superficie de la mayoría de las

membranas es altamente uniforme, existen de 0.20, 0.45, 0.65 y 0.80µm, en color

blanco, con superficie lisa y no estéril. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf

Las partículas más grandes que el tamaño del poro son rechazadas por la superficie

de la membrana y el remanente permanece o se concentra allí. El volumen del fluido

y otras partículas finas de menor tamaño del poro pueden pasar a través de la

membrana al sitio de filtrado. (PEARCE, 2007)

15

Figura Nº 4. Filtro de acetato de celulosa Fuente: Levy R. y Jornitz M., 2006.

Aplicaciones

Filtración de muestras de aguas.

Esterilización de muestras de proteínas.

Esterilización de fluidos biológicos.

Filtración de alcoholes.

Filtración de aceites.

16

2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD

Se puede definir esterilidad como la total ausencia de toda vida viable. A partir de

1940 la definición de esterilidad aplicada a las industrias farmacéuticas fue

“incapacidad de un producto de generar turbidez al ser adicionado a un medio de

crecimiento estéril.” (ALLISON, 1999)

La prueba de esterilidad es básicamente una prueba en la cual se evalúa si un

producto médico o farmacéutico esterilizado está libre de microorganismos

contaminantes, mediante la incubación de todo o parte del producto con un medio

nutritivo. (HUGO y RUSSEL 1998) En esencia, se añade una muestra del material a

analizar a un medio de cultivo, se incuba y se comprueba la existencia de signos de

crecimiento. Si existe crecimiento, se supondrá que la contaminación procede de la

muestra que, por tanto, no pasará la prueba. (HUGO y RUSSEL, 1998)

El fundamento de la prueba de esterilidad consiste en establecer un procedimiento

para valorar la ausencia/presencia de microorganismos aerobios y anaerobios

viables (bacterias, hongos y levaduras) (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002); en

sustancias, preparaciones y objetos que según la farmacopea deben ser estériles.

Las Farmacopeas y las autoridades reguladoras exigen que el nivel de garantía de

esterilidad para los productos esterilizados acabados sea de 10-6 o superior. Esto

significa que la probabilidad de que un producto seleccionado al azar a partir de un

lote no sea estéril debe ser inferior a 1 en 1 millón. (HUGO y RUSSEL 1998)

2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO

Según la USP 29, 2006 los siguientes medios de cultivo son adecuados para la

prueba de esterilidad.

2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato

Se utiliza principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo

también detecta bacterias aerobias.

17

Tabla Nº 1. Composición del medio Fluido de Tioglicolato

L-cisteina 0.5 g

Cloruro de sodio 2.5 g

Dextrosa 5.5 g

Extracto de levadura (soluble en agua) 5.0 g

Digerido pancreático de Caseína 15.0 g

Tioglicolato de sodio o Ácido tioglicólico 0.3 mL

Rezarsurina sódica 1.0 mL

Agua purificada 1000 mL

Fuente: USP 29, 2006

Después de la esterilización, el pH del medio debe ser de 7,1 +/- 0,2. El Medio

Fluido de Tioglicolato debe incubarse a 32,5 +/- 2,5 º.

Figura Nº 5. Medio Fluido Tioglicolato.

Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003.

Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteina, los cuales proporcionan una

anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. La elevada viscosidad

del medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxígeno. El eventual

aumento del contenido en oxígeno se pone de manifiesto por un viraje a rojo del

indicador redox Resarzurina sódica. (MERCK, 1998)

La dextrosa, peptona, L-cisteina, y el extracto de levadura proveen los factores de

crecimiento necesarios para la replicación de los microorganismos. El cloruro de

sodio da iones esenciales. El tioglicolato de sodio es un agente reductor que

previene la acumulación de peróxidos que son letales para los microorganismos.

18

Después de incubación, el crecimiento es evidente por la presencia de turbidez

comparada al control sin inocular. Los aerobios estrictos tienden a crecer en la

superficie del medio, los anaerobios obligados pueden crecer solamente en la

porción del medio por debajo de la parte oxidada. (ZIMBRO y POWER, 2003)

2.3.1.2. Medio de Digerido Caseína-Soja

Este medio es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias

aerobias. Es un medio de cultivo versátil y altamente nutritivo que se recomienda

para el crecimiento de hongos y levaduras.

Tabla Nº 2. Composición del medio de Digerido Caseína-Soja

Digerido Pancreático de Caseína 17.0 g

Digerido Papaínico de Harina de Soja 3.0 g

Dextrosa 2.5 g

Cloruro de sodio 5.0 g

Fosfato Dibásico de Potasio 2.5 g

Agua purificada 1000 mL


Después de la esterilización, el pH debe ser de 7,3 +/- 0,2. El Medio de Digerido

Caseína-Soja debe incubarse a 22,5 +/- 2,5 º.

Figura Nº 6. Medio Digerido Caseína-Soja

Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003.

19

El digerido pancreático de caseína y el digerido papaínico de harina de soja proveen

aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas. La dextrosa es una fuente de energía.

El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico, y el fosfato dibásico de potasio

actúa como buffer para controlar el pH. (ZIMBRO y POWER, 2003)

2.3.1.3. Líquidos de dilución y lavado para filtración por membrana

Estas soluciones son empleadas para disolver y acondicionar la muestra a evaluar e

inhibir sustancias bacteriostáticas y fungistáticas que puedan contener la muestra.

(USP 29, 2006)

Los líquidos contienen digerido péptico de tejido animal, que provee una fuente de

nitrógeno para los microorganismos. (ZIMBRO y POWER, 2003)

Liquido A

Contiene digerido péptico de tejido animal en una concentración de 1g/L y un pH de

7,1 +/- 0,2. Se utiliza para sustancias líquidas miscibles en agua. (USP 29, 2006)

Es un diluyente general o solución de lavado utilizado para evaluar antibióticos y

sustancias que contienen preservativos. (MILLPORE, 2005)

Líquido D

Contiene digerido péptico de tejido animal y tween 80 en una concentración de

1ml/L y un pH de 7,1 +/- 0,2 se usa este líquido para artículos que contengan

lecitina o aceite. (USP 29, 2006)

Los líquidos A y D ayudan en el completo enjuague de los filtros de membrana y no

son tóxicos para los microorganismos. Además el tween 80 actúa como un

surfactante para romper la lecitina o aceites presentes. (ZIMBRO y POWER, 2003)

Líquido K

Contiene digerido péptico de tejido animal, extracto de carne bovina y tween 80, con

un pH de 6,9 +/- 0,2. (USP 29, 2006)

Es generalmente utilizado como solución de lavado cuando se evalúan sustancias

que contienen petrolato. (MILLPORE, 2005)

20

2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD 2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo

Se confirma la esterilidad del medio para cada partida de esterilización, incubando

una porción del medio a la temperatura de incubación especifica, durante 14 días.

No se debe producir crecimiento de ningún organismo. (USP 29, 2006). Estos

medios sirven como controles negativos durante la realización de la prueba de

esterilidad.

2.3.2.2. Prueba de promoción del crecimiento de organismos aerobios, anaerobios y hongos

Se evalúa cada lote de medio preparado o cada lote de medio deshidratado, para

garantizar que el medio de cultivo contiene los nutrientes necesarios para promover

el crecimiento de microorganismos presentes en el producto y para demostrar que

este medio puede sostener el crecimiento de los contaminantes habituales para los

que está diseñado. (HUGO y RUSSEL, 1998)

Para realizar esta prueba se debe inocular cada medio con un número pequeño (no

más de 100 UFC) de los microorganismos viables (ver tabla Nº 6) e incubarlos

durante no más de 3 días en el caso de bacterias y durante no más de 5 días en el

caso de hongos. Los medios son adecuados (prueba satisfactoria) si se produce un

crecimiento claramente visible de los microorganismos. (USP 29, 2006)

Tabla Nº 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la prueba de

promoción de crecimiento. Fuente: USP 29, 2006

Medio de cultivo Microorganismo Cepa Temperatura

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Fluido de

Tioglicolato Clostridium sporogenes ATCC19404

32,5 +/- 2,5º C

Candida albicans ATCC 10231

Bacillus subtilis ATCC 6633

Digerido de

Caseína-Soja Aspergillus niger ATCC 16404

22,5 +/- 2,5º C

21

Para realizar la prueba de promoción de crecimiento se puede emplear el patrón de

McFarland, este patrón es utilizado como estándar de turbidez en la preparación de

suspensiones de microorganismos. Los estándares de turbidez son preparados por

la mezcla de químicos que precipitan para formar una solución de turbidez

reproducible. Son realizados adicionando ácido sulfúrico a una solución acuosa de

cloruro de bario, del cual resulta la formación de un precipitado de sulfato de bario.

(ZIMBRO y POWER, 2003)

Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl2 de 0.048 M y H2SO4

0.6M, la turbidez la da el cloruro de bario, el cual va en cantidad creciente mientras

el ácido sulfúrico va disminuyendo la proporción.

Cada uno de los tubos del patrón de acuerdo con la turbidez, representa un número

de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por

recuento de colonias. De esta forma al comparar una emulsión de bacterias con el

tubo del patrón de McFarland que más se asemeje se puede saber

aproximadamente el número de bacterias en la emulsión. (ESCOBAR, 2002)

Igualmente es importante tener en cuenta la recuperación microbiana, ya que esto

va a determinar la cantidad de microorganismos que van a crecer durante la prueba

de promoción de crecimiento y si es o no satisfactoria esta prueba. Las pruebas

microbianas no utilizan células individuales, se recolectan poblaciones de células

para su estudio. Los datos generados en estos estudios son menos variables si las

poblaciones de células son homogéneas. Los cultivos líquidos o los cultivos

confluentes en medios sólidos son más adecuados para la preparación de cultivos

reproducibles.

Las condiciones de recuperación microbiana están dentro de las más cruciales para

calcular con exactitud el número de microorganismos presentes en la solución de

prueba. Se debe considerar el medio de recuperación que permita el crecimiento,

las condiciones de incubación, las condiciones óptimas de crecimiento para así

asegurar el crecimiento completo y resultados reproducibles. (USP 29, 2006)

La prueba de esterilidad es no válida si las pruebas de aptitud no son satisfactorias.

22

2.3.3. MÉTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

2.3.3.1. Filtración por membrana

Esta técnica es recomendada por la mayoría de las Farmacopeas y envuelve la

filtración de fluidos a través de un filtro de membrana estéril, cualquier

microorganismo presente es retenido en la superficie del filtro. También se pueden

analizar sólidos solubles en agua, los cuales pueden ser disueltos en un diluyente

apropiado y procesados por medio de esta técnica. (HUGO y RUSSEL, 1998)

La técnica de filtración por membrana se basa en hacer pasar la muestra a través

de una membrana porosa delgada, elaborada con plástico de celulosa inerte, los

poros son de tamaño uniforme lo suficientemente pequeños para retener los

microorganismos. (AVENDANO y MOYANO, 1997)

Esta técnica involucra la filtración a través de una membrana la cual se coloca en el

equipo de filtración, donde los microorganismos son atrapados en la superficie del

filtro. Después de lavar el filtro de membrana con el fin de eliminar los residuos de

las sustancias antimicrobianas del producto que puedan inhibir el crecimiento de los

posibles contaminantes, la membrana se transfiere a los correspondientes medios

de cultivo los cuales son incubados a 32,5 +/- 2,5ºC para bacterias en el medio

Fluido de Tioglicolato y para hongos en el medio Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/-

2,5ºC, durante el tiempo apropiado. (HUGO y RUSSEL 1998)

Se debe transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla

asépticamente en dos partes iguales y transferir una mitad a cada uno de los

medios de cultivo e incubar los medios durante no menos de 14 días.

Cuando se obtengan evidencias de contaminación microbiana en algún artículo el

resultado es concluyente para determinar que el artículo no cumple con los

requisitos de la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006)

La membrana debe sostenerse firmemente en una unidad de la filtración que

consiste en una base de apoyo para la membrana, un vaso para el fluido que va a

ser evaluado, un depósito colectivo para el fluido filtrado, y los tubos necesarios o

conexiones. El aparato se diseña de forma que la solución a ser filtrada se puede

23

introducir y filtrarse bajo las condiciones asépticas. Además permite retirar

asépticamente la membrana para transferirla al medio de cultivo o es adecuado para

llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de agregar el medio.

(AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)

Figura Nº 7. Equipo de filtración por membrana.

Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf

Existen dos tipos de sistemas de filtración por membrana: el sistema abierto y el

sistema cerrado.

Tabla Nº 4. Comparación de los sistemas abierto y cerrado para la técnica de

filtración por membrana.

SISTEMA ABIERTO SISTEMA CERRADO

Preparación del material: se debe

esterilizar el equipo junto con los

portafiltros y la membrana.

Preparación del material: si el equipo

es reutilizable se debe esterilizar el

manifold junto con los portafiltros y la

membrana.

Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo

en un área estéril en cabina de flujo

laminar clase 100.

Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo

en un área estéril en cabina de flujo

laminar clase 100.

24

Filtración del producto: se debe abrir

el sistema para adicionar la muestra.

(Momento en que puede presentarse

contaminación de la muestra).

Filtración del producto: no hay

manipulación de la muestra.

Adición de la membrana al medio de cultivo: se debe desmontar el equipo y

cortar la membrana por mitad para

adicionarla a los medios de cultivo.

Adición de la membrana al medio de cultivo: no hay contacto en ningún

momento con la membrana ni

manipulación, se adiciona el producto y

el medio de cultivo, para su posterior

incubación.

Fuente: Catalogo Sartorius. Sterility Testing System.

2.3.3.2. Inoculación directa

En condiciones asépticas se transfiere directamente en los medio de cultivo (Fluido

de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja) la cantidad apropiada de producto a

examinar, de modo que el volumen del producto no sea mayor de 10% del volumen

del medio, a menos que se indique algo diferente.

Se incuban los medios por no menos de 14 días a la temperatura adecuada,

32,5 +/- 2,5ºC para el medio Fluido de Tioglicolato y para el medio Digerido

Caseína-Soja a 22,5 +/- 2,5ºC. Se observan los medios de cultivo periódicamente

durante el periodo de incubación para determinar la ausencia o presencia de

microorganismos. (USP 29, 2006)

Este método es de elección para dispositivos médicos debido a que estos

dispositivos están en contacto directo con los medios de cultivo durante el periodo

de incubación. De esta forma los microorganismos viables que se pueden encontrar

en un producto después de una inadecuada o defectuosa esterilización tienen un

ambiente ideal donde pueden crecer y proliferar. (RICHTER, 2006)

25

2.3.4. Interpretación de resultados

A intervalos durante el período de incubación y al momento de su finalización,

examinar los medios en busca de evidencias macroscópicas de crecimiento

microbiano. (USP 29, 2006)

Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado

cumple con la prueba de esterilidad.

Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, los microorganismos deben aislarse

e identificarse y el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a

menos que pueda demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas

no relacionadas con el producto examinado. (RICHTER, 2006)

El crecimiento es determinado mediante la observación del medio, el cual es

generalmente claro y transparente, la turbidez en el medio indica el crecimiento

microbiano. Una vez la turbidez es detectada se debe confirmar que es causada por

el crecimiento de microorganismos y no por la desintegración de la muestra.

Algunas muestras producen turbidez cuando son vertidas en los medios o producen

reacciones químicas con los medios de cultivo.

La prueba puede considerarse inválida si se cumple una o más de las siguientes

condiciones:

- los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para la prueba de

esterilidad demuestran una falla.

- Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba revela una

falla.

- Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.

- Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la

prueba, el crecimiento de esta especie puede atribuirse de manera

inequívoca a fallas con respecto al material o a la técnica usados al realizar

el procedimiento de la prueba de esterilidad.

Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la

prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba

26

repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan

pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no

cumple con la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006) (Ver Figura Nº 8.)

27

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2.3.5. Condiciones del área estéril de trabajo

Las áreas limpias para la manufactura y análisis de productos estériles son

clasificadas de acuerdo a las características ambientales requeridas. Cada

operación requiere un nivel de limpieza ambiental apropiado para minimizar los

riesgos de contaminación microbiana en el producto.

Un área limpia o cuarto limpio es un espacio definido en el cual la concentración de

microorganismos en el aire, en superficies y en el personal, se encuentra entre

límites o niveles específicos a una clase.

Para la fabricación normal de productos estériles pueden distinguirse cuatro

calidades de cuartos limpios:

- Grado A: es la zona para operaciones de alto riesgo, tales condiciones son

proporcionadas por un trabajo bajo cámara de flujo laminar.

- Grado B: es el ambiente de los alrededores de la zona A.

- Grado C y D: áreas limpias donde se realizan las fases menos críticas, pero

igualmente importantes, en la fabricación de productos estériles.

Esto es un punto importante que se debe tener en cuenta para que la preparación

de los productos estériles se lleve de una forma controlada, evitando riesgos de

contaminación y garantizando la calidad de estos productos para su

comercialización. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002)

Para lograr las condiciones asépticas en la prueba de esterilidad, el entorno de la

prueba tendrá que adaptarse a la manera en que se realice. Se deben tomar

precauciones para evitar la contaminación de modo que no afecte a ningún

microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones asépticas

para la ejecución de la prueba deben ser usadas en una cabina de flujo laminar

(cuarto limpio clase A) localizado en un cuarto limpio clase B. (Ver tabla Nº 5)

(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005)

Las condiciones de trabajo en las que se efectúan las pruebas se controlan

regularmente mediante un muestreo adecuado del área de trabajo y la realización

29

de controles adecuados para verificar que estas condiciones sean apropiadas.

(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005) El control microbiológico de las áreas

estériles se puede realizar por diferentes métodos como el método de

sedimentación, el método de impactación utilizando un equipo muestreador de aire y

también por muestreo de superficies. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002)

Al realizar los análisis de esterilidad en estas condiciones y con los debidos

controles se reduce la incidencia de resultados falsos positivos debido a

contaminaciones extrañas introducidas durante la realización del análisis. (HUGO y

RUSSEL, 1998)

Las condiciones de trabajo donde se realizó la evaluación práctica, laboratorio de

microbiología de AQM Ltda., presenta especificaciones ambientales establecidas

mediante estudios previos y resultados históricos. (Ver tabla Nº 6)

Debido a que las pruebas de esterilidad constituyen un procedimiento cuya asepsia

debe garantizarse para lograr una interpretación correcta de los resultados, es

importante que el personal esté debidamente entrenado y calificado. (USP 29, 2006)

Es importante que los materiales en los que se va a analizar la esterilidad no sufran

contaminaciones procedentes de los operadores o del ambiente durante la

realización del análisis. (HUGO y RUSSEL 1998)

Por ello, estas pruebas deben llevarse a cabo en laboratorios adecuados y por

personal competente y experto usando técnicas y equipo, lo cual minimiza los

riesgos de contaminación microbiana accidental en las pruebas y en el muestreo

ambiental. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)

El personal que ocupa el área aséptica durante la prueba de esterilidad debe llevar

vestimenta estéril. (Ver tabla Nº 7) Igualmente todo el material, equipo y demás

objetos que pueden entran en contacto durante el curso de la prueba deben ser

esterilizados antes de su uso. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)

En conclusión el ensayo de esterilidad debe realizarse en condiciones muy estrictas,

respetando las exigencias en cuanto a los procedimientos establecidos por la

Farmacopea.

30

Tabla Nº 5. Clasificación de ambientes controlados para la industria farmacéutica.

Área grado

Denominación US

Nº máximo de partículas/m3

Nº máximo de microorganismos viables/m3

A 100 3530 < 1

B 1000 35300 5

C 10000 350000 100

D 100000 3530000 500

Fuente: USP 29, 2006.

Tabla Nº 6. Límites microbiológicos para el área aséptica manejados por AQM Ltda.

Ambiente del área aséptica Nº máximo de microorganismos viables/placa

Cabina – Clase 1001 < 1

Mesa 5

Sobre cabina 5

Puerta 8 1 Según USP 29, 2006.

Tabla Nº 7. Límites microbiológicos para el control de personal.

Área Nº máximo de microorganismos viables/guante

Clase 100 3

Clase 10000 10

Fuente: USP 29, 2006.

31

2.4. ESPECTROFOTOMETRÍA

Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante

que absorbe un sistema en función de la longitud de onda de la radiación, y a las

mediciones a una determinada longitud de onda.

La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de

cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda está

asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de

energía. (FISHER, 1970)

Se puede realizar lecturas espectrofotométricas de diversas sustancias para

determinar parámetros como la absorbancia o la tramitancia, lo mismo que puede

hacerse con una emulsión de microorganismos para determinar así su

concentración.

Un cultivo bacteriano actúa como una suspensión coloidal, porque absorbe o

transmite la luz que pasa a través de él. Dentro de ciertos límites, la luz que pasa

por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de

células que hay en el cultivo. Por lo tanto al aplicar la medida de la transmisión de

los rayos de luz, o la medida del porcentaje de absorción de luz a una suspensión

bacteriana, se puede calcular el número de células presentes. (ESCOBAR, 2002)

Para estas determinaciones se utiliza el espectrofotómetro, instrumento que posee

una fuente de luz monocromática. Esta luz pasa a través de un cultivo bacteriano y

la cantidad de luz reflejada o transmitida es medida.

2.4.1. Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción: Ley de Beer-Bouguer-Lambert

La ley de Beer-Bouguer-Lambert rige las determinaciones espectrofotométricas, en

las cuales al incidir un rayo de luz monocromática sobre un medio absorbente de

luz, la absorbancia por el medio será directamente proporcional a la concentración

de la sustancia responsable de la absorción, al mantenerse constante la intensidad

32

del rayo incidente, la distancia recorrida por el rayo dentro de la sustancia y la

longitud de onda de ésta.

Al incidir un rayo de intensidad, la intensidad que sale del medio se denomina

intensidad transmitida. La relación entre estas dos variables se denomina tramtancia

(T). El logaritmo de la tramitancia multiplicado por menos uno es igual a la

absorbancia (A). (ESCOBAR, 2002)

La forma matemática de la ley de Beer-Bouguer-Lambert, – log T = A, muestra que

log T y A son funciones lineales de la concentración. La representación de log T

frente a la concentración es una línea recta de pendiente negativa, y la

representación de A frente a la concentración es una línea recta de pendiente

positiva. (FISHER, 1970)

2.4.2. Tratamientos de los datos espectrofotométricos 2.4.2.1. Curvas espectrales

Los datos obtenidos mediante espectrofotometría pueden representarse mediante

una gráfica de tramitancia o absorbancia frente a longitudes de onda. Algunas

sustancias exhiben una mayor o menor absorción en una región espectral amplia,

otras pueden mostrar una absorción específica a una longitud de onda

característica. (FISHER, 1970)

2.4.2.2. Curvas de calibrado

Después de determinar la longitud de onda a la cual deben de realizarse las

medidas, se calibra el método midiendo una serie de patrones del constituyente

evaluado. Las medidas de tramitancia (o absorbancia) se realizan comúnmente

ajustando la escala de medida del instrumento a 100% de tramitancia (absorbancia

0) cuando el rayo luminoso pasa a través de un blanco, que debe ser idéntico a la

muestra en todo, excepto que no debe contener el constituyente que se ha de

determinar. (FISHER, 1970)

33

3. JUSTIFICACIÓN

La calidad debe ser garantizada en la producción de medicamentos en la industria

farmacéutica, por lo cual la evaluación de estos productos es de gran importancia

para asegurar su calidad y su uso sin ningún riesgo.

Esta calidad se relaciona con el cumplimiento de las especificaciones, las cuales

comprenden una serie de normas seleccionadas junto con los métodos de análisis

correspondientes, utilizadas para determinar la integridad de los productos y las

materias primas. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997)

Es evidente que los puntos de calidad son características importantes en la

manufactura de los medicamentos, no solamente para el producto sino también en

el hecho que un error puede ser perjudicial para la salud y la vida. Todo esto ha

causado que la industria farmacéutica sea fuertemente regulada sobre la calidad de

los productos a comercializar. Así se dio inicio al concepto de validación como una

medida para asegurar la calidad el producto final. (ALEEM, et al. 2003)

El componente más importante de la garantía de la calidad microbiológica aplicada

tradicionalmente a los productos estériles es el análisis de esterilidad, que asegura

que un producto farmacéutico estéril se encuentra libre de microorganismos

contaminantes. (HUGO y RUSSEL 1998) Para esto se añade una muestra del

material a analizar a un medio de cultivo, se incuba y se comprueba la existencia de

signos de crecimiento. (HUGO y RUSSEL 1998). Al ser esta una prueba que

necesita un largo tiempo de análisis, los laboratorios de análisis microbiológicos

enfocados hacia la industria farmacéutica, necesitan establecer un procedimiento

estándar que produzca de forma constante las mismas características y resultados

satisfactorios.

Por lo tanto, la prueba de esterilidad es uno de los pasos más importantes en el

control de un producto farmacéutico estéril, evitando falsos positivos, falsos

34

negativos, fallas en el equipo y errores humanos que pueden costar tiempo, dinero y

fundamentalmente producto. (MILLPORE, 2005)

Las técnicas analíticas de un producto farmacéutico o de ingredientes específicos

sin producto, son necesarias para garantizar la seguridad y eficacia de éstos

durante toda su vida útil, incluyendo su almacenamiento, distribución y uso; esta

evaluación debe ser llevada en concordancia con especificaciones elaboradas y

validadas durante el desarrollo del producto y su análisis. (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 1997)

En este trabajo se validó la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de

celulosa empleados en la técnica de filtración por membrana, esta evaluación se

realizó sin ningún producto específico para que en adelante esta técnica sirva de

soporte para la prueba de esterilidad con diferentes productos farmacéuticos,

controlando las condiciones establecidas por la validación.

El Laboratorio de análisis químico y microbiológico AQM Ltda., diariamente realiza

pruebas de esterilidad donde analiza diversos productos farmacéuticos, por lo tanto

se hace necesario obtener una técnica reproducible y con óptimos resultados. Al

optimizar esta prueba el laboratorio va a obtener resultados precisos y confiables,

disminuyendo el riesgo de equivocación y la repetición de análisis con lo cual

disminuye costos, incrementa la productividad y mejora la calidad del servicio al

cliente.

35

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Validar la retención microbiana en los filtros de membrana de acetato y nitrato de

celulosa con un tamaño de poro de 0,45µm empleados en la técnica de filtración por

membrana para la prueba de esterilidad.

4.2. Objetivos específicos

Comprobar la retención de microorganismos contaminantes en los filtros de

membrana de 0,45 µm mediante la turbidez de los medios de cultivo líquidos.

Determinar la retención y la recuperación de los microorganismos

contaminantes en los filtros de membrana de acetato y nitrato de celulosa

empleados en la técnica de filtración por membrana.

Confirmar las condiciones del montaje de la técnica de filtración por

membrana siguiendo los parámetros de la USP 29.

Verificar en los medios de cultivo, Fluido de Tioglicolato y Digerido de

Caseína-Soja la prueba de promoción de crecimiento.

Determinar el tiempo de crecimiento de los microorganismos utilizados en la

prueba de promoción de crecimiento mediante turbidimetría, en los medios

de cultivo líquidos Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja.

Ajustar el procedimiento POSM0017 – P002 “PROCEDIMIENTO PARA LA

REALIZACIÓN DE PRUEBAS DE ESTERILIDAD” para optimizar el proceso

de la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad en el

Laboratorio AQM Ltda.

36

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

Se realizó un estudio experimental donde la validación fue de tipo concurrente ya

que la información se obtuvo durante el proceso, realizando monitoreo de todo el

proceso para verificar que esta bajo control.

Igualmente en la validación se evaluaron parámetros como la linealidad, la precisión

y la especificidad.

5.1.1. Población de estudio y muestra

Se analizaron 6 microorganismos estos son:



Clostridium sporogenes ATCC 19404



Aspergillus niger ATCC 16404

Con estos microorganismos se realizó el montaje de la técnica de filtración por

membrana con 5 réplicas para cada microorganismo, realizando cada réplica en 5

días diferentes.

Igualmente se utilizaron dos tipos de membranas de 0,45 µm, los cuales son filtros

de nitrato de celulosa y filtros de acetato de celulosa.

Para la prueba de promoción de crecimiento se utilizaron los 6 microorganismos

mencionados anteriormente y se realizaron 3 réplicas en 3 días diferentes.

La prueba de esterilidad de los medios de cultivo se realizó 5 veces en días

diferentes, sin ningún microorganismo.

Las cepas de los microorganismos utilizados se encontraban liofilizadas para luego

ser conservadas en cultivos de mantenimiento, sin embargo los microorganismos

viables empleados para la prueba no debían tener más de cinco transferencias

desde el lote original.

37

5.1.2. Materiales utilizados durante la validación

5.1.2.1. Pruebas preliminares

5.1.2.1.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

- Medio Fluido de Tioglicolato

- Medio Digerido Caseína-Soja

- Frascos Schott de 250 mL

- Incubadora de 22,5 +/- 2,5ºC


5.1.2.1.2. Prueba de promoción de crecimiento

- Agar Casoy

- Agar HC



- Solución salina

- Cajas de Petri desechables


- Asa curva



- Tubos de ensayo de 13 X100

- Tubo 0,5 del patrón de Mc Farland

- Pipetas de 2mL

- Anaerogen

- Indicador de anaerobiosis

- Cámara de anaerobiosis

- Láminas

- Colorantes de Gram

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

38

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

- Clostridium sporogenes ATCC 19404

- Candida albicans ATCC 10231

- Bacillus subtilis ATCC 6633

- Aspergillus niger ATCC 16404

5.1.2.2. Técnica de filtración por membrana 5.1.2.2.1. Controles para el proceso

- Agar Casoy

- Agar HC

- Alcohol al 72 %

- Cajas de Petri desechables

- Muestreador de aire MAS-100

- Cabina de flujo laminar con filtro HEPA.

5.1.2.2.2. Control negativo

- Diluyente D estéril



- Filtro de membrana de acetato de celulosa Sartorious

- Filtro de membrana de nitrato de celulosa Durapore - Millipore




- Tijeras estériles

- Pinzas estériles

- Manifold

- Mangueras

- Erlenmeyer con tabuladora lateral

- Vasos de filtración

39

- Tapón

- Bomba de vacío de 420 mmHg.


- Autoclave

5.1.2.2.3. Filtración por membrana

- Diluyente D



- Solución salina

- Filtro de membrana de acetato de celulosa Sartorious

- Filtro de membrana de nitrato de celulosa Durapore - Millipore


- Tubos de ensayo de 13 X 100



- Tijeras estériles

- Pinzas estériles

- Láminas

- Colorantes de Gram

- Manifold

- Mangueras

- Erlenmeyer con tabuladota lateral

- Vasos de filtración

- Tapón

- Bomba de vacío de 420 mmHg.


- Autoclave

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

- Clostridium sporogenes ATCC 19404

- Candida albicans ATCC 10231

40

- Bacillus subtilis ATCC 6633

- Aspergillus niger ATCC 16404

5.2. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN

Figura Nº 9. Validación de procedimientos.

Fuente: CORTES, A. et al. 2003

5.2.1. Recopilación de la información

Se realizó una revisión de los factores que influyen en la validez de la prueba como

lo son técnicas, personal, equipos e instalaciones, controles ambientales, de

personal y sanitización de equipos e instalaciones del área aséptica, reactivos y

medios de cultivo utilizados para la prueba de esterilidad y procedimientos

operativos del laboratorio para el área de microbiología.

VALIDACIÓN DE PROCEDIMIENTOS

Recopilación de información

Calibración y mantenimiento de equipos

Revisión bibliográfica de la prueba en USP 29

Realización de pruebas preliminares

Realización de la prueba de esterilidad

Reporte de resultados

Optimización de procedimientos POEs

41

PRUEBAS PRELIMINARES

Prueba organoléptica

Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

Prueba de promoción de crecimiento

Reportar resultados en formatos respectivos

Reporte de resultados

5.2.2. Calibración y mantenimiento de los equipos

Se verificó que los equipos utilizados en la validación se encontraban funcionando

de la forma esperada dentro de los rangos operacionales para los cuales fueron

diseñados.

Dentro de los equipos utilizados se encuentran:

- Cabina de flujo laminar horizontal del área aséptica

- Bomba de vacío del área aséptica

- Balanza Ohaus

- Autoclave Sterilof

- Incubadoras de 22,55ºC y 32,5ºC.

- Muestreador de aire MAS 100

- Microscopio

- Termómetro de cada incubadora

- Espectrofotómetro

5.3. Pruebas preliminares

Figura Nº 10. Pruebas preliminares


Se realizó a cada lote de medio de cultivo preparado una prueba organoléptica

donde se evaluó el color, la textura y aspecto frente a las especificaciones de la

USP 29.

42

5.3.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

Esta prueba se realizó a cada lote de medio de cultivo líquido preparado y utilizado

durante la metodología. Este ensayo se realizó 5 veces en días diferentes para

determinar así la esterilidad de los medios de cultivo durante el estudio de

validación.

Figura Nº 11. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo.


5.3.2. Prueba de promoción de crecimiento

Se realizaron 3 repeticiones en 3 días diferentes para garantizar que los medios de

cultivo utilizados durante el estudio contenían los nutrientes necesarios para

promover el crecimiento de los microorganismos evaluados y verificar así la

efectividad de estos medios.

Para realizar esta prueba fue necesario obtener las cepas de los 6 microorganismos

evaluados, los cuales se encontraban en medio de mantenimiento, por lo cual se

realizó una siembra por agotamiento en los medios de cultivo sólidos agar Casoy y

agar HC. Con las cepas obtenidas anteriormente se realizó una suspensión de cada

microorganismo en 10 mL de solución salina según el tubo 0,5 del patrón de Mc

ESTERILIDAD

Se incubaron los medios de cultivo líquidos, Medio Fluido de Tioglicolato a 32,5 +/-

2,5ºC y Medio de Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/- 2,5ºC durante 14 días.

No crecimiento Crecimiento

Prueba satisfactoria Prueba no satisfactoria

Realizar coloración de Gram

43

Farland el cual corresponde a una concentración de 1X108 UFC/mL. A partir de

cada suspensión se realizaron diluciones hasta 10-6 inoculando 0.1 mL en 9,9 mL de

solución salina obteniendo así una concentración final de 1X102 UFC/ml. (Ver figura

Nº 12)

Figura Nº 12. Diagrama de las diluciones empleadas en la prueba de promoción de

crecimiento.

Después de realizar las diluciones se sembró 0.1mL de la última dilución 10-6 en los

medios de cultivo líquidos (Fluido de Tioglicolato, Digerido Caseína Soja) y sólidos

(Agar Casoy, Agar HC) y éstos se incubaron durante el tiempo adecuado como se

muestra en la figura Nº 13.

En el ensayo 3 de esta prueba se inoculó 0,1mL de la dilución 10-6 de cada

microorganismo en los medios de cultivo líquidos (Fluido de Tioglicolato y Digerido

Caseína- Soja) y se incubaron durante 100 horas para observar su crecimiento

mediante un método turbidimétrico utilizando el espectrofotómetro con una longitud

de onda de 540 nm y haciendo una lectura de porcentaje de Tramitancia. Los

tiempos evaluados fueron 2, 4, 6, 8, 24, 28, 32, 48, 52, 56, 72, 78, 96 y 100 horas.

9,9 mL solución salina

10-2

1X106 UFC/mL


10-4

1X104 UFC/mL


10-6

1X102 UFC/mL

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

Suspensión del microorganismo según tubo 0,5 patrón Mc Farland 1X108 UFC/mL

44

Los datos de crecimiento obtenidos corresponden al parámetro de linealidad y

fueron analizados mediante el software Validation Manager, versión 2.20L.

PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO

A partir de un cultivo en medio de mantenimiento (Procedimiento para el manejo del

cepario POSM002-P002) se obtuvieron las cepas de los diferentes microorganismos

(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida

albicans, Bacillus subtilis, Aspergillus niger) realizando una siembra por agotamiento en

agar Casoy para bacterias y agar HC para hongos, incubándolos 24 horas a 32,5 +/-

2,5ºC para bacterias1 y 3 días a 22,5 +/-2,5ºC para hongos.

Se realizó una suspensión de cada microorganismo repicado en un tubo con 10 mL de

Solución Salina según el tubo 0,5 del patrón de Mc Farland correspondiente a una

concentración de 1X108UFC/mL.

Se realizaron diluciones hasta 10-6 en tubos con 9.9 mL de solución salina inoculando 0,1 mL de cada suspensión en cada una de las diluciones.

Se sembró 0,1 mL de la última dilución 10-6 (100UFC/mL) en los medios de cultivo

Fluido de Tioglicolato Digerido Caseína-Soja

Staphylococcus aureusPseudomonas aeruginosa Clostridium sporogenes

Candida albicans Bacillus subtilis Aspergillus niger

Se incubó durante 5 días a 22,5 +/- 2,5ºC

Se incubó durante 2 días a 32,5 +/- 2,5ºC

Se evaluó el crecimiento de los microorganismos por turbidimetría durante 100 horas

mediante espectrofotómetro con una longitud de onda de 540 nm.

45

1 Clostridium sporogenes se incubó en condiciones de anaerobiosis.

Figura Nº 13. Prueba de promoción de crecimiento.


5.4. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA UTILIZADA EN LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

Cada montaje incluyó esterilidad en los dos tipos de membrana de 0,45 µm, filtros

de nitrato de celulosa y acetato de celulosa, por cada microorganismo para un total

de 12 esterilidades, teniendo en cuenta los 6 microorganismos y realizados en 5

Se observaron los resultados en los medios líquidos y sólidos

Crecimiento No crecimiento

Prueba no satisfactoriaPrueba satisfactoria

Se realizó conteo de UFC/mL en medios sólidos el

cual era aproximadamente de 100 UFC/mL.

Se realizó coloración de Gram

Candida albicansAspergillus niger

Se sembró en profundidad por duplicado 1 mL de la dilución 10-6 en los medios de cultivo sólido, agar HC para hongos y agar Casoy para bacterias.

Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Clostridium sporogenes1

Se incubó por 5 días a 22,5 +/- 2,5ºC Se incubó por 2 días a 32,5 +/- 2,5ºC

46

días diferentes, para un total de 60 pruebas de esterilidad, utilizando el líquido D

como diluyente.

Antes de los montajes de esta prueba se colocó una membrana de 0,45 µm en cada

vaso de filtración, para que éstos y los demás materiales que se utilizaron fueran

esterilizados, previamente al ensayo, en el autoclave a 121ºC y 15 lb psi durante 35

minutos.

En cada montaje se evaluaron inicialmente los controles para el proceso en donde

se realizó el control ambiental del área estéril por el método de sedimentación, en

agar Casoy y agar HC, en ambientes como la cabina de flujo laminar, sobre la

cabina, la mesa auxiliar y la puerta, igualmente se realizó el control ambiental inicial

en la cabina de flujo laminar con el muestreador de aire MAS-100 durante 2 minutos

equivalentes a 200 L.

Además se realizó el control de personal al inicio y final de cada montaje mediante

la impresión de guantes en agar Casoy y agar HC.

Después de los controles ambientales y de personal se sanitizaron los materiales

con alcohol al 72% y éstos se ubicaron dentro de la cabina de flujo laminar para

armar el equipo de filtración y así proceder a las filtraciones. (Ver figura Nº 14.)

Primero se realizó la filtración del control negativo del montaje o blanco del equipo

en donde se filtró 250 mL de diluyente D estéril, se cortó por mitad el filtro de

membrana y cada parte de la membrana se adicionó a los medio de cultivo líquidos

(Fluido de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja), los cuales fueron incubados

durante 14 días a la temperatura adecuada como se indica en la figura Nº 15. Si

después del tiempo de incubación se observa turbidez (crecimiento microbiano) del

medio de cultivo la prueba era no satisfactoria y se realizaba coloración de Gram, al

contrario si no se presentaba turbidez o crecimiento microbiano la prueba era

satisfactoria.

Para realizar las filtraciones por membrana se contaminó el diluyente D con 0,1 mL

de la dilución 10-6 de cada uno de los 6 microorganismos evaluados en la prueba de

promoción de crecimiento. El diluyente contaminado fue filtrado, la membrana fue

47

cortada por mitad y cada parte fue adicionada a los medios de cultivo Fluido de

Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja, éstos medios se incubaron durante 14 días a

la temperatura adecuada. Al cabo del tiempo de incubación se realizó la lectura si

se observa crecimiento microbiano se considera una prueba satisfactoria, si no se

observa crecimiento la prueba es no satisfactoria. (Ver figura Nº 16)

Después de filtrar cada diluyente contaminado se agregó a cada medio de cultivo

líquido 10 mL del líquido filtrado, para asegurar la retención de los microorganismos

contaminantes en los filtros de membrana y el no crecimiento de éstos en el líquido

filtrado. Los medios de cultivo fueron incubados durante 14 días, si después del

tiempo de incubación se observa turbidez (crecimiento microbiano) del medio de

cultivo la prueba se considera no satisfactoria, al contrario si no se presenta turbidez

o crecimiento microbiano la prueba es satisfactoria. (Ver figura Nº 16). Esta

evaluación del líquido filtrado se realizó en los montajes 1, 3 y 5 de la técnica de

filtración por membrana.

Para realizar los controles para el proceso se utilizó por cada día:

- 5 cajas de Petri con agar Casoy para el control ambiental.

- 5 cajas de Petri con agar HC para el control ambiental.

- 2 cajas de Petri con agar Casoy para el control de personal al inicio y final de

la prueba.

- 2 cajas de Petri con agar HC para el control de personal al inicio y final de la

prueba.

Para realizar el control negativo de la prueba se utilizó por cada día:

- Un frasco con medio Fluido de Tioglicolato para el diluyente estéril.

- Un frasco con medio Digerido Caseína-Soja para el diluyente estéril.

Para realizar la filtración por membrana se utilizó por cada montaje:

- Dos frascos con medio Fluido de Tioglicolato para cada microorganismo a

evaluar.

- Dos frascos con medio Digerido Caseína-Soja para cada microorganismo a

evaluar.

- Dos frascos con medio Fluido de Tioglicolato para agregar el líquido filtrado.

- Dos frascos con medio Digerido Caseína-Soja para agregar el líquido

filtrado.

48

Se utilizaron frascos Schott de 250 mL que contenían 80 mL de medio preparado.

Figura Nº 14. Controles para el proceso en la técnica de filtración por membrana.

Figura Nº 15. Control negativo de la técnica de filtración por membrana.

CONTROLES PARA EL PROCESO

Se realizó el control ambiental en la cabina de flujo laminar, sobre la cabina, mesa

auxiliar y puerta con agar Casoy y agar HC mediante el método de sedimentación

durante el tiempo de la prueba. Igualmente se realizó el control ambiental de la cabina, al

inicio de la prueba, con el equipo MAS-100 durante 2 minuto equivalente a 200L.

Se realizó el control de personal al inicio y final de la prueba mediante la impresión de guantes en agar Casoy y agar HC.

Se sanitizaron los materiales a utilizar en la cabina de flujo laminar con alcohol al 72%

Se ubicó el material y se armó el equipo Manifold dentro de la cabina de flujo

Se cortó la membrana por mitad con tijeras y pinzas estériles

Se incubaron los medios por 14 días observándose periódicamente. Medio Fluido de

Tioglicolato a 32,5 +/- 2,5ºC y Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/-2,5ºC

Se adicionó cada parte de la membrana a los medios líquidos

Se filtró 250 mL de diluyente

CONTROL NEGATIVO


Prueba no

satisfactoria

Prueba

satisfactoria

Coloración de Gram

49

Figura Nº 16. Técnica de Filtración por membrana.


Prueba no satisfactoria

Prueba satisfactoria

Coloración de Gram

Se contaminó 250 mL de diluyente D

con 0,1 mL de la dilución 10-3 de

cada microorganismo evaluado en la

prueba de promoción de crecimiento

Se filtró el diluyente contaminado

Se cortó la membrana por mitad con

tijeras y pinzas estériles, se adicionó

cada parte a los medios líquidos

Se incubaron los medios durante 14

días observándose periódicamente.

Medio Fluido de Tioglicolato a 32,5

+/- 2,5ºC y Digerido Caseína-Soja a

22,5 +/-2,5ºC

Se agregó 10 mL del filtrado a los

medios de cultivo líquidos y éstos se

incubaron durante 14 días.


Prueba no

satisfactoria

Prueba

satisfactoria

Coloración de Gram

FILTRACIÓN POR MEMBRANA

50

6. RESULTADOS

6.1. Calibración y mantenimiento de equipos

Tabla Nº 8. Programa de calibración y mantenimiento de los equipos utilizados en

la validación.

EQUIPO

MARCA /

MODELO

ÚLTIMA

VERIFICACIÓN

PRÓXIMA

VERIFICACIÓN

PROVEEDOR

Incubadora Nº 2 BINDER /

M1711509900312

M: febrero

2007

M: octubre 2007 Servibalanzas

Incubadora Nº 6 BINDER /

M1711509900312

M: febrero

2007

M: octubre 2007 Servibalanzas

Termómetro digital FISHER /

15-078G

C: julio 2006 C: julio 2007 Metrocal

Cabina de flujo

laminar

PAF /

PAMAS 2448

CF: julio 2006 CF: julio 2007 Técnica

Bomba de vacío MILLIPORE /

5KH33DN16X

M: julio 2006 M: julio 2007 Impresión y

plásticos

Muestreador

MAS 100

MERCK /

65792

M y C: octubre

2006

M y C: octubre

2006

Merck

Balanza OHAUS OHAUS /

2610

M: enero 2007 M: julio 2007 Vansolix

Microscopio OLYMPUS /

CHK 4E

M: abril 2007 M: abril 2008 Servibalanzas

Autoclave Sterilof STERILOF /

144-1PGrPr

CF: enero 2007

M: mayo 2007

CF: enero 2008

M: noviembre

2007

BPM Andina

Equitécnicos

Espectrofotómetro UNICAM /

UV2-100

M y C: abril 2007 M y C: abril 2007 Innovatec

M: Mantenimiento

C: Calibración

CF: Calificación

51

6.2. Pruebas preliminares 6.2.1. Prueba organoléptica

Tabla Nº 9. Análisis organoléptico de los medios de cultivo.

MEDIO ESPECIFICACIÓN RESULTADO

Fluido de

Tioglicolato

Medio líquido transparente de color

amarillo claro, translúcido, con anillo de

rezarsurina en la parte superior.

Satisfactorio

Digerido Caseína-

Soja

Medio líquido transparente de color

amarillo, translúcido.

Satisfactorio

Agar Casoy Medio sólido de color claro.

Satisfactorio

Agar HC Medio sólido de color ámbar con tonos

amarillos, ligeramente turbio y sin

precipitado significante.

Satisfactorio

52

6.2.2. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

Tabla Nº 10. Resultados de la Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

líquidos.

MEDIO

dE

CULTIVO

Ensayo 1

14-04-07

Ensayo 2

21-04-07

Ensayo 3

28-04-07

Ensayo 4

12-05-07

Ensayo 5

19-05-07

Fluido de

Tioglicolato

Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio

Digerido

Caseína-

Soja

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano.

6.2.3. Prueba de promoción de crecimiento

Tabla Nº 11. Recuentos obtenidos en la Prueba de promoción de crecimiento.

MEDIO

de

cultivo

Microorganismo Recuento 1

UFC / ML

14-04-07

Recuento 2

UFC / ML

28-04-07

Recuento 3

UFC / ML

19-05-07

216 69 20 Bacillus subtilis ATCC 6633

237 52 21

Promedio 226 60 20

23 24 71 Clostridium sporogenes

ATCC 19404 30 29 31

AGAR

CASOY Promedio 26 26 51

53

177 90 97 Staphylococcus aureus

ATCC 6538 205 118 89

Promedio 191 104 93

173 91 103 Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027 197 104 96

AGAR

CASOY

Promedio 185 97 99

96 78 65 Candida albicans

ATCC 10231 101 73 48

Promedio 98 76 56

20 24 92 Aspergillus niger

ATCC 16404 23 22 60

AGAR

HC

Promedio 22 23 76

Figura Nº 17. Bacillus subtilis en agar Casoy.

54

Figura Nº 18. Clostridium sporogenes en agar Casoy.

Figura Nº 19. Staphylococcus aureus en agar Casoy.

Figura Nº 20. Pseudomas aeruginosa en agar Casoy.

55

Figura Nº 21. Candida albicans en agar HC.

Figura Nº 22. Aspergillus niger en agar HC.

Tabla 12. Resultados obtenidos en la Prueba de promoción de crecimiento para

medios de cultivo líquidos en los tres ensayos realizados.

MEDIO de

cultivo

MICROORGANISMO RESULTADO MORFOLOGIA

Clostridium sporogenes

ATCC 19404

Satisfactorio Bacilos Gram

positivos

Fluido de

Tioglicolato

Staphylococcus aureus

ATCC 6538

Satisfactorio Cocos Gram

positivos

56

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027


negativos

Bacillus subtilis

ATCC 6633


positivos

Candida albicans

ATCC 10231

Satisfactorio Levaduras

Digerido

Caseína-Soja

Aspergillus niger

ATCC 16404

Satisfactorio

Hifas hialinas,

conidios globosos y

cabezas conidiales

radiales.

Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano.

57

6.2.3.1. Método turbidimétrico

Los datos de % de tramitancia obtenidos durante el tiempo de incubación (100

horas) de los medios inoculados se observan en las tablas Nº 12 a la Nº 23.

Tabla Nº 13. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium sporogenes en

medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.

TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 94,159 2 94,714

Promedio 94,437 4 90,196 4 90,024

Promedio 90,110 6 89,603 6 88,497

Promedio 89,050 8 82,024 8 82,024

Promedio 82,024 24 77,967 24 76,984

Promedio 77,476 28 69,471 28 67,429

Promedio 68,450 32 59,556 32 59,821

Promedio 59,689 48 50,619 48 49,867

Promedio 50,243 52 45,736 52 41,830

Promedio 43,783 56 34,202 56 34,148

Promedio 34,175 72 17,470 72 17,459

Promedio 17,465 78 12,102 78 12,207

Promedio 12,155 96 4,552 96 4,496

Promedio 4,524 100 2,955 100 2,947

Promedio 2,951

58 Fi

gura

Nº

23. C

urva

de

crec

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de C

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m s

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la p

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a

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rom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0164

x - 1.

3427

-2,0

-1,5

-1,0

-0,50,00,5

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.9

9029

3

Fase

de

adap

taci

ón d

uran

te la

s pr

imer

as 2

4 ho

ras

desp

ués

de la

inoc

ulac

ión.

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

la h

ora

56.

59

Tabla Nº 14. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium sporogenes en

medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.


Promedio 99,861 4 99,622 4 99,605

Promedio 99,613 6 99,682 6 99,668

Promedio 99,675 8 100,091 8 98,612

Promedio 99,351 24 99,363 24 99,405

Promedio 99,384 28 98,212 28 98,184

Promedio 98,198 32 97,239 32 97,240

Promedio 97,240 48 98,544 48 98,286

Promedio 98,415 52 98,228 52 97,901

Promedio 98,065 56 97,457 56 97,499

Promedio 97,478 72 95,734 72 95,840

Promedio 95,787 78 94,983 78 95,085

Promedio 95,034 96 94,740 96 94,699

Promedio 94,720

60

100 94,818 100 94,719

Promedio 94,769

61

Figu

ra N

º 24.

Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Clo

strid

ium

spo

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nes

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Dig

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rom

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cre

cim

ient

o.

y = 0,0

136x -

2,7897

-3,5-3,0-2,5-2,0-1,5-1,0-0,50,00

24

68

1012

1416

1820

2224

2628

3032

3436

3840

4244

4648

5052

5456

5860

6264

6668

7072

7476

7880

8284

8688

9092

9496

98100

Tiemp

o (Hora

s)

log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.9

6520

1

No

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s va

lore

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tram

itanc

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uran

te la

s 10

0 ho

ras

eval

uada

s.

62

Tabla Nº 15. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus aureus en

medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.


Promedio 92,412 4 90,638 4 89,473

Promedio 90,056 6 87,130 6 87,077

Promedio 87,104 8 81,850 8 81,974

Promedio 81,912 24 70,702 24 71,697

Promedio 71,200 28 65,708 28 65,663

Promedio 65,686 32 60,215 32 60,442

Promedio 60,329 48 51,022 48 53,612

Promedio 52,317 52 42,057 52 42,652

Promedio 42,355 56 39,414 56 40,194

Promedio 39,804 72 28,676 72 28,667

Promedio 28,672 78 21,478 78 21,498

Promedio 21,488 96 16,336 96 17,312

Promedio 16,824

63

100 12,255 100 12,238

Promedio 12,247

64 Fi

gura

Nº

25. C

urva

de

crec

imie

nto

de S

taph

yloc

occu

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en

la p

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rom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0133

x - 1.

238

-1,6

-1,4

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,20,00,2

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

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cor

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ción

R2 =

0.98

3401

Fase

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adap

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hor

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e la

inoc

ulac

ión.

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

la h

ora

52.

65

Tabla Nº 16. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus aureus en

medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.


Promedio 95,009 4 92,537 4 93,573

Promedio 93,055 6 90,666 6 90,545

Promedio 90,606 8 88,498 8 88,576

Promedio 88,537 24 81,491 24 81,485

Promedio 81,488 28 77,521 28 76,424

Promedio 76,973 32 72,766 32 70,407

Promedio 71,587 48 64,442 48 63,400

Promedio 63,921 52 58,249 52 58,039

Promedio 58,144 56 46,727 56 46,169

Promedio 46,448 72 25,725 72 25,719

Promedio 25,722 78 16,457 78 16,499

Promedio 16,478 96 5,887 96 5,857

Promedio 5,872

66

100 2,923 100 2,897

Promedio 2,910

67

Figu

ra N

º 26.

Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Sta

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Dig

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cre

cim

ient

o.

y = 0.

0173

x - 1.

4996

-2,0

-1,5

-1,0

-0,50,00,5

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.98

2761

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

la h

ora

56.

68

Tabla Nº 17. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa

en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.


Promedio 90,073 4 86,592 4 86,165

Promedio 86,379 6 84,804 6 84,931

Promedio 84,868 8 78,415 8 78,280

Promedio 78,348 24 62,947 24 62,838

Promedio 62,893 28 60,675 28 60,484

Promedio 60,580 32 51,168 32 52,736

Promedio 51,952 48 50,601 48 50,951

Promedio 50,776 52 40,176 52 39,396

Promedio 39,786 56 41,084 56 40,906

Promedio 40,995 72 11,517 72 11,547

Promedio 11,532 78 6,678 78 6,686

Promedio 6,682 96 3,430 96 3,363

Promedio 3,397

69

100 0,294 100 0,296

Promedio 0,295

70 Fi

gura

Nº

27.

Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Pse

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aer

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Flu

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mie

nto.

y = 0.

0155

x - 1.

1933

-1,6

-1,4

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,20,00,20,40,6

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.97

4784

Fase

de

adap

taci

ón d

uran

te la

s 8

prim

eras

hor

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espu

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e la

inoc

ulac

ión.

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

60 h

oras

.

71

Tabla Nº 18. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa

en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.


Promedio 98,076 4 96,982 4 96,896

Promedio 96,939 6 94,207 6 94,176

Promedio 94,192 8 89,919 8 89,046

Promedio 89,483 24 79,545 24 80,648

Promedio 80,097 28 80,763 28 80,624

Promedio 80,694 32 75,993 32 73,185

Promedio 74,589 48 53,269 48 52,434

Promedio 52,852 52 42,054 52 44,894

Promedio 43,474 56 48,317 56 47,754

Promedio 48,036 72 20,253 72 23,023

Promedio 21,638 78 13,307 78 13,231

Promedio 13,269 96 1,732 96 1,675

Promedio 1,704

72

100 1,877 100 1,797

Promedio 1,837

73

Figu

ra.

Nº

28.

Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Pse

udom

onas

aer

ugin

osa

en m

edio

Dig

erid

o C

aseí

na-S

oja,

ob

serv

ada

en la

prue

ba d

e pr

omoc

ión

de c

reci

mie

nto.

y = 0.

0213

x - 1.

7083

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,50,00,51,0

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.98

3573

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

56 h

oras

.

74

Tabla Nº 19. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en medio

Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.


Promedio 71,485 4 65,071 4 67,557

Promedio 66,314 6 60,677 6 60,301

Promedio 60,489 8 51,784 8 52,156

Promedio 51,970 24 35,820 24 36,209

Promedio 36,015 28 31,648 28 32,052

Promedio 31,850 32 26,018 32 27,802

Promedio 26,910 48 15,871 48 15,782

Promedio 15,827 52 12,392 52 12,367

Promedio 12,380 56 10,635 56 10,663

Promedio 10,649 72 7,439 72 6,445

Promedio 6,942 78 6,681 78 6,174

Promedio 6,428 96 2,043 96 2,954

Promedio 2,499

75

100 0,659 100 0,664

Promedio 0,662

76 Fi

gura

Nº

29.

Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Bac

illus

subt

ilis e

n m

edio

Flu

ido

de T

iogl

icol

ato,

ob

serv

ada

en la

pru

eba

de

prom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0103

x - 0.

6752

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,20,00,20,40,6

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.92

2125

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

24 h

oras

77

Tabla Nº 20. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en medio

Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.


Promedio 97,006 4 96,493 4 96,877

Promedio 96,685 6 95,000 6 95,276

Promedio 95,138 8 95,695 8 94,988

Promedio 95,342 24 94,199 24 96,324

Promedio 95,262 28 90,122 28 89,231

Promedio 89,677 32 91,534 32 94,418

Promedio 92,976 48 88,956 48 89,650

Promedio 89,303 52 71,600 52 72,552

Promedio 72,076 56 80,827 56 80,565

Promedio 80,696 72 56,888 72 56,481

Promedio 56,685 78 48,836 78 48,461

Promedio 48,649 96 23,053 96 24,130

Promedio 23,592

78

100 28,232 100 27,732

Promedio 27,982

79

Figu

ra N

º 30

. C

urva

de

crec

imie

nto

de B

acillu

s su

btilis

en

med

io D

iger

ido

Cas

eína

-Soj

a,

obse

rvad

a en

la p

rueb

a de

prom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0175

x - 1.

9094

-2,0

-1,8

-1,6

-1,4

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,20,0

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.93

5590

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

66 h

oras

.

80

Tabla Nº 21. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans en medio



Promedio 91,476 4 90,439 4 90,346

Promedio 90,393 6 87,901 6 88,050

Promedio 87,976 8 79,224 8 78,753

Promedio 78,989 24 62,556 24 62,482

Promedio 62,519 28 57,607 28 58,667

Promedio 58,137 32 49,059 32 49,360

Promedio 49,210 48 39,299 48 39,488

Promedio 39,394 52 34,070 52 31,671

Promedio 32,871 56 36,184 56 36,110

Promedio 36,147 72 20,938 72 20,931

Promedio 20,935 78 8,127 78 8,155

Promedio 8,141 96 3,216 96 3,232

Promedio 3,224

81

100 0,447 100 0,448

Promedio 0,448

82 Fi

gura

Nº

31.

Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Can

dida

alb

ican

s en

med

io F

luid

o de

Tio

glic

olat

o,

obse

rvad

a en

la p

rueb

a de

prom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0161

x - 1

.2312

-1,6

-1,4

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,20,00,20,40,6

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (H

oras

)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.98

0164

Fase

de

adap

taci

ón d

uran

te la

s pr

imer

as 8

hor

as d

espu

és d

e la

inoc

ulac

ión.

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

56 h

oras

.

83

Tabla Nº 22. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans en medio



Promedio 90,470 4 90,576 4 90,559

Promedio 90,568 6 90,072 6 90,151

Promedio 90,112 8 83,141 8 83,127

Promedio 83,134 24 76,325 24 76,333

Promedio 76,329 28 76,911 28 76,965

Promedio 76,938 32 65,474 32 62,229

Promedio 63,852 48 43,391 48 43,037

Promedio 43,214 52 52,901 52 52,629

Promedio 52,765 56 47,268 56 47,010

Promedio 47,139 72 12,263 72 12,237

Promedio 12,250 78 12,228 78 12,111

Promedio 12,170 96 2,859 96 2,823

Promedio 2,841

84

100 0,853 100 0,843

Promedio 0,848

85

Figu

ra N

º 32

. Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Can

dida

alb

ican

s en

med

io D

iger

ido

Cas

eína

-Soj

a,

obse

rvad

a en

la p

rueb

a de

prom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0169

x - 1.

3594

-1,6

-1,4

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,20,00,20,40,6

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.97

9663

Fase

de

adap

taci

ón d

uran

te la

s pr

imer

as 6

hor

as d

espu

és d

e la

inoc

ulac

ión.

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

52 h

oras

.

86

Tabla Nº 23. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en medio



Promedio 93,342 4 90,380 4 90,425

Promedio 90,403 6 84,581 6 84,592

Promedio 84,587 8 77,329 8 77,265

Promedio 77,297 24 66,302 24 66,284

Promedio 66,293 28 57,064 28 57,171

Promedio 57,118 32 57,814 32 55,475

Promedio 56,645 48 55,346 48 53,579

Promedio 54,463 52 49,761 52 47,644

Promedio 48,703 56 34,886 56 34,647

Promedio 34,767 72 6,730 72 6,707

Promedio 6,719 78 2,417 78 2,403

Promedio 2,410 96 1,249 96 1,244

Promedio 1,247

87

100 0,448 100 0,444

Promedio 0,446

88 Fi

gura

Nº

33.

Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Asp

ergi

llus

nige

r en

med

io F

luid

o de

Tio

glic

olat

o,

obse

rvad

a en

la p

rueb

a de

prom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0172

x - 1.

2764

-2,0

-1,5

-1,0

-0,50,00,51,0

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.97

3866

Fase

de

adap

taci

ón d

uran

te la

s pr

imer

as 8

hor

as d

espu

és d

e la

inoc

ulac

ión.

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

56 h

oras

.

89

Tabla Nº 24. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en medio



Promedio 95,772 4 94,722 4 94,728

Promedio 94,725 6 90,282 6 91,186

Promedio 90,734 8 88,492 8 88,503

Promedio 88,498 24 82,205 24 83,124

Promedio 82,665 28 85,370 28 85,427

Promedio 85,399 32 85,924 32 82,856

Promedio 84,390 48 70,321 48 70,228

Promedio 70,275 52 70,917 52 70,686

Promedio 70,802 56 65,514 56 64,777

Promedio 65,146 72 18,240 72 18,087

Promedio 18,164 78 14,531 78 14,506

Promedio 14,519 96 0,559 96 0,562

Promedio 0,561

90

100 0,973 100 0,966

Promedio 0,970

91

Figu

ra N

º 34

. Cur

va d

e cr

ecim

ient

o de

Asp

ergi

llus

nige

r en

med

io D

iger

ido

Cas

eína

-Soj

a,

obse

rvad

a en

la p

rueb

a de

prom

oció

n de

cre

cim

ient

o.

y = 0.

0196

x - 1.

6558

-2,0

-1,5

-1,0

-0,50,00,5

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

3638

4042

4446

4850

5254

5658

6062

6466

6870

7274

7678

8082

8486

8890

9294

9698

100

Tiemp

o (Ho

ras)

Log A

C

oefic

ient

e de

cor

rela

ción

R2 =

0.94

5140

Fase

exp

onen

cial

a p

artir

de

las

60 h

oras

.

92

6.3. Técnica de filtración por membrana utilizada en la prueba de esterilidad 6.3.1. Controles para el proceso

6.3.1.1. Control ambiental y de personal

Tabla Nº 25. Resultados del control ambiental durante la prueba de esterilidad.

Ambiente

Montaje 1 14-04-07

Montaje 2 21-04-07

Montaje 3 28-04-07

Montaje 4 12-05-07

Montaje 5 19-05-07

MEDIO DE

CULTIVO

Casoy H

C

Casoy HC Casoy H

C

Casoy HC Casoy H

C

eSPECIFICACI

ÓN

ufc/ PLACA

(VIABLES

TOTALES)

Cabina con equipo MAS-100 UFC/m3

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Cabina UFC/placa

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Sobre cabina UFC/placa

0 0 2 1H 1L

0 0 1 0 3 0 5

Mesa UFC/placa

1 0 4 0 0 0 1 0 3 0 5

Puerta UFC/placa

1 0 4 1H

0 0 2 1H

2 0

8

H: Hongos; L: Levaduras

Los resultados obtenidos para el control microbiológico de ambientes CUMPLEN

con las especificaciones establecidas en el Laboratorio AQM Ltda.

Tabla Nº 26. Resultados del control de personal durante la prueba de esterilidad.

Montaje 1 14-04-07

Montaje 2 21-04-07

Montaje 3 28-04-07

Montaje 4 12-05-07

Montaje 5 19-05-07

Casoy HC Casoy HC Casoy HC Casoy HC Casoy HC MEDIO

DE

CULTIVO UFC/guante UFC/guante UFC/guante UFC/guante UFC/guante

eSPECIFICACIÓN

ufc/GUANTE

Guantes inicial

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3

Guantes final

0 0 1 2L 0 1H 2 0 0 0 3

H: Hongos; L: Levaduras

93

Los resultados obtenidos para el control microbiológico de personal CUMPLEN con

las especificaciones establecidas en el Laboratorio AQM Ltda.

6.3.1.2. Control negativo de la prueba

Tabla Nº 27. Resultados obtenidos para el control negativo de la técnica de filtración

de membrana durante los 5 montajes realizados.

membrana acetato de celulosa nitrato de celulosa

Medio de

cultivo

Fluido de Tioglicolato

Digerido Caseína-Soja



CONTROL

NEGATIVO

Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio

Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano

6.3.2. Técnica de filtración por membrana Tabla Nº 28. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana

durante el Montaje 1, abril 14 de 2007.

MEMBRANA

Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa MORFOLOGIA

MEDIO Microorganismo






Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Bacilos Gram positivos


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Levaduras


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Hifas hialinas, conidios globosos


Satisfactorio

No satisfactorio

Satisfactorio

No satisfactorio


Staphylococcus aureus

Cocos

94

ATCC 6538 Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Gram positivos


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Bacilos Gram negativo

Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano

Tabla Nº 29. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana durante

el Montaje 2, abril 21 de 2007.

MEMBRANA








Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Levaduras


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

No satisfactorio

Satisfactorio

1

No satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Cocos Gram positivos


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio


Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano 1 Se sembró Clostridium sporogenes en medio sólido después de 14 días de

incubación del medio líquido.

95


el Montaje 3, abril 28 de 2007.

MEMBRANA








Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Levaduras


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

No satisfactorio

Satisfactorio

No satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio




el Montaje 4, mayo 12 de 2007.

MEMBRANA







Bacillus subtilis ATCC

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Bacilos Gram positivo

96

6633 s Candida albicans ATCC 10231

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Levaduras


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

No satisfactorio

Satisfactorio

No satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio




el Montaje 5, mayo 19 de 2007.

MEMBRANA








Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Levaduras


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio


Clostridium sporogenes

Satisfactorio

No satisfactorio

Satisfactorio

No satisfactorio

Bacilos Gram

97

ATCC 19404 positivos


Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



6.3.3. Líquido filtrado

Los días de montaje 2 y 4 que corresponden a las fechas 21-04-07 y 12-05-07, no

se realizó la inoculación del líquido filtrado en los medio de cultivo.

Tabla Nº 33. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del líquido

filtrado del montaje 1, abril 14 de 2007.

MEMBRANA

Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa

MEDIO

Microorganismo

Fluído de Tioglicolato




Bacillus subtilis

ATCC 6633


Candida albicans

ATCC 10231


Aspergillus niger

ATCC 16404


Clostridium

sporogenes

ATCC 19404

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Staphylococcus

aureus

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

98

ATCC 6538

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC 9027

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio



filtrado del montaje 3, abril 28 de 2007.

MEMBRANA


MEDIO

Microorganismo





Bacillus subtilis

ATCC 6633


Candida albicans

ATCC 10231


Aspergillus niger

ATCC 16404


Clostridium

sporogenes

ATCC 19404

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Staphylococcus

aureus

ATCC 6538

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC 9027

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio


99


filtrado del montaje 5, mayo 19 de 2007.

MEMBRANA


MEDIO

Microorganismo





Bacillus subtilis

ATCC 6633


Candida albicans

ATCC 10231


Aspergillus niger

ATCC 16404


Clostridium

sporogenes

ATCC 19404

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Staphylococcus

aureus

ATCC 6538

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC 9027

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio

Satisfactorio


7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los resultados y la información obtenida demostraron un monitoreo de las variables

críticas para un proceso bajo control, lo cual proporciona un alto grado de seguridad

100

a la validación realizada donde se producirán constantemente las mismas

características obteniendo resultados confiables y reproducibles.

Los resultados demuestran que la técnica de filtración por membrana para evaluar

los filtros de acetato y nitrocelulosa evaluada es precisa, reproducible al tener en

cuenta que se realizó diferentes días y es repetible ya que se realizó por el mismo

analista y con el mismo equipo.

Se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y los pasos a

seguir para el buen desarrollo de la validación con la recopilación de la información

que se realizó.

La calibración y el mantenimiento de los equipos es un paso importante dentro de la

metodología de validación; los equipos utilizados durante las diferentes pruebas

realizadas se encontraban funcionando correctamente y dentro de los rangos

esperados, por lo tanto se debe contar con un cronograma de mantenimiento

preventivo vigente. (Ver Tabla Nº 8)

Los resultados de la prueba organoléptica mostraron que los medios de cultivo

cumplen con las especificaciones de color, textura y aspecto según las casas

comerciales y la USP 29, indicando su calidad para la obtención de resultados en la

metodología realizada. (Ver Tabla Nº 9)

La prueba de promoción de crecimiento demostró que los medios de cultivo Fluido

de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja contienen los nutrientes necesarios para el

desarrollo y crecimiento de los microorganismos evaluados. (Ver tabla Nº 10)

El crecimiento de los microorganismos contaminantes en los medios de cultivo

líquidos en los 3 ensayos realizados se evaluó en un tiempo de 2 y 5 días de

incubación, en los medios de cultivo líquidos se observó turbidez en menor tiempo

de lo esperado, por lo cual se determinó para cada microorganismo su curva de

crecimiento en ambos medios, los resultados se obtuvieron por medo del método

espectrofotométrico.

101

Después de evaluar los medios de cultivo inoculados mediante espectrofotometría

se evidenció el crecimiento de los microorganismos contaminantes mediante

turbidez evidenciada por la disminución del porcentaje de tramitancia durante el

tiempo evaluado.

Los microorganismos crecieron en ambos medios de cultivo debido a que estos no

contienen sustancias inhibitorias y poseen sustancias nutritivas que ayudan al

crecimiento de bacterias, hongos y levaduras.

El medio Fluido de Tioglicolato es utilizado principalmente para microorganismos

anaerobios, como Clostridium sporogenes, por su contenido de sustancias

reductoras y su alta viscosidad, también crecen microorganismos aerobios y

microaerofílicos al poseer componentes como dextrosa, peptona de caseína y

extracto de levadura, los cuales proveen los factores de crecimiento necesarios para

la replicación. (ZIMBRO y POWER, 2003) Por lo cual para el trabajo realizado los

resultados de tramitancia obtenidos reflejan una disminución aproximada del 25% –

30% a las 24 horas de inoculación. Sin embargo, Clostridium sporogenes fue el

microorganismo que presentó mayor porcentaje de tramitancia en este tiempo (ver

Tabla Nº 13) es decir su crecimiento fue menor.

Esto se atribuye a que en cada tiempo evaluado al tomar la muestra se pudo

introducir oxígeno atmosférico o aumentó el oxígeno por alguna agitación del frasco

y éste es un microorganismo anaerobio que necesita total ausencia de oxígeno.

En el medio Digerido Caseína-Soja se presentó crecimiento de bacterias aerobias,

hongos y levaduras, debido a que este medio de cultivo es altamente nutritivo por la

combinación de peptonas de caseína y soya y se encuentra exento de sustancias

inhibidoras lo cual soporta el crecimiento de gran variedad de microorganismos

exigentes y no exigentes. (ZIMBRO y POWER, 2003)

A las 24 horas de evaluación de los microorganismos en el medio Digerido Caseína-

Soja se obtuvo una disminución entre el 13% y 18% de tramitancia comparado con

el medio Fluido de Tioglicolato para Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,

Aspergillus niger y Staphylococcus aureus. (Ver Tablas Nº 16, 18, 22 y 24). Bacillus

subtilis presentó menor crecimiento a las 24 horas pero durante todo el tiempo

102

evaluado se observó mayor crecimiento y por lo tanto disminución del porcentaje de

tramitancia. (Ver Tabla Nº 20)

Durante las 100 horas evaluadas se encontró que Clostridium sporogenes no creció

en el medio Digerido Caseína-Soja debido a que este microorganismo es anaerobio

y el medio no posee las condiciones ni sustancias reductoras apropiadas para su

crecimiento. La falta de crecimiento se determinó al obtener por espectrofotometría

valores altos de % de tramitancia y valores cercanos al valor de tramitancia del

tiempo inicial (ver Tabla Nº 14), esto demuestra que no se presentó turbidez en el

medio de cultivo, a diferencia de los otros microorganismos evaluados en el mismo

medio.

El tiempo requerido para el crecimiento evidenciado por turbidez puede ser

considerado como la suma de dos etapas, una fase donde los microorganismos se

preparan para crecer, y el tiempo de generación requerido para un bajo nivel de

crecimiento donde éstos son visibles a la visión humana, la concentración de los

microorganismos es aproximadamente 107 UFC/mL. (MOLDENHAUER y SUTTON,

2004)

Los resultados mostraron que en las primeras horas después de la inoculación de

los microorganismos en los dos medios de cultivo los valores del porcentaje de

tramitancia disminuyeron en menor proporción con relación a las demás horas

evaluadas. Esto determina que los microorganismos tuvieron una fase de

adaptación durante las primeras seis horas aproximadamente, donde los

microorganismos empezaron a tomar los nutrientes del medio para su posterior

replicación. Para luego presentarse un crecimiento determinado por valores de %

tramitancia muy bajos y la presencia de turbidez.

La linealidad fue determinada mediante el software Validation Manager, evaluando

los datos de % de tramitancia obtenidos para cada microorganismo contaminante en

los medios de cultivo líquidos durante 100 horas evaluadas.

Para cada microorganismo inoculado en los medios de cultivo se determinó la

regresión lineal y el coeficiente de correlación, observándose que hay una relación

directa entre las dos variables, en este caso a medida que aumenta el tiempo el

103

microorganismo produce biomasa presentandose turbidez lo que provoca la

disminución del porcentaje de tramitancia del medio de cultivo.

A partir de cada regresión lineal calculada se obtuvo la ecuación de la recta la cual

puede ser utilizada para estimar porcentajes de tramitancia en valores de tiempo no

evaluados, demostrándose así una relación directamente proporcional entre las dos

variables estimadas.

El coeficiente de correlación calculado para cada curva evaluada fue superior a 0.9

valor que para crecimiento y cuantificación microbiano es óptimo, siendo los

menores valores 0,92 y 0,93 obtenidos para Bacillus subtilis en los medios Fluido de

tioglicolato y Digerido caseína-soja respectivamente (ver figuras Nº 29 y 30). Estos

coeficientes demuestran resultados para la regresión lineal donde existe un alto

grado de asociación y una relación directa entre las dos variables (tiempo vs.

crecimiento microbiano), obteniendo así un modelo lineal.

Para verificar que el recuento de los microorganismos no fuera mayor a 100

UFC/mL se sembraron en los medios sólidos agar Casoy y agar HC según lo indica

la USP 29. Esto se evidenció en los tres días de ensayo para la prueba de

promoción de crecimiento en los resultados obtenidos para Candida albicans,

Aspergillus niger y Clostridium sporogenes los cuales tuvieron recuentos entre 20 y

100 UFC/mL, y para los recuentos de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y

Pseudomonas aeruginosa en el segundo y tercer ensayo. (Ver Tabla Nº 11)

Los resultados obtenidos en los recuentos de Staphylococcus aureus y

Pseudomonas aeruginosa se relacionan con la disminución del porcentaje de

tramitancia durante el tiempo evaluado, especialmente durante las primeras 24

horas en el medio Fluido de Tioglicolato.

Por otro lado la prueba de esterilidad de los medios de cultivo se realizó a cada lote

de esterilización y se incubaron los medios durante 14 días, tiempo durante el cual

se evidenciaron resultados satisfactorios ya que no existió crecimiento de ningún

microorganismo contaminante en los medios de cultivo utilizados en la técnica de

filtración por membrana, estos medios de cultivo se dejaron como controles

negativos de la prueba de esterilidad.

104

Gracias a los resultados derivados de las pruebas preliminares se continuó con los

ensayos de la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad, ya

que de haber observado resultados no satisfactorios la prueba sería no válida. (USP

29, 2006)

Los resultados obtenidos a partir de los cinco días de montaje de la técnica de

filtración por membrana fueron satisfactorios ya que en los ensayos realizados con

los filtros de acetato y nitrato de celulosa evaluados se observó crecimiento de los

microorganismos inoculados en los diluyentes, los cuales fueron filtrados y la

membrana sembrada en los medios Fluido Tioglicolato y Digerido Caseína Soja,

verificando de esta forma la retención microbiana en los filtros por la presencia de

crecimiento microbiano en los medio de cultivo.

Los seis microorganismos utilizados en la prueba crecieron satisfactoriamente en los

medios líquidos (ver Tablas Nº 27, 28, 29, 30 y 31), es decir fueron retenidos en los

filtros de acetato y nitrato de celulosa y utilizaron los nutrientes de los medios de

cultivo para promover su crecimiento. En el montaje 2 correspondiente al 21 de abril

de 2007 se observó menor turbidez en los medios Fluido de Tioglicolato que

poseían los filtros de membrana contaminados con Clostridium sporogenes. El

medio que contenía la membrana de nitrato de celulosa se sembró en agar Casoy

después de los 14 días de incubación, en éste medio de cultivo sólido se evidenció

crecimiento al cual se le realizó coloración de Gram observando la presencia de

bacilos Gram positivos.

En todos los ensayos realizados por la técnica filtración por membrana los medios

Digerido Caseína-Soja adicionados con los filtros de acetato y nitrato de celulosa

contaminados con Clostridium sporogenes no presentaron turbidez, esto se debe a

que éste medio de cultivo es adecuado para el crecimiento de hongos, levaduras y

bacterias aerobias (ZIMBRO y POWER, 2003), y no para bacterias anaerobias

como es el caso de Clostridium sporogenes.

Estos resultados se relacionan con la prueba de promoción de crecimiento apoyada

por espectrofotometría, donde el medio Digerido Caseína-Soja inoculado con

105

Clostridium sporogenes no presentó disminución del % de tramitancia, esto quiere

decir que el microorganismo no creció.

Al comparar los dos filtros de membrana acetato y nitrato de celulosa con un tamaño

de poro de 0,45µm se observó que éstos retienen microorganismos contaminantes,

de esta forma se puede asegurar su uso en las pruebas de esterilidad con

resultados óptimos y confiables.

A partir de cada filtración se adicionó el fluido filtrado en los medios de cultivo

obteniendo resultados satisfactorios (ver Tablas Nº 32, 33 y 34) al no presentarse

turbidez durante los 14 días de incubación. Esto demuestra que el diluyente

después de ser filtrado no contiene microorganismos contaminantes debido a que

éstos quedaron retenidos en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en

la prueba de esterilidad dejando así el líquido filtrado estéril.

Para evitar falsos positivos y posibles repeticiones es importante tener en cuenta el

buen manejo del equipo de filtración ya que al desarrollarse la prueba de esterilidad

en un sistema abierto existe mayor riesgo de contaminación cruzada, por esto es

crucial el ajuste del equipo, la ubicación del filtro de membrana dentro del embudo y

la mínima manipulación, que pueden generar falsos positivos y posibles

repeticiones.

En el estudio realizado se evaluó el control negativo de cada montaje de la técnica

de filtración por membrana donde solamente se filtró el diluyente estéril y se

incubaron los medios de cultivo con los filtros de membrana. Estos resultados fueron

satisfactorios al no presentar turbidez en los medios, lo que demuestra que no se

presentaron falsos positivos que afecten la validez de la prueba.

Durante el tiempo empleado en cada ensayo de la técnica de filtración de

membrana se realizó el control ambiental y de personal, los resultados obtenidos

cumplen (ver Tablas Nº 25 y 26) según los límites microbianos manejados por AQM

Ltda. (Ver Tablas Nº 6 y 7) Estos resultados aseguran que las condiciones de

trabajo para la prueba de esterilidad fueron controladas, obteniendo resultados

satisfactorios durante todos los ensayos de la técnica evaluada.

106

Al realizar las pruebas bajo condiciones ambientales controladas se reducen falsos

positivos por contaminación microbiana cruzada y se garantiza la asepsia del área

donde se realiza la prueba de esterilidad. El proceso de limpieza y desinfección del

área de trabajo, en este caso del área estéril, fueron primordiales para obtener

buenos resultados durante la validación y a futuro para el análisis diario de la prueba

de esterilidad para la técnica de filtración por membrana.

Las pruebas realizadas mostraron resultados satisfactorios gracias al correcto

procedimiento empleado durante la validación, el personal capacitado con las

habilidades para el manejo de equipos y materiales, y el uso de equipos calificados

y validados que funcionan de la forma esperada.

8. CONCLUSIONES

Se realizó la validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y

nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45µm empleados en la

107

técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad,

obteniéndose resultados satisfactorios y reproducibles.

Se comprobó que en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un

tamaño de poro de 0,45µm utilizados en la técnica de filtración por

membrana retienen y recuperan satisfactoriamente los microorganismos

contaminantes, esto se observa por la turbidez presentada en los medios de

cultivo líquidos, los resultados se confirmaron por coloración de Gram.

La retención y recuperación de los microorganismos en los filtros de acetato

y nitrato de celulosa se determinó con el líquido filtrado que se inoculó en los

medios de cultivo; los resultados obtenidos no presentaron turbidez es decir

no hubo crecimiento microbiano.

Se confirmaron las condiciones de montaje de la técnica de filtración por

membrana siguiendo los parámetros de la USP 29 mediante la obtención de

resultados que optimizan la técnica reduciendo repeticiones y minimizando

riesgos en las pruebas.

Se verificó mediante la prueba de promoción de crecimiento que los medios

de cultivo Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja utilizados en la

prueba de esterilidad poseen los nutrientes necesarios para favorecer el

crecimiento de microorganismos contaminantes.

El crecimiento de los microorganismos utilizados en la prueba de promoción

de crecimiento se verificó mediante espectrofotometría observándose

disminución del % de tramitancia que indica el crecimiento de los

microorganismos en los medios de cultivo, este crecimiento fue determinado

en menos de 24 horas.

El crecimiento de los microorganismos presenta un modelo lineal

demostrando así una relación directamente proporcional entre las variables,

tiempo y crecimiento microbiano.

108

De acuerdo a los resultados obtenidos se actualizó el procedimiento

operativo estándar POSM0017 – P002 “PROCEDIMIENTO PARA LA

REALIZACIÓN DE PRUEBAS DE ESTERILIDAD” para la ejecución de la

técnica de filtración por membrana empleada en el análisis de esterilidad en

el laboratorio de Análisis Microbiológico y Químico AQM Ltda.

La capacitación oportuna de los analistas minimiza posibles errores, los

riesgos de contaminación y asegura resultados confiables durante la

validación y el transcurso habitual de las pruebas realizadas en el

laboratorio.

El funcionamiento y el mantenimiento preventivo de los equipos garantizan

que los procedimientos realizados y los resultados obtenidos son confiables

para el estudio realizado.

La calidad de los medios de cultivo trabajados presentaron una característica

importante para la recuperación de los microorganismos y la interpretación

de resultados confiables, evitando falsos positivos.

109

9. RECOMENDACIONES

Es importante el buen manejo del equipo de filtración durante el análisis de

productos estériles, mediante la técnica de filtración por membrana en un

sistema abierto, por lo que se recomienda tener en cuenta el ajuste del

equipo y los embudos, la ubicación del filtro de membrana dentro del

embudo y la mínima manipulación del equipo para evitar cualquier

contaminación cruzada.

Teniendo en cuenta los tiempos de crecimiento y recuperación de los

microorganismos se sugiere un monitoreo visual frecuente de los medios de

cultivo, Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja, para una rápida

detección de microorganismos contaminantes en productos evaluados.

Al monitorear el medio de cultivo Fluido de Tioglicolato se debe evitar la

agitación para mantener las condiciones de anaerobiosis y así poder

recuperar microorganismos anaerobios contaminantes como Clostridium

sporogenes.

La actualización y revisión periódica de acuerdo a la normatividad es

importante para el éxito de la pruebas y para obtener resultados óptimos y

confiables.

Es fundamental el empleo de los microorganismos establecidos por la USP

para la evaluación de controles positivos y así verificar la efectividad de la

técnica de filtración.

110

10. BIBLIOGRAFÍA

ALEEM, H. ZHAO, Y. LORD, S. McCARTHY, T. SHARRATT, P. 2003.

Pharmaceutical process validation: an overview. Journal Process Mechanical

Engineering. Vol. 213: 141-151.

ALLISON, D. 1999. A review: Taking the sterile out of sterility. Journal of Applied

Microbiology, Volumen 87: 789 – 793.

AUSTRALIAN GOVERNMENT. DEPARTMENT OF HEALTH AND AGEING

THERAPEUTIC GOODS ADMINISTRATION. 2006. TGA Guidelines for Sterility

Testing of Therapeutic Goods. Págs 3-33.

AULTON, M. 2004. Farmacia la ciencia del diseño de las formas farmacéuticas.

Segunda edición. Editorial El Sevier. Madrid. España. Págs 638 – 640.

AVENDANO, J. MOYANO, E. 1997. Desafío de los métodos: filtración por

membrana frente a placa fluida para el análisis microbiológico en bebidas no

alcohólicas. Bacteriología. Pontificia Universidad Javeriana. Facultas de Ciencias.

Bogotá.

BARRAGÁN, D. GARCÍA, L. 2001. Validación de las pruebas de esterilidad e

inocuidad de la vacuna antiamarílica. Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad

Javeriana. Facultas de Ciencias. Bogotá.

CASTILLO, B. GONZALEZ, R. 1996. Protocolo de validación de métodos analíticos

para la cuantificación de fármacos. Revista Cubana de Farmacia. Enero-abril.

Vol.30, No.1.

Catalogo Sartorius. Sterility Testing System.

111

CORTÉS, A. SANDINO, C. ARIAS, J. 2003. Validación de la prueba de esterilidad

para vacunas virales en vehículos oleoso y acuoso. Revista de la Facultad de

Farmacia Vol. 45 (1): 36-43.

ESCOBAR, M. 2002. Fundamentos de Microbiología. Tercera edición. CEJA.

Bogotá. Colombia. Págs 202-204.

EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0. 2004. Biological Test. Sterility. (2.6). Págs

145-149.

FISHER, R. 1970. Análisis químico cuantitativo. Tercera Edición. Editorial

Interamericana. México. Págs 478, 479, 481.

FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. FDA. 2003. Ora Laboratory Procedure,

Assuring the quality of test results. Págs 1 – 12.

FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. FDA. 2005. Ora Laboratory Procedure,

Methods, method verification and validation. Págs 1 – 14.

GARCIA, C. FERNANDEZ, D. NUÑEZ, L. GÓMEZ, M. MARTINEZ, V. 2005.

Validación de los métodos analíticos para el control de la calidad y estudio de

estabilidad del salbutamol 0,5 % en solución nebulizadora. Revista Cubana de

Farmacia. Mayo-agosto. Vol.39, No.2.

GONZÁLEZ, C. 2005. Validación retrospectiva y control estadístico de procesos en

la industria farmacéutica. Química Farmacéutica. Universidad de Chile. Facultad de

ciencias químicas y farmacéuticas. Santiago de Chile.

HERNÁNDEZ, L. VÁSQUEZ, D. 2002. Estudio preliminar para la validación de

técnicas en el análisis microbiológico de insumos, aguas y productos terminados no

estériles en una industria farmacéutica. Microbiología Industrial. Pontificia

Universidad Javeriana. Facultas de Ciencias. Bogotá.

112

HUGO, W. RUSSEL, A. 1998. Pharmaceutical microbiology. Sexta edición.

Blackwell Science. Gran Bretaña. Págs. 19 - 23, 274, 310 – 315, 320 – 322.

INTERNET: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf

http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf

JAIME, C. 2002. Validación de desinfectantes usados en las áreas de producción en

una industria farmacéutica en Bogotá. Microbiología Industrial. Pontificia Universidad

Javeriana. Facultas de Ciencias. Bogotá.

MEDINA, J. QUINTANA, S. 2002. Validación microbiológica de las áreas de

producción de la vacuna contra la fiebre amarilla y laboratorios de aseguramiento de

la calidad en el Instituto Nacional de Salud. Microbiología Industrial. Pontificia

Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá.

MERCK. 1998. Manual de medios de cultivo. Págs 70, 249.

MILLPORE. 2000. Effect of Membrane Filter Pore Size on Microbial Recovery and

Colony Morphology. Págs. 1-3.

MILLPORE. 2005. Sterility testing media and rinse solutions. Págs. 1, 2.

MOLDENHAUER, J. SUTTON, S. 2004. Towards an improved sterility test. Journal

of Pharmaceutical Science Tecnology. Volumen 58 (6): 284-286.

PEARCE, G. 2007. Introduction to membranes: Filtration for water and wastewater

treatment. Filtration & Separation. Vol 44 (2): 24-27.

PRADEAU, D. 1997. Análisis y control de calidad en los medicamentos. Volumen 3.

Primera edición. Editorial Limusa S.A. México. Págs. 869, 871, 875.

RICHTER, S. 2006. Sterility testing, white paper. Microtest Laboratories Inc. Estados

Unidos. Págs. 3 - 8.

113

THE UNITED STATES PHARMACOPEIA. USP 29. 2006. Pruebas Microbiológicas.

Pruebas de Esterilidad (71). Págs. 2728 – 2733.

THE UNITED STATES PHARMACOPEIA. USP 29. 2006. Validación de Métodos

Farmacopeicos (1225). Págs 3328 – 3331.

WORLD HEALTH ORGANIZATION. 1997. Quality assurance of pharmaceuticals, a

compendium of guidelines and related materials. Volumen 1. Geneva. Págs 78, 110,

119, 120.

ZIMBRO, M. POWER, D. 2003. Manual of microbiological culture media. Difco y BBL

manual. Estados Unidos. Págs. 231,232, 257, 258, 357, 358, 554, 555, 588- 590.

114

11. ANEXOS

SOPORTE ESTADÍSTICO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO OBTENIDAS EN

LA PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO REALIZADO POR EL

SOFTWARE VALIDATION MANAGER

Anexo 1. Clostridium sporogenes en el medio Fluido de Tioglicolato.

1. Resultados

El modelo usado es: bXaY +=

El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:

Número de valores 33

Número de repeticiones 3

Curva crecimiento

# Tiempo %T Residuales

1 2 94.159 3.276

2 2 94.714 3.831

3 2 94.437 3.554

4 4 90.196 1.168

5 4 90.024 0.996

6 4 90.110 1.082

7 6 89.603 2.430

8 6 88.497 1.324

9 6 89.050 1.877

115

Curva crecimiento


10 8 82.024 -3.294

11 8 82.024 -3.294

12 8 82.024 -3.294

13 28 69.471 2.703

14 28 67.429 0.661

15 28 68.450 1.682

16 32 59.556 -3.502

17 32 59.821 -3.237

18 32 59.689 -3.369

19 48 50.619 2.401

20 48 49.867 1.649

21 48 50.243 2.025

22 52 45.736 1.228

23 52 41.830 -2.678

24 52 43.783 -0.725

25 56 34.202 -6.596

26 56 34.148 -6.650

27 56 34.175 -6.623

28 96 4.552 0.855

29 96 4.496 0.799

30 96 4.524 0.827

31 100 2.955 2.968

32 100 2.947 2.960

33 100 2.951 2.964

116

1.1 Curva de calibración

Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50

1.2. Cuadro de residuales

Nivel de confianza para los residuales: 97.50

117

1.3. Análisis de la varianza de la linealidad Nivel de confianza 97.5

t- Student 2.021

Intercepto Y 9.27380e+001

- Varianza 7.24286e-001

- Intervalo de confianza 1.71997e+000

Pendiente -9.27505e-001

- Varianza 2.72028e-004

- Intervalo de confianza 3.33329e-002

Coeficiente de correlación r 0.995134

Coeficiente de determinación r² 0.990293

Varianza de la regresión SI² 3.18011e+004

Varianza residual SR² 1.00559e+001

Suma residual de cuadrados 3.11734e+002

Varianza del error experimental SE² 4.91575e-001

Varianza del error de la regresión SL² 3.34355e+001

1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1) Nivel de confianza 95.00

Grados de libertad (1,2) 1 , 31

F tabulado 4.080

F calculado 3162.419

El test F de Fisher es satisfactorio.

1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0 Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50

Grados de libertad 31

t tabulado 2.021

t calculado 108.969

El intercepto-Y es diferente de cero.

118

2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN

Análisis de la varianza de la linealidad

InterceptoY : 9.27380e+001

Pendiente : -9.27505e-001

Coeficiente de determinación r² : 0.990293

Anexo 2. Clostridium sporogenes en el medio Digerido Caseína-soja.

1. Resultados



Número de datos 30


Curva crecimiento


1 2 99.786 -0.155

2 2 99.935 -0.006

3 2 99.861 -0.080

4 4 99.622 -0.208

5 4 99.605 -0.225

6 4 99.613 -0.217

7 6 99.682 -0.036

119

Curva crecimiento


8 6 99.668 -0.050

9 6 99.675 -0.043

10 24 99.363 0.650

11 24 99.405 0.692

12 24 99.384 0.671

13 28 98.212 -0.278

14 28 98.184 -0.306

15 28 98.198 -0.292

16 56 97.457 0.530

17 56 97.499 0.572

18 56 97.478 0.551

19 72 95.734 -0.300

20 72 95.840 -0.194

21 72 95.787 -0.247

22 78 94.983 -0.716

23 78 95.085 -0.614

24 78 95.034 -0.665

25 96 94.740 0.046

26 96 94.699 0.005

27 96 94.720 0.026

28 100 94.818 0.347

29 100 94.719 0.248

30 100 94.769 0.298

120

1.1. Curva de calibración




121

1.3. Análisis de la varianza de la linealidad

Nivel de confianza 97.5

t- Student 2.048


- Varianza 1.40563e-002



- Varianza 4.01194e-006





Varianza residual SR² 1.60322e-001



Varianza del error de la regresión SL² 5.57370e-001

1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)



F tabulado 5.610

F calculado 776.620


1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0

Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50


t tabulado 2.048

t calculado 843.909


122

2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN


Intercepto Y : 1.00053e+002

Pendiente: -5.58190e-002


Anexo 3. Staphylococcus aureus en medio Fluido de Tioglicolato.

1. Resultados



Número de datos 42


Linealidad

# Tiempo (horas) % T Residuales

1 2 92.443 3.967

2 2 92.380 3.904

3 2 92.412 3.936

4 4 90.638 3.810

5 4 89.473 2.645

6 4 90.056 3.228

7 6 87.130 1.950

123

Linealidad


8 6 87.077 1.897

9 6 87.104 1.924

10 8 81.850 -1.682

11 8 81.974 -1.558

12 8 81.972 -1.560

13 24 70.702 0.353

14 24 71.697 1.348

15 24 71.200 0.851

16 28 65.708 -1.345

17 28 65.663 -1.390

18 28 65.686 -1.367

19 32 60.215 -3.543

20 32 60.442 -3.316

21 32 60.329 -3.429

22 48 51.022 0.448

23 48 53.612 3.038

24 48 52.317 1.743

25 52 42.057 -5.222

26 52 42.652 -4.627

27 52 42.355 -4.924

28 56 39.414 -4.569

29 56 40.194 -3.789

30 56 39.804 -4.179

31 72 28.676 -2.124

32 72 28.667 -2.133

33 72 28.672 -2.128

34 78 21.478 -4.378

35 78 21.498 -4.358

36 78 21.488 -4.368

124

Linealidad


37 96 16.336 5.311

38 96 17.312 6.287

39 96 16.824 5.799

40 100 12.255 4.526

41 100 12.238 4.509

42 100 12.247 4.518



125





t-Student 2.021


- Varianza 8.41670e-001



- Varianza 2.86477e-004






126


Varianza de error experimental SE² 1.97351e-001


1.4. Test para la existencia de una pendiente significatica (F1)



F tabulado 4.080






t tabulado 2.021

t calculado 98.236


2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN





127

Anexo 4. Staphylococcus aureus en medio Digerido Caseína-soja.

1. Resultados


El test de linealidad dió los siguientes resultados:

Número de datos 39


Linealidad

# Tiempo (horas) %Tramitancia Residuales

1 2 95.015 -1.085

2 2 95.002 -1.098

3 2 95.009 -1.091

4 4 92.537 -1.653

5 4 93.573 -0.617

6 4 93.055 -1.135

7 6 90.666 -1.615

8 6 90.545 -1.736

9 6 90.606 -1.675

10 8 88.498 -1.873

11 8 88.576 -1.795

12 8 88.537 -1.834

13 12 81.495 -5.057

14 12 81.485 -5.067

15 12 81.488 -5.064

16 28 77.521 6.245

17 28 76.424 5.148

18 28 76.973 5.697

128

Linealidad

# Tiempo (horas) %Tramitancia Residuales

19 32 72.766 5.309

20 32 70.407 2.950

21 32 71.587 4.130

22 52 58.249 9.887

23 52 58.039 9.677

24 52 58.144 9.782

25 56 46.727 2.184

26 56 46.169 1.626

27 56 46.448 1.905

28 72 25.725 -3.542

29 72 25.719 -3.548

30 72 25.722 -3.545

31 78 16.457 -7.082

32 78 16.499 -7.040

33 78 16.478 -7.061

34 96 5.887 -0.467

35 96 5.857 -0.497

36 96 5.872 -0.482

37 100 2.923 0.388

38 100 2.897 0.362

39 100 2.910 0.375

129





130



T Student 2.021


- Varianza 1.27636e+000



- Varianza 4.32147e-004










F tabulado 4.080






t tabulado 2.021

t calculado 86.752


131

2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN Análisis de la varianza de la linealidad


Pendiente: -9.54747e-001

Coeficiente de determinación r² : 0.982761 Anexo 5. Pseudomonas aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato.

1. Resultados



Número de datos 36


Curva de crecimiento


1 2 90.093 3.103

2 2 90.052 3.062

3 2 90.073 3.083

4 4 86.592 1.477

5 4 86.165 1.050

6 4 86.379 1.264

7 6 84.804 1.565

8 6 84.931 1.692

9 6 84.868 1.629

132

Curva de crecimiento


10 8 78.415 -2.948

11 8 78.280 -3.083

12 8 78.348 -3.015

13 24 62.947 -3.410

14 24 62.838 -3.519

15 24 62.893 -3.464

16 28 60.675 -1.930

17 28 60.484 -2.121

18 28 60.580 -2.025

19 48 50.601 6.754

20 48 50.951 7.104

21 48 50.776 6.929

22 56 41.084 4.740

23 56 40.906 4.562

24 56 40.995 4.651

25 72 11.517 -9.821

26 72 11.547 -9.791

27 72 11.532 -9.806

28 78 6.678 -9.033

29 78 6.686 -9.025

30 78 6.682 -9.029

31 96 3.430 4.601

32 96 3.363 4.534

33 96 3.397 4.568

34 100 0.294 5.217

35 100 0.296 5.219

36 100 0.295 5.218

133





134



T Student 2.021


- Varianza 2.08604e+000



- Varianza 6.69247e-004












F tabulado 4.080






t tabulado 2.021

t calculado 61.528


135

2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN





Anexo 6. Pseudomonas aeruginosa en medio Digerido Caseína-soja.

1. Resultados



Número de datos 42


Linealidad


1 2 98.081 -2.152

2 2 98.070 -2.163

3 2 98.076 -2.157

4 4 96.982 -1.153

5 4 96.896 -1.239

6 4 96.939 -1.196

7 6 94.207 -1.830

136

Linealidad


8 6 94.176 -1.861

9 6 94.192 -1.845

10 8 89.919 -4.020

11 8 89.046 -4.893

12 8 89.483 -4.456

13 24 79.575 2.422

14 24 80.648 3.495

15 24 80.097 2.944

16 28 80.763 7.806

17 28 80.624 7.667

18 28 80.694 7.737

19 32 75.993 7.233

20 32 73.185 4.425

21 32 74.589 5.829

22 48 53.269 1.294

23 48 52.434 0.459

24 48 52.852 0.877

25 52 42.054 -5.724

26 52 44.894 -2.884

27 52 43.474 -4.304

28 56 48.317 4.735

29 56 47.754 4.172

30 56 48.036 4.454

31 72 20.253 -6.544

32 72 23.023 -3.774

33 72 21.638 -5.159

34 78 13.307 -7.195

35 78 13.231 -7.271

36 78 13.269 -7.233

137

Linealidad


37 96 1.732 0.114

38 96 1.675 0.057

39 96 1.704 0.086

40 100 1.877 4.455

41 100 1.797 4.375

42 100 1.837 4.415



138





t Student 2.021

InterceptoY 1.02331e+002

- Varianza 1.35009e+000


Pendiente -1.04909e+000

- Varianza 4.59527e-004







139






F tabulado 4.080






t tabulado 2.021

t calculado 88.070


2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN


Intercepto Y: 1.02331e+002

Pendiente : -1.04909e+000


140

Anexo 7. Bacillus subtilis en medio Fluido de Tioglicolato.

1. Resultados



Número de datos 27


Curva crecimiento


1 6 60.677 11.020

2 6 60.301 10.644

3 6 60.489 10.832

4 8 51.784 3.276

5 8 52.156 3.648

6 8 51.970 3.462

7 24 35.820 -3.497

8 24 36.209 -3.108

9 24 36.015 -3.302

10 28 31.648 -5.371

11 28 32.052 -4.967

12 28 31.850 -5.169

13 32 26.018 -8.703

14 32 27.802 -6.919

15 32 26.910 -7.811

16 72 7.439 -4.304

17 72 6.445 -5.298

18 72 6.942 -4.801

19 76 6.681 -2.764

20 76 6.445 -3.000

141

Curva crecimiento # Tiempo %T Residuales

21 76 6.942 -2.503

22 96 2.043 4.087

23 96 2.954 4.998

24 96 2.499 4.543

25 100 0.659 5.001

26 100 0.664 5.006

27 100 0.662 5.004


Nivel de confianza para la curva: 97.50

142



1.3. Análisis de la varianza de la linealidad Nivel de confianza 97.5

t Student 2.06


- Varianza 4.04528e+000



- Varianza 1.11474e-003





143





1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1) Nivel de confianza 95.00


F tabulado 4.240

F calculado 296.029




t tabulado 2.060

t calculado 26.403


2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN

Análisis de la vaianza de la linealidad

InterceptoY: 5.31037e+001



144

Anexo 8. Bacillus subtilis en medio Digerido Caseína-soja.

1. Resultados



Número de datos 30



1 2 96.826 -5.816

2 2 97.185 -5.457

3 2 97.006 -5.636

4 4 96.493 -4.590

5 4 96.877 -4.206

6 4 96.685 -4.398

7 6 95.000 -4.524

8 6 95.276 -4.248

9 6 95.138 -4.386

10 8 95.695 -2.270

11 8 94.988 -2.977

12 8 95.342 -2.623

13 24 94.199 8.707

14 24 96.324 10.832

15 24 95.262 9.770

16 32 91.534 12.279

17 32 94.418 15.163

18 32 92.976 13.721

19 72 56.888 8.816

20 72 56.481 8.409

145

21 72 56.685 8.613

22 76 34.111 -10.842

23 76 33.676 -11.277

24 76 33.894 -11.059

25 96 23.053 -6.309

26 96 24.130 -5.232

27 96 23.592 -5.770

28 100 28.323 2.080

29 100 27.732 1.489

30 100 27.982 1.739



146





t Student 2.048


- Varianza 4.76619e+000



- Varianza 1.49429e-003







147






F tabulado 4.200

F calculado 406.714




t tabulado 2.048

t calculado 47.730


2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN





148

Anexo 9. Candida albicans en medio Fluido de Tioglicolato.

1. Resultados


El test de la linealidad del método dío los siguientes resultados:

Número de datos 36


Curva Crecimiento


1 2 91.473 4.220

2 2 91.478 4.225

3 2 91.476 4.223

4 4 90.439 5.082

5 4 90.346 4.989

6 4 90.393 5.036

7 6 87.901 4.439

8 6 88.050 4.588

9 6 87.976 4.514

10 8 79.224 -2.342

11 8 78.753 -2.813

12 8 78.989 -2.577

13 24 62.556 -3.846

14 24 62.482 -3.920

15 24 62.519 -3.883

16 28 57.607 -5.004

149

Curva Crecimiento


17 28 58.667 -3.944

18 28 58.137 -4.474

19 52 34.070 -5.794

20 52 31.671 -8.193

21 52 32.871 -6.993

22 56 36.184 0.111

23 56 36.110 0.037

24 56 36.147 0.074

25 72 20.938 0.029

26 72 20.931 0.022

27 72 20.935 0.026

28 78 8.127 -7.096

29 78 8.155 -7.068

30 78 8.141 -7.082

31 96 3.216 5.053

32 96 3.232 5.069

33 96 3.224 5.061

34 100 0.447 6.075

35 100 0.448 6.076

36 100 0.448 6.076

150





151



t Student 2.021


- Varianza 1.68437e+000



- Varianza 5.34665e-004












F tabulado 4.080


The Fisher F test is satisfactory.




t tabulado 2.021

t calculado 68.690


152

2. Conclusiones

Linealidad

RESUMEN


Intercepto Y: 8.91481e+001



Anexo 10. Candida albicans en medio Digerido Caseína-soja

1. Resultados



Número de datos 33


Curva Crecimiento


1 2 90.447 -3.845

2 2 90.493 -3.799

3 2 90.470 -3.822

4 4 90.576 -1.799

5 4 90.559 -1.816

6 4 90.568 -1.807

7 6 90.072 -0.387

153

Curva Crecimiento


8 6 90.151 -0.308

9 6 90.112 -0.347

10 8 83.141 -5.402

11 8 83.127 -5.416

12 8 83.134 -5.409

13 24 76.325 3.111

14 24 76.333 3.119

15 24 76.329 3.115

16 28 76.911 7.530

17 28 76.965 7.584

18 28 76.938 7.557

19 52 52.901 6.514

20 52 52.629 6.242

21 52 52.765 6.378

22 56 47.268 4.713

23 56 47.010 4.455

24 56 47.139 4.584

25 78 12.228 -9.249

26 78 12.111 -9.366

27 78 12.170 -9.307

28 96 2.859 -1.372

29 96 2.823 -1.408

30 96 2.841 -1.390

31 100 0.853 0.454

32 100 0.843 0.444

33 100 0.848 0.449

154





155



t Student 2.021


- Varianza 1.82289e+000



- Varianza 6.14709e-004












F tabulado 4.080






t tabulado 2.021

t calculado 71.257


156

2. Conclusiones

Linealidad





Anexo 11. Aspergillus niger en medio Fluido de Tioglicolato.

1.1 Resultados



Número de datos 36


Curva Crecimiento


1 2 93.918 5.891

2 2 92.766 4.739

3 2 93.342 5.315

4 4 90.380 4.163

5 4 90.425 4.208

6 4 90.403 4.186

7 6 84.581 0.175

8 6 84.592 0.186

9 6 84.587 0.181

10 8 77.329 -5.267

157

Curva Crecimiento


11 8 77.265 -5.331

12 8 77.297 -5.299

13 24 66.302 -1.812

14 24 66.284 -1.830

15 24 66.293 -1.821

16 28 57.064 -7.430

17 28 57.171 -7.323

18 28 57.118 -7.376

19 32 57.814 -3.059

20 32 55.475 -5.398

21 32 56.645 -4.228

22 48 55.346 8.955

23 48 53.579 7.188

24 48 54.463 8.072

25 52 49.761 6.990

26 52 47.644 4.873

27 52 48.703 5.932

28 56 34.886 -4.264

29 56 34.647 -4.503

30 56 34.767 -4.383

31 96 1.249 -1.696

32 96 1.244 -1.701

33 96 1.247 -1.698

34 100 0.448 1.123

35 100 0.444 1.119

36 100 0.446 1.121

158





159



t Student 2.021


- Varianza 1.60917e+000



- Varianza 6.46600e-004












F tabulado 4.080



1.5 Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0 Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50


t tabulado 2.021

t calculado 70.820


160

2. Conclusiones

Linealidad





Anexo 12. Aspergillus niger en medio Digerido Caseína-soja

1. Resultados



Número de datos 33


Curva Crecimiento


1 2 96.278 -7.052

2 2 95.265 -8.065

3 2 95.772 -7.558

4 4 94.722 -6.478

5 4 94.728 -6.472

6 4 94.725 -6.475

7 6 90.282 -8.788

8 6 91.186 -7.884

9 6 90.734 -8.336

161

Curva Crecimiento


10 24 82.205 2.307

11 24 83.124 3.226

12 24 82.665 2.767

13 28 85.370 9.732

14 28 85.427 9.789

15 28 85.399 9.761

16 32 85.924 14.546

17 32 82.856 11.478

18 32 84.390 13.012

19 48 70.321 15.985

20 48 70.228 15.892

21 48 70.275 15.939

22 72 18.240 -10.534

23 72 18.087 -10.687

24 72 18.164 -10.610

25 78 14.531 -7.852

26 78 14.506 -7.877

27 78 14.519 -7.864

28 96 0.559 -2.653

29 96 0.562 -2.650

30 96 0.561 -2.651

31 100 0.973 2.021

32 100 0.966 2.014

33 100 0.970 2.018

162


Nivel de confianza de la curva de calibración: 97.50


Nivel de confianza de los residuales: 97.50

163



t Student 2.021


- Varianza 6.80245e+000


Pendiente -1.06509e+000

- Varianza 2.12408e-003












F tabulado 4.080

F calculado 534.075





t tabulado 2.021

t calculado 40.435

El intecepto-Y es diferente de cero.

164

2. Conclusiones

Linealidad



Pendiente : -1.06509e+000


validaciÓn de la retenciÓn microbiana en los filtros de ... · 2 validaciÓn de la retenciÓn...

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