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UNIVERSIDAD TÉCNICA DEL NORTE
FACULTAD DE INGENIERÍA EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y
AMBIENTALES
ESCUELA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
“CARACTERIZACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS DE SUELO
ANTÁRTICO TOLERANTES A CROMO, HIERRO Y COBRE CON
POTENCIAL APLICACIÓN BIOTECNOLÓGICA EN LA ZONA 1 DEL
ECUADOR”
TESIS PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO EN
BIOTECNOLOGÍA
AUTOR:
Jonathan Santiago Villalva Pozo
DIRECTORA:
MSc. Delia Elizabeth Velarde Cruz
Ibarra, Abril del 2018
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ÍNDICE
Contenido Páginas
RESUMEN ........................................................................................................................ 7
SUMMARY ...................................................................................................................... 8
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 9
CAPÍTULO II ................................................................................................................. 12
2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 12
Bacterias .............................................................................................................. 12
Colonias bacterianas en el suelo del Continente Antártico y otras áreas de
investigación ................................................................................................................... 15
Metales pesados .................................................................................................. 17
Organismos tolerantes a metales pesados ........................................................... 18
Caracterización morfológica de colonias bacterianas ......................................... 19
2.1.1 Tinción de Gram ............................................................................... 20
Medios de cultivo para crecimiento bacteriano .................................................. 23
Método de conteo en placa para curva de crecimiento ....................................... 26
Método de identificación de microorganismos ................................................... 26
CAPÍTULO III ................................................................................................................ 33
3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 33
3.1 CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO .......................................... 33
3.2 METODOLOGÍA ............................................................................................... 36
3.2.1 Aislamiento de cepas bacterianas...................................................... 36
3.2.2 Tolerancia a metales pesados de cepas aisladas ................................ 39
3.2.3 Identificación de cepas tolerantes a metales pesados ........................ 41
CAPÍTULO IV ................................................................................................................ 45
4. RESULTADOS ....................................................................................................... 45
4.1 AISLAMIENTO IN VITRO DE BACTERIAS DE SUELOS
ANTÁRTICOS ............................................................................................................... 45
6
4.1.1 Colonias bacterianas obtenidas de los suelos antárticos previas a su
aislamiento .................................................................................................... 46
4.2 ENSAYO DE TOLERANCIA DE CEPAS BACTERIANAS AISLADAS
A LOS METALES PESADOS: HIERRO, CROMO Y COBRE ................................... 52
4.3 ENSAYO DE CURVA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS 17 Y 18
EN PRESENCIA DE METALES PESADOS ................................................................ 56
4.4 IDENTIFICACIÓN ............................................................................................ 66
CAPITULO V ................................................................................................................. 70
5. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 70
6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 74
BIBLIOGRAFÍA CITADA ............................................................................................ 76
ANEXOS ........................................................................................................................ 84
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RESUMEN
La movilidad de los metales pesados en el ambiente es un problema creciente en
el Ecuador citando por ejemplo en el caso la contaminación de ríos como el Río
Tahuando y Río Ambi y la explotación minera del Proyecto Llurimagua ubicados
en la provincia de Imbabura. Para esta clase de contaminaciones se puede aplicar
un tipo de remediación biológica la cual se aferra a la utilización de
microorganismos como bacterias que son tolerantes a concentraciones de metales
pesados.
Siendo así, el presente estudio llevó a cabo el aislamiento de 26 de cepas
bacterianas de suelos obtenidos del continente antártico y se los sometió a análisis
de tolerancia ante los metales pesados cobre (Cu), hierro (Fe) y cromo (Cr) en los
siguientes medios de cultivo: a) agar nutriente, y medios específicos b) agar
Pseudomonas P y c) Pseudomonas F con las concentraciones metálicas de 2500,
6500 y 1000 ppm. Ante la concentración 1 el 8% de las cepas bacterianas aisladas
de los suelos antárticos fue resistente a Hierro y Cobre, mientras que el 90% de las
cepas fue resistente a Cromo; mientras que ante la concentración 2 únicamente se
observó resistencia al metal Cromo con el 45% de las cepas y por último a la
concentración 3 no hubo muestra de tolerancia.
Posterior al análisis de tolerancia las cepas tolerantes fueron caracterizadas
mediante morfología de colonias, tinción Gram y método de MALDI-TOF y se
las reconoció como B. pumilus y S. maltophilia respectivamente.
PALABRAS CLAVE: explotación minera, metales pesados, microorganismos,
remediación biológica, tolerancia.
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SUMMARY
The mobility of heavy metals in the environment is a growing problem in Ecuador
citing for example, the contamination of rivers such as the Tahuando River and
the Ambi River and the mining exploitation of the Llurimagua Project located in
the province of Imbabura. For this type of contamination a type of biological
remediation can be applied which clings to the use of microorganisms such as
bacteria that are tolerant to concentrations of heavy metals.
So, the present study carried out the isolation of 26 bacterial strains of soils
obtained from the Antarctic continent and subjected them to analysis of tolerance
to the heavy metals copper (Cu), iron (Fe) and chromium (Cr) in the following
culture medium: a) nutrient agar, and specific medium b) Pseudomonas P and c)
Pseudomonas F agar with metal concentrations of 2500, 6500 and 1000 ppm. At
concentration 1, 8% of the bacterial strains isolated from Antarctic soils were
resistant to Iron and Copper, while 90% of strains were resistant to Chromium;
while before concentration 2 only resistance was observed to the metal Chromium
with 45% of the strains and finally to the concentration 3 there was no tolerance
sample.
After the tolerance analysis, the tolerant strains were characterized by colony
morphology, Gram stain and MALDI-TOF method and were recognized as B.
pumilus and S. maltophilia respectively.
KEY WORDS: mining, heavy metals, microorganisms, biological remediation,
tolerance.
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CAPÍTULO I
1. INTRODUCCIÓN
Los metales pesados son considerados sustancias o elementos altamente tóxicos
para el medio ambiente en general, ya que puede provocar cambios nocivos y
potencialmente severos, como el deterioro del suelo en su capacidad para producir
vegetación. La contaminación por metales pesados requiere un adecuado
tratamiento para restablecer las características iniciales, caso contrario el área
afectada quedará con secuelas degenerativas muy difíciles de reparar (Villalobos,
2003).
El Ecuador posee una alta riqueza de recursos minerales explotables (ENAMI,
s/f). Las entidades encargadas de extraer estos recursos no son exigentes a la hora
de aplicar protocolos de preservación y manejo de áreas contaminadas,
posiblemente, debido a la falta de compromiso de las empresas o escasez de
alternativas y conocimiento para su correcto manejo. Por ende en varias zonas del
país afectadas ya están sufriendo las consecuencias a causa de la prominente
contaminación (MAE, s/f).
Ya sea por la explotación minera o por los desechos generados por la población
que no han recibido tratamiento, nuestro país posee grandes extensiones de tierra
y cuerpos de agua contaminados por metales pesados (MAE, s/f). Como ejemplos
de contaminación por metales pesados tenemos el proyecto Llurimagua (Intag)
por explotación minera (CODELCO, 2015) y, orillas de ríos como el Río
Tahuando (Ibarra) o el Río Ambi (Atuntaqui), sitios donde terminan su recorrido
los desechos de las ciudades (MAE, s/f).
Para sanearlos y recuperarlos se utilizan tratamientos de remediación biológica,
con la finalidad exclusiva de desintoxicar el suelo y devolverle sus características
iniciales, ya sea neutralizando totalmente las acciones tóxicas del contaminante, ó,
reduciendo en gran medida su acción, y con ello, mitigar el impacto ambiental. La
10
biodescontaminación o biorremediación de suelos es un proceso que puede darse
por generación propia del medio que puede tardar décadas hasta incluso siglos en
regenerar el área afectada, o puede ser inducido y el tiempo puede ser
significativamente menor. Esto se lo lleva a cabo mediante procedimientos físico-
químicos, biológicos o netamente microbiológicos (Martín, 2012).
En las últimas décadas, en la Estación Científica Ecuatoriana Pedro Vicente
Maldonado en la Antártida se han encontrado áreas contaminadas con metales
pesados como arsénico, cadmio, mercurio, cromo y plomo mediante la utilización
de bioindicadores (Sarmiento, 2013) y de acuerdo a los efectos de las adaptación
los microorganismos que habitan esas áreas ya tienen una potencial resistencia a
la influencia de estos metales pesados y posiblemente los utilicen como su fuente
nutricional al no haber otra fuente disponible (Campbell y Reece, 2007). Este tipo
de microorganismos tienen un gran valor ambiental ya que podrían desintoxicar
áreas que han sido sometidas a compuestos contaminantes (Rodríguez, 2003).
Durante la expedición del Instituto Antártico Ecuatoriano a la estación Antártica
“Pedro Vicente Maldonado” del año 2015 situado en la Isla Barrientos, 5 muestras
de suelos fueron seleccionas y traídas hasta las instalaciones de la Universidad
Técnica del Norte. En vista de que los microorganismos antárticos viven en
condiciones extremas (bajas temperaturas la mayor parte del año, ausencia de
agua libre) se decidió analizar la resistencia de estos microorganismos a otras
condiciones extremas y probar la tolerancia a metales pesados, para luego; darle
una aplicación biotecnológica favorable a los ecosistemas contaminados con los
mismos en el Ecuador.
Conociendo que las explotaciones mineras en la zona norte del Ecuador aún no se
realizan, se prevé dar una solución de biorremediación al futuro impacto
ambiental, pero ¿Cómo hacerlo si los microorganismos de estas zonas aún no se
han adaptado a dichas condiciones? pues al no contar con esa alternativa es
posible aprovechar el gran potencial de los recursos genéticos del resto del
Ecuador, tomando en cuenta que se han estudiado microorganismos de la
11
Antártida y se ha demostrado que tienen un excelente potencial de adaptación a
concentraciones extremas entre ellas con metales tóxicos y son útiles para
practicar la biorremediación (Scheuch y Alberto, 2015; Moraga, Merino, y
Mondaca, 2003).
1.1 OBJETIVOS
Los objetivos del presente estudio son:
1.1.1 Objetivo general
Caracterización de cepas microbianas de suelo antártico tolerantes a cromo, hierro
y cobre con potencial aplicación biotecnológica en la zona 1 del Ecuador.
1.1.2 Objetivos específicos
Aislar bacterias de suelos obtenidos del continente Antártico.
Evaluar la tolerancia de las bacterias aisladas a la presencia de los metales
pesados: cromo (Cr), hierro (Fe) y cobre (Cu).
Identificar las bacterias metalotolerantes mediante morfología de colonias,
tinción Gram y Espectrometría de masas MALDI-TOF.
1.1.3 Hipótesis
Las cepas bacterianas aisladas de los suelos antárticos son tolerantes a los metales
pesados: cobre (Cu), hierro (Fe) y cromo (Cr).
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CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICO
Bacterias
Las bacterias son organismos unicelulares, con características específicas de
procariotas que los diferencian del grupo complejo de las células eucariotas. Los
organismos procariotas son células sumamente pequeñas que no tienen un núcleo
definido, “núcleo primitivo” (Maillet, 2003) por lo cual su ADN, que por cierto
tiene forma circular cerrada, se encuentra disperso en el citoplasma junto con el
resto de orgánulos celulares necesarios para realizar sus respectivas funciones
metabólicas.
Las bacterias se reproducen asexualmente mediante fisión binaria o bipartición,
que consiste en la duplicación de su ADN y luego el resto de la célula para
obtener dos células hijas (ONM, s/f). Para esto, la célula madre necesita de (1)
materia prima o nutriente para la síntesis de sus moléculas estructurales, y (2)
suministro de energía, que lo puede conseguir dependiendo de la estructura
bioquímica de la célula o factores ambientales (Struthers y Westran, 2003), por
ejemplo, hay bacterias que pueden simplemente aprovechar la luz como fuente
de energía (fotosíntesis), mediante la oxidación de sales minerales o lo realizan
mediante una manera más compleja que es el caso por fermentación de
compuestos orgánicos (Fraile, Prieto, Marí, y Fraile, 2011).
En condiciones adecuadas las bacterias que tienen un buen tiempo de crecimiento
como por ejemplo, Escherichia coli puede reproducirse cada veinte minutos,
logrando obtener varios millones de ellas en cuestión de horas (Fraile et al.,
2011).
13
Las bacterias comprenden una diversidad de formas y tamaños. La mayor parte de
ellas tienen un tamaño que oscila entre 0,2 μm y 2 μm de diámetro y 2 μm y 8 μm
de largo. Estos microorganismos se los relaciona con los siguientes tipos de
formas:
a) cocos (globulares),
b) bacilos (forma de bastones)
c) y células espirales.
Al momento de la reproducción celular las células hijas pueden quedar enlazadas
entre sí, si los cocos al duplicarse se enlazan de manera de obtener pares cocos
unidos, éste se llama diplococo; si los se encuentran enlazados de manera de tener
grupos de cuatro cocos en dos filas, éste se llama tétrada, también podemos
encontrar cocos que se reproducen en tres filas de tal manera de formar un cubo, a
éste se lo denomina sarcina, o si se reproducen en múltiples aglomeraciones en
forma de racimo, éste se denomina estafilococo; y si después de la reproducción
permanecen unidos formando cadenas largas de cocos, a éstos se los denominan
estreptococos (Tortora, Funke, y Case, 2007). Figura 1.
De la misma manera como se ha caracterizado a las agrupaciones de cocos,
también podemos denominar a los bacilos, pero, de manera que los bacilos tienen
forma de bastones podemos encontrar en la naturaleza agrupaciones como
diplobacilos y estreptobacilos; y a aquellos bacilos que tienen una configuración
ovalada se los ha dado el nombre de cocobacilos (Tortora et al., 2007). Figura 2.
14
Figura 1. Esquema: Denominación de cocos de acuerdo a su agrupación.
Fuente: (Tortora, Funke, y Case, 2007). Disposición de los cocos: (a) La división en un plano
producen diplococos y estreptococos. (b) La división en dos planos produce tétradas. (c) La
división en tres planos produce sarcinas. (d) La división en múltiples planos produce estafilococos.
Pág. 79
15
Figura 2. Esquema: Denominación de bacilos acuerdo a su agrupación.
Fuente: (Tortora et al., 2007). Bacilos: (a) bacilos aislados. (b) Diplobacilo. En la microfotografía
de la parte superior apareados representan ejemplos de diplobacilos. (c) Estreptobacilos. (d)
Cocobacilos. Pág. 79
Colonias bacterianas en el suelo del Continente Antártico y otras áreas de
investigación
Una colonia bacteriana puede concebirse como la agrupación de bacterias
genéticamente idénticas formadas a partir de la reproducción de una Unidad
Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño
16
generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo
microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como
en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los
estafilococos o los estreptococos (Pumarola A., 1987).
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color característicos, que, aunque puede variar de acuerdo al medio en que se
encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie
bacteriana que la forme (Ruiz P., 2010).
Según Ruberto et al. (2004) en su trabajo de investigación se aislaron de las
superficies con historia de contaminación de la base Argentina Antártica Carlini
(sitios Jubany y Marambio) las cepas identificadas como Rhodococcus sp.,
Stenotrophomonas maltophilia., Stenotrophomonas sp. y Pseudomonas sp. para
realizar su investigación. Un estudio similar es el de Scheuch y Alberto, (2015)
donde se menciona que de los suelos del territorio antártico chileno en los que se
llevó a cabo su estudio se aisló y caracterizó una cepa identificada como
Pseudomonas flavescens la cualdióexcelentes resultados en lo propuesto; como
también en el trabajo de Ceccotti et al. (2015) indican que como resultado del
aislamiento de microorganismos de suelos obtenidos del territorio antártico de
Argentina se obtuvieron 3 cepas distintas: Pseudomonas sp., Sinorhizobium sp.
Y la última cepa no pudo ser identificada por el método de comparación utilizando
el programa BLAST (Basic Local Aligment Search Tools) de igual manera
Berrios (2012) señala en su trabajo de investigación que la bacteria aislada de
suelo encontrada en las raíces de la planta Deschampsia antarctica Desv. no pudo
ser identificada por el método de comparación utilizando el programa BLAST y
no hay una base de datos que contengan la información genética de la cepa
tratada, pero tiene características del género Pseudomonas sp., por lo que podría
tratarse de una nueva especie dentro de este género.
17
Metales pesados
En química, se denominan metales pesados a aquellos elementos de la tabla
periódica cuyos valores de densidad superan los del agua por un aproximado de
cinco veces más alto, es decir su valor de densidad rodea los cinco gramos por
centímetro cúbico. Pero la densidad de los metales no se relaciona con los valores
tóxicos, ecotóxicos reactividad de los mismos (Sepúlveda, 2005). Podemos ubicar
a estos elementos que se encuentran dispersos en la tabla periódica. Figura 3.
Estos elementos mencionados son catalogados por las personas como agentes
tóxicos y dañinos para el ecosistema, pero esta premisa es incorrecta, pues, el
significado de metal pesado no implica neta toxicidad (Baird, 2004). Debido a que
“no todos” los metales necesariamente son peligrosos, al contrario “algunos” de
ellos son esenciales para la vida de gran variedad de organismos, pero altamente
dependiente de la concentración con la que sean absorbidos por los seres vivos
(Zúñiga, 1999).
Figura 3. Localización de los metales en la tabla periódica.
Fuente: (Volke et al., 2005). Metales pesados clasificados como clase A (Duros), clase B (suaves)
y clase frontera (intermedios), pág. 34.
18
Organismos tolerantes a metales pesados
Los organismos vivos presentes en masas de suelo o agua muestran determinados
ajustes evolutivos ante ciertas condiciones ambientales en los hábitats en los que
viven, y si estas condiciones se alteran (ya sean de temperatura, acidez,
alcalinidad, oxígeno, radiación, presión, entre otros) (Ramírez et al., 2006), los
organismos existentes en estos hábitats delimitan su capacidad de tolerar y
sobrevivir ante las alteraciones producidas (Quinta-Ferreira et al., 2012). Los
organismos de acuerdo a sus límites de tolerancia se las definen como organismos
tolerantes que son aquellos que son capaces de resistir las condiciones que fueron
aplicadas, y los organismos sensibles o intolerantes que son los que resultan
afectados ante las nuevas condiciones ambientales (IGME, 1996).
Los organismos vivos pueden adquirir resistencia a diferentes tipos de
condiciones exageradas, como los organismos metalotolerantes que son aquellos
capaces de crecer en condiciones impuestas con metales pesados por ejemplo, es
el caso de la planta Festuca ovina, a la que su hábitat lo han convertido en una
zona netamente minera o de Agrostistenuis que se ha adaptado para vivir en
concentraciones (1%) de plomo o como también, es el caso de plantas resistentes
a herbicidas, bacterias que han adquirido resistencia a antibióticos y levaduras
ante metales pesados (Rodríguez et al., 2005).
Si las plantas se han logrado adaptar a condiciones contaminantes con metales
pesados pues también es el caso de algunos microrganismos de suelos antárticos
que han podido alcanzar resistencia y convertir estas superficies contaminadas en
su hábitat. Tenemos por ejemplo en el trabajo de Scheuch y Alberto (2015) el cual
menciona que en particular la cepa identificada como Pseudomonas flavescens resiste 25
mg/L de Cd y 5 mg/L de Cr. Además, tras 7 días de incubación es capaz de degradar hasta
un 80% de fenantreno en medio de cultivo con el hidrocarburo como única fuente de
carbono. Al agregar 0.025, 0.05 y 0.5 mg/L de Cd el porcentaje de degradación es 60, 26 y
25 mg/L, respectivamente, además según Tashyrev et al. (2009) en su trabajo de
investigación menciona que se aislaron microorganismos, superresistentes a metales
19
tóxicos, han sido revelados en una zona geográfica de la plataforma interna de la isla de la
península Antártica (30x60 km) en las islas Darboux, Berthelot, Cruls, Barchans, Jalour,
Uruguay, Three pigs, Winter, Grotto, Galindez, Pitermann, Booth, capes Perez, Tuxen
(costa de la península antártica, y también en la lejana isla King George.) y se las sembró en
medio de cultivo caldo nutriente con concentraciones de metales pesados (ppm): Hg 2+
(100 y 200); Cu 2+ (500 y 1000); Co 2+ (1000 y 2000); Cr (VI) (2000 y 5000). El
crecimiento de microorganismos fue determinada mediante densidad óptica de los cultivos
entre los 3 y 14 días. Los resultados del mencionado estudio mostraron superresistencia a
Cu2+ (500 ppm) y Cr (VI) (2000 ppm) y entre el 50 y 70 % de las muestras presentaron
resistencia a cromo (5000 ppm) y 1000 ppm de cobre y cobalto. Como también Ceccotti
M. et al. (2015) en su trabajo indican en sus resultados que las cepas identificadas como
Pseudomonas sp. y Sinorhizobium sp. fueron sometidas a K2TeO3 y CdCl2 las cuales
dieron excelentes resultados en resistencia a CdCl2 con una concentración inhibitoria
mínima de 500 (µg/ml) para la cepa del género Pseudomonas sp. y en la presencia
de K2TeO3 una concentración inhibitoria mínima de 15,62 (µg/ml), en cambio
para la cepa del género Sinorhizobium sp. No tuvo mejor resultado con un valor
de resistencia menor a 0,98 (µg/ml) en ambos reactivos.
Caracterización morfológica de colonias bacterianas
Las bacterias presentan una morfología y un tamaño muy variable unas a otras, así
como distintos sistemas de agrupación microscópica y que en gran cantidad de
congregación se puede apreciar a simple vista por las características de la colonia
que permiten distribuirlas en grupos afines que faciliten su estudio.
La siembra de las cepas en los medios sólidos de cultivo da lugar a estas masas
formadas por varios millones de bacterias. El tamaño, así como el aspecto, es
constante para cada género y especie bacteriana y para hacer el diagnostico se
debe tener presente las siguientes cualidades: tamaño, forma, superficie,
consistencia, transparencia o coloración y otros caracteres (la presencia de algún
20
reactivo adicional en el medio de cultivo puede influir en las características de la
colonia). Figura 4.
Figura 4. Esquema morfológico de colonias bacterianas sobre medio de cultivo.
Fuente: (Pumarola A., 1987). Representación esquemática de la forma, superficie y bordes de
diferentes tipos de colonias bacterianas sobre medios sólidos. Pág. 67.
2.1.1 Tinción de Gram
21
La tinción Gram es un método de tinción diferencial. Tinción diferencial se refiere
a que este tipo de métodos reaccionan de manera específica en los múltiples tipos
de bacterias y consecuentemente se emplea este tipo de técnica para realizar una
distinción entre las mismas.
El método de la tinción Gram fue elaborada en el año 1884 por el microbiólogo
danés Hans Christian Gram, de donde proviene su nombre. Desde entonces ésta
técnica resultó ser demasiado útil para la microbiología, ya que representa un
elemento básico para la taxonomía bacteriana, permitiendo la subdivisión de las
bacterias en Gram-positivas (Gram +) y Gram-negativas (Gram -) (Tortora et al.,
2007).
Se trata de una doble tinción que implica el uso de dos colorantes (colorante
primario y colorante de contraste) y de un lavado con alcohol entre los dos
colores. Hoy en día, en el mercado existen kits disponibles que proporcionan las
soluciones listas para realizar la tinción Gram (Vaughan, Buzzini, y Clementi,
2008).
En la primera coloración se utiliza cristal violeta, que, con el siguiente paso de
preparación con el reactivo de Lugol (solución de yodo), se une a los
componentes celulares coloreando las células de color púrpura. El lavado con
alcohol (etanol o alcohol cetona) determina la decoloración de las bacterias Gram
(-), mientras que las bacterias Gram + resisten al lavado con el disolvente y
permanecen de color púrpura (Figura 5). Esta diferencia de comportamiento se
determina dependiendo de:
Las diferencias en la composición y la estructura existentes entre los dos
grupos a nivel de pared celular;
Diferente estabilidad de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en
el enlace entre los componentes celulares con el complejo cristal violeta-
Lugol.
22
En las bacterias Gram (+) la acción solvente determina la deshidratación de la
pared, y la consecuente reducción de la permeabilidad representa un obstáculo
para la salida del complejo cristal violeta.
Sin embargo, En las bacterias Gram (+) el etanol tiene un efecto opuesto, ya que
determina un aumento de permeabilidad en la pared, mediante la solubilidad de
los lípidos presentes en la membrana externa. En consecuencia, el lavado en
alcohol provoca, en este caso, la fuga o salida de la célula del compuesto cristal
violeta (Vaughan et al., 2008).
Figura 5. Esquema del proceso de coloración bacteriana y diferenciación de Gram-positivas
(Gram +) y Gram-negativas (Gram -).
Fuente:(Tortora et al., 2007) .Tinción de Gram. Procedimiento. Pág. 70.
El diferente comportamiento de la pared bacterias Gram (+) y los Gram (-) en el
caso del disolvente determina una diferencia de respuesta de los dos tipos de las
células de tinción posteriores (contra tinción), realizada con fucsina o safranina
básicos, colorantes (contraste) de color rosa brillante (Vaughan et al., 2008).
23
Las bacterias Gram (+) tienen un comportamiento constante, manteniendo en
todos los casos, el color violeta dada por el primer colorante, mientras que en las
bacterias Gram (–) su comportamiento difiere dependiendo de:
Estado fisiológico del cultivo
Condiciones ambientales
Medios de cultivo para crecimiento bacteriano
Para cultivar microorganismos en ambientes controlados fuera de su hábitat (in
vitro), para sus diferentes aplicaciones es de primordial importancia realizar
cultivos. Un cultivo es una población de bacterias o microorganismos que se
desarrollan en un ambiente artificial; a estos medios artificiales se los llama
medios de cultivo o sustratos (Fraile et al., 2011), en los que se debe encontrar las
condiciones adecuadas para el crecimiento bacteriano o microorganismos en
general (Tortora et al., 2007). Todos los microorganismos requieren fuentes de
energía, carbono, nitrógeno, fósforo, macro elementos y oligoelementos
esenciales para el crecimiento, así como un pH adecuado para el crecimiento. Sin
embargo, dado que las necesidades nutricionales son muy diferentes de un grupo
microbiano a otro, la composición exacta de un medio de cultivo depende del tipo
de microorganismo que se va a cultivar (Vaughan et al., 2008) (Forbes, 2009).
Los medios de cultivo según su estado físico se los clasifica en medios sólidos y
líquidos:
a) Medio líquido: están constituidos de elementos nutritivos disueltos en
agua destilada. El crecimiento microbiano se puede observar a través de la
turbidez visible a simple vista. Por ejemplo:
Caldo Nutriente: El caldo nutriente es un medio de cultivo líquido no selectivo. Y
su composición describe peptona de carne y caseína como fuente de carbono e
hidrógeno. Su uso se amplia como medio de pre-enriquecimiento para una gran
24
variedad de microorganismos de nutrición no muy exigente (“Laboratorios
Britania”, s/f).
b) Medio sólido: es el medio que contiene agar como agente solidificante
para facilitar la siembra de microorganismos aerobios en su superficie. Por
ejemplo:
Medio PDA (Potato Dextrose Agar): Es un medio de cultivo de objetivo general.
Es comúnmente utilizado para realizar de recuento en placa. Su constitución
comprende infusión de papa como la fuente nutricional del medio y sirve para
inducir la esporulación de mohos. También sirve para fortalecer la producción de
pigmentos ciertos dermatofitos (Neogen, s/f).
Dependiendo del propósito de crecimiento bacteriano tenemos varios tipos de
medio:
a) Medios selectivos: se caracterizan por una composición capaz de
promover el crecimiento de microorganismos e inhibir el desarrollo de
otros. Por ejemplo:
Medio EMB (Eosin methylene Blue Agar): El Agar de Eosina y Azul de metileno
es un medio selectivo capaz de permitir el crecimiento de bacterias Gram
negativas e inhibir el crecimiento de la microbiota acompañante Gram positiva de
la muestra. Permite la diferenciación de las bacterias coliformes (lactosa positivo,
colonias color violeta) de las no coliformes (lactosa negativo, colonias color rosa)
(Probiotek, s/f).
b) Medios no selectivos: se caracterizan por una composición capaz de
promover el crecimiento de un gran número de microorganismos sin
causar inhibición de ningún tipo. Por ejemplo:
25
Agar Nutriente: El agar nutriente es un medio de cultivo sólido que tiene uso
general, debido al amplio espectro de microorganismos que crecen en él. Este
medio de cultivo está compuesto por pluripeptona, extracto de carne, como fuente
nutritiva, cloruro de sodio y agar. El añadido de cloruro de sodio permite el
enriquecimiento con sustancias como sangre de carnero para favorecer al
desarrollo de microorganismos nutricionalmente exigentes. El agar nutriente se
maneja para cultivo de microorganismos y recuento de colonias en placa (“BD”,
s/f) (“Laboratorios Britania”, s/f).
c) Medios de enriquecimiento: se caracterizan por una composición capaz
de favorecer el desarrollo de uno o más grupos microbianos similares sin
evitar el desarrollo de otros. Por ejemplo:
Agar Pseudomonas P: El medio Pseudomonas p es un medio selectivo sólido,
compuesto por peptona de gelatina, que sirve como vital aporte de nitrógeno para
los microorganismos; cloruro de magnesio y sulfato de potasio, que son los
encargados de promover la producción de las moléculas piorrubina y piocioanina
e impiden la producción de la molécula fluosceína; y la glicerina que favorece a la
producción de los pigmentos. Si la tonalidad de este medio se torna amarillenta
verdosa levanta la posibilidad de encontrar la presencia de P. aeruginosa (Merck,
s/f) (“Laboratorios Britania”, s/f)
Agar Pseudomonas F: El medio de cultivo Pseudomonas f es un medio sólido
selectivo compuesto por tripteína y peptona de gelatina, como nutrientes para el
crecimiento bacteriano; fosfato dipotásico y sulfato de magnesio, para promover
la producción de la molécula fluoresceína e impedir la producción de piocianina y
piorrubina; y la glicerina que favorece a la producción de los pigmentos. Si el
medio de cultivo toma un tono azulado es posible encontrar encontrar la presencia
de P. aeruginosa, P. fluorescens o P. putida (“Laboratorios Britania”, s/f).
26
d) Medio diferencial: tiene una composición que permite distinguir los
diferentes grupos microbianos que pueden desarrollarse juntos en una sola
placa de Petri. Por ejemplo:
Agar Cromocult: Este es un medio selectivo diferencial debido a que permite la
identificación combinada de E. coli y de coliformes totales de una muestra. El
medio está constituido por los compuestos MUG y X-GAL como sustratos
específicos. MUG es específico para E. coli mientras que X-GAL para coliformes.
Al momento de la degradación de los compuestos, se forman nuevos complejos de
colores que facilitan la diferenciación al observar. E. coli presenta coloración azul
violeta mientras que las coliformes se diferencian al presentar coloración rosa
(“Laboratorios Britania”, s/f) (Vanegas, 2015) .
Método de conteo en placa para curva de crecimiento
El recuento en placa es un método de conteo de bacterias indirecto e individual,
con la gran ventaja que el valor cuantifica el número de las bacterias viables. Este
método se basa en la suposición de que cada célula bacteriana daría lugar a una
colonia. Para realizar la medición mediante este método existen dos técnicas para
llevar a cabo la siembra, a) siembra en superficie: se efectúa por vertido y luego se
extiende el inoculo en el medio sólido y b) siembra en el fondo: se realiza un
vertido en la caja Petri mientras que el medio se lo mantiene a 50° C en baño
María para que no se solidifique y luego se administra sobre el inóculo. Para que
el recuento en placa tenga validez estadística es necesario contar desde 30 hasta
300 colonias bacteriana, con objeto de reducir el error de la medición (Vanegas,
2015).
Método de identificación de microorganismos
La identificación de microorganismos en los laboratorios se realiza hoy
principalmente por análisis de reacciones bioquímicas y características
fenotípicas, como el crecimiento en diferentes medios, la morfología de las
27
colonias y la tinción de Gram. Cuando se combinan, estas técnicas de laboratorio
de rutina aseguran una identificación precisa de la mayoría de los
microorganismos, pero requieren mayor tiempo y, en algunos casos, necesitan
técnicos bien capacitados para una interpretación correcta y que hasta no podría
identificar a nivel de especie. Existe un método de identificación bacteriana fuera
de lo convencional basado en la desorción por láser y una de las principales
ventajas de utilizar dicha tecnología es el tiempo de respuesta, que se reduce de 24
a 48 horas a menos de una hora. Además, permite la identificación bacteriana
precisa de una gran variedad de bacterias, que solo muestran pocos rasgos
fenotípicos y que se identificaban mediante la secuenciación del gen 16S rRNA
antes de la era MALDI-TOF (Bizzini et al., 2011).
Espectrometría de masas: MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser
desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer)
La espectrometría de masas es una técnica de caracterización e identificación
microbiana rápido, preciso y rentable. Esta tecnología se caracteriza por generar
una especie de huellas dactilares espectrales de masas características, que son
firmas únicas para cada microorganismo y, por lo tanto, son ideales para una
identificación de microorganismos precisa a nivel de género y especie; y tienen el
potencial de ser utilizadas para la tipificación e identificación de cepas.
MALDI-TOF MS se ha utilizado para caracterizar una amplia variedad de
microorganismos, incluidas bacterias, hongos y virus (Giebel et al., 2010). La
espectrometría de masas es un método adecuado para alto rendimiento y rápida
identificación microbiana a bajo costo y es una alternativa para los sistemas de
identificación bioquímica y molecular de laboratorio convencionales (Croxatto,
Prod’hom, y Greub, 2012).
El procedimiento que utiliza esta técnica es el siguiente: la muestra o varias
muestras a ser identificadas se las somete a cristalización mediante una solución
matriz (reactivos específicos dependiendo el objeto de analito) (Beaz, 2008) y se
28
las coloca en una placa o chip y se introduce en un espectrómetro de masas, donde
el analito será volatilizado mediante MALDI (Blanco, 2008). MALDI utiliza
pulsos de luz láser (nanosegundos) con frecuencia de infrarrojo o de ultravioleta
para desorber (gas que abandona un sólido al alcanzar cierta temperatura) e
ionizar (cargar eléctricamente) el analito (Andreu y Rivas, 1997).
Las moléculas desorbidas e ionizadas se aceleran a través de un campo
electromagnético y se expulsan a través de un tubo de vuelo (TOF) metálico
sometido a vacío hasta que alcanzan un detector, con iones más pequeños que
viajan más rápido que los iones más grandes. Entonces, los bio-analitos separados
crean un espectro de masa que está compuesto por picos de masa a carga (m / z)
con intensidades variables. Por lo tanto, un espectro es una “huella dactilar”
microbiana (Croxatto et al., 2012). Figura 6.
Debido a que cada especie de microorganismo analizado mediante espectrometría
de masas conferirá siempre un único espectro de masas, los creadores de los
equipos de espectrometría de masas han establecido una elaborada base de datos
que contiene los espectros de masas de las proteínas y péptidos correspondientes a
los diferentes microorganismos en las mismas condiciones de emisiones de láser y
recorrido de migración. La caracterización y tipificación de los bio-analitos se da
lugar mediante un software especializado que correlaciona los picos resultantes de
la muestra con cada uno de los espectros de masas contenidos en la base de datos
conferidos por los fabricantes para realizar la identificación a nivel de especie o
género (García et al., 2012).
29
Figura 6. Esquema del proceso de identificación de microorganismos mediante
espectrometría de masas: MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ ionization
time-of-flight mass spectrometer)
Fuente: (Croxatto et al., 2012) . Descripción técnica de MALDI-TOF MS.
Varios estudios han analizado la eficiencia de identificación bacteriana de este
método con sus respectivos programas y bases de datos. A continuación presento
aquí los resultados de tres estudios de laboratorio que evalúan métodos
convencionales y espectrometría de masas con las mismas muestras microbianas
para la comparar su identificación: (1) Eficacia de la espectrometría de masas
MALDI-TOF en la identificación de bacterias anaerobias (Vega-Castaño et al.,
2012), (2) Identificación bacteriana mediante espectrometría de masas matrix-
assisted laser desorption ionization time-of-flight. Comparación con la
30
metodología habitual en los laboratorios de Microbiología Clínica (Ferreira et al.,
2009), y (3) Utilidad de la espectrometría de masas MALDI-TOF en la
identificación de bacterias anaerobias (Zárate et al., 2014).
Según el trabajo de Vega-Castaño et al., 2012 se usó MALDI-TOF (Autoflex II,
Bruker Daltonics, Alemania), se analizaron 126 cepas clínicas aisladas, las mimas
se identificaron mediante el API 20ª (bioMérieux, Marcy l’Étoile, Francia). Los
autores observaron que las pruebas bioquímicas y MALDI-TOF coincidieron, a
nivel de género en solo el 20,3% de los casos, y a nivel de especie, en el 60,9%.
De las 48 identificaciones que no concordaron, se realizó secuenciación para
respaldar la caracterización por MALDI-TOF, a nivel de género en 8 casos
(16,7%), mientras que a nivel de especie en 32 (66,7%). El método de
secuenciación contribuyó a la caracterización bioquímica a nivel de género en 26
casos (54,2%), mientras que a nivel de especie únicamente en 2 casos (4,2%). Por
último las 8 cepas en que la Espectrometría de masas no consiguió ninguna
caracterización fue respaldad mediante el método de secuenciación de ARNr 16S,
se comprobó que la especie de las cepas a la que pertenecían estos
microorganismos no se encontraba añadida a la base de datos. Finalmente los
autores concluyeron que los datos conseguidos en este trabajo indican que, el
método MALDI-TOF promete una caracterización de bacterias anaerobias
superior que las pruebas bioquímicas habituales (24% más de caracterizaciones
acertadas a nivel de especie), y el número de errores mayores (tipificación
inexacta a nivel de género) 2,5 veces menor. Dado que todas las caracterizaciones
erróneas a nivel de género se debieron a que no se las agrego a la base de datos,
sin embargo, mientras que las especies faltantes se vayan anexando a la base de
datos, el método brindará resultados de mejor calidad.
Ferreira et al. (2009) han llevado a cabo un análisis de identificación similar de
comparación de métodos en el que se analizaron 294 aislamientos bacterianos
aerobios y anaerobios facultativos (65 Gram positivos y 229 gramnegativos)
obtenidos a partir de diferentes muestras clínicas mediante metodología
microbiológica habitual (Wider, Francisco Soria Melguizo, Madrid, España;
31
Vitek-2, API Staph, API 20 Strep, API Coryne y API NH, BioMérieux, Marcy
L’Etoile, Francia) y mediante un dispositivo de MALDI-TOF Autoflex III
(Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Alemania). Los aislamientos de Salmonella se
tipificaron con sueros específicos. Los aislamientos que no ofrecieron una
fiabilidad en la identificación superior al 95% en Vitek-2 o Wider se corroboraron
mediante API. Los aislamientos en los que los sistemas API no ofrecieron un
perfil fiable se descartaron. La identificación mediante MALDI-TOF se puntúa
automáticamente por el software del sistema de 0–3 en función de su fiabilidad.
Los aislamientos con puntuaciones inferiores a 1,5 se consideraron no fiables. La
correlación entre ambas identificaciones se clasificó como correlación en la
especie, el género o la ausencia de correlación. La correlación de la especie en los
Gram positivos estudiados fue del 100%. La correlación en los gramnegativos fue
del 87,7% en la especie y del 97,7% en el género. Solo hubo ausencia de
correlación en un 2,2% de los aislamientos. Las identificaciones fallidas se dieron
en los géneros Raoultella y Acinetobacter, en Stenotrophomonas maltophilia y
en Francisella tularensis. Finalmente los autores llegaron a la conclusión de que
la identificación de las cepas bacterianas clínicos mediante MALDI-TOF presenta
una excelente correlación con la tipificación realizada mediante los métodos
habituales.
Zárate et al. (2014) han evaluado la viabilidad del sistema de espectrometría de
masas ante los métodos convencionales; en su estudio se analizaron 104
aislamientos clínicos de bacterias anaerobias: 58 bacilos Gram negativos (BGN),
37 bacilos Gram positivos (BGP), 8 cocos Gram positivos (CGP), 1 coco Gram
negativo (CGN) y 2 cepas control ATCC. Los aislados fueron identificados
mediante MALDI-TOF MS y también se emplearon sistemas miniaturizados API
20A, Rapid ID 32A (bioMèrieux®, Marcy, l’Étoile, Francia). Debido a que la
identificación mediante los medios convencionales no se pudo llevar a cabo ante
algunas bacterias anaerobia, se efectuó la secuenciación del gen 16S rARN. Como
resultados obtuvieron que las metodologías habituales y el MALDI-TOF
concordaran a nivel de género y especie en un 95,3 % de las cepas aisladas. El
porcentaje de coincidencia fue de 91,4 % entre los bacilos Gram negativos y de
32
100 % en el conjunto de los bacilos Gram positivos. A su vez, concordaron en la
caracterización por ambas metodologías los 8 cocos Gram positivos utilizados y
también el coco Gram negativo.
Hubieron 5 cepas que no fueron identificadas por MALDI-TOF, estas cepas
pertenecían al género Porphyromonas sp. Al emplear el protocolo de extracción
de proteínas recomendado por el fabricante los análisis no proyectaron espectros
que concordaran con ninguno de la base de datos. Por esta razón, se procedió a
secuenciar las 5 cepas faltantes; de las cuales 3 de ellas fueron caracterizadas
como Porphyromonas asaccharolytica, y las 2 restantes como Porphyromonas
uneonis. Posteriormente las cepas Alloscardovia omnicolens, Actinomyces
oris, Bacteroides intestinalis, Veillonella atypica y Prevotella nigrescens también
fueron secuenciadas, ya que las pruebas bioquímicas habituales presentan
dificultad para identificar estos géneros.
Muchas de las identificaciones bacterianas que pueden formarse solo a nivel de
género se deben a espectros de referencia incompletos que cubren muchos
aislamientos o especies diferentes de un género dado. Por ejemplo, solo un
espectro de referencia de Propionibacterium acnes o Bacillus cereus se incluye en
la base de datos Bruker que es totalmente insuficiente para cubrir la verdadera
diversidad de estas bacterias y así identificar con precisión estos microorganismos
(Bizzini et al., 2011).
Además, el etiquetado incorrecto de especies bacterianas en la base de datos
puede causar una identificación errónea por MALDI-TOF MS. En el estudio de
Seng et al. ( 2009 ), siete Stenotrophomonas maltophilia los aislamientos se
identificaron incorrectamente como Pseudomonas hibiscicola, que es un nombre
no válido para un bacilo Gram negativo no fermentador que se demostró que
era S. maltophilia
33
CAPÍTULO III
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO
El estudio se lo llevó a cabo con muestras de suelo procedentes de cinco puntos
geográficos diferentes del continente antártico que se encuentran en los
alrededores de la estación científica ecuatoriana “PEDRO VICENTE
MALDONADO”, mientras que el experimento tuvo lugar en el laboratorio de
ingeniería en biotecnología ambiental (LABINAM) de la Universidad Técnica del
Norte.
Toma de muestras de suelo en el continente Antártico
Para la recolección de muestras se determinó la superficie de muestreo tomando
en cuenta que sea el mismo suelo homogéneo, una vez localizados los puntos se
utilizaron herramientas y material de excavación (pala de mano). La toma de
muestras fue del horizonte superficial (hasta 20 cm), esto debido a que en el
verano austral apenas unos pocos cm, se descongelan lo suficiente como para
permitir la toma de muestras y el desarrollo de una actividad microbiana intensa.
Para tener una muestra representativa del área de ingreso a la sala de máquinas, de
la Estacion Científica Pedro Vicente Maldonado, se tomaron muestras de tres
partes dentro del área de ingreso. Figura 7. Mediante la metodología de cuarte
(Cases & Ríos, 2002) se tomó una muestra representativa, para su análisis y
medición de parámetros básicos como: pH, conductividad, temperatura, además
de efectuar siembras en agar nutritivo traído desde el continente en cajas petri
(Castellanos y Marquéz, 2002). Los puntos de recolección de muestras se los
puede vizualizar en la tabla 1. Figura 8.
34
Tabla 1: Tabla de coordenadas de puntos de recolección de muestras de suelo en
el Continente Antártico.
Figura 7: Recolección de muestras de suelo en la Antártida.
Eje en x Eje en y
Punta Ambato 356045 3073434
Isla Barrientos (sitio 1) 357658 3077181
Estación Arturo prat 362706 3069648
Isla Barrientos (sitio 2) 358545 3072758
Isla Dee 356045 3073434
COORDENADAS UTMLocalidad
35
Figura 8: Mapa de los puntos de muestreo de suelos en el Continente Antártico.
36
3.2 METODOLOGÍA
A partir de las muestras de suelo recolectadas en la Antártida se aislaron las cepas
bacterianas que contengan estos suelos para someterlas a distintas concentraciones
de metales pesados como son: cromo (Cr), hierro (fe) y cobre (Cu) a los cuales se
esperan obtener resultados metabólicos muy favorables de crecimiento en las
bacterias.
3.2.1 Aislamiento de cepas bacterianas.
Para la siembra de los suelos se utilizaron 3 medios de cultivo, un medio de
cultivo general (Agar Nutriente), y dos medios de cultivo diferenciales (Agar
Pseudomonas P y Agar Pseudomonas F).
3.2.1.1 Preparación de medios de cultivo
A continuación se enumera de forma detallada el procedimiento que se llevó a
cabo para la preparación de cada medio de cultivo utilizado.
3.2.1.1.1 Preparacion de medio Caldo Nutriente:
Protocolo estandarizado por DIFCO
a) Se pesó 8 gramos por litro de medio en seco de agar nutriente.
b) Se colocó el medio seco en un frasco de vidrio y aforar hasta 1 litro con
agua destilada estéril.
c) Se agitó la mezcla con un agitador magnético hasta que se muestre
completamente homogénea y hasta su ebullición.
d) Se autoclavó el medio de cultivo a una atmosfera de presión y 120°
Celsius de temperatura por 15 minutos.
37
3.2.1.1.2 Preparación de medio Agar Nutriente:
Protocolo estandarizado por DIFCO
e) Se pesó 23 gramos por litro de medio en seco de agar nutriente.
f) Se colocó el medio seco en un frasco de vidrio y aforar hasta 1 litro con
agua destilada estéril y se agregó nistatina (anti fúngico para inhibir el
crecimiento de hongos) 80 unidades/ml.
g) Se agitó la mezcla con un agitador magnético hasta que se muestre
completamente homogénea y hasta su ebullición.
h) Se autoclavó el medio de cultivo a una atmosfera de presión y 120°
Celsius de temperatura por 15 minutos.
i) Se dispensó 20 ml de medio por caja Petri de vidrio/ plástico estéril dentro
de la cámara de flujo laminar con total asepsia.
3.2.1.1.3 Preparación de medio Agar Pseudomonas P
Protocolo estandarizado por DIFCO
a) Se pesó 46,4 gr/L de medio en seco de agar Pseudomonas P.
b) Se puso la medida en un frasco de vidrio y aforar hasta 1 litro con agua
destilada estéril y agregar 10 ml de glicerol y nistatina (anti fúngico para
inhibir el crecimiento de hongos) 80 unidades/ml.
c) Se agitó la mezcla con un agitador magnético hasta que se muestre
completamente homogénea y hasta su ebullición.
d) Se autoclavó el medio de cultivo a una atmosfera de presión y 120°
Celsius de temperatura por 15 minutos.
e) Se dispensó 20 ml de medio por caja Petri de vidrio/ plástico estéril dentro
de la cámara de flujo laminar con total asepsia.
38
3.2.1.1.4 Preparación de medio Agar Pseudomonas F.
Protocolo estandarizado por DIFCO
a) Se pesó 38 gr/L de medio en seco de agar Pseudomonas F.
b) Se aplicaron los mismos pasos posteriores de la preparación del agar
Pseudomonas P.
3.2.1.2 Siembra y resiembra de muestras de suelo
Para proceder a la siembre de los suelos se realizó un ensayo previo en el cual se
probó la temperatura para cultivar las bacterias de los suelos. El ensayo consistió
en sembrar los suelos en los medios de cultivo especificados anteriormente e
incubados a tres temperaturas diferentes: 15, 22 y 37 ºC para determinar la
temperatura óptima de los microorganismos que se encontraron en los suelos
mediante el notable crecimiento microbiano.
Se sembraron cinco muestras de suelo antártico recolectadas en la expedición del
año 2012, previo a esto, se realizó diluciones de 10-1 de las cinco muestras de
suelo (10 gramos de suelo en 90 ml de agua estéril y agitación por 30 minutos).
La siembra se realizó usando el método de vertido, para esto, se tomó 0,5 ml con
la micro pipeta y se depositó en cada caja Petri con medio de cultivo: a) agar
nutriente, y en medios específicos b) agar Pseudomonas P y c) agar Pseudomonas
F y se las incubó a distintas temperaturas para probar mejores resultados a 22º
Celsius (temperatura ambiente) por 24 horas. Se obtuvo el crecimiento de
diferentes tipos de bacterias, de los cuales se separaron todas las bacterias
encontradas de acuerdo a las diferentes variaciones de color y formación de las
colonias, para luego ser resembradas y aisladas. La resiembra se efectuó
utilizando el método de sembrado por estría. El método de estría o agotamiento
consiste en realizar un frote de una “colonia madre” con un asa de siembra
(alambre redondeado en la punta de platino o nicron) y dispersarlo en el nuevo
medio de cultivo desde un extremo de la caja en forma de zig-zag hasta que se
39
agote la muestra recogida (Fraile et al., 2011). La resiembra a nuevos medios de
cultivo se realizó varias veces para conseguir cada tipo de colonia cultivada lo
más pura posible para su manipulación, ya que posteriormente se trabajarían los
ensayos con cada tipo de bacteria por separado.
Cabe recalcar que, para todos los procedimientos realizados en este trabajo la
asepsia juega un papel sumamente importante para la obtención de resultados
óptimos; así que, éste, y el resto de procedimientos han sido efectuados en la
cámara de flujo laminar, donde podemos encontrar un área de trabajo
completamente estéril. También usar los implementos de trabajo adecuados es
debidamente necesario para ejecutar un trabajo eficaz y resguardar la salud del
personal, ya que la manipulación de reactivos y microorganismos es riesgoso de
contraer infecciones. El trabajo se realizó con el uso adecuado de: guantes
quirúrgicos, mascarilla, cofia para cabellera y el área de trabajo se mantuvo
desinfectada utilizando etanol al 70% y un mechero de gas encendido.
3.2.2 Tolerancia a metales pesados de cepas aisladas
Para probar la tolerancia a metales pesados de las bacterias se utilizaron los
mismos medios de cultivo de los que se extrajeron inicialmente las colonias, pero,
en esta etapa de la investigación los medios de cultivo se los preparó añadiendo
los metales pesados a tres concentraciones. Para la preparación de medios de
cultivo con metales pesados se siguieron los protocolos establecidos en la etapa de
aislamiento de las cepas y se le añadieron Cloruro cúprico (CuCl2), Cromato de
potasio (K2CrO4) y Cloruro ferroso (FeCl2) a las concentraciones de 2500, 10000
y 6500 ppm (Tashyrev, Rokitko, y Matvieieva, 2009) (Scheuch y Alberto, 2015).
Por cuestión de esterilidad los procedimientos se vuelven escasamente vulnerables
al momento de añadir los metales pesados. Si las sales metálicas se encuentran en
presencia del agua del medio, la elevada temperatura y presión que proporciona el
autoclave, existe la posibilidad de que ocurra un intercambio iónico entre los
metales pesados y los compuestos de los medios específicos y se dé lugar a la
40
formación de nuevos compuestos que no se desean en el medio de cultivo (Díaz,
2002) (Burriel et al., 2002); por tal motivo los metales pesados se adicionaron en
el momento previo a la dispensación del medio en las cajas en el instante justo que
el material sale del proceso de autoclavado, y se lo lleva a la cámara de flujo y en
presencia de agitación se incorporan las sales metálicas a los diferentes medios de
cultivo.
Nota: Para obtener la medida de las concentraciones de los metales pesados, se
usó la fórmula (Regalado, 2015):
𝑝𝑝𝑚 𝐹𝑒+2 = 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝐹𝑒+2
𝑜,4 𝐿
Dónde:
Ppm es la concentración del soluto;
Mg es el peso del soluto en miligramos; y,
L es el volumen de la disolución.
Luego del aditamento de las sales metálicas el pH neutro de la solución se alteró,
debido a los iones metálicos y no obtuvo la característica sólida que se esperaba
que tenga el medio, por lo tanto, luego de la inserción de las sales metálicas se
midió y ajustó el pH a 7.0 ± 0.2 utilizando diluciones de ácido (ácido clorhídrico)
y una base (hidróxido de sodio)
Se realizó la siembra de las cepas en cajas Petri de vidrio/plástico que contengan
los diferentes medios con las sales metálicas diluidas y se las cultivó una
temperatura de 22°C (temperatura ambiente).
La presencia del crecimiento de microorganismos se la determinó por aparición de
colonias que florecieron en los medios de cultivo. Esto se lo llevó a cabo en un
41
rango de 3-14 días después de haber hecho la siembra. El procedimeinto de
cultivar las cepas aisladas en presencia de cobre (Cu), cromo (Cr) y hierro (Fe) se
lo hizo a tres repeticiones para verificar su comportamiento ante los metales
pesados (Tashyrev, Rokitko, y Matvieieva, 2009).
3.2.2.1 Elaboracion de curvas de crecimiento
Para verificar la tolerancia de las cepas se estableció las dinámicas de crecimiento
de las mismas en presencia de los metales pesados, para esto se tomó como
referencia la concentración de 2500 ppm (a la que mejores resultados mostraron
las cepas tolerantes) y se añadió una nueva concentración de 3500 ppm con el
propósito de verificar su comportamiento.
Este procedimiento se llevó a cabo mediante el inóculo de las cepas tolerantes en
tubos de tapa rosca que contenían 10 mililitros de medio de cultivo caldo nutriente
con las respectivas sales metálicas cloruro ferroso, cromato de potasio y cloruro
cúprico a las concentraciones de 2500 y 3500 ppm y se incubó a 22ºC en agitación
permanente y total asepsia, consecuentemente, se utilizó la dilución 10-1 y se
realizó resiembras de 5 μL a 3 repeticiones en agar nutriente cada 48 horas previa
su inoculación por 5 semanas. Las resiembras fueron incubadas por 48 h y se
realizó el recuento en placa de las colonias bacterianas.
3.2.3 Identificación de cepas tolerantes a metales pesados
Para la identificación de las cepas resistentes se utilizó el método de tinción Gram
para dar un acercamiento al tipo de bacterias que hemos utilizado ya que ello
representa un elemento fundamental en la taxonomía bacteriana.
3.2.3.1 Tinción Gram
3.2.3.1.1 Preparación del frotis
42
Este trabajo consistió en colocar el material a ser observado (suspensión
microbiana) en la superficie de un portaobjetos de vidrio, a fin de formar una fina
película. La fijación del frotis se lo realizó con la ayuda del calor, ya que permite
la adherencia de la preparación al vidrio, causa la muerte de las células
microbianas y permite la penetración de las moléculas de colorante dentro de
ellas. Es importante recordar que estas operaciones pueden causar cambios
considerables (a veces) de la morfología microbiana (Vaughan et al., 2008).
Procedimiento:
1) Se preparó una estación de trabajo bajo una cámara de flujo laminar (o en
la cercanía de un mechero de Bunsen) para el desarrollo de los
procedimientos posteriores.
2) Se escogió la colonia aislada y recoger suavemente una pequeña porción
de la colonia con un asa estéril.
3) Se colocó la porción tomada en el centro de un portaobjetos de
microscopio.
4) Se dispersó suavemente el material bacteriano en la superficie del
portaobjetos de vidrio.
5) Se secó el portaobjetos con el frotis al aire o teniéndolo cerca de la llama
del mechero de Bunsen. Otra alternativa sería secar el portaobjetos
suavemente con papel absorbente.
3.2.3.1.2 Coloración del preparado método de Gram
Luego de la preparación de la muestra se procede a realizar los siguientes pasos:
1) Se preparó una estación de trabajo bajo una cámara de flujo laminar (o la
proximidad de un mechero Bunsen) para la realización el procedimiento
continuo.
2) Se preparó y fijó la muestra cómo se indicó (Una preparación para el Gram
(+) y uno para los Gram-).
43
3) Se preparó una bandeja para apoyo de los portaobjetos.
4) Se vertió con un gotero la solución de cristal violeta hasta cubrir
completamente el frotis.
5) Se dejó reposar el preparado aproximadamente 1 minuto.
6) Se quitó el colorante en exceso sumergiendo el portaobjetos en un vaso de
precipitación que contenga agua destilada
7) Se añadió lugol con un gotero hasta cubrir completamente el frotis.
8) Se dejó reposar el preparado por alrededor de 1 minuto.
9) Se quitó el exceso de tinte con alcohol cetona como se realizó con el agua
destilada, hasta que el preparado no libere más color.
10) Se vertió con un gotero la solución de safranina hasta cubrir
completamente el frotis
11) Se dejó en reposo durante aproximadamente 1 minuto.
12) Se quitó el colorante en exceso sumergiendo el portaobjetos en un vaso de
precipitados que contiene agua destilada, como en el apartado 6.
13) Después del lavado, se secó el agua mediante ventilación o sosteniéndolo
en la parte superior y cerca de la llama del mechero de Bunsen. O también,
se puede utilizar papel absorbente.
14) Se colocó una gota de aceite de inmersión directamente encima de
preparado, sin usar cubreobjetos.
15) Y por último, se procedió a observar la coloración de las muestras
bacterianas.
Nota: al observar la coloración del preparado: las bacterias Gram positivas se
muestran de color púrpura, mientras que las bacterias Gram-negativas se
observarán en rojo.
Por último, se realizaron las pruebas de identificación con los
microorganismos que se muestren tolerantes a la presencia de metales
pesados. Para determinar el grupo de bacterias a las cuales pertenecen y
tener un acercamiento más profundo al conocimiento de sus especies.
44
3.2.3.1 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
La identificación de las cepas bacterianas se las realizó mediante el método
espectrometría de masas: MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/
ionization time-of-flight mass spectrometer). El método se lo llevo a cabo en el
Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas Henry Parra en la ciudad de
Guayaquil-Ecuador. Para realizar este procedimiento las cepas 17 y 18 fueron
enviadas al laboratorio utilizando las respectivas medidas de conservación.
Procedimiento:
Se efectuó una resiembra de las cepas 17 y 18 en medio de cultivo agar
nutriente en cajas Petri de plástico.
Las cajas Petri sembradas fueron doblemente selladas con Parafilm y
colocadas dentro de una funda de aluminio para evitar que las cepas
tengan contacto con luz del exterior. Posterior a esto las cepas fueron
introducidas nuevamente en una funda plástica y selladas con su respectiva
rotulación.
Las cajas Petri fueron transportadas desde el laboratorio de investigaciones
ambientales (LABINAM) en la Universidad Técnica Del Norte hasta el
Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas Henry Parra en un cooler
sellado herméticamente con hielo seco para que las cepas se conserven y
puedan sobrevivir a las alta temperatura del clima costero de la ciudad de
Guayaquil.
Una vez que las cepas fueron recibidas en las instalaciones del Laboratorio
de Investigaciones Microbiológicas Henry Parra se procedió a realizar la
identificación por el método MALDI-TOF MS.
45
CAPÍTULO IV
4. RESULTADOS
4.1 AISLAMIENTO IN VITRO DE BACTERIAS DE SUELOS
ANTÁRTICOS
De la siembra de las muestras de suelo antártico se obtuvieron un total de 26 cepas
bacterianas de las cuales 15 cepas se desarrollaron en el medio agar nutriente, 6
cepas se obtuvieron en medio especifico Pseudomonas P y las 5 cepas restantes en
el medio de cultivo agar Pseudomonas F . Tabla 2.
Tabla 2. Esquema de los nombres ordenados de las cepas en base al suelo y el
medio de cultivo en el cual germinaron.
Cepa Suelo Agar Nutriente Agar Pseudomonas P Agar Pseudomonas F
1 suelo 1 1
2 suelo 2 2,1
3 suelo 2 2,2
4 suelo 2 2,3
5 suelo 2 2,4
6 suelo 3 3,1
7 suelo 3 3,2
8 suelo 3 3,3
9 suelo 3 3,4
10 suelo 3 3,5
11 suelo 4 4,1
12 suelo 4 4,2
13 suelo 5 5,1
14 suelo 5 5,2
15 suelo 5 5,3
16 suelo 1 1
17 suelo 3 3,1
18 suelo 3 3,2
19 suelo 3 3,3
20 suelo 4 4
21 suelo 5 5
22 suelo 1 1,1
23 suelo 1 1,2
24 suelo 2 2
25 suelo 4 4
26 suelo 5 5
46
4.1.1 Colonias bacterianas obtenidas de los suelos antárticos
previas a su aislamiento
4.1.1.1 Cepas obtenidas en el medio Agar Nutriente
La mayor parte de las cepas bacterianas se obtuvieron de la siembra de los suelos
antárticos en medio agar nutriente, el aislamiento dió lugar de 15 cepas en este
medio, las cuales fueron aisladas mediante la diferenciación de la morfología y
color de las colonias. En la tabla 2 se detalla la obtención de las cepas y los suelos
provenientes. Tabla 3.
Tabla 3. Descripción de obtención de cepas bacterianas en medio agar nutriente.
MUESTRA
LOCALIZACIÓN DE
COLONIAS PREVIA AL
AISLAMIENTO
DESCRIPCIÓN
La siembra del suelo 1 en
medio agar nutriente dió
lugar a la generación de 1
sola cepa bacteriana (se
presentó morfología
uniforme entre las colonias).
Cepa 1.
47
La siembra del suelo 2 en
medio agar nutriente
presentó 4 morfologías
diferentes entre colonias,
que dieron lugar a 4 cepas.
Cepas 2, 3, 4 y 5.
El suelo 3 presentó
crecimiento de mayor
variedad de colonias; dando
lugar a 5 cepas bacterianas.
Cepas 6, 7, 8, 9 y 10.
La siembra del suelo 4 en
medio agar nutrientediólugar
a la generación de 2 tipos de
colonias. Por ende, se
obtuvieron 2 cepas. Cepas
11 y 12.
48
La siembra del suelo
5diólugar al crecimiento de
3 formas de colonias
diferentes. Dando lugar a 3
cepas bacterianas. Cepas 13,
14 y 15.
4.1.1.2 Cepas obtenidas en medio agar Pseudomonas P
Reduciéndose a una tercera parte de las cepas desarrolladas en el medio de cultivo
agar nutriente, el medio de cultivo presentó el florecimiento de un total de 6 cepas
bacterianas mostrando un crecimiento diferente en los suelos, tal es el caso de la
muestra de suelo número 2 que no presentó crecimiento alguno, mientras que los
suelos 1, 3, 4 y 5 manifestaron el desarrollo de 1, 3, 1 y 1 cepas bacterianas
respectivamente. En la tabla 4 se detalla la obtención de las cepas y los suelos
provenientes.
Tabla 4. Descripción de obtención de cepas bacterianas en medio agar
Pseudomonas P.
MUESTRA
LOCALIZACIÓN DE
COLONIAS PREVIA AL
AISLAMIENTO
DESCRIPCIÓN
49
SUELO Nº 1:
PUNTA AMBATO
(SITIO 1)
La siembra del suelo 1 en
medio agar Pseudomonas P
dió lugar a la generación de
1 sola cepa bacteriana (se
presentó morfología
uniforme entre las
colonias).
Cepa 16.
SUELO Nº 2:
ISLA
BARRIENTOS
(SITIO 1)
La siembra del suelo 2 en
medio Pseudomonas P no
presentó crecimiento
alguno. La muestra no
consolidó su desarrollo.
SUELO Nº 3:
ESTACIÓN
ARTURO PRAT
El suelo 3 presentó
crecimiento de mayor
variedad de colonias en el
medio agar Pseudomonas
P; dando lugar a 3 cepas
bacterianas. Cepas 17, 18 y
19.
50
SUELO Nº 4:
ISLA
BARRIENTOS
(SITIO 2)
La siembra del suelo 1 en
medio agar Pseudomonas P
dió lugar a la generación de
1 sola cepa bacteriana (se
presentó morfología
uniforme entre las
colonias).
Cepa 20.
SUELO Nº 5:
PUNTA AMBATO
(SITIO 2)
La siembra del suelo 1 en
medio agar Pseudomonas P
dió lugar a la generación de
1 sola cepa bacteriana (se
presentó morfología
uniforme entre las
colonias).
Cepa 21.
4.1.1.3 Cepas obtenidas en medio agar Pseudomonas F
La menor parte del total de las cepas obtenidas en este estudio se presentó en el
medio agar Pseudomonas F, ya que dió lugar a la formación de 5 cepas
bacterianas; estas mostraron un crecimiento diferente en los suelos, tal es el caso
de la muestra de suelo número 3 que no presentó crecimiento alguno, mientras
que los suelos 1, 2, 4 y 5 desarrollaron 2, 1, 1 y 1 cepas bacterianas
respectivamente. En la tabla 5 se detalla la obtención de las cepas y los suelos
provenientes.
Tabla 5. Descripción de obtención de cepas bacterianas en medio agar
Pseudomonas P.
51
MUESTRA
LOCALIZACIÓN DE
COLONIAS PREVIA AL
AISLAMIENTO
DESCRIPCIÓN
SUELO Nº 1:
PUNTA AMBATO
(SITIO 1)
El suelo 1 presentó
crecimiento de mayor
variedad de colonias en el
medio agar Pseudomonas
F; con lugar a 2 cepas
bacterianas. Cepas 22 y
23.
SUELO Nº 2:
ISLA
BARRIENTOS
(SITIO 1)
La siembra del suelo 2 en
medio agar Pseudomonas
F dió lugar a la generación
de 1 sola cepa bacteriana
(se presentó morfología
uniforme entre las
colonias).
Cepa 24.
SUELO Nº 3:
ESTACIÓN
ARTURO PRAT
La siembra del suelo 3 en
medio Pseudomonas F no
presentó presencia de
colonias bacterianas. La
muestra no consolidó su
desarrollo.
52
SUELO Nº 4:
ISLA
BARRIENTOS
(SITIO 2)
La siembra del suelo 4 en
medio agar Pseudomonas
F dió lugar a la generación
de 1 sola cepa bacteriana
(se presentó morfología
uniforme entre las
colonias).
Cepa 25.
SUELO Nº 5:
PUNTA AMBATO
(SITIO 2)
La siembra del suelo 5 en
medio agar Pseudomonas
F dió lugar a la generación
de 1 sola cepa bacteriana
(se presentó morfología
uniforme entre las
colonias).
Cepa 25.
Hay que tomar en cuenta que el medio agar nutriente es un medio no selectivo y
permite el crecimiento de un gran variedad de microorganismos, mientras que los
medios Agar Pseudomonas P y Agar Pseudomonas F son medios selectivos y
disminuye la probabilidad del desarrollo de otros microrganismos.
4.2 ENSAYO DE TOLERANCIA DE CEPAS BACTERIANAS
AISLADAS A LOS METALES PESADOS: HIERRO, CROMO Y
COBRE
Para el levantamiento de datos del ensayo de tolerancia de las cepas bacterianas a
metales pesados se tomó en cuenta el crecimiento bacteriano como limitante (si se
53
produjo o no crecimiento). De tal manera los datos fueron recogidos como
booleanos 0 = no hubo formación de colonias y 1 = hubo formación de colonias;
según esto se obtuvieron los siguientes datos:
Concentración 1: 2500 ppm.
a) Para el primer metal hierro (cloruro ferroso) a la concentración de 2500
parte por millón (ppm) los datos recogidos indicaron que no hubo
crecimiento de las cepas ante este metal, a excepción de las cepas 17, que
mostró crecimiento en todas las repeticiones y la 18 y la 26, que
presentaron crecimiento en 2 y 1 repeticiones, respectivamente. Tabla 6.
b) Para el segundo metal, cromo (Cromato de potasio), a la concentración de
2500 ppm los datos tomados presentaron crecimiento en todas las cepas
ante este metal, a excepción de las cepas 16 y 22. Adicionalmente, las
cepas 2, 9 y 15 no mostraron crecimiento en una repetición. Tabla 7.
c) Para el tercer y último metal, el cobre (cloruro cúprico) en la
concentración de 2500 ppm los datos reunidos no presentaron crecimiento
alguno de la cepas con la singular excepción de las cepas 17 y 18, que
fueron las únicas que mostraron un crecimiento abundante. Tabla 8.
Concentración 2: 6500 ppm
a) Para el metal hierro (cloruro ferroso) a la concentración de 6500 ppm no se
apreció crecimiento alguno para todas las cepas como se puede observar
en la Tabla 9.
b) Para el metal cromo (Cromato de potasio) a la concentración de 6500 ppm
el crecimiento de las cepas totales fue alternado. Los datos recogidos en
esta evaluación presentan crecimiento absoluto (en 3 repeticiones) para las
cepas: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 24 y 26; crecimiento parcial (en 1 o 2
54
repeticiones) para las cepas: 14, 15, 17, 18, y 19; y, mientras que las cepas
restantes: 1, 8, 9, 10, 16, 20, 21, 22, 23 y 25 no manifestaron crecimiento
bacteriano alguno. Tabla 10.
c) Para el metal cobre (cloruro cúprico) a la concentración de 6500 ppm,
según el levantamiento de datos, no se presentó ningún tipo de crecimiento
aparición de colonias bacterianas. Tabla 11.
Concentración 3: 10000 ppm
Para la concentración más alta de metales pesados en los medios de cultivo, el
crecimiento bacteriano no se consolidó (totalmente nulo). Dependiendo
indistintamente de los metales pesados o de las cepas utilizadas no hubo
crecimiento alguno como se puede observar en las tablas de datos. Tabla 12.
Ante la concentración l el 8% de las cepas bacterianas aisladas de los suelos
antárticos fue resistente a Hierro y Cobre, mientras que el 90% de las cepas fue
resistente a Cromo; ante la concentración 2 únicamente se observó resistencia al
metal Cromo con el 45% de las cepas y por último a la concentración 3
(concentración más alta) la resistencia fue nula en todos los casos. Figura 9.
En vista de que las cepas 17 y 18 fueron las únicas que presentaron crecimiento
ante los 3 metales, se decidió realizar un muestreo no probabilístico por criterio
para realizar la caracterización de las curvas de crecimiento en presencia de los
metales pesados. Tabla 13.
55
HIERRO 1 HUBO CRECIMIENTO
CROMO 0 NO HUBO CRECIMIENTO
COBRE
Tabla 13: Resultados de ensayo de tolerancia. Cepas 17 y 18 son las únicas tolerantes a los 3 metales a 2500 ppm.
CEPA R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3
1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
13 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
15 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
17 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
18 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
19 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
20 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
21 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
23 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
24 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
26 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CONCENTRACION 1: 2500 PPM CONCENTRACION 2: 6500 PPM CONCENTRACION 3: 10000 PPM
56
Figura 9: Porcentaje de cepas tolerantes a las distintas concentraciones de metales
pesados.
4.3 ENSAYO DE CURVA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS 17 Y
18 EN PRESENCIA DE METALES PESADOS
En este apartado se encuentran los resultados del ensayo de la curva de
crecimiento de las cepas antes los metales pesados. Los resultados se encuentran
clasificados en el orden de metales pesados: hierro, cromo y cobre de acuerdo a
cada cepa 17 y 18 respectivamente.
4.3.1 Recuento en placa y curva de crecimiento de la cepa 17
como resultado su crecimiento en presencia de los metales
pesados a concentración 1 = 2500 y concentración 2 = 3500
ppm.
4.3.1.1 Hierro
El levantamiento de datos del conteo en placa de la cepa 17 ante la presencia de
hierro presentó los siguientes datos (Tabla 14):
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
2500 ppm 6500 ppm 1000 ppm
CEP
AS
TOLE
RA
NTE
S
CONCENTRACIÓN
Fe
Cr
Cu
57
Tabla 14: Recuento de colonias de la cepa 17 en presencia de hierro.
Ante la presencia del metal pesado hierro la cepa 17 presentó una dinámica de
crecimiento irregular en ambas concentraciones. En la primera semana se observó
un crecimiento notable para 2500 ppm mientas que para 3500 ppm su crecimiento
no es muy pronunciado, posteriormente las semanas 2, 3 y 4 se notó un
decrecimiento para ambas concentraciones, teniendo un mínimo de 96 y 99
colonias para 2500 y 3500 ppm respectivamente; y por último en la semana 5 se
presentó un crecimiento elevado para la concentración inferior alcanzando su
máximo número de colonias de 218 unidades mientras que para 3500 ppm alcanzó
117 colonias. No se tiene estudios de límites de referencia para para hierro.
Figura 10.
R1 R2 R3 x R1 R2 R3 X
48 100 123 132 118 137 139 117 131
96 106 143 123 124 119 150 148 139
144 121 108 107 112 138 109 200 149
192 129 144 164 146 166 204 118 163
240 162 145 115 141 238 145 142 175
288 121 146 184 150 129 148 141 139
336 135 109 119 121 136 160 153 150
384 131 111 98 113 88 171 129 129
432 159 55 114 109 92 104 142 113
480 113 84 125 107 131 113 147 130
528 89 103 148 113 115 104 170 130
576 133 110 94 112 90 102 135 109
624 100 100 100 100 101 115 71 96
672 111 96 90 99 109 111 110 110
720 115 102 159 125 130 180 89 133
768 136 150 172 153 189 223 221 211
816 134 134 134 134 225 218 198 214
864 142 112 96 117 187 216 252 218
2500 PPM3500 ppmT (horas)
NÚMERO DE COLONIAS (CLORURO FERROSO-CEPA 17)
58
Figura 10: Dinámica de crecimiento de la cepa 17 en presencia de hierro.
4.3.1.2 Cromo
La recopilación de datos del conteo en placa de la cepa 17 ante la presencia de
cromo presentó los siguientes datos (Tabla 15):
Tabla 15: Recuento de colonias de la cepa 17 en presencia de cromo.
0
50
100
150
200
250
48
96
14
41
92
24
02
88
33
63
84
43
24
80
52
85
76
62
46
72
72
07
68
81
68
64
Nú
me
ro d
e c
olo
nia
s (U
FC
/m
L)
Tiempo (h)
CLORURO FERROSOCEPA 17
3500 ppm
2500 ppm
59
La cepa 17 ante la presencia del metal pesado cromo presentó una dinámica de
crecimiento similar para la concentración 1 y 2. En la primera semana se pudo
apreciar la fase de crecimiento exponencial alcanzando sus máximos de 161 y 187
colonias para 2500 y 3500 ppm respectivamente, inmediatamente, las semanas 2,
3, 4 y 5 muestran explícitamente una fase decreciente para ambas
concentraciones, alcanzando sus puntos mínimos con 50 y 16 colonias para 2500
y 3500 ppm; siendo el rango de referencia el estudio de Tashyrev et al. (2009)
mostrando en sus resultados una superresistencia a 2000 ppm y una resistencia al cromo a
una concentración de 5000 ppm. Figura 11.
R1 R2 R3 x R1 R2 R3 x
48 123 114 131 123 111 136 135 127
96 102 115 107 108 199 178 107 161
144 164 192 206 187 181 94 136 137
192 186 162 142 163 127 134 121 127
240 134 186 188 169 154 137 137 143
288 120 141 181 147 110 164 132 135
336 122 91 94 102 93 100 123 105
384 97 136 108 114 151 136 126 138
432 102 92 93 96 118 68 102 96
480 68 73 100 80 82 130 123 112
528 41 81 59 60 84 82 87 84
576 91 32 63 62 76 62 126 88
624 49 58 83 63 70 73 84 76
672 58 36 50 48 67 79 68 71
720 33 29 38 33 55 65 54 58
768 36 21 21 26 43 84 48 58
816 19 13 16 16 61 46 53 53
864 19 12 16 16 45 55 51 50
NÚMERO DE COLONIAS (CROMATO DE POTASIO-CEPA 17)
3500 PPM 2500 PPMT (horas)
60
Figura 11: Dinámica de crecimiento de la cepa 17 en presencia de cromo.
4.3.1.3 Cobre
El compendio de datos del conteo en placa de la cepa 17 ante la presencia de
cobre presentó los siguientes datos (Tabla 16):
Tabla 16: Recuento de colonias de la cepa 17 en presencia de cobre.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
48
96
14
41
92
24
02
88
33
63
84
43
24
80
52
85
76
62
46
72
72
07
68
81
68
64
Nú
me
ro d
e c
olo
nia
s (U
FC
/m
L)
Tiempo (h)
CROMATO DE POTASIO
CEPA 17
3500 ppm
2500 pmm
R1 R2 R3 x R1 R2 R3 x
48 52 53 63 56 91 78 70 80
96 77 44 74 65 102 90 89 94
144 85 46 64 65 77 109 107 98
192 66 61 48 58 98 95 109 101
240 65 65 69 66 108 55 72 78
288 68 66 63 66 102 99 78 93
336 69 47 30 49 91 40 79 70
384 30 30 43 34 89 66 61 72
432 36 26 20 27 37 120 97 85
480 65 27 25 39 123 39 95 86
528 33 37 24 31 92 80 96 89
576 45 47 46 46 103 75 73 84
624 50 61 59 57 114 75 65 85
672 54 46 28 43 76 85 83 81
720 75 60 48 61 127 123 84 111
768 47 29 44 40 84 115 116 105
816 50 56 61 56 94 110 109 104
864 76 76 59 70 142 120 132 131
NÚMERO DE COLONIAS (CLORURO CÚPRICO-CEPA 17)
35000 PPM 2500 PPMT (horas)
61
Al encontrarse en presencia del metal pesado cobre, la cepa 17 mostró curvas de
crecimiento similares tomando en cuenta que la concentración 1 supera en número
de colonias a la concentración 2. En la primera semana se observó un vago
crecimiento de la cepa, posteriormente las semanas 2, 3 y 4 se notó un descenso
de población para ambas concentraciones, teniendo un mínimo de 70 y 27
colonias para 2500 y 3500 ppm respectivamente; y por último en la semana 5 la
cepa a 2500 ppm presentó un crecimiento relativamente superior alcanzando su
máximo de 215 colonias mientras que para la concentración 2 se contabilizaron 70
colonias; como el rango de referencia se muestra el estudio de Tashyrev et al.
(2009) mostrando en sus resultados una resistencia al cobre a una concentración de 1000
ppm. Figura 12.
Figura 12: Dinámica de crecimiento de la cepa 17 en presencia de cobre.
0
20
40
60
80
100
120
140
48
96
14
41
92
24
02
88
33
63
84
43
24
80
52
85
76
62
46
72
72
07
68
81
68
64
Nú
me
ro d
e c
olo
nia
s (U
FC
/m
L)
Tiempo (h)
CLORURO CÚPRICOCEPA 17
3500 ppm
2500 ppm
62
4.3.2 Recuento en placa y curva de crecimiento de la cepa 18
como resultado su crecimiento en presencia de metales
pesados a 2500 y 3500 ppm de concentración.
4.3.2.1 Hierro
El levantamiento de datos del conteo en placa de la cepa 17 ante la presencia de
hierro presento los siguientes datos (Tabla 17):
Tabla 17: Recuento de colonias de la cepa 18 en presencia de hierro.
Ante la presencia del metal pesado hierro la cepa 18 presentó una dinámica de
crecimiento similar en ambas concentraciones. En la primera semana se observó
un escaso crecimiento a la par; a la segunda y tercera semanas se notó un descenso
alcanzando un sus puntos mínimos en la curva, marcando 100 y 90 colonias en las
concentraciones 1 y 2 respectivamente, mientras que en la semana cuarta empiezó
un crecimiento hasta la semana 5 en la cual la población se elevó hasta alcanzar
sus puntos máximos de 215 y 184 colonias para las concentraciones 1 y 2
respectivamente. Figura 13.
R1 R2 R3 x R1 R2 R3 x
48 130 139 113 127 107 133 121 120
96 90 150 136 125 130 127 128 128
144 112 165 164 147 134 117 199 150
192 103 191 185 160 142 178 122 147
240 127 116 108 117 142 122 122 129
288 116 203 111 143 98 157 209 155
336 57 93 177 109 90 152 90 111
384 120 79 101 100 92 119 89 100
432 139 142 157 146 244 92 87 141
480 148 72 73 98 171 188 148 169
528 146 102 93 114 126 119 164 136
576 85 95 90 90 111 154 126 130
624 95 124 90 103 120 152 105 126
672 112 75 95 94 153 160 132 148
720 120 123 125 123 182 99 152 144
768 139 129 171 146 153 204 189 182
816 171 169 199 180 187 236 189 204
864 196 151 204 184 281 187 178 215
T (horas)
NÚMERO DE COLONIAS (CLORURO FERROSO-CEPA 18)
3500 PPM 2500 PPM
63
Figura 13: Dinámica de crecimiento de la cepa 18 en presencia de hierro.
4.3.2.2 Cromo
La recopilación de datos del conteo en placa de la cepa 18 ante la presencia de
cromo presentó los siguientes datos (Tabla 18):
Tabla 17: Recuento de colonias de la cepa 18 en presencia de cromo.
R1 R2 R3 x R1 R2 R3 x
48 96 76 67 80 48 56 69 58
96 112 116 113 114 125 140 105 123
144 132 100 81 104 177 129 183 163
192 100 94 128 107 143 96 125 121
240 136 147 138 140 101 180 140 140
288 145 130 170 148 165 214 213 197
336 83 77 54 71 148 120 95 121
384 123 140 76 113 72 77 70 73
432 49 32 30 37 110 47 57 71
480 56 25 73 51 121 82 129 111
528 43 45 41 43 69 84 68 74
576 25 30 48 34 115 64 78 86
624 31 27 18 25 105 119 82 102
672 39 34 36 36 96 115 71 94
720 24 19 7 17 96 43 97 79
768 31 19 24 25 70 64 59 64
816 23 24 26 24 77 68 76 74
864 4 9 10 8 57 62 64 61
3500 PPM 2500 PPM
NÚMERO DE COLONIAS (CROMATO DE POTASIO-CEPA 18)
TIEMPO
(horas)
64
La cepa 17 ante la presencia del metal pesado cromo presentó una dinámica de
crecimiento irregular para la concentración 1 y 2. En la primera y segunda
semanas se pudo apreciar la fase de crecimiento exponencial de las bacterias,
alcanzando así sus puntos máximos en la curva con 197 y 148 colonias,
inmediatamente, las semanas 3, 4 y 5 mostraron un irregular e inestable descenso
de población, alcanzaron así sus puntos mínimos en la quinta semana con 61 y 8
colonias para las concentraciones 1 y 2 respectivamente; se pudo apreciar que la
concentración más alta casi terminó con la población bacteriana como se muestra
en la figura 14.
Figura 14: Dinámica de crecimiento de la cepa 18 en presencia de cromo.
4.3.2.3 Cobre
El compendio de datos del conteo en placa de la cepa 18 ante la presencia de
cobre presentó los siguientes datos (Tabla 19):
Tabla 19: Recuento de colonias de la cepa 18 en presencia de cobre.
0
50
100
150
200
250
48
96
14
41
92
24
02
88
33
63
84
43
24
80
52
85
76
62
46
72
72
07
68
81
68
64
Nú
me
ro d
e c
olo
nia
s (U
FC
/m
L)
Tiempo (h)
CROMATO DE POTASIO
CEPA 18
3500 ppm
2500 ppm
65
Al encontrarse en la presencia del metal pesado cobre, la cepa 17 mostró curvas
de crecimiento muy irregulares en sus picos. Para la concentración de 2500 ppm,
la primera semana se observó crecimiento de la cepa, en la semanas 2, 3 y 4 se
observó un irregular descenso de población y en la quinta semana nuevamente
ganó un crecimiento elevado obteniendo su punto máximo en la curva con 185
colonias; mientras que para la concentración de 3500 en la primera semana se
logró un leve incremento en la segunda semana la población bacteriana descendió
hasta alcanzar su punto mínimo en la curva con 81 colonias y por último en las
semanas 3, 4 y 5 alcanzó un elevado crecimiento de población superando el punto
máximo de la concentración con 209 colonias bacterianas. Figura 15.
R1 R2 R3 x R1 R2 R3 x
48 102 118 67 96 77 97 44 73
96 85 89 100 91 118 108 127 118
144 111 90 146 116 117 102 94 104
192 174 124 125 141 116 77 88 94
240 84 124 136 115 133 148 193 158
288 87 81 109 92 143 183 120 149
336 70 115 89 91 86 95 96 92
384 59 51 133 81 117 73 124 105
432 93 104 93 97 85 83 258 142
480 161 125 120 135 89 101 85 92
528 128 121 114 121 89 101 78 89
576 83 150 140 124 111 125 100 112
624 121 122 148 130 84 64 95 81
672 186 147 131 155 125 100 121 115
720 120 180 131 144 147 81 124 117
768 170 191 158 173 144 113 120 126
816 200 126 146 157 100 162 225 162
864 201 220 205 209 154 168 232 185
NÚMERO DE COLONIAS (CLORURO CÚPRICO-CEPA 18)
2500 PPM 3500 PPM TIEMPO
(horas)
66
Figura 15: Dinámica de crecimiento de la cepa 18 en presencia de cromo.
4.4 IDENTIFICACIÓN
4.4.1 Caracterización morfológica de colonias bacterianas
La caracterización morfológica de las colonias de las cepas presentó una amplia
variedad de formas, superficies bordes y colores. Mediante esta caracterización se
reconocieron formas puntiformes, irregulares, circulares, fusiformes y rizoides;
superficies planas, convexas, planoconvexas y acuminadas; las mismas
manifestaron bordes redondeados, lobulados y redondeados; y también se
identificaron una gama de colores entre blanco, crema, amarillo, marrón y
durazno como se puede apreciar detalladamente en la tabla 20.
0
50
100
150
200
250
48
96
14
41
92
24
02
88
33
63
84
43
24
80
52
85
76
62
46
72
72
07
68
81
68
64
Nú
me
ro d
e c
olo
nia
s (U
FC
/m
L)
Tiempo (h)
CLORUROCÚPRICOCEPA 18
3500 ppm
2500 ppm
67
Tabla 20: Caracterización morfológica de colonias bacterianas antárticas.
4.4.2 Tinción Gram
La tinción Gram de las cepas bacterianas fue un método necesario para ayudar a
tipificar las cepas, ya que se obtuvo un enfoque de la morfología a nivel celular de
las 26 cepas.
FORMA SUPERFICIE BORDE COLOR
1 puntiforme plana redondeado crema
2 irregular plana ondulado blanco cremoso
3 puntiforme convexa redondeado blanco
4 circular planoconvexa redondeado blanco cremoso
5 puntiforme acuminada redondeado blanco
6 filamentosa acuminada lobulado crema
7 fusiforme planoconvexa redondeado crema
8 irregular plana ondulado blanco
9 circular plana redondeado blanco cremoso
10 puntiforme acuminada redondeado blanco cremoso
11 circular planoconvexa redondeado crema
12 puntiforme planoconvexa redondeado crema
13 irregular acuminada ondulado amarillo
14 circular planoconvexa redondeado crema
15 puntiforme acuminada redondeado amarillo
16 irregular planoconvexa ondulado crema
17 circular convexa redondeado blanco
18 circular planoconvexa redondeado blanco cremoso
19 filamentosa plana lobulado blanco
20 irregular planoconvexa redondeado amarillo
21 rizoide plana rizoide blanco
22 rizoide plana rizoide crema
23 irregular convexa ondulado marrón
24 rizoide plana rizoide crema
25 irregular acuminada lobulado amarillo
26 irregular acuminada ondulado durazno
CEPAMORFOLOGÍA DE COLONIAS BACTERIANAS
68
Las cepas según su morfología y coloración Gram se las clasificó de la siguiente
manera (Tabla 21):
a) Siete cocos Gram negativos (dos diplococos y cinco cocos)
b) Siete cocos Gram positivos (dos estafilococos, un estreptococo y cuatro
cocos)
c) Tres bacilos Gram negativos, y
d) Nueve bacilos Gram positivos
Tabla 21: Caracterización mediante Tinción Gram de bacterias antárticas.
Gram positivo (+) Gram negativo (-)
1 ✔ cocos
2 ✔ cocos
3 ✔ bacilos
4 ✔ cocos
5 ✔ bacilos
6 ✔ bacilos
7 ✔ bacilos
8 ✔ cocos
9 ✔ bacilos
10 ✔ bacilos
11 ✔ bacilos
12 ✔ bacilos
13 ✔ cocos
14 ✔ bacilos
15 ✔ cocos
16 ✔ bacilos
17 ✔ bacilos
18 ✔ bacilos
19 ✔ estafilococos
20 ✔ estafilococos
21 ✔ cocos
22 ✔ cocos
23 ✔ bacilos
24 ✔ bacilos
25 ✔ cocos
26 ✔ estreptococos
Coloración GramCEPA Morfología celular
69
4.4.3 Caracterización mediante el método MALDI-TOF MS
(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight
mass spectrometer).
La caracterización de las cepas 17 y 18 (cepas tolerantes a los metales pesados:
hierro, cromo y cobre) mediante el método de espectrometría de masas MALDI-
TOF mostró una identificación a nivel de especie. Los resultados del análisis por
MALDI-TOF identificaron a la cepa 17 como Bacillus pumilus mientras que a la
cepa 18 se determinó como Stenotrophomonas maltophilia.
4.4.3.1 Clasificación taxonómica de B. pumilus.
Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacillus
Orden: Bacillales
Familia: Bacillaceae
Género: Bacillus
Especies: B. pumilus
4.4.3.2 Clasificación taxonómica de S. maltophilia.
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Xanthomonadales
Familia: Xanthomonadaceae
Género: Stenotrophomonas
Especie: S. maltophilia
70
CAPITULO V
5. DISCUSIÓN
En el presente estudio se obtuvo un total de 26 cepas bacterianas de las muestras
de suelos antárticos; de las cuales 15 cepas se desarrollaron en el medio agar
nutriente, 6 cepas se obtuvieron en medio especifico Pseudomonas P y las 5 cepas
restantes en el medio de cultivo agar Pseudomonas F.
Las diferencias en la variedad de crecimiento bacteriano entre uno y otro medios
de cultivo pudo deberse a las necesidades nutricionales y que tan exigentes son
cada uno de los tipos de bacterias cultivadas (Forbes, 2009) y las distintas
composiciones de los medios de cultivo utilizados de acuerdo a sus capacidades
selectivas, no selectivas o diferenciales de los mismos (Vaughan et al., 2008).
Por tal motivo la mayor variedad de bacterias concebidas en el agar nutriente, se
debe a que este es un medio de cultivo no selectivo que contiene tres componentes
(pluripeptona, extracto de carne y cloruro de sodio) destinados a facilitar el
desarrollo de una amplia variedad de microorganismos exigentes y no exigentes
en su nutrición. Mientras que los medios de cultivo agar Pseudomonas P y agar
Pseudomonas F contienen una limitada cantidad de nutrientes y compuestos
estimulantes e inhibidores de ciertas moléculas (piorrubina, piocianina y
fluoresceína) que facilitan la diferenciación de bacterias del genero Pseudomonas
(“Laboratorios Britania”, s/f).
Del número total de microorganismos obtenidos (26 cepas bacterianas) de los
suelos antárticos, las cepas 17 y 18 fueron las únicas que presentaron tolerancia
ante los 3 metales a la concentración de 2500 ppm y 3500 ppm, siendo mayor al
de investigaciones anteriores que mostraron resistencia a concentraciones
máximas de 1000 ppm para cobre, mientras que para cromo presentaron una
resistencia hasta 5000 ppm como se menciona en el trabajo de Tashyrev et al.
(2009).
71
La cepa 17 que mostró resistencia a las 3 sales metálicas fue identificada como B.
pumilus lo cual corrobora el informe del estudio realizado por Cañizares-
Villanueva, (2000) el cual menciona que el género Bacillus sp. presentó
superresistencia y es capaz de remover de forma individual o en conjunto los
metales: Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, U y Zn, en un amplio rango de concentraciones
no mencionadas detalladamente.
La cepa 18 que mostró resistencia a los 3 metales pesados hierro, cromo y cobre
fue identificada como S. maltophilia, lo cual concuerda con la investigación
realizada por Moraga y colaboradores (2003) la cual demuestra que S. maltophilia
es una de las principales cepas pertenecientes al 27% que presentaron actividad
productiva en el medio de cultivo que contenía cobre.
Mediante el método de espectrometría de masas MALDI-TOF se caracterizaron
las cepas 17 y 18 a nivel de especie de modo que la cepa 17 pertenece al género
Bacillus y a la especie B. pumilus mientras que la cepa 18 mostró pertenecer al
género Stenotrophomonas y a la especie S. maltophilia.
La identificación de la cepa 17 como B. pumilus mediante el método de MALDI-
TOF se la puede considerar con un margen de error nulo según el estudio
realizado por Bizzini et al. (2011), en el cual menciona que del genero Bacillus
únicamente se dificulta la identificación de la especie Bacillus cereus que se debe
a espectros de referencia incompletos en la base de datos Bruker que cubren
muchos aislamientos o especies diferentes de un género dado.
El método de espectrometría de masas MALDI-TOF tiene la posibilidad de
manifestar fallos en sus resultados ya que de algunos géneros, ciertas especies no
pueden ser identificadas con especificidad, esto puede ser validado por Ferreira y
sus colaboradores (2009) en el cual menciona que las identificaciones fallidas se
dieron en los géneros Raoultella y Acinetobacter, en Stenotrophomonas
maltophilia y en Francisella tularensis. Además en el estudio de Seng et
72
al. ( 2009 ), siete Stenotrophomonas maltophilia los aislamientos se identificaron
incorrectamente como Pseudomonas hibiscicola, que es un nombre no válido para
un bacilo Gram negativo no fermentador que se demostró que era S. maltophilia.
Las cepas 17 y 18 fueron las que mejor resistencia mostraron ante la presencia de
los metales pesados, y en el ensayo que se utilizó el recuento en placa para
determinar la dinámica de crecimiento ayudó para denotar una comparación entre
las cepas. La cepa 17 ante la concentración 1 confirmó una resistencia ante los tres
metales, pero no en igual medida ante los mismos ya que hubo resistencia para
hierro, cobre y cromo en el respectivo orden descendente con notable
decrecimiento de población; mientras que para la concentración 2 de igual manera
se confirmó la resistencia ante los metales pero con un leve decrecimiento de
población en comparación con la concentración 1 para hierro y cobre en tanto que
para la cromo la cepa disminuyó su población notablemente.
La cepa 18 ante la concentración 1 comprobó su resistencia ante los tres metales,
con una resistencia que se rige por el metal hierro, seguido por cobre y cromo con
una leve diferencia poblacional mientras que para la concentración 2 se puede
confirmar la resistencia y posiblemente degradación de los metales cobre y hierro
ya que los niveles poblacionales de la cepa se mantienen similares a los de la
concentración 1 siendo el hierro el que mostró una mayor población final mientras
que para el metal cromo se nota claramente la sensibilidad de la cepa ante el
aumento de concentración de dicho metal debido a que mostró una población final
cerca de desaparecer.
El enfoque principal del presente estudio es plantear una base firme, tomando en
cuenta que el mismo es el inicio de futuras investigaciones en el ámbito de
biorremediación, en base a los resultados en cuanto a la resistencia que presentan
las bacterias obtenidas del continente antártico las cepas 17 y 18 determinadas
como B. pumilus y S. maltophilia se las puede considerar para posteriores
investigaciones de campo en lo que conciernen las zonas afectadas con impactos
ambientales que están manifiestando por consecuencia de la minería que está
73
aquejando a la zona 1 del Ecuador, ya que el clima y temperatura que nos brinda
la zona 1 del Ecuador no es una impedimento ante la genuina capacidad de
adaptación que caracteriza a la microbiota antártica. Posteriormente se prevé
utilizar esta investigación y mediante técnicas biotecnológicas moldear una
herramienta capaz de reanudar los procesos biológicos que se han interrumpido o
deteriorado en sitios afectados por los impactos ambientales causados por la
minería en lo que comprende la zona 1.
74
CAPÍTULO VI
6. CONCLUSIONES
Se obtuvieron un total de 26 cepas bacterianas precedentes de las muestras
de suelo antártico, de las cuales 15 cepas se desarrollaron en medio agar
nutriente, 6 cepas en medio agar Pseudomonas P y 5 en medio agar
Pseudomonas F.
Se evaluó la tolerancia de las 26 cepas aisladas de las muestras de suelo
antártico, de las cuales las cepas 17 y 18 presentaron resistencia
simultanea antes los tres metales a la concentración 1.
Las cepas 17 y 18 fueron caracterizadas mediante morfología de colonias,
tinción Gram y método de MALDI-TOF y se las reconoció como B.
pumilus y S. maltophilia respectivamente.
Ante la concentración l el 8% de las cepas bacterianas aisladas de los
suelos antárticos fue resistente a Hierro y Cobre, mientras que el 90% de
las cepas fue resistente a Cromo; ante la concentración 2 únicamente se
observó resistencia al metal Cromo con el 45% de las cepas y por último a
la concentración 3 (concentración más alta) la resistencia fue nula en todos
los casos.
75
7. RECOMENDACIONES
Utilizar medios de cultivo selectivos y no selectivos para la obtención de
mayor variedad de cepas bacterianas.
Realizar dinámicas de crecimiento de las bacterias tolerantes mediante un
seguimiento periódico con recuento en placa.
Caracterizar morfológicamente las cepas a nivel de colonia y a nivel
celular para para verificar las características mediante métodos que
tipifiquen a nivel de especie
Considerar microorganismos de procedencia netamente antártica para
incrementar el éxito de las alternativas biológicas en la recuperación de
suelos contaminados con metales pesados.
Utilizar cepas microbianas en conjunto, con el propósito de obtener
consorcios bacterianos que actúen de modo que, las cepas se beneficien
unas a otras, con la posibilidad de obtener un mejor comportamiento ante
los metales pesados.
Caracterizar las cepas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 19, 24 y 26 que fueron
tolerantes a la concentración de 6500 partes por millón del metal Cromo
debido a que en base a los resultados obtenidos muestran un importante
potencial de tolerancia en presencia del mismo.
76
BIBLIOGRAFÍA CITADA
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84
ANEXOS
6.1 ANEXO 1
Tabla 5.
CEPA R1 R2 R3
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0
10 0 0 0
11 0 0 0
12 0 0 0
13 0 0 0
14 0 0 0
15 0 0 0
16 0 0 0
17 1 1 1
18 0 1 1
19 0 0 0
20 0 0 0
21 0 0 0
22 0 0 0
23 0 0 0
24 0 0 0
25 0 0 0
26 0 1 0
CLORURO FERROSO (a) 2500 ppm
85
6.2 ANEXO 2
Tabla 6.
CEPA R1 R2 R3
1 1 1 1
2 0 1 1
3 1 1 1
4 1 1 1
5 1 1 1
6 1 1 1
7 1 1 1
8 1 1 1
9 1 0 1
10 1 1 1
11 1 1 1
12 1 1 1
13 1 1 1
14 1 1 0
15 1 0 1
16 0 0 0
17 1 1 1
18 1 1 1
19 1 1 1
20 1 1 1
21 1 1 1
22 0 0 0
23 1 1 1
24 1 1 1
25 1 1 1
26 1 1 1
CROMATO DE POTASIO (b) 2500 ppm
86
6.3 ANEXO 3
Tabla 7.
CEPA R1 R2 R3
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0
10 0 0 0
11 0 0 0
12 0 0 0
13 0 0 0
14 0 0 0
15 0 0 0
16 0 0 0
17 1 1 1
18 1 1 1
19 0 0 0
20 0 0 0
21 0 0 0
22 0 0 0
23 0 0 0
24 0 0 0
25 0 0 0
26 0 0 0
CLORURO CÚPRICO (C) 2500 ppm
87
6.4 ANEXO 4
Tabla 8.
CEPA R1 R2 R3
1 0 0 0
2 1 1 1
3 1 1 1
4 1 1 1
5 1 1 1
6 1 1 1
7 1 1 1
8 0 0 0
9 0 0 0
10 0 0 0
11 1 1 1
12 1 1 1
13 1 1 1
14 1 1 0
15 1 0 1
16 0 0 0
17 1 0 0
18 0 0 1
19 1 1 0
20 0 0 0
21 0 0 0
22 0 0 0
23 0 0 0
24 1 1 1
25 0 0 0
26 1 1 1
CROMATO DE POTASIO (b) 6500 ppm
88
6.5 ANEXO 5
Tabla 9.
CEPA R1 R2 R3
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0
10 0 0 0
11 0 0 0
12 0 0 0
13 0 0 0
14 0 0 0
15 0 0 0
16 0 0 0
17 0 0 0
18 0 0 0
19 0 0 0
20 0 0 0
21 0 0 0
22 0 0 0
23 0 0 0
24 0 0 0
25 0 0 0
26 0 0 0
CLORURO FERROSO (a) 6500 ppm
89
6.6 ANEXO 6
Tabla 10.
CEPA R1 R2 R3
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0
10 0 0 0
11 0 0 0
12 0 0 0
13 0 0 0
14 0 0 0
15 0 0 0
16 0 0 0
17 0 0 0
18 0 0 0
19 0 0 0
20 0 0 0
21 0 0 0
22 0 0 0
23 0 0 0
24 0 0 0
25 0 0 0
26 0 0 0
CLORURO CÚPRICO (C) 6500 ppm
90
6.7 ANEXO 7
Tabla 11.
CEPA R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 0 0 0 0 0 0
13 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 0 0 0 0 0 0 0 0 0
17 0 0 0 0 0 0 0 0 0
18 0 0 0 0 0 0 0 0 0
19 0 0 0 0 0 0 0 0 0
20 0 0 0 0 0 0 0 0 0
21 0 0 0 0 0 0 0 0 0
22 0 0 0 0 0 0 0 0 0
23 0 0 0 0 0 0 0 0 0
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 0 0 0 0 0 0 0 0 0
26 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CLORURO FERROSO (a) CROMATO DE POTASIO (b) CLORURO CÚPRICO (c)