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Universidad de Oviedo
Departamento de Cirugía y Especialidades
Médico-Quirúrgicas
“Linfangiogénesis en los carcinomas
epidermoides de cabeza y cuello”
Tesis Doctoral (que opta al grado de Doctor por la Universidad de
Oviedo)
Autor: Alfonso Martínez Ferreras
Fecha: 2010
Universidad de Oviedo
Departamento de Cirugía y Especialidades
Médico-Quirúrgicas
“Linfangiogénesis en los carcinomas
epidermoides de cabeza y cuello”
Tesis Doctoral (que opta al grado de Doctor por la Universidad de
Oviedo)
Autor: Directores:
Alfonso Martínez Ferreras María Victoria González Meana
Juan Pablo Rodrigo Tapia
CERTIFICADO
Se facilita en la Unidad Administrativa del Departamento
Agradecimientos
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que directa
o indirectamente han contribuido a la realización de este trabajo:
A todo el Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Central de Asturias
(ahora también Universitario) por crear el ambiente, la tradición y casi la costumbre de
impulsar la realización de tesis doctorales, más allá del trabajo clínico día a día, algo que a
la larga siempre será beneficioso en el transcurrir de nuestro ejercicio profesional.
En concreto, al co-director de esta tesis, el Doctor Juan Pablo Rodrigo Tapia,
que sirvió de puente entre el, no del todo desconocido para mí, mundo de la
Otorrinolaringología y ese otro universo de la Biología Molecular.
Principalmente, a la Doctora María Victoria González Meana, quien a pesar de
los años trascurridos y de todas las dificultades, confió en mí para la realización de este
trabajo y me introdujo en el complejo (para mí) mundo de las técnicas de laboratorio,
resolviendo con paciencia todas mis dudas y comprendiendo mis limitaciones en este
campo. Nada podrá agradecérselo suficientemente.
A los miembros del laboratorio de la Unidad de Cáncer de Cabeza y Cuello del
Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias – Obra Social CajAstur
(IUOPA), muy especialmente al Dr. Darío García Carracedo, núcleo central del trabajo y a
la Dra. Juana Mª García Pedrero, por su inestimable ayuda en la realización de los
experimentos, soportando con paciencia la torpeza de un neófito en la materia. Muchas
gracias.
A mi madre, por su constante impulso durante estos últimos años para que no
me dejara llevar por la comodidad (¡Qué!, ¡esa tesis pa cuándo!) y a mi padre, por
repetirme periódicamente a lo largo de los años que uno nunca deja de prepararse en toda
su vida y que todo puede cambiar, incluso a peor.
A mis hijos Covadonga y Diego, por ser fuente de alegría y vigilia y por sus
inquebrantables esfuerzos para que este trabajo no saliera adelante.
Y finalmente (y sobre todo) a mi mujer Clara, por animarme cuando la cosa
iba, ser moderadamente condescendiente cuando no iba, tirarme de las orejas cuando me
paraba y soportar el peso de la familia cuando yo no podía.
ÍNDICE
1 INTRODUCCIÓN...................................................................................................... 1
1.1 Carcinoma epidermoide de cabeza y cuello: aspectos epidemiológicos,
clinicopatológicos y etiológicos. .............................................................................. 2
1.2 Bases moleculares del carcinoma epidermoide de cabeza y cuello: modelo de
progresión tumoral. .................................................................................................. 3
1.3 Sistema linfático .............................................................................................. 5
1.4 Linfangiogénesis .............................................................................................. 7
1.4.1 Concepto de linfangiogénesis ............................................................ 7
1.4.2 Marcadores de endotelio linfático ...................................................... 9
1.4.2.1 5´-nucleotidasa (5´-Nasa).................................................... 9
1.4.2.2 LYVE-1 ............................................................................ 10
1.4.2.3 Prox-1 ................................................................................ 10
1.4.2.4 FoxC2 ................................................................................ 10
1.4.2.5 Familia VEGF ................................................................... 10
1.4.2.6 Podoplanina: Localización gen, función descrita, expresión
en tejidos sanos, implicación en el desarrollo de tumores ..... 14
1.5 Linfangiogénesis y carcinoma epidermoide de cabeza y cuello ................... 15
2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 17
3 MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 19
3.1 Muestras y pacientes ...................................................................................... 20
3.2 Análisis Western-blot ................................................................................... 22
3.3 Inmunohistoquímica ...................................................................................... 22
3.3.1 Cuantificación de la densidad vascular ............................................. 24
3.3.2 Invasión linfática .............................................................................. 24
3.3.3 Evaluación de la tinción para podoplanina por parte de las células
tumorales ............................................................................................... 24
3.4 Inmunofluorescencia .................................................................................... 25
3.5 RT-PCR cuantitativa (Q-RT-PCR) ............................................................... 25
3.5.1 Extracción de ARN ........................................................................... 25
3.5.2 Retrotranscripción ............................................................................. 26
3.5.3 PCR cuantitativa (Q-PCR) ................................................................ 26
3.6 Análisis estadístico ....................................................................................... 28
4 RESULTADOS ........................................................................................................ 29
4.1 Análisis Western con anticuerpo D2-40 Signet ........................................... 30
4.2 Cuantificación de la densidad linfática. ....................................................... 30
4.3 Determinación del estado proliferativo de los vasos linfáticos .................... 31
4.4 Detección de invasión tumoral de los vasos linfáticos (IL) ......................... 31
4.5 Correlación entre densidad de vasos linfáticos, invasión linfática y
características clínico-patológicas .................................................................... 33
4.6 Correlación entre densidad de linfáticos y presencia de invasión linfática . 37
4.7 Expresión de podoplanina en las células tumorales. .................................... 37
4.7.1 Expresión de podoplanina en tumores de laringe. ............................ 38
4.7.2 Expresión de podoplanina en tumores de faringe. ............................ 39
4.8 Expresión de mARN de VEGFR3 y VEGFD .............................................. 40
4.9 Análisis de supervivencia ............................................................................ 41
4.9.1 Análisis de supervivencia univariante .............................................. 41
4.9.2 Análisis de supervivencia multivariante ........................................... 46
5 DISCUSIÓN ............................................................................................................. 48
6 CONCLUSIONES.................................................................................................... 56
7 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 58
ABREVIATURAS
ADN, Ácido Desoxirribonucleico
ANOVA, del inglés, Analysis of variance
ARN, Ácido Ribonucleico
CECC, Carcinoma Epidermoide de
Cabeza y Cuello
CEL, Célula Endotelial Linfática
CIS, Carcinoma in situ
DAB, Diaminobenzidina.
DAPasa, Dipeptidil Aminopeptidasa
DAPI, del inglés, 4',6-diamidino-2-
phenylindole
DLG, Densidad Linfática Global.
DLI, Densidad Linfática Intratumoral.
DLP, Densidad Linfática Peritumoral.
E.E., Error Estándar.
ECL, del inglés, Enhanced
Chemoluminiscence
EDTA, del inglés,
Ethylendiaminetetraacetic Acid
EGFR, del inglés, Epidermal Growth
Factor Receptor
eIF4E, del inglés, eucariotic Initiation
Factor 4E
FITC, del inglés, Fluorescein
Isothiocyanate
FoxC2, del inglés, Forkhead Box C2
HEPES, del inglés, 4-(2-Hydroxyethyl)-
1-Piperazineethanesulfonic acid
HIF 1del inglés, Hypoxia Inducible
Factor 1
HRP, del inglés, Horseradish Peroxidase
IL, Invasión Linfática
LCR, Líquido Céfalo-Raquídeo
LYVE-1, del inglés, Lymphatic Vessel
Hyaluronan receptor-1
MMP, del inglés, Matrix
Metalloproteases
5´-Nasa, 5´-Nucleotidasa
NRP, neuropilina
PBS, del inglés, Phosphate Buffer Saline
PI3K, del inglés, Phosphatidyl Inositol 3
Kinase
PDE
PDPN, Podoplanina
PKC, del inglés, Protein Kinase C
PlGF, del inglés, Placental growth factor
PLC, del inglés, Phospholipase C
PMSF, del ingles,
Phenylmethanesulfonyl fluoride
Prox-1, del inglés, Prospero-Related
homeobox gene-1
Q-PCR, del inglés, Quantitative
Polymerase Chain Reaction
RPL19, del inglés, Ribosomal Protein
L19
SDS, del inglés, sodium dodecyl sulfate
RT, del inglés, Retrotranscription
SPSS, del inglés, Statistical Package for
the Social Sciences
TBS, del inglés, Tris Buffer Saline
TIC, del inglés, Tumor Inicitating Cell
TKR, del inglés, Tyrosin Kinase
Receptor
uPA, del inglés, urokinase Plasminogen
Activator
VEGF, del inglés, Vascular Endothelial
Growth Factor
VEGFR, del inglés, Vascular
Endothelial Growth Factor Receptor
VPF, del inglés, Vascular Permeability
Factor
INTRODUCCIÓN
1
1 INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
2
1.1.- Carcinoma epidermoide de cabeza y cuello: aspectos epidemiológicos, clínico-
patológicos y etiológicos.
El concepto “cáncer de cabeza y cuello” se aplica a tumores que aparecen en las
mucosas de la cavidad oral, faringe, laringe y esófago cervical, aunque también incluiría
estrictamente otras localizaciones, como fosas nasales, senos paranasales, glándulas
salivales, tiroides, paratiroides, etc.
Globalmente, los cánceres de cabeza y cuello representan el 5-10 % de los tumores
malignos diagnosticados anualmente en España, siendo los responsables de
aproximadamente el 5 % de las muertes por cáncer. A nivel mundial se diagnostican
anualmente unos 500,000 nuevos casos, lo cual representa el sexto tipo de tumor más
común, por lo que continúa siendo una importante causa de morbimortalidad (Kleihues y
cols., 2003).
Más del 90 % de los cánceres de esta región son carcinomas epidermoides (CECC,
“Carcinoma Epidermoide de Cabeza y Cuello”). Los estudios epidemiológicos atribuyen al
tabaco un papel etiológico fundamental en su aparición. El alcohol, aunque no
carcinogénico por sí mismo, parece desempeñar un papel sinérgico con el tabaco en la
génesis de estos tumores, especialmente en los de la cavidad oral y la faringe. De hecho, el
85 % de estos pacientes presentan historia de consumo de tabaco y alcohol conjuntos. La
incidencia de este grupo de tumores ha ido en aumento en los últimos 30 años, siendo más
notable el incremento en los tumores de la cavidad oral y la faringe. En España la
localización más frecuente de estos cánceres es la laringe, seguida de la cavidad oral y la
faringe (Parkin y cols., 2001).
Los tumores de cabeza y cuello se clasifican en cuatro estadios (I-IV) siguiendo el
sistema TNM (Sobin 2002), donde T representa el tamaño del tumor primario, N la
presencia de metástasis en nódulos linfáticos y M la presencia de metástasis a distancia.
Las principales causas de muerte relacionada con el CECC son la afectación
ganglionar y las metástasis a distancia. Sin embargo, con frecuencia los parámetros clínico-
patológicos no son suficientes para determinar el curso de la enfermedad. Por ello, parece
claro que la identificación de nuevas dianas moleculares cuya alteración esté asociada a la
aparición de focos metastáticos ayudará a evaluar este riesgo con mayor exactitud, para
seleccionar a los pacientes con tumores biológicamente más agresivos y elegir los
INTRODUCCIÓN
3
tratamientos más adecuados. Todo ello redundaría, sin duda, en una mejora en la
supervivencia de los pacientes.
1.2.- Bases moleculares del carcinoma epidermoide de cabeza y cuello: modelo de
progresión tumoral.
En 1953 Slaughter utilizó por primera vez el término “cancerización de campo”
(“field cancerization”) en referencia a la existencia de procesos preneoplásicos en
múltiples sitios de la mucosa. Un campo tiene un origen monoclonal y no muestra el
comportamiento invasivo o metastático propio de un cáncer. Sin embargo, tras una
exposición continuada a agentes carcinógenos, dichos campos se convierten en focos
malignos (Slaughter y cols., 1953).
Los avances en el conocimiento de las bases genéticas del CECC han dado lugar a
un modelo de carcinogénesis similar al establecido para otros tipos de tumores humanos,
cuyo paradigma es el carcinoma de colon. Está bien establecido que la carcinogénesis es
un proceso multietapa, basado en la acumulación de alteraciones genéticas, cuyo número
aumenta con el grado de malignidad. Así, se puede proponer el siguiente modelo: una
célula adquiere una o varias mutaciones y forma un clon de células hijas genéticamente
alteradas. Con estas mutaciones la célula progenitora adquiere ventaja selectiva y se
expande, formando un campo que va desplazando al epitelio normal. Cuando la lesión se
va agrandando, va acumulando más mutaciones que generan nuevos subclones. Cada uno
diverge del resto pero comparten un origen común. La presencia de varias células
progenitoras genéticamente alteradas constituye una “bomba de relojería” y como
resultado de la divergencia y la selección, eventualmente se convierten en tumores
invasivos. Así, la probabilidad de que esto ocurra está directamente relacionada con la
cantidad de células progenitoras alteradas. En este modelo hay dos puntos críticos: la
pérdida del control de proliferación de un clon de células progenitoras y el eventual
fenómeno transformante que convierte el campo en un carcinoma invasivo (Braakhuis y
cols., 2003). La acumulación de alteraciones genéticas se correlaciona con los estadios
clínico-patológicos. Por tanto, estas alteraciones moleculares son marcadores que señalan
un estadio en la carcinogénesis entre la iniciación y el desarrollo de un tumor maligno
(Califano y cols., 1996) (Fig.1).
INTRODUCCIÓN
4
Figura 1. Modelo de progresión genética en el CECC. Cambios genéticos asociados con
las etapas de progresión fenotípica. Es la acumulación y no necesariamente el orden en que
se producen las alteraciones genéticas lo que determina la progresión tumoral. (Adaptado
de Califano y cols., 1996).
Entre las alteraciones genéticas en CECC, la amplificación de la región 11q13 es la
más consistentemente descrita en la literatura (30 - 60 % de los casos), seguida por la
ganancia y/o amplificación del brazo cromosómico 3q.
Según el modelo propuesto por Knudson en 1971, la inactivación de los genes
supresores de tumores requiere la alteración de ambos alelos. Típicamente, la pérdida de
un alelo va acompañada por la inactivación del otro mediante mutación puntual o deleción
(Knudson 1971). La inactivación del gen supresor de tumores p16INK4A
(9p21) es la más
frecuente en CECC (80 % de los casos). En cuanto a las activaciones oncogénicas
frecuentemente encontradas en CECC cabe destacar la sobreexpresión de EGFR y de
eIF4E. El análisis de microsatélites de numerosos loci genéticos ha permitido identificar
otras regiones frecuentemente delecionadas en CECC, entre las que cabe destacar 17p13,
locus del gen supresor de tumores p53, considerado el “guardián del genoma”. Otros loci
frecuentemente delecionados, para los que no se ha identificado aún ningún gen candidato
cuya pérdida pudiera contribuir al desarrollo tumoral, son: 3p14-21, 4q26-28, 6p, 8p21-23,
13q14-21 y 14q31-32.
Hiperplasia Normal Displasia Carcinoma infiltrante
Pérdida 9p21 (p16)
Sobreexpresión EGFR
Reactivación de la telomerasa
Inestabilidad genómica
Pérdida 3p, 17p13 (p53)
Pérdida RAR
Pérdidas: 11q, 13q, 14q, 6p, 4q, 18q
Amplificación 11q13 (ciclina D1)
Moderada Leve Severa/CIS
INTRODUCCIÓN
5
El complejo proceso de metástasis en CECC no se conoce por completo a nivel
molecular. Se han llevado a cabo múltiples estudios para identificar marcadores predictivos
de metástasis. Uno de los sucesos clave que acompañan a la adquisición de capacidad
invasiva por parte de las células epiteliales es la pérdida de expresión de cadherina E, cuya
función es mantener la integridad de los epitelios estableciendo uniones intercelulares
homotípicas. Su expresión se encuentra reducida en CECC (St John y cols., 2009).
Estudios a nivel genómico han permitido la identificación de un perfil de expresión
génica en CECC primarios que predecía la presencia de metástasis en ganglios linfáticos.
Los genes expresados de forma diferencial en pacientes con CECC con y sin ganglios
afectados están implicados en el remodelado de la matriz extracelular (MMPs, sistema
uPA), hipoxia y angiogénesis (regulados por HIF1) (Hensen y cols., 2008).
La adquisición de la capacidad invasiva permite a las células tumorales diseminarse
desde el foco primario a regiones cercanas o distantes. El sistema linfático desempeña una
función muy importante en el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos y como
transportador de células de la inmunidad, pero también sirve como vía directa de
metastatización de los tumores malignos hacia los ganglios linfáticos regionales (Wicki y
cols., 2007). De hecho, en los CECC, la principal vía de diseminación tumoral es la
linfática.
1.3.- Sistema linfático
La homeostasis normal de los fluidos, necesaria para el mantenimiento saludable de
células y tejidos, implica un equilibrio entre la presión osmótica (mantenida por las
proteínas plasmáticas) y la presión hidrostática de la sangre, lo cual permite que las
ganancias o pérdidas de fluido a través de los lechos capilares sean mínimas. Una
reducción de la presión osmótica o un aumento de la presión hidrostática afectan al
movimiento neto de líquido, que se acumula en los espacios intersticiales.
Aproximadamente el 90 % del agua extravasada es reabsorbida en la parte venosa de la red
capilar, donde la presión osmótica de la sangre excede a la presión sanguínea. La principal
función del sistema linfático es retornar el restante 10 % al sistema vascular sanguíneo,
funcionando como un colector para el líquido intersticial, rico en macromoléculas,
extravasado del sistema cardiovascular y devolviéndolo al mismo (20-30 gramos de
INTRODUCCIÓN
6
proteínas por litro y 1-2 litros de líquido intersticial en un adulto sano), jugando, por tanto,
un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos.
Otras importantes funciones del sistema linfático son la contribución a la absorción
de grasas en el intestino en forma de quilomicrones, así como el mantenimiento del sistema
inmunológico (transporte de antígenos y células presentadoras de antígenos desde el
intersticio para ser ofrecidas al procesamiento por los linfocitos B y T en los ganglios
linfáticos).
El sistema linfático incluye ganglios y vasos linfáticos. Entre los vasos se pueden
distinguir: linfáticos iniciales o capilares linfáticos, (de unos 30-80 μm de diámetro) que
recogen la linfa (fluido biológico rico en macromoléculas y linfocitos extravasados) del
espacio intersticial, y vasos linfáticos mayores o colectores, formando un sistema de
sentido único que mueve la linfa hacia el torrente sanguíneo, restituyendo el volumen
perdido en la formación del fluido intersticial.
A diferencia del sistema cardiovascular, el sistema linfático no es cerrado. La
circulación linfática comienza en unos fondos de saco ciegos que son el inicio de unos
capilares linfáticos altamente permeables. Comparados con los sanguíneos, los capilares
linfáticos tienen luces amplias y paredes finas; están formados por una capa única no
fenestrada de células endoteliales, sin uniones fuertes, con sus bordes parcialmente
superpuestos, que forman unas pseudo-válvulas o gaps que permiten una fácil entrada
(pero no salida) de líquidos, macromoléculas y células (Baluk y cols., 2007; Tammela y
cols., 2007). Al contrario que los capilares sanguíneos, tienen una membrana basal muy
discontinua o casi ausente, poco desarrollada y muy permeable. Los capilares linfáticos no
presentan pericitos ni células musculares (Alitalo y cols., 2005; Wick y cols., 2007; Maby-
El Hajjami y cols., 2008). Se anclan (a través de moléculas de adhesión, como la integrina
αvβ3) a las fibras de colágeno de la matriz extracelular mediante otras fibras elásticas,
compuestas fundamentalmente por emilina-1 y fibrilina (Danussi y cols., 2008; Maby-El
Hajjami y cols., 2008), que les impiden colapsarse incluso en condiciones de hiperpresión
tisular, en que las fibras tiran de las células endoteliales, resultando en una apertura de los
capilares y permitiendo así la captación de componentes tisulares. Los capilares vierten la
linfa a los vasos linfáticos precolectores y colectores. Estos tienen membrana basal, una
capa de células musculares lisas alrededor para permitir la propulsión de la misma y, como
las venas, válvulas para evitar el reflujo de linfa (Alitalo y cols., 2005; Baluk y cols., 2007;
INTRODUCCIÓN
7
Maby-El Hajjami y cols., 2008; Bazigou y cols., 2009). En su curso, los colectores
encuentran ganglios linfáticos, a los que entran como vasos aferentes. En los ganglios la
linfa se filtra y sale por los linfáticos eferentes, que alcanzan el conducto torácico (que
recoge la linfa de la mitad izquierda del cuerpo y la mitad derecha por debajo del hígado) y
la gran vena linfática (que drena la linfa del hígado y mitad supradiafragmática derecha del
cuerpo), los cuales desembocan en el confluente yúgulo-subclavio a cada lado del cuerpo,
donde una válvula impide el paso de la sangre venosa a su interior.
Otra diferencia respecto al sistema cardiovascular es que el linfático no tiene una
bomba central. El movimiento de la linfa se produce por peristalsia o propulsión debida a
la contracción y relajación del músculo liso, válvulas, compresión de músculo esquelético
adyacente y el latido de arterias contiguas.
Todos los tejidos humanos, excepto los avasculares, como la epidermis, cartílago y
córnea, y algunos vascularizados, como la retina, la médula ósea y el sistema nervioso
central, tienen vasos linfáticos, aunque existe alguna conexión entre el líquido cefalo-
raquídeo (LCR) y el sistema linfático que permite que éste sea capaz de compensar
parcialmente las situaciones donde el drenaje de aquel está comprometido (Johnston y
cols., 2004).
El sistema linfático está particularmente presente en aquellos tejidos que están en
contacto frecuente con antígenos extraños, como la piel y las mucosas.
El sistema linfático existe en vertebrados, como los peces teleósteos, anfibios,
reptiles y mamíferos, cuyos complejos sistemas cardiovasculares y grandes tamaños
requieren un sistema vascular secundario para el mantenimiento de la homeostasis (Jeltsch
y cols., 2003; Ny y cols., 2005; Kuchler y cols., 2006; Yaniv y cols., 2006).
1.4.-Linfangiogénesis
1.4.1.-Concepto de linfangiogénesis
La linfangiogénesis consiste en la formación de nuevos vasos linfáticos a partir de
vasos preformados. Se trata de un fenómeno parecido a la angiogénesis, o formación de
vasos sanguíneos a partir de los preexistentes. Ambos fenómenos contribuyen de forma
significativa al crecimiento de los tumores malignos sólidos, así como de sus metástasis,
INTRODUCCIÓN
8
tanto regionales linfáticas como a distancia (Folkman 1995; Risau 1997), y están mediados
por una serie de citoquinas y receptores específicos.
La formación de vasos que tiene lugar en el desarrollo embrionario temprano recibe
el nombre de vasculogénesis, en la que las células madre precursoras mesenquimales o
angioblastos, se diferencian a células endoteliales, las cuales proliferan y se organizan en
forma de vasos arteriales o venosos.
El sistema linfático comienza a desarrollarse cuando el sistema cardiovascular ya
está establecido y es funcional, sobre la 6ª semana del desarrollo embrionario. El
mecanismo implicado en su formación no se conoce bien aún. La cuestión de si los
linfáticos embrionarios se desarrollan sólo a partir de venas o también de tejido
mesenquimal permanece sin resolver. Existen dos teorías al respecto:
Teoría centrífuga: Según esta teoría, que es la predominante, las células
endoteliales linfáticas (CEL) derivan del endotelio venoso en el desarrollo
embrionario, formándose varios sacos linfáticos primarios en las proximidades de
las grandes venas desde donde brota, de forma centrífuga, toda una red de vasos
linfáticos periféricos y finalmente la red capilar linfática (Wigle y cols., 1999;
Oliver 2004; Alitalo y cols., 2005).
Teoría dual o centrífuga/centrípeta: Esta otra teoría sugiere un origen dual del
sistema linfático: las partes profundas de los sacos linfáticos derivan de las venas
adyacentes, mientras que las partes superficiales de estos sacos y los vasos
linfáticos dérmicos provienen de unas células progenitoras mesenquimales
perivenosas llamadas linfangioblastos, que son aplanadas formando pequeñas luces
vasculares que van coalesciendo para formar vasos linfáticos. La existencia de
linfangioblastos se ha demostrado en anfibios y aves (Ny y cols., 2005; Wilting y
cols., 2006), pero no en mamíferos. Por tanto, esta teoría postula la existencia de
linfangiovasculogénesis (neoformación de vasos linfáticos a partir de tejido
mesenquimal, algo en principio sólo posible en los vasos sanguíneos), que podría
contribuir a la formación de la red linfática en el periodo embrionario.
En adultos, las CEL habitualmente están en estado quiescente, pero pueden
responder a determinados estímulos fisiológicos (desarrollo del cuerpo lúteo, proceso de
INTRODUCCIÓN
9
regeneración tisular y cicatrización) (Otsuki y cols., 1986; Alitalo y cols., 2005), o
patológicos (crecimiento tumoral, metástasis, rechazo a transplantes e inflamación) (Achen
y cols., 2005; Alitalo y cols., 2005; Cueni y cols., 2008).
Se asume que los nuevos linfáticos se desarrollan a partir de otros preexistentes, es
decir, por linfangiogénesis (He y cols., 2004; Alitalo y cols., 2005). La existencia de
células circulantes derivadas de la médula ósea capaces de diferenciarse en CEL es
discutida aún, aunque se ha demostrado la transformación de macrófagos en CEL en
transplantes humanos hepáticos (Kerjaschki y cols., 2004; Kerjaschki y cols., 2006), en un
modelo murino de lesión corneal (Maruyama y cols., 2005) y en otro tumoral (Zumsteg y
cols., 2009).
Las células hematopoyéticas contribuyen al desarrollo de la linfangiogénesis
mediante factores paracrinos, como se ha descrito en la angiogénesis (Tammela y cols.,
2005), siendo los macrófagos una importante fuente de factores linfangiogénicos (Kubota y
cols., 2009).
Los ganglios linfáticos se empiezan a desarrollar como protrusiones de tejido
conectivo dentro de los sacos linfáticos, inducidas por células de origen hematopoyético
(Mebius 2003). El estímulo continuado por parte de las células presentadoras de antígenos
que llegan por las aferencias, mantienen los ganglios como unos órganos de gran
plasticidad, pero no hay formación de nuevos ganglios después de la embriogénesis.
1.4.2.-Marcadores de endotelio linfático
El desconocimiento de los mecanismos detallados implicados en el fenómeno de la
linfangiogénesis se debe en parte a las limitaciones técnicas derivadas de la carencia de
modelos experimentales (cultivos de células de endotelio linfático) y de marcadores
específicos de endotelio linfático que permitiesen distinguirlos del endotelio sanguíneo.
Los avances conseguidos en los años recientes han permitido profundizar en estas
cuestiones y en la actualidad se dispone de algunos marcadores linfáticos útiles. Veamos, a
continuación, los más importantes:
1.4.2.1 5´-nucleotidasa (5´-Nasa): Enzima cuya expresión es más elevada en
endotelio linfático que en el vascular. La triple tinción inmunohistoquímica con 5´-Nasa,
fosfatasa alcalina (gran actividad en arterias, baja en linfáticos) y dipeptidil aminopeptidasa
INTRODUCCIÓN
10
IV (DAPasa) (nivel más elevado en venas que en arterias y linfáticos), permite distinguir
los tres tipos de vasos (Kato y cols., 1996).
1.4.2.2 LYVE-1 (del inglés, Lymphatic Vessel Hyaluronan receptor-1): LYVE-1
fue identificado como un receptor de ácido hialurónico (homólogo de CD44) específico de
la pared de los vasos linfáticos. El ácido hialurónico es un componente abundante de la piel
y de tejidos mesenquimales, en los que facilita la migración celular durante la cicatrización
tisular, la inflamación, la morfogénesis embrionaria y la progresión tumoral (Banerji y
cols., 1999; Jackson y cols., 2001).
En el periodo fetal temprano LYVE-1 se expresa en la subpoblación de células
endoteliales de venas que se están diferenciando en linfáticos, por lo que es un marcador
temprano de vasos linfáticos (Oliver 2004; Maby-El Hajjami y cols., 2008; Jurisic y cols.,
2009).
En adultos se expresa específicamente en el endotelio de capilares linfáticos y en
macrófagos (Makinen y cols., 2005). Del endotelio sanguíneo sólo reconoce capilares
sanguíneos sinusoidales hepáticos (Mouta Carreira y cols., 2001).
1.4.2.3 Prox-1 (del inglés, Prospero-Related homeobox gene-1): Es un factor de
transcripción esencial para la identidad de las CEL. Diversos estudios llevados a cabo en
ratones sugieren que este gen es el principal regulador en la diferenciación de las CEL
(Wigle y cols., 1999; Wigle y cols., 2002). En adultos Prox-1 sólo se expresa en el
endotelio linfático de tejidos normales y en tumores.
1.4.2.4. FoxC2 (del inglés, Forkhead Box C2): es un factor de transcripción que se
expresa en linfáticos y es esencial para la morfogénesis de las válvulas y el establecimiento
de una red capilar linfática sin pericitos, diferenciando los fenotipos de capilares vs
colectores linfáticos (Dagenais y cols., 2004; Petrova y cols., 2004; Norrmen y cols., 2009).
1.4.2.5. Familia VEGF (del inglés, Vascular Endotelial Growth Factor): Tanto la
linfangiogénesis como la angiogénesis están mediadas por la interacción de una serie de
citoquinas y sus receptores. Entre ellas, las más conocidas son los miembros de la familia
de los factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), de los cuales existen los
INTRODUCCIÓN
11
tipos -A, -B, -C, -D y -E, y el factor de crecimiento de placenta (PlGF), así como sus
receptores de membrana con actividad tirosinquinasa (TKRs), VEGFR-1, -2 y -3. Se
localizan en la superficie de las células endoteliales vasculares y de células derivadas de la
médula ósea, así como en forma soluble en circulación (Ferrara y cols., 2003, Mustonen y
cols., 1995; Risau 1997; Veikkola y cols., 2000; Shibuya 2001; Ferrara 2002; Dvorak
2005) (Fig. 2).
Los miembros de la familia VEGF son factores de crecimiento con actividad
mitogénica altamente específica para las células endoteliales. VEGF-A fue el primero en
ser identificado, como un factor de permeabilidad vascular (por lo que se llamó VPF, del
inglés Vascular Permeability Factor) (Senger y cols., 1983) y posteriormente como factor
de crecimiento específico de células endoteliales vasculares codificado por el gen VEGF
(Leung y cols., 1989; Keck y cols., 1989). Se expresa en células sanguíneas normales
(plaquetas, macrófagos, linfocitos T). Además de su función en la mitogénesis endotelial y
en la permeabilidad vascular, también ejerce acción vasomotora, estimula la formación de
moléculas vasoactivas y la quimiotaxis de monocitos. También se expresa en células
tumorales.
Los receptores, VEGFRs, contienen siete dominios homólogos a las
inmunoglobulinas en su parte extracelular, responsables de la unión a VEGFs, una región
transmembrana, otra yuxtamembranal y un dominio intracelular de señalización tirosin-
quinasa (Davis y cols., 1999; Ferrara y cols., 2003). El segundo y tercer dominio de la
primera región forman el lugar de unión al ligando, mientras que del cuarto al sexto
dominio son esenciales para la dimerización del receptor (Shibuya 2001). Además, algunos
VEGFs también pueden unirse a co-receptores como las neuropilinas (NRPs) (Soker y
cols., 1998) y a otros receptores de la superficie celular. Al igual que otros TKRs, los
VEGFRs dimerizan y experimentan trans-autofosforilación cuando se produce su unión al
ligando, desencadenando una cascada de señalización fosforilando distintas proteínas,
como proteín-quinasa-C (PKC), fosfolipasa C-gamma (PLC-γ), fosfatidilinositol 3-quinasa
(PI3K), etc…, regulando mecanismos involucrados en angiogénesis y linfangiogénesis
(Fig. 2).
Se observa cierto grado de especificidad, aunque no completo, en la unión de los
diferentes VEGF a los VEGFR:
INTRODUCCIÓN
12
- VEGF-A se une a VEGFR-1 y 2, expresados en las células del endotelio vascular
sanguíneo (no en el linfático) y se cree que es el principal inductor de la angiogénesis
(Dvorak 2005).
- VEGF-B comparte con el anterior el receptor VEGFR-1.
- VEGF-C y VEGF-D son ligandos para VEGFR-2 (de las células endoteliales de
vasos sanguíneos, aunque también se expresa en niveles bajos en CEL) y VEGFR-3
(específico del endotelio linfático en tejidos adultos normales) (Davis y cols., 1999).
Ambos son sintetizados como pre-proteínas que requieren un procesamiento post-
traduccional tanto intracelular como extracelular. El grado de procesamiento influye en su
afinidad por VEGFR2 o VEGFR3. Las formas parcialmente procesadas secretadas se unen
exclusivamente al VEGFR-3 con gran afinidad, mientras que las formas maduras o
completamente procesadas de VEGF-C y VEGF-D se unen tanto a VEGFR-2 como a
VEGFR-3 (Alitalo y cols., 2005; Karpanen y cols., 2008). Tanto VEGF-C como D (en
menor medida), son esenciales para el desarrollo del sistema linfático (promoviendo la
proliferación, migración y supervivencia de las CEL) a través de su unión a VEGFR3 y
pueden también inducir angiogénesis y aumentar la permeabilidad vascular a través de la
unión de sus formas maduras al VEGFR-2 (Tammela y cols., 2005).
En los últimos años, muchos estudios se han centrado en la acción de VEGF-C y
VEGF-D en la progresión tumoral. En varios de ellos con ratones transgénicos, se ha
demostrado que la expresión de esos factores induce el crecimiento de nuevos vasos
linfáticos, principalmente peritumorales, pero también intratumorales, y también causan
dilatación de los preexistentes (Karpanen y cols., 2001; Mandriota y cols., 2001; Skobe y
cols., 2001; Stacker y cols., 2001; Yanai y cols., 2001; Mattila y cols., 2002; Padera y cols.,
2002). Muchos tipos de tumores sólidos expresan el VEGF-C, siendo varios los estudios
que han correlacionado su expresión con la invasión linfática, metástasis a distancia y
menor supervivencia, pero no necesariamente con la densidad de linfáticos asociados al
tumor (Stacker y cols., 2002; Pepper y cols., 2003; He y cols., 2004).
INTRODUCCIÓN
13
Figura 2. Familia de VEGFs y sus receptores en la superficie celular. Existe cierta pero
no completa especificidad en la interacción de los diversos miembros de la familia VEGF y
sus receptores (http://www.incan.org.mx/revistaincan/elementos/Documentos
Portada/1172284727.pdf)
VEGFR-3 se expresa en todas las células endoteliales vasculares, linfáticas y
sanguíneas, en las etapas tempranas del desarrollo, mientras que después de la
organogénesis permanece restringido a las CEL, los vasos sanguíneos fenestrados de
órganos endocrinos como el tiroides, el páncreas y las glándulas suprarrenales (Tammela y
cols., 2005).
La inhibición de la vía VEGF-C/-D/VEGFR-3 en modelos experimentales consigue
inhibir la linfangiogénesis tumoral y las metástasis linfáticas pero no afecta a los linfáticos
normales del adulto, lo cual apuntaría a su interés como potencial diana terapéutica para
prevenir las metástasis linfáticas (Karpanen y cols., 2001; Stacker y cols., 2001; He y cols.,
2002; Shimizu y cols., 2004; Chen y cols., 2005; He y cols., 2005; Roberts y cols., 2006;
Laakkonen y cols., 2007).
INTRODUCCIÓN
14
VEGFR-3 fue uno de los primeros marcadores específicos utilizado para identificar
vasos linfáticos en tejidos sanos. Sin embargo, ha perdido vigencia, puesto que se ha
demostrado también su sobreexpresión en vasos sanguíneos tumorales, lo que sugiere un
papel en la angiogénesis tumoral (Partanen y cols., 1999; Valtola y cols., 1999).
1.4.2.6 Podoplanina (también llamada antígeno E11, PA2.26, T1α, aggrus y gp38):
es una pequeña glicoproteína transmembranal de 162 aminoácidos, 9 de los cuales forman
el dominio extracelular. El gen que lo codifica, PDPN mapea en 1p36. En embriones
murinos aparece en la vena cardinal anterior y posteriormente en CEL que expresan Prox-1
(Breiteneder-Geleff y cols., 1999). En tejidos humanos normales, la podoplanina se
expresa tanto en colectores como en capilares linfáticos, en podocitos renales, músculo
esquelético, osteoblastos, placenta, pulmón y corazón, miofibroblastos de mama y
glándulas salivales, y células mesoteliales (Breiteneder-Geleff y cols., 1999; Schacht y
cols., 2003; Martin-Villar y cols., 2005; Ordonez 2006). Su función fisiológica no se
conoce aún. Los ratones deficientes mueren al nacer debido a fallo respiratorio, con vasos
linfáticos defectuosos, dilatados y linfoedema (Schacht y cols., 2003). Se ha sugerido un
papel activo en la reorganización del citoesqueleto celular, por unión a ezrina,
contribuyendo a la formación de prolongaciones celulares que participan en la adhesión y
migración de las células endoteliales linfáticas y en la formación de conexiones linfáticas
(Scholl y cols., 1999). Además, podoplanina puede inducir agregación plaquetaria in vitro.
Se sabe que interviene en la separación de los vasos linfáticos de los sanguíneos (excepto
en la confluencias yúgulo-subclavias) a través de la activación de la agregación
plaquetaria, que forma una barrera que desconecta ambas redes vasculares (Suzuki-Inoue y
cols., 2006; Suzuki-Inoue y cols., 2007).
En algunas situaciones patológicas estudiadas hasta ahora, se ha visto su inducción
en ratones durante la regeneración tisular y tumorigénesis e invasión, induciendo la
migración colectiva a través de la regulación a la baja de GTPasas de la familia Rho
(también implicadas en la regulación del citoesqueleto) (Wicki et al., 2006).
Podoplanina se ha identificado recientemente como un marcador de células
tumorales iniciadoras (TICs, del inglés “Tumour Initiating Cells”) en carcinomas
epidermoides (Atsumi y cols., 2008). Su expresión se regula al alza en varios tipos de
tumores humanos, como carcinoma epidermoide de la cavidad oral, laringe, pulmón,
INTRODUCCIÓN
15
cérvix, esófago, piel, disgerminomas y tumores de células granulosas de ovario, en
mesotelio, tumores del SNC y en tumores de células germinales de testículo (Dumoff y
cols., 2005; Kato y cols., 2005; Kimura y cols., 2005; Martin-Villar y cols., 2005; Schacht
y cols., 2005; Shibahara y cols., 2006; Wicki y cols., 2006).
Inicialmente se desarrolló el marcador D2-40, para reconocer el antígeno M2A,
proteína oncofetal de los tumores testiculares de células germinales. Posteriormente, se
demostró que D2-40 reconocía podoplanina en testículos humanos en desarrollo,
carcinoma in situ testicular y tumores de células germinales (Sonne y cols., 2006).
Evangelou comprobó su especificidad para células endoteliales linfáticas vs sanguíneas
(Evangelou y cols., 2005). Actualmente, D2-40 se acepta como un marcador para el
antígeno M2A, homólogo de la podoplanina. El uso de D2-40 en inmunohistoquímica se
considera actualmente superior a otros métodos histológicos para visualizar linfáticos y
demarcar émbolos tumorales en secciones titulares (Kahn y cols., 2002).
1.5.-Linfangiogénesis y carcinoma epidermoide de cabeza y cuello
Los procesos de invasión y metástasis (regional y a distancia) representan los pasos
de la progresión tumoral más amenazantes para la vida. En ellos cobran especial
importancia la diseminación hematógena y/o linfática, siendo ésta la más importante en el
caso de CECC. Así, el sistema linfático, con sus importantísimas funciones en el
mantenimiento de la homeostasis tisular y en el sistema inmune, se convierte en una vía de
escape para las células tumorales que han conseguido desvincularse del tumor primario y
llegan así a alcanzar los ganglios linfáticos.
Como ya hemos mencionado, en CECC la presencia de metástasis ganglionares
regionales es el factor clínico-patológico independiente más potente como indicador de
mal pronóstico y agresividad tumoral, influyendo el estadio ganglionar de forma
determinante en la forma de tratamiento (uni- o multidisciplinario); lo mismo ocurre en
otras entidades como cáncer de mama, colorrectal, prostático, melanoma, etc. (Achen y
cols., 2005; Karpanen y cols., 2008). Sin embargo, este valor pronóstico no es perfecto,
haciéndose necesaria la búsqueda de factores adicionales que puedan mejorarlo.
En las pasadas décadas, el proceso de la angiogénesis ha sido profusamente
estudiado. Las metástasis por vía hematógena se han relacionado claramente con la
formación de nuevos vasos (angiogénesis) y su posterior invasión por las células
INTRODUCCIÓN
16
tumorales. Sin embargo, el proceso de invasión linfática y la metastatización hacia
ganglios regionales no se conoce con detalle.
La posibilidad de que los tumores promuevan linfangiogénesis, de forma similar a
como inducen angiogénesis, ha sido objeto de controversia. El pensamiento tradicional de
que los linfáticos son un mero canal pasivo de tránsito para las células malignas ha ido
cambiado, atribuyéndose un papel activo fundamental a la red linfática en la diseminación
tumoral. En los últimos años se han acumulando pruebas a favor de la existencia de
linfangiogénesis tumoral: se ha demostrado que la expresión de factores linfangiogénicos
por sí sola es suficiente para inducir la formación de linfáticos en el seno de una masa
tumoral, lo cual proporcionaría una vía más directa para la invasión (Stacker y cols., 2001).
Otros estudios en modelos experimentales indicaban que los linfáticos preexistentes eran
más importantes para la diseminación tumoral que los linfáticos neoformados. Incluso un
modelo murino de sarcoma mostró por microlinfografía que sus tumores sólidos carecían
de vasos linfáticos internos funcionales por estar colapsados (Leu y cols., 2000).
Es decir, algunos autores defienden que los linfáticos intratumorales serían la vía
más importante para la metastatización, mientras que para otros sería una ruta inviable. Por
tanto, sigue sin haber consenso sobre si la metástasis se produce por invasión de vasos
linfáticos preexistentes peritumorales, en los que penetra el tumor, o mediante la formación
e invasión de nuevos linfáticos intratumorales (Clarijs y cols., 2001; Pepper 2001; Beasley
y cols., 2002; Williams y cols., 2003; Franchi y cols., 2004; Kyzas y cols., 2005).
OBJETIVOS
17
2 OBJETIVOS
OBJETIVOS
18
Por todo lo anteriormente expuesto nos propusimos los siguientes objetivos:
1. Detectar la presencia de vasos linfáticos en muestras de CECC.
2. Cuantificar la densidad de vasos linfáticos (intratumorales, peritumorales y en su
conjunto) y establecer su utilidad como posibles marcadores con valor pronóstico
en relación a la afectación ganglionar (y otras características clínico-patológicas) e
impacto en la supervivencia.
3. Detectar la presencia de émbolos de células tumorales circulantes en vasos
linfáticos.
4. Valorar la expresión de podoplanina en células de CECC y establecer su posible
papel como factor pronóstico.
5. Valorar la expresión de VEGF-D y VEGFR-3 en los tejidos tumorales en
comparación con tejido sano y establecer su significación pronóstica.
MATERIAL Y MÉTODOS
19
3 MATERIAL Y MÉTODOS
MATERIAL Y MÉTODOS
20
3.1.- Muestras y pacientes
Se obtuvieron muestras fijadas en formol e incluidas en parafina y conservadas en
el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA)
procedentes de 104 pacientes que presentaron CECC y fueron sometidos a cirugía en el
Servicio de Otorrinolaringología de dicho hospital entre los años 2000 y 2006. La
obtención de grupos equilibrados en número de pacientes para cada categoría de las
variables clínico-patológicas consideradas fue un criterio de inclusión. Ninguno de estos
pacientes había recibido tratamiento radio y/o quimioterápico previo a la resección y no se
evidenció presencia de metástasis a distancia en el momento del diagnóstico. El patólogo
había confirmado la presencia de células de carcinoma epidermoide en las muestras
obtenidas.
Adicionalmente, se reunieron muestras de 33 pacientes (16 incluidas en la serie
anterior) destinadas a la extracción de ARN, conservadas a – 80 ºC en el Banco de
Tumores del HUCA.
Las características epidemiológicas y tumorales (edad, sexo, localización
anatómica, categorías pT y pN, grado histológico y estadio tumoral de acuerdo con el
sistema TNM de la Unión Internacional contra el Cáncer (6ª edición) (Sobin 2002) y
periodo medio de seguimiento se muestran en la Tabla 1.
MATERIAL Y MÉTODOS
21
Tabla 1. Características clinicopatológicas de los CECC y los pacientes (N= 104).
Característica
clinicopatológica Nº casos (%)
Edad Media 60 (33-86)
Sexo
Hombre 98 (94.2)
Mujer 6 (5.8)
Sitio anatómico
Hipofaringe 18 (17,3)
Orofaringe 32 (30,8)
Glotis 30 (28,8)
Supraglotis 24 (23,1)
Categoría T (pT)
1 19 (18,3)
2 20 (19,2)
3 30 (28,8)
4 35 (33,7)
Categoría N (pN)
0 47 (47,4)
1 6 (6,1)
2 39 (39,4)
3 7 (7,1)
Grado de diferenciación
Bueno 48 (49)
Moderado 32 (32.6)
Pobre 18 (18.4)
Estadio tumoral (TNMa)
I 19 (19,2)
II 9 (9,1)
III 14 (14,1)
IV 57 (57,6)
Estado 104
Vivo sin tumor 49 (47)
Vivo con tumor 3 (3)
Muerto por tumor 34 (33)
Muerto otra causa 18 (17)
Recidiva 100
No 66 (66)
Si 34 (34)
Hábitos tóxicos
Consumo tabaco 103 (99)
Consumo alcohol 91 (88) Seguimiento medio (meses) (rango)
Población completa 23 (10 - 67)
Laringe 26 (9 - 67)
Faringe 20 (10 - 66) aEstadificación TNM según International Union Against
Cancer – 6ª Edición (Sobin 2002).
MATERIAL Y MÉTODOS
22
3.2.- Análisis Western-blot
Se llevó a cabo un análisis Western-blot con el fin de comprobar la especificidad
del anticuerpo D2-40 (antígeno M2A, Signet-Covance, California, EEUU) en el
reconocimiento de podoplanina humana. Se procesaron tres muestras tumorales
conservadas a -80 ºC, para la obtención de extractos proteicos. Cada muestra se sometió a
tres ciclos de congelación/descongelación y se lisó mecánicamente en frío en tampón de
lisis (50 mM HEPES pH 7.9, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2 % (v/v) NP-40, 10 %
glicerol junto con una mezcla de inhibidores de fosfatasas y proteasas [PPIM: 25 mM
glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 10 μg/ml
leupeptina y 10 μg/ml aprotinina]). Se estimó la concentración proteica por el método
Bradford (Bio-Rad, Richmond, California, EEUU) y por espectrofotometría (medida de
absorbancia a 595 nm).
Se hirvieron en tampón Laemli 40 microlitros de cada muestra, se sometieron a
electroforesis vertical en gel de SDS / poliacrilamida al 10 % y se transfirieron a
membrana de nitrocelulosa. Se incubó la membrana con el anticuerpo primario anti
podoplanina humana D2-40 (antígeno M2A, Signet-Covance, California, EEUU) (dilución,
1:750), seguido del anticuerpo secundario de cabra antiratón (dilución 1:10000).
Las bandas de inmunorreacción se visualizaron utilizando el sistema de análisis
Western de quimioluminiscencia aumentada (ECL Plus, Amersham-Pharmacia-Biotech,
Arlington Heights, Illinois, EEUU).
3.3.- Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica permite determinar la expresión de proteínas en un tejido
mediante el uso de anticuerpos específicos. La reacción antígeno-anticuerpo se puede
detectar de maneras muy diversas. En nuestro estudio, se ha utilizado el sistema de
polímeros de dextrano EnVisionTM
plus (PDE, DakoCytomation, Carpintería, California,
EEUU), que presenta alta sensibilidad y una mínima señal de fondo. Se trata de una técnica
de tinción en dos pasos en la que, tras el anticuerpo primario, se utiliza dextrano, polímero
de alto peso molecular, conjugado covalentemente con un gran número de moléculas de
anticuerpo secundario (hasta 20 por cadena) y de moléculas de enzima (por ejemplo,
peroxidasa de rábano, hasta 100 por cadena). Con ello se aumenta mucho la sensibilidad,
lo que permite incrementar las diluciones de la mayoría de los anticuerpos primarios. Los
MATERIAL Y MÉTODOS
23
resultados son más reproducibles y comparables que los obtenidos con el sistema biotina-
avidina (Sabattini y cols., 1998; Vyberg 1998; Wiedorn y cols., 2001).
Para cada muestra parafinada se realizaron con el microtomo secciones de 4 micras de
grosor, que permanecieron en una estufa a 54-56 ºC 12 horas, con el fin de conseguir una
adherencia óptima del tejido al portaobjetos (ChemMate, DakoCytomation, Carpintería,
California, EEUU). Parte del material cortado fue teñido con hematoxilina-eosina para su
revisión por un patólogo y otra parte fue reservada para los estudios inmunohistoquímicos.
El procedimiento se inició tras el desparafinado de las muestras con xileno, y
posterior rehidratación utilizando soluciones de concentración decreciente de etanol, tras lo
cual se mantuvieron en tampón fosfato (PBS) durante 20 minutos para mantener el medio a
pH adecuado para el resto de las reacciones.
Se precisó recuperación antigénica, mediante tratamiento de las muestras a elevada
temperatura en tampón citrato 10 mM, a pH 6.0. Con el fin de bloquear la actividad
peroxidasa endógena se incubó con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos.
Se utilizó el anticuerpo primario monoclonal murino contra podoplanina humana
D2-40 (antígeno M2A, Signet-Covance, California, EEUU), diluido 1:100, en incubación
durante una noche a 4 ºC en una cámara húmeda y posterior aclarado con PBS. La
detección se llevó a cabo con el sistema EnVision plus, incubando las muestras con un
anticuerpo secundario antimurino marcado con peroxidasa de rábano (HRP, del inglés
horseradish peroxidase), a temperatura ambiente durante 30 minutos, y añadiendo
posteriormente el cromógeno diaminobenzidina (DAB) al 2 % en tampón con peróxido de
hidrógeno (DakoCytomation, Dinamarca).
Se realizó una contratinción suave de cada preparación con hematoxilina de Mayers
(Merck, Alemania), proporcionando una contraste azul a la reacción para finalmente
deshidratar y montar las preparaciones con Entellan® (Merck, Alemania).
Como control negativo se llevó a cabo todo el proceso sobre un portaobjetos, en
ausencia del anticuerpo primario. En este caso, la señal desaparecía por completo.
MATERIAL Y MÉTODOS
24
3.3.1.- Cuantificación de la densidad vascular
Se llevó a cabo un análisis cuantitativo de la densidad de vasos linfáticos
peritumorales e intratumorales en secciones sometidas a inmunotinción de podoplanina con
el anticuerpo D2-40.
Para cada muestra se identificaron tres regiones con la mayor presencia de vasos
(hot spots), utilizando un microscopio Olympus BX-51 a un aumento 10x. Se llevó a cabo
el recuento de los vasos en esas regiones, utilizando un aumento de 40x (área 0,53 mm2).
Se definió la densidad linfática como el número de vasos linfáticos por mm2, tomando
como resultado la media de los tres campos considerados. El recuento se llevó a cabo en el
área tumoral (densidad linfática intratumoral, DLI) y en un área que abarcaba 500 µm
desde el borde del tumor (densidad linfática peritumoral, DLP). También se consideró la
densidad de vasos independientemente de su localización respecto al tumor (densidad
linfática global, DLG).
3.3.2.-Invasión linfática
Se evaluó también la presencia de células tumorales en las secciones de los vasos
linfáticos positivos para podoplanina. Se consideró que existía invasión linfática (IL)
cuando se observaba al menos un agregado de células tumorales (émbolos tumorales) en el
lumen de un vaso. Así, se clasificaron los casos como IL negativos o positivos.
3.3.3.- Evaluación de la tinción para podoplanina por parte de las células tumorales
La valoración de la tinción de podoplanina por parte de las células tumorales se
llevó a cabo teniendo en cuenta el producto de dos parámetros:
intensidad de la señal (0-3):
- 0, ausente
- 1, débil
- 2, moderado
- 3, intenso
proporción de células tumorales positivas (0-5).
- 0 (0 %)
- 1 (1 a 10 %)
- 2 (11 a 30 %)
MATERIAL Y MÉTODOS
25
- 3 (31 a 50 %)
- 4 (51 a 80 %)
- 5 (81 a 100 %)
Se estableció así una puntuación para cada caso, con un rango de 0 a 15.
3.4.- Inmunofluorescencia
Las secciones tisulares desparafinadas y rehidratadas se aclararon con tampón 0,05
M TBS (del inglés, Tris-Buffered Saline), pH 7.5, con suero bovino (1 %) y tritón X-100
(0,2 %). La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con 3 % H202.
Las secciones se incubaron durante una noche a 4 ºC en cámara húmeda con los
anticuerpos primarios: monoclonal murino antipodoplanina humana D2-40 (antígeno
M2A, Signet-Covance, California, EEUU) y policlonal anti ki67 de conejo (ab 833;
Abcam, Cambridge, Reino Unido), como marcador de proliferación celular. A
continuación se incubaron las secciones con los siguientes anticuerpos secundarios (todos
ellos a dilución 1: 100, 1hr, temperatura ambiente) (Amersham):
- IgG de oveja antiratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC, verde).
- IgG de oveja anticonejo marcado con Texas Red (rojo).
Finalmente se llevó a cabo tinción con DAPI (del inglés, 4',6-diamidino-2-
phenylindole), para detectar los núcleos celulares (azul) y se observaron las preparaciones
en un microscopio láser de barrido confocal (Bio-Rad MR-600; Servicio de Proceso de
Imágenes de la Universidad de Oviedo).
3.5.- RT-PCR cuantitativa (Q-RT-PCR)
3.5.1.- Extracción de ARN
Se aisló el ARN total de parejas de muestras tumorales y normales de 33 pacientes.
La extracción se llevó a cabo usando el sistema de purificación Micro-to-Midi Total ARN
purification System (Invitrogen Life Technologies, Glasgow, Reino Unido), siguiendo las
indicaciones del fabricante. El ARN aislado se sometió a tratamiento con ADNsa, con el
fin de eliminar posibles restos de ADN genómico. Tras la extracción de ARN, su
integridad se evaluó observando las dos bandas mayoritarias correspondientes al ARN
ribosomal, de 18S y 28S mediante métodos electroforéticos, en geles de agarosa en
condiciones desnaturalizantes. Las muestras se conservaron a –80 ºC hasta su utilización.
MATERIAL Y MÉTODOS
26
3.5.2.- Retrotranscripción (RT)
Para la síntesis de ADN complementario (cADN) se partió de 1 g de ARN total y
se utilizaron como cebadores hexámeros aleatorios en el caso de VEGFD y oligonucleótido
reverso específico para VEGFR3 (5’ CTATGCCTGCTCTCTATCTGC TCAA 3’), hasta
un volumen final de 20 l. Se utilizó el sistema Thermoscript RT-PCR System Invitrogen
Life Technologies (Glasgow, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Las
condiciones utilizadas para la retrotranscripción fueron las siguientes: 10 minutos a 25 ºC
(incubación), 30 minutos a 48 ºC (retrotranscripción), 5 minutos a 99 ºC (inactivación de
transcriptasa inversa). Los productos se conservaron a -20 ºC hasta su uso.
3.5.3.- PCR cuantitativa (Q-PCR)
El análisis de expresión de VEGFD y VEGFR3 se llevó a cabo mediante Q-PCR
(del inglés, “Quantitative Polymerase Chain Reaction”). Para ello, se diseñaron parejas de
oligonucleótidos para el gen diana (VEGFD o VEGFR3) y para el gen control (RPL19)
óptimas para Q-PCR. Los oligonucleótidos utilizados se sitúan en exones diferentes para
evitar la amplificación de ADN genómico contaminante, posiblemente presente en las
muestras. Sus secuencias se recogen en la Tabla 2. Todos fueron sintetizados
comercialmente por Invitrogen Life Technologies (Glasgow, Reino Unido).
Tabla 2: Secuencias de los oligonucleótidos utilizados en Q-PCR
Diana Secuencia
VEGFD Fwd 5’- CTGGAACAG AAGACCACTCTCATC -3’
5’- CTCGCAACGATCTTCGTCAAA -3’
5’- CTCGTATGTGTGCAAGGCCA -3’
Rvs
VEGFR3 Fwd
Rvs 5’- CTCGACGCTGATGAAGGGAT-3’
RPL19 Fwd 5’- GCGGAAGGGTACAGCCAAT -3’
Rvs 5’- GCAGCCGGCGCAAA -3’
Las concentraciones de oligonucleótidos fueron optimizadas, utilizando los
protocolos de optimización de Applied Biosystem SYBR Green PCR master mix. Las
reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 10 µl conteniendo 5 ng de
ADN, 300 nM de cada pareja de oligonuceótidos (VEGFD y RPL19 o VEGFR3 y RPL19
MATERIAL Y MÉTODOS
27
en reacciones independientes) y 1X SYBR-Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster
City, California, EEUU).
Las condiciones de PCR empleadas fueron: un primer paso de 10 minutos a 95 ºC
durante 10 min (activación del enzima AmpliTaq Gold® DNA Polymerase) seguido de 40
ciclos de 15 segundos a 95 ºC (desnaturalización del ADN) más 1 minuto a 60 ºC
(hibridación de oligonucleótidos y molde seguida de extensión del nuevo ADN). Todas las
muestras fueron analizadas por triplicado y cada reacción fue sometida a un protocolo de
disociación del fluoróforo SYBR-Green I para comprobar la ausencia de productos
inespecíficos que producirían picos de temperatura de disociación (T melting) distintos al
del gen estudiado, invalidando los resultados. Cada experimento se acompañó de una recta
patrón de Ct (threshold cycle o ciclo umbral) calculada a partir de la amplificación de
ADN humano tumoral como molde en concentraciones decrecientes de 20 ng a 2.5 ng por
triplicado para cada gen. Además, en cada experimento se llevo a cabo una reacción (en
triplicado) sin ADN molde como control negativo. Todas las reacciones se realizaron en
placas de 96 pocillos (Applied Biosystems) empleando el termociclador con el sistema de
detección ABI PRIMS 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems).
La cuantificación de la amplificación se realizó de la siguiente manera:
● Cálculo de Ct (del inglés “threshold cycle”, ciclo umbral, en el que se detecta por
primera vez el producto de amplificación) tomando el valor medio de los triplicados
llevados a cabo para los genes diana (VEGFD y VEGFR3) y el gen control (RPL19) en
todas las muestras tumorales y en las muestras de tejido normal disponibles.
● Cálculo de Ct: diferencia entre el Ct de los genes a estudio (VEGFD o
VEGFR3) y el Ct del gen endógeno (RPL19) en cada muestra (T, tumoral, N, sana).
● Cálculo de Ct: diferencia entre Ct del tumor (T) respecto al tejido sano (N),
en los casos disponibles.
● Q, determina la magnitud del cambio (“fold change”). Los cambios fueron
considerados cuando Q2.
MATERIAL Y MÉTODOS
28
3.6.- Análisis estadístico
Con propósitos estadísticos se crearon las siguientes categorías para las
características clínico-patológicas:
- pT: 1-2 vs 3-4.
- pN: ganglios no afectados (pN0) vs ganglios afectados (pN1-3).
- Estadio: I-II vs III-IV.
Para detectar las asociaciones entre los resultados moleculares y los parámetros
clínico-patológicos, se aplicó el test Chi-cuadrado (χ2) para las variables cualitativas (con
la corrección de Yates en caso conveniente) y los test t-Student o Mann Whitney para las
variables continuas paramétricas y no paramétricas, respectivamente (ANOVA o Kruskal-
Wallis en variables con más de dos categorías paramétricas y no paramétricas,
respectivamente).
Las curvas de supervivencia, global y específica de tumor, se calcularon mediante
el método Kaplan-Meier. Las diferencias de supervivencia fueron analizadas mediante el
método log-rank. Se utilizó el modelo multivariante de Cox (adelante Wald) de riesgo
relativo para examinar el impacto relativo de aquellas variables que mostraron ser
estadísticamente significativas en el análisis univariante. Todos los test fueron bilaterales.
Se tomaron valores de p<0,05 (de análisis bilaterales) como estadísticamente
significativos. Todo el estudio estadístico se llevó a cabo con el paquete estadístico SPSS
12.0 (SPSS, Inc., Chicago, Illinois, EEUU).
CtT =
(Ctdiana
– CtRPL19
)T
CtN
= (Ct
diana – Ct
RPL19)
N
Ct = Ct
T - Ct
N
Q =2ˉCt
RESULTADOS
29
4 RESULTADOS
RESULTADOS
30
A continuación se detallan los resultados de nuestro trabajo, siguiendo las
directrices recogidas en REMARK (REporting recommendations for tumor MARKer
prognostic studies) (McShane y cols., 2005).
4.1.- Análisis Western del anticuerpo D2-40
Se detectaron dos bandas de inmunoreacción: una del tamaño esperado para
podoplanina, 37 kD, y otra de mayor tamaño, compatible con la forma glicosilada de la
misma (Fig. 3).
Figura 3 - Análisis Western del anticuerpo D2-40.
4.2.- Cuantificación de la densidad linfática
Se pudieron identificar vasos linfáticos positivos para D2-40 tanto entre los islotes
de células tumorales, en un 75 % de los casos (78/104), como en la periferia del tumor, en
un 80 % (83/104 casos) (Fig. 4).
El 94 % de los casos presentaban positividad para D2-40 en vasos linfáticos,
independientemente de que éstos fuera intra o peritumorales.
Los valores medios para las diferentes densidades linfáticas fueron los siguientes:
- DLI 14,8 (con un rango entre 0 - 78 y error estándar 1,33).
- DLP 22,0 (con un rango entre 0 - 82,2 y error estándar 1,59).
- DLG 22,3 (con un rango entre 0 - 79,3 y error estándar 1,19).
RESULTADOS
31
Figura 4 - Identificación de vasos linfáticos por inmunohistoquímica. Detección de
vasos linfáticos utilizando el anticuerpo D2-40 (podoplanina) en tumores de orofaringe (A)
y supraglotis (E) en los que los vasos sanguíneos permanecen negativos para la tinción.
Detección de linfáticos intratumorales en tumores de orofaringe (B) y supraglotis (F).
Detección de linfáticos peritumorales en un tumor supraglótico (C). Detección de linfáticos
en un tumor de glotis que mostraba tinción para podoplanina, con un patrón difuso (G).
Ejemplos representativos de émbolos tumorales positivos para podoplanina en el interior
de vasos linfáticos positivos en tumores de orofaringe (D) y supraglotis (H). Barra de
escala, 250 m.
4.3.- Determinación del estado proliferativo de los vasos linfáticos
Para conocer el estado de proliferación de los vasos linfáticos, se realizó una doble
inmunofluorescencia con D2-40 y ki-67 en diez casos representativos, seleccionados en
función de la calidad de las imágenes obtenidas para los vasos linfáticos en IHQ. Se
consideró que un vaso linfático estaba en proceso de proliferación cuando contenía al
menos una célula positiva para ki-67, y se encontraron varios, tanto en el interior de la
masa tumoral como en su periferia (Fig. 5 A-L).
4.4.- Detección de invasión tumoral de los vasos linfáticos (IL)
En este estudio, se encontraron émbolos de células tumorales en el interior de los
vasos linfáticos, mediante inmunohistoquímica, en el 43 % e los casos (44/103) (Fig. 4D,
H). En la Figura 5 M-P se muestra el estado proliferativo (positividad para ki-67) de una
masa tumoral, que además expresa también D2-40, dentro de un vaso linfático.
RESULTADOS
32
Figura 5 – Estado proliferativo de los vasos linfáticos. Ejemplos de vasos linfáticos
positivos para podoplanina (verde) y proliferativos (ki 67 positivos, rojo) en carcinomas de
orofaringe (A-D e I-L) y supragotis (E-H). Masa tumoral positiva para podoplanina (verde)
y proliferante (ki67 positiva, rojo) en el interior de un vaso linfático de un carcinoma
supraglótico (M-P). Primera y segunda columnas, inmunotinciones con D2-40 (verde) y
ki67 (rojo), respectivamente; tercera y cuarta columnas, DAPI (azul) y superposición de
imágenes. Barra de escala, 10 m.
RESULTADOS
33
4.5.- Correlación entre densidad de vasos linfáticos, invasión linfática y
características clínico-patológicas
Las Tablas 3-5 recogen la distribución de los valores medios de DLI, DLP y DLG,
entre las diferentes categorías para cada variable clínico-patológica en el conjunto de la
serie estudiada y de forma independiente para carcinomas de laringe y faringe.
Los valores más altos de DLI, DLP y DLG se asociaron significativamente con la
presencia de metástasis ganglionares, con un mayor tamaño tumoral (excepto DLP, que no
alcanzó significación estadística), estadio tumoral más avanzado y la localización faríngea.
Cuando el grupo tumoral de estudio se separó en dos subgrupos de acuerdo a la
localización tumoral (faringe y laringe) se observó una diferencia notable: mientras en el
grupo de tumores faríngeos no se observaron diferencias significativas para DLI, DLP y
DLG con respecto a los parámetros clínico-patológicos, en la laringe se observó una
correlación de DLI y DLG con pT y TNM avanzados, siendo además más elevadas en
supraglotis que en glotis.
La glotis es una localización de particular interés, puesto que es una región pobre
en vasos linfáticos. En nuestra serie, 13 de los 30 casos glóticos (43 %) mostraron
linfáticos dentro de la masa tumoral, tres de las cuales eran tumores T1.
No se observó ninguna correlación entre DLI, DLP o DLG con la aparición de
recidivas en ninguna de las poblaciones consideradas. El grado de diferenciación pobre
sólo se correlacionaba con una mayor DLI en la población de tumores de laringe
(p=0,002).
Es importante reseñar que la presencia de émbolos tumorales (casos con invasión
linfática, IL) se correlacionó con la localización faríngea (58 % - 29/50, frente al 28 % -
15/53 - en los tumores de laringe; p=0,002), y fue además más frecuente en tumores
grandes (pT 3-4; p=0,006), en estadios avanzados (III-IV; p=0,0001) y en casos con
afectación ganglionar (p=0,001) (Tabla 3).
En los tumores laríngeos, la mayoría de los casos con émbolos eran tumores de
tamaño grande (12/15, p=0,003), y la ausencia de émbolos era más frecuente en los casos
con ganglios libres de tumor (30/38, p=0,062) (Tabla 4). En la faringe, la presencia de
émbolos era más abundante en tumores de orofaringe, frente a los de hipofaringe
(p=0,023). Todos los tumores de faringe con émbolos tumorales eran de estadio avanzado
(27/27, p=0,01) (Tabla 5).
RESULTADOS
34
Tabla 3. Frecuencias (casos con vasos linfáticos), valores promedio y rangos para DLI,
DLP, DLG en la serie CECC completa (N=104). Comparación de los valores medios para
DLI, DLP y DLG entre las categorías de las variables clinicopatológicas consideradas.
Distribución de los tumores de acuerdo con la invasión linfática en relación a las
características clinicopatológicas.
CECC DLI DLP DLG Invasión linfática (IL)
Frecuencia 75 % (78/104) 80 % (83/104) 94 % (98/104) 42,72 % (44/103)
Media (E.E.) 14,8 (1,33) 22,0 (1,59) 22,3 (1,19)
Rango 0-78,4 0-82,2 0-79,3
N Rango medio
p# N Media (E.E) p¥ N Media (E.E) p¥ Ausente Presente Total p
Sitio anatómico
Faringe 50 63,34 0,0004 50 27,41 (2,57) 0,0072 50 26,47 (1,92) 0,0029 21 29 50 0,002
Laringe 54 42,46 54 18,47 (2,03) 54 18,98 (1,56) 38 15 53
Total 104 104 104 59 44 103
pT
T1-2 39 39,09 0,0000 39 19,19 (2,47) 0,099 39 19,20 (2,03) 0,039 29 10 39 0,006
T3-4 65 60,55 65 24,91 (2,21) 65 24,61 (1,60) 30 34 64
Total 104 104 104 59 44 103
Afectación ganglionar
Libres 47 42,44 0,0020 47 18,60 (2,37) 0,0230 47 19,34 (1,67) 0,0190 35 12 47 0,001
Afectados 57 60,80 57 26,20 (2,27) 57 25,24 (1,82) 24 32 56
Total 104 104 104 59 44 103
Estadio Tumoral
I-II 28 32,98 0,0001 28 14,67 (2,44) 0,0010 28 16,89 (2,25) 0,0060 24 4 28 0,0001
III-IV 71 56,71 71 25,83 (2,14) 71 24,76 (1,57) 31 38 69
Total 99 99 99 55 42 97
Grado diferenciación
Bien 48 43,86 0,151 48 19,99 (2,68) 0,244 48 20,61 (2,04) 0,289 31 17 48 0,111
Moderado 32 54,81 32 24,06 (3,17) 32 24,61(2,35) 18 14 32
Pobre 18 55,08 18 27,69 (2,73) 18 25,15 (2,26) 6 11 17
Total 98 98 98 55 42 97
Recidiva
No 66 50,98 0,8167 66 20,29 (2,17) 0,0729 66 21,15 (1,54) 0,1649 38 27 65 0,8050
Si 34 49,57 34 26,86 (2,78) 34 25,04 (2,47) 19 15 34
Total 100 100 100 57 42 99
DLI, Densidad Linfática Intratumoral; DLP, Densidad Linfática Peritumoral; DLG, Densidad Linfática Global E.E., Error Estándar p# (U Mann-Whitney o Kruskal Wallis); p¥ (t Student o ANOVA); p (chi cuadrado)
RESULTADOS
35
Tabla 4. Frecuencias (casos con vasos linfáticos), valores promedio y rangos para DLI,
DLP, DLG en la serie de carcinomas de laringe (N=54). Comparación de los valores
medios para DLI, DLP y DLG entre las categorías de las variables clinicopatológicas
consideradas. Distribución de los tumores de acuerdo con la invasión linfática en relación a
las características clinicopatológicas.
LARINGE DLI DLP DLG Invasión linfática (IL)
Frecuencia 57,41 % (31/54) 55,56 % (30/54) 87,04 % (47/54) 28,30 % (15/53)
Media (E.E.) 10,59 (1,65) 18,47 (2,03) 18,98 (1,56)
Rango 0-41,56 0-60,45 0-44,71
N Rango medio
p# N Media (E.E) p¥ N Media (E.E) p¥ Ausente Presente Total p
Sitio anatómico
Glotis 30 23,45 0,028 30 15,22 (2,43) 0,073 30 16,14 (2,06) 0,042 23 6 29 0,176
Supraglotis 24 32,56 24 22,54 (3,30) 24 22,52 (2,24) 15 9 24
Total 54 54 54 38 15 53
pT
T1-2 28 22,05 0,006 28 15,95 (2,85) 0,2 28 15,98 (2,38) 0,044 25 3 28 0,003
T3-4 26 33,37 26 21,19 (2,86) 26 22,20 (1,84) 13 12 25
Total 54 54 54 38 15 53
Afectación ganglionar
Libres 38 25,38 0,112 38 16,63 (2,23) 0,165 38 17,72 (1,81) 0,219 30 8 38 0,062
Afectados 16 32,53 16 22,85 (4,27) 16 21,96 (3,03) 8 7 15
Total 54 54 54 38 15 53
Estadio Tumoral
I-II 24 20,92 0,004 24 13,95 (2,52) 0,045 24 15,05 (2,35) 0,023 20 4 24 0,073
III-IV 30 32,77 30 22,09 (2,92) 30 22,12 (1,94) 17 11 28
Total 54 54 54 37 15 52
Grado diferenciación
Bien 31 20,58 0,002 31 16,85 (2,65) 0,497 31 17,06 (2,17) 0,234 23 8 31 0,491
Moderado 14 34,21 14 19,77 (4,68) 14 22,76 (2,83) 10 4 14
Pobre 7 37,29 7 24,02 (3,52) 7 22,18 (3,03) 3 3 6
Total 52 52 52 36 15 5
Recidiva
No 43 28,35 0,169 43 17,02 (2,28) 0,218 43 18,60 (1,80) 0,685 29 13 42 0,492
Si 10 21,20 10 23,55 (4,7) 10 20,28 (3,57) 8 2 10
Total 53 53 53 37 15 52
DLI, Densidad Linfática Intratumoral; DLP, Densidad Linfática Peritumoral; DLG, Densidad Linfática Global E.E., Error Estándar p# (U Mann-Whitney o Kruskal Wallis); p¥ (t Student o ANOVA); p (chi cuadrado)
RESULTADOS
36
Tabla 5. Frecuencias (casos con vasos linfáticos), valores promedio y rangos para DLI,
DLP, DLG en la serie de carcinomas de faringe (N=50). Comparación de los valores
medios para DLI, DLP y DLG entre las categorías de las variables clinicopatológicas
consideradas. Distribución de los tumores de acuerdo con la invasión linfática en relación a
las características clinicopatológicas.
FARINGE DLI DLP DLG Invasión linfática (IL)
Frecuencia 90 % (45/50) 90 % (45/50) 96 % (48/50) 58 % (29/50)
Media (E.E.) 19,14 (1,97) 27,41 (2,57) 26,47 (1,92)
Rango 0-78,39 0-82,17 8,5 -79,34
N Media (E.E) p¥ N Media (E.E) p¥ N Rango medio
p# Ausente Presente Total p
Sitio anatómico
Hipofaringe 18 19,92 (3,48) 0,8600 18 30,87 (3,91) 0,3470 18 29,67 0,0810 12 6 18 0,0230
Orofaringe 32 19,18 (2,45) 32 25,70 (3,46) 32 22,29 9 22 31
Total 50 50 50 21 28 49
pT
T1-2 11 14,71 (3,53) 0,236 11 27,45 (3,12) 0,993 11 29,18 0,343 4 7 11 0,668
T3-4 39 20,39 (2,30) 39 27,39 (3,11) 39 24,46 17 22 39
Total 50 50 50 21 29 50
Afectación ganglionar
Libres 9 16,30 (3,90) 0,3330 9 26,94 (7,77) 0,3450 9 27,50 0,6550 5 4 9 0,3630
Afectados 41 19,77 (2,25) 41 27,51 (2,69) 41 25,06 16 25 41
Total 50 50 50 21 29 50
Estadio Tumoral
I-II 4 12,12 (7,01) 0,3720 4 19,05 (8,74) 0,3650 4 28,13 0,4280 4 0 4 0,0100
III-IV 41 19,60 (2,29) 41 28,57 (2,99) 41 22,50 14 27 41
Total 45 45 45 18 27 45
Grado diferenciación
Bien 17 24,74 (3,96) 0,112 17 25,73 (5,69) 0,848 17 23,71 0,591 8 9 17 0,549
Moderado 18 16,63 (3,08) 18 27,39 (4,26) 18 21,39 8 10 18
Pobre 11 14,25 (3,48) 11 30,02 (3,81) 11 26,64 3 8 11
Total 46 46 46 19 27 46
Recidiva
No 23 19,19 (2,37) 0,9140 23 26,41 (4,34) 0,7410 23 24,39 0,8480 9 14 23 0,6420
Si 24 18,73 (3,45) 24 28,24 (3,43) 24 23,63 11 13 24
Total 47 47 47 20 27 47
DLI, Densidad Linfática Intratumoral; DLP, Densidad Linfática Peritumoral; DLG, Densidad Linfática Global E.E., Error Estándar p# (U Mann-Whitney o Kruskal Wallis); p¥ (t Student o ANOVA); p (chi cuadrado)
RESULTADOS
37
4.6.- Correlación entre densidad de vasos linfáticos y presencia de invasión linfática.
En cuanto a la correlación entre la presencia de IL y la densidad linfática global, los
tumores de laringe en los que se detectaron émbolos tumorales presentaban una densidad
media de vasos linfáticos superior a aquellos que no los tenían (p=0,038) (Fig. 6).
Figura 6. Valores medios de la densidad linfática global (DLG) para los grupos de
tumores sin o con invasión linfática (IL ausente o presente) en cada una de las poblaciones
consideradas.
4.7.- Expresión de podoplanina en las células tumorales
Una vez evaluada la extensión e intensidad de la inmunotinción para podoplanina
en las células tumorales, se asignó una puntuación a cada caso (rango 0-15) y esta variable
se dicotomizó, con fines estadísticos, según el valor de la mediana en cada población
considerada (6 en tumores laríngeos y 3 en tumores de faringe). Así, los tumores se
dividieron en dos grupos: expresión elevada o reducida de podoplanina. Las correlaciones
entre la expresión de podoplanina y las características clinicopatológicas consideradas se
recogen en la Tabla 6 y se comentan a continuación.
RESULTADOS
38
Tabla 6. Correlación entre el nivel de expresión de podoplanina (valorado por
inmunhistoquímica) y las variables clínicopatológicas indicadas en tumores de laringe y
faringe
LARINGE
Nivel de podoplanina FARINGE
Nivel de podoplanina#
Bajo/nulo Elevado Total p Bajo/nulo Elevado Total p
Sitio anatómico Sitio anatómico 1
Glotis 13 16 29 0,004 Hipofaringe 9 9 18
Supraglotis 20 4 24 Orofaringe 15 15 30
Total 33 20 53 Total 24 24 48
T1-2 vs 3-4 0,051 T1-2 vs 3-4 0,524
T1-2 14 14 28 T1-2 6 4 10
T3-4 19 6 25 T3-4 19 20 39
Total 33 20 53 Total 25 24 49
Ganglios 0,678 Ganglios 0,24
Libres 23 15 38 Libres 3 6 9
Afectados 10 5 15 Afectados 22 18 40
Total 33 20 53 Total 25 24 49
Estadio tumoral 0,001 Estadio tumoral 0,924
Est I-II 9 15 24 Est I-II 2 2 4
Est III-IV 24 5 29 Est III-IV 21 19 40
Total 33 20 53 Total 23 21 44
Grado de diferenciación 0,057
Grado de diferenciación 0,151
Bien 15 16 31 Bien 6 11 17
Moderado 12 2 14 Moderado 11 7 18
Pobre 4 2 6 Pobre 7 3 10
Total 31 20 51 Total 24 21 45
Recidiva 0,182 Recidiva 0,382
No 24 18 42 No 10 12 22
Si 8 2 10 Si 14 10 24
Total 32 20 52 Total 24 22 46 Categorías establecidas según el valor de la mediana (6, para la serie de tumores de laringe) de la puntuación asignada a cada caso, considerando conjuntamente intensidad y extensión de la tinción. # Categorías establecidas según el valor de la mediana (3, para la serie de tumores de faringe) de
la puntuación asignada a cada caso, considerando conjuntamente intensidad y extensión de la tinción.
4.7.1.- Expresión de podoplanina en los carcinomas de laringe
La expresión de podoplanina en epitelio normal de laringe era inapreciable o
restringida a pequeños grupos de células en la capa basal y mostraba un patrón de
membrana y citoplásmico.
En carcinoma de laringe la expresión de podoplanina era generalmente heterogénea
y mostraba dos patrones diferentes. 21 casos (43 %) mostraban una expresión difusa en la
mayoría de las células tumorales (Fig. 7D) y el resto (28 casos) presentaba un patrón de
RESULTADOS
39
expresión focal en la periferia proliferativa de los nichos tumorales (Fig. 7B). Entre éstos,
12 casos (25 %) mostraban además expresión difusa en las áreas centrales.
Tres tumores no expresaban podoplanina (6 %), 30 (56 %) mostraban tinción baja o
moderada (puntuación 1-6) y 20 (38 %) mostraban expresión elevada (puntuación 7-15).
Se observaron niveles más elevados de podoplanina en carcinomas de glotis
(p=0,004). La expresión decrecía con el tamaño tumoral (p=0,051) y en consecuencia se
vio una relación inversa con el estadio tumoral (p=0,001): la mayoría de los casos en
estadios IV (15/17) tenían niveles reducidos de podoplanina. Los tumores bien
diferenciados mostraban niveles superiores (p=0,052). No había correlación con la
afectación ganglionar (p=0,678), con la aparición de recidivas (p=0,182) ni con la
presencia de émbolos de células tumorales en los vasos linfáticos (p=0,678).
4.7.2.- Expresión de podoplanina en los carcinomas de faringe
Seis tumores no expresaban podoplanina (12 %), 19 (39 %) mostraban tinción baja
o moderada (puntuación 1-3) y 24 (49 %) mostraban expresión elevada (puntuación 4-15)
(Fig. 7A,C ).
16 casos (38 %) mostraban una expresión difusa en la mayoría de las células
tumorales (Fig. 7C) y 26 (62 %) presentaba un patrón de expresión focal en la periferia
proliferativa de los nichos tumorales (Fig. 7A). Entre éstos, 8 casos (19 %) mostraban
además expresión difusa en las áreas centrales.
No se observó correlación alguna entre el nivel de expresión de podoplanina y las
siguientes variables: localización anatómica (orofaringe vs hipofaringe), tamaño, estadio
tumoral, afectación ganglionar, grado de diferenciación, aparición de recidivas o invasión
linfática.
RESULTADOS
40
Figura 7 - Expresión de podoplanina en las células tumorales. Se muestra la expresión
en tumores representativos de faringe (A, C) y laringe (B, D) con patrones de expresión
focal (A, B) y difuso (C, D).
4.8.- Expresión de mARN de VEGFR3 y VEGFD
La comparación de los niveles de expresión de VEGFD y VEGFR3 entre las
muestras tumorales respecto a sus correspondientes tejidos sanos permitió clasificar los
casos según presentasen niveles semejantes, elevados o reducidos.
En 22/33 casos (67 %) la expresión de VEGFD estaba alterada (en 19 regulado a la
baja y en 3 al alza) y en 11 (33 %) era normal. En cuanto a VEGFR3, 16/33 (48 %)
presentaban niveles normales, mientras que 13 (40 %) mostraban niveles reducidos y 4 (12
%) niveles elevados de mARN.
La regulación a la baja de VEGFD se asociaba a ausencia de afectación ganglionar
(p=0,032). Todos los tumores con niveles elevados de VEGFR3 se localizaban en la
faringe (p=0,026) (Fig. 8).
RESULTADOS
41
A) B)
Figura 8 - Distribución de los niveles de mRNA de VEGFD (A) y VEGFR3 (B) según los
parámetros de afectación ganglionar y localización tumoral, respectivamente.
4.9.- Análisis de supervivencia
4.9.1.- Análisis de supervivencia univariante
La supervivencia específica para la enfermedad y la global a los 5 años para la
población completa fue del 52 % y 28 %, respectivamente (Fig. 9), siendo superior en
pacientes con tumores de laringe (74 % y 37 %, respectivamente) que en aquellos con
tumores de faringe (31 % y 17 %, respectivamente; p<0,05, tanto para supervivencia global
como específica de tumor al comparar las dos localizaciones anatómicas). Además, los
tumores T1-2, los de estadios I-II y los pN0 tuvieron un mejor pronóstico que el resto
(p<0,05 en cada parámetro) (Fig. 10)
RESULTADOS
42
Figura 9 – Supervivencia específica de tumor y global para la población de carcinomas
epidermoides de cabeza y cuello (N=104).
Figura 10 – Supervivencia específica de tumor según localización (A), pT (B),
afectación ganglionar (C) y estadio tumoral (D) para la población completa de CECC.
Se indica el nivel de significación (p) para el test Log rank.
RESULTADOS
43
Para el análisis de supervivencia, las variables de los vasos linfáticos se
categorizaron en casos de alta densidad linfática frente al resto, de acuerdo con el valor de
las medianas de las densidades de vasos linfáticos (DLI, DLP y DLG) en el grupo positivo
de cada población (Tabla 7)
Tabla 7. Incidencia de las variables relacionadas con linfangiogénesis en la supervivencia
tanto específica de tumor como global para las poblaciones tumorales indicadas (laringe,
faringe y serie completa). p-valor, Kaplan-Meier
SUPERVIVENCIA
Específica de tumor Global
Mediana p Mediana p
Laringe (N=54)
DLI 15,74 0,4825 15,74 0,4594
DLP 24,56 0,2171 24,56 0,0028
DLG 22,04 0,027 22,04 0,0029
IL 0,015 0,1276
Faringe (N= 50)
DLI 19,83 0,4230 19,83 0,3235
DLP 29,28 0,7923 29,28 0,5809
DLG 22.98 0,5303 22.98 0,9812
IL 0,5933 0,959
CECC (N=104)
DLI 17,95 0,15 17,95 0,1703
DLP 26,45 0,4526 26,45 0,2895
DLG 22.04 0,045 22.04 0,0564
IL 0,045 0,0312
Una DLG elevada (independientemente de la localización intra o peritumoral de los
vasos), tuvo impacto en la supervivencia específica de tumor y global tanto en la población
completa como en la de tumores de laringe, pero no en faringe (Fig. 11).
RESULTADOS
44
Figura 11 – Supervivencia específica de tumor según el valor de la densidad linfática
global (DLG) para las poblaciones CECC (A), ca. laringe (B) y ca. faringe (C). Se indica
el nivel de significación (p) para el test Log rank.
La variable DLP sólo mostró un valor pronóstico en supervivencia global en la
población de tumores de laringe, mientras que la variable DLI no mostró un valor
pronóstico en ninguna de las poblaciones consideradas.
La presencia de émbolos tumorales (IL) mostró un valor pronóstico en
supervivencia específica de tumor y global en la población completa y en supervivencia
específica de tumor en la de tumores de laringe, pero no en faringe (Fig. 12, Tabla 7).
Figura 12 – Supervivencia específica de tumor según la presencia de invasión linfática
(IL) para las poblaciones CECC (A), ca. laringe (B) y ca. faringe (C). Se indica el nivel de
significación (p) para el test Log rank.
Es interesante remarcar que de los 47 casos de CECC clasificados como pN0,
aquellos que presentaban elevadas DLG y DLP tenían una supervivencia (específica de
RESULTADOS
45
tumor y global) peor que los que mostraban bajas densidades (Fig. 13 A). Este resultado
fue encontrado también en el grupo de 38 tumores pN0 laríngeos, donde también fue peor
la supervivencia específica de tumor y global en el grupo con DLG (Fig. 13 B) y DLP
elevada. La variable DLI en tumores pN0 sólo mostró un valor pronóstico en la serie
completa de CECC (supervivencia específica de tumor) (Tabla 8).
Tabla 8. Incidencia de las variables relacionadas con linfangiogénesis en la supervivencia
tanto específica de tumor como global para las poblaciones tumorales indicadas (ca. de
laringe y serie completa clasificados como pN0). p-valor, Kaplan-Meier
SUPERVIVENCIA
Específica de tumor Global
Mediana p Mediana p
pN0 Laringe (N= 38)
DLI 15,74 0,7482 15,74 0,4031
DLP 22,67 0,0165 22,67 0,0015
DLG 21,41 0,0307 21,41 0,0312
IL 0,5812 0,9718
pN0 CECC (N=47)
DLI 17,00 0,0427 17,00 0,2383
DLP 24,56 0,0226 24,56 0,0018
DLG 22,04 0,0053 22,04 0,0429
IL 0,0577 0,1653
Figura 13 – Supervivencia específica de tumor según el valor de la densidad linfática
global (DLG) para las poblaciones pN0 CECC (A) y pN0 ca. laringe (B). Se indica el
nivel de significación (p) para el test Log rank.
RESULTADOS
46
Respecto a la expresión de podoplanina, la supervivencia global fue similar para los
grupos con expresión elevada y reducida (p=0,6517 en laringe y p=0,4950 en faringe). Los
casos de tumor de laringe con patrón focal tenían supervivencia específica de tumor mejor
que los que no lo mostraban (Log-rank test, p = 0,0624) (Fig. 14).
Figura 14 – Supervivencia específica de tumor según la presencia del patrón focal en
la expresión de podoplanina por parte de las células tumorales para las poblaciones
CECC (A), ca. laringe (B) y ca. faringe (C). Se indica el nivel de significación (p) para el
test Log rank.
4.9.2.- Análisis de supervivencia multivariante
Para el análisis multivariante de supervivencia específica de tumor y global se
incluyeron las siguientes variables: localización anatómica, pT (T1-2 vs T3-4), afectación
ganglionar (N0 vs resto), DLI, DLP, DLG (elevada vs resto, para cada una), invasión
linfática, expresión de podoplanina (elevada vs reducida) y presencia del patrón focal vs
difuso de podoplanina. Los resultados se recogen en la Tabla 9.
Cabe destacar el valor pronóstico independiente para la presencia de invasión
linfática (supervivencia específica de tumor) y de la densidad linfática global
(supervivencia global) en tumores de laringe.
RESULTADOS
47
Tabla 9. Análisis multivariante de supervivencia específica de tumor y global para las
poblaciones tumorales consideradas.
Supervivencia específica de tumor
Análisis supervivencia multivariante Cox p Exp(B) 95,0 % IC para Exp(B)
Inferior Superior
LARINGE
Invasión linfática 0,024 6,686 1,281 34,889
CECC
Afectación ganglionar 0,000 6,292 2,379 16,641
Supervivencia global
Análisis supervivencia multivariante Cox p Exp(B) 95,0 % IC para Exp(B)
Inferior Superior
LARINGE
Densidad linfática global 0,017 12,512 1,512 99,007
FARINGE
Tamaño 0,047 3,413 1,014 11,485
CECC
Localización 0,001 3,55 1,701 7,410
Tamaño 0,013 3,074 1,267 7,458 , p-valor de log-rank test
DISCUSIÓN
48
5 DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
49
El carcinoma epidermoide de cabeza y cuello es un tipo de tumor frecuente, con
una supervivencia a los 5 años en torno al 50 %. La pérdida del control locorregional,
mediada principalmente por la diseminación a través del sistema linfático, contribuye
decisivamente a la progresión de la enfermedad.
El hallazgo de algún ganglio linfático afectado por metástasis tumorales es el
principal factor pronóstico manejado en la práctica clínica. La presencia de células
tumorales en los ganglios linfáticos puede ser un mero reflejo de su tránsito hacia puntos
distantes del organismo, aunque también se propone que las células tumorales podrían
permanecer atrapadas en ellos, resultando en un cierto retraso en el proceso de
diseminación, o incluso que los ganglios pudieran servir como amplificadores de la
diseminación tumoral (Joyce y cols., 2009; Sleeman y cols., 2009).
Sin embargo, la presencia de metástasis ganglionares no determina de forma
completa el comportamiento biológico del tumor, siendo su valor limitado como factor
pronóstico. Por ello, es necesario identificar otros factores del tumor primario que permitan
predecir con mayor precisión el curso clínico de los pacientes afectados por tumores
epidermoides de cabeza y cuello, lo cual contribuiría a mejorar sus expectativas. Con dicho
objetivo investigamos el fenómeno de la linfangiogénesis en un grupo de 104 tumores
faringo-laríngeos primarios, en relación con las características clínico-patológicas de los
tumores (entre ellas, la afectación ganglionar), así como con la supervivencia global y
específica de enfermedad.
El conocimiento del fenómeno de la linfangiogénesis ha sufrido un retraso temporal
con respecto al de la angiogénesis tumoral, debido a las limitaciones técnicas del cultivo de
células endoteliales linfáticas y a la ausencia de marcadores específicos de endotelio
linfático. Recientemente se han identificado algunos, entre los cuales destacó en un
principio VEGFR-3 (receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular-3). Sin
embargo, su valor como marcador linfático se vio comprometido por su falta de
especificidad frente a los vasos sanguíneos. En los últimos años se ha extendido el uso del
anticuerpo D2-40, que reconoce podoplanina, expresada específicamente por el endotelio
linfático frente al sanguíneo. En el presente estudio hemos comprobado la utilidad de este
anticuerpo, que nos ha permitido observar la presencia de vasos linfáticos tanto dentro de
la masa tumoral como en su periferia, en sintonía con resultados previos (Beasley y cols.,
2002; Maula y cols., 2003; Franchi y cols., 2004; Audet y cols., 2005; Kyzas y cols., 2005).
DISCUSIÓN
50
Asimismo, y como estaba descrito (Yuan y cols., 2006), observamos expresión de
podoplanina por parte de las células tumorales. Los datos encontrados en la literatura
acerca del papel biológico de la podoplanina en tumores epidermoides presentan
diferencias según el sitio anatómico considerado. Por ejemplo, en tumores epidermoides de
cuello de útero, unos niveles bajos se asocian a peor pronóstico (Dumoff y cols., 2005),
mientras que en tumores de pulmón, aquellos casos positivos y con un patrón de expresión
focal mostraban una mejor supervivencia global que los negativos (Shimada y cols., 2009).
Nuestros resultados apuntan en el mismo sentido, estando en discordancia con los
conocidos en carcinoma oral y de esófago, tipos de tumor en los que se ha descrito una
asociación entre una elevada expresión de podoplanina, metástasis ganglionar y
supervivencia reducida (Yuan y cols., 2006; Kreppel y cols., 2010; Rahadiani y cols.,
2010). En nuestra serie, mientras que la expresión de podoplanina en tumores de faringe no
presentaba relación con ninguna variable clínico-patológica considerada, en los tumores de
laringe se observó una asociación inversa entre la expresión de podoplanina y tamaño y
estadio tumoral. Teniendo en cuenta que podoplanina podría identificar células iniciadoras
de tumor (TICs), este resultado podría reflejar una mayor proporción de TICs en los
tumores más pequeños, menos avanzados. La expresión era más frecuente en tumores de
glotis que los supraglóticos y en tumores bien diferenciados, que normalmente son menos
invasivos que los pobremente diferenciados. La presencia de un patrón de expresión focal
en laringe marcaba una tendencia hacia una mejor supervivencia, lo cual indicaría una
menor agresividad biológica de estos tumores, en consonancia con los resultados descritos
por Shimada y cols en carcinomas de pulmón. Sería plausible que los carcinomas con un
patrón focal representen un grupo de tumores bien organizados en base al concepto TIC,
mientras que los que presentan un patrón difuso podrían ser tumores desordenados en
términos de una jerarquía de desarrollo. No observamos ninguna correlación entre la
expresión de podoplanina y la invasión linfática.
Histológicamente, las células positivas para podoplanina estaban localizadas en la
región basal de los nidos tumorales, cerca del estroma circundante. Se ha descrito
recientemente que la expresión de podoplanina por los fibroblastos del estroma ejerce un
papel protector contra la invasión celular y es un indicador de buen pronóstico en pacientes
con cáncer colorectal avanzado (Yamanashi y cols., 2009).
DISCUSIÓN
51
En cuanto a la expresión de los factores implicados en linfangiogénesis, VEGFD y
VEGFR3, por parte de las muestras tumorales, cabe destacar la correlación entre los
niveles reducidos de VEGFD y la ausencia de ganglios afectados, de acuerdo con
resultados previamente descritos en carcinoma colorectal (White y cols., 2002), así como el
aumento de los niveles de VEGFR3 en tumores de faringe, más agresivos que los
localizados en la laringe. El número reducido de muestras disponibles para llevar a cabo la
técnica de RT-PCR (debidamente procesadas para mantener la integridad del mARN)
impidió analizar el impacto que pudieran tener estas variables en la supervivencia de los
pacientes.
Respecto a la presencia de vasos linfáticos, observamos una correlación entre una
elevada densidad de vasos peritumorales (DLP), intratumorales (DLI) o considerados
globalmente (DLG), y un fenotipo tumoral más agresivo, incluyendo la localización
faríngea, un mayor tamaño del tumor primario, la presencia de metástasis linfáticas
regionales y, en consecuencia, estadios tumorales más avanzados.
Cabe destacar que cuando se consideraron por separado los tumores faríngeos y
laríngeos, se observó una asociación de la DLI y DLG con un mayor tamaño y estadio
tumorales en tumores de laringe pero no en los faríngeos. Estos resultados, junto con los de
diferentes autores (Maula y cols., 2003; Franchi y cols., 2004; Kyzas y cols., 2005),
sugieren una contribución diferencial de la linfangiogénesis según el origen anatómico del
tumor. Una posible explicación para justificar la mayor importancia del proceso
linfangiogénico en la laringe respecto a la faringe sería que ésta última es una zona tan rica
en linfáticos que prácticamente todos los tumores tienen vasos tanto dentro del tumor como
en la periferia (en nuestra serie, el 96 % tienen linfáticos en alguna de estas localizaciones).
De este modo, dada la abundancia, la densidad linfática deja de ser un factor diferencial en
el pronóstico. En contraste, la laringe, y especialmente la glotis, son zonas pobres en vasos
linfáticos, por lo que la presencia de una mayor densidad de vasos identifica a los tumores
con un pronóstico peor, como lo apoya el hallazgo del valor pronóstico independiente en
supervivencia global para DLG en nuestra serie de tumores laríngeos.
La detección de vasos linfáticos en tumores T1 de glotis es de particular interés, ya
que se trata de una localización anatómica en la que estos vasos son normalmente muy
escasos, lo cual sugeriría que los hallados serían de nueva formación. Por otra parte, la
presencia de linfáticos en tumores T2-4 glóticos no necesariamente implicaría
DISCUSIÓN
52
neoformación, ya que podría tratarse de vasos atrapados por el crecimiento del tumor hacia
zonas con una amplia red linfática, como el espacio paraglótico, la supraglotis o la
subglotis.
Para determinar la existencia de células en proliferación en el endotelio linfático se
realizó una inmunofluorescencia doble con podoplanina y el marcador asociado a
proliferación ki-67 en diez casos representativos de laringe y faringe. Encontramos al
menos una célula endotelial linfática proliferando, tanto en vasos intratumorales como
peritumorales. Estos resultados concuerdan con otros aportados por varios autores (Beasley
y cols., 2002; Kyzas y cols., 2005), confirmando no sólo la presencia de linfangiogénesis
peritumoral, sino también dentro de la masa tumoral, lo cual contribuiría a facilitar la
diseminación linfática del tumor. La correlación entre la DLI y la presencia de adenopatías
en la serie estudiada apoya este concepto. Nuestros datos concuerdan con los de Beasley y
cols, quienes, además, defienden la teoría de que los vasos intratumorales son realmente
vasos neoformados (linfangiogénesis) y no vasos preformados atrapados por el crecimiento
tumoral:
- La arquitectura de los vasos intratumorales recuerda a la de vasos inmaduros en
cuanto a su menor diámetro y sus características estructurales.
- Contienen núcleos en proliferación.
- Se localizan con frecuencia en nidos tumorales, en lugar de en áreas de estroma
atrapados por el crecimiento tumoral.
Las células tumorales aprovecharían los vasos linfáticos como vía de escape.
Prueba de ello sería la detección de émbolos de células tumorales en el lumen de los vasos
linfáticos en 46 de los 104 tumores (43 %), una frecuencia más alta que la hallada en
estudios anteriores (Beasley y cols., 2002; Maula y cols., 2003; Kyzas y cols., 2005). Los
émbolos se encontraban principalmente en los tumores con un curso clínico más
desfavorable: localizados en la faringe, aquellos de gran tamaño y estadio avanzado y en
los pacientes con afectación ganglionar y supervivencia reducida. El hecho de que los
casos con evidencia de invasión linfática presentasen valores medios de densidad linfática
superiores apoyaría la idea de que los vasos linfáticos son ciertamente una vía de escape
para las células tumorales desprendidas del tumor primario. Esta relación fue significativa
en la población de tumores de laringe, en la que una DLG superior se correlacionaba con
una mayor detección de émbolos de células tumorales, dato que contribuye a considerar la
DISCUSIÓN
53
linfangiogénesis como fenómeno diferenciador de los tumores localizados en distintos
sitios anatómicos.
En la serie de tumores laríngeos (donde es menos frecuente la invasión linfática), se
encontró una tendencia hacia una mayor incidencia de metástasis linfáticas en aquellos
casos con émbolos tumorales en los vasos linfáticos. De hecho, la presencia de émbolos
tumorales mostró un valor pronóstico independiente en la supervivencia específica de
enfermedad en este grupo de tumores.
La proliferación de células linfáticas y la presencia de émbolos tumorales pueden
ser sucesos poco frecuentes, difíciles de detectar cuando se examinan en un único punto
espacio-temporal de secciones tisulares. A pesar de esto, el hallazgo de células de
endotelio linfático en proliferación y de émbolos tumorales en los vasos son pruebas de la
presencia de linfangiogénesis activa y del uso de esos linfáticos para la diseminación
tumoral en los CECC, en contraste con otros tumores, como el carcinoma de mama que
metastatiza por vía linfática en ausencia de linfangiogénesis activa (Vleugel y cols., 2004).
Un punto controvertido en la literatura es la contribución respectiva de los linfáticos
intratumorales y peritumorales a la extensión tumoral, partiendo de la duda sobre la
funcionalidad de los primeros. Por una parte, se ha demostrado en modelos animales que
los vasos linfáticos intratumorales están comprimidos por el tumor, y por tanto dejan de ser
funcionales. Esto ha llevado a pensar que los linfáticos peritumorales son suficientes por sí
solos para producir la diseminación linfática (Padera y cols., 2004). Igualmente, Longatto y
cols., en un estudio sobre carcinoma oral, encuentran vasos intratumorales desorganizados,
tortuosos y a menudo colapsados, lo que limitaría su utilidad como vía de metástasis,
comparados con los vasos peritumorales, amplios y funcionantes. Además, observaron que
la densidad de linfáticos peritumorales (pero no los intratumorales) se correlacionaba con
una mayor tasa de recurrencias, lo que corroboraría su papel más importante en la
diseminación tumoral. (Longatto Filho y cols., 2007). Varios estudios más concluyen que
los linfáticos intratumorales son poco funcionales y no necesarios para la producción de
metástasis linfáticas (Padera y cols., 2002; Wong y cols., 2005) y otros autores (Franchi y
cols., 2004) sugieren una asociación significativa entre una alta densidad peritumoral y un
corto periodo libre de enfermedad. Sin embargo, también se ha descrito una asociación
entre DLP alta y un pronóstico favorable (Maula y cols., 2003).
DISCUSIÓN
54
Por otro lado y de forma contradictoria, algunos autores muestran que los linfáticos
intratumorales están implicados en la producción de metástasis ganglionares y que la DLI
es un potente indicador de mal pronóstico (Beasley y cols., 2002; Maula y cols., 2003;
Franchi y cols., 2004; Audet y cols., 2005; Kyzas y cols., 2005).
El uso de criterios subjetivos particulares en cada estudio para definir intratumoral
versus peritumoral podría contribuir a explicar la heterogeneidad de resultados en los
estudios sobre linfangiogénesis. Además, no podemos olvidar la limitación intrínseca de la
observación de una única sección tumoral tomada en un solo punto espacio-temporal, con
la posibilidad de clasificar los vasos de forma errónea (un vaso que en una sección parece
peritumoral, en las contiguas podría presentarse como intratumoral), por lo que el valor de
estos estudios quedaría comprometido.
Desde nuestra experiencia, y teniendo en cuenta las limitaciones descritas, así como
la probable contribución aditiva de los vasos intratumorales y peritumorales a la
diseminación linfática de CECC, nosotros propondríamos que la cuantificación global de
vasos linfáticos (es decir, independientemente de su localización respecto al tumor), sería
más reproducible y podría ser un marcador pronóstico más fiable, especialmente en el
grupo de carcinomas laríngeos. De hecho, DLG presentaba un valor pronóstico
independiente de supervivencia global reducida en los tumores de laringe.
Aunque la presencia de metástasis ganglionares es el principal factor pronóstico
utilizado en la práctica clínica, nuestros resultados aportan variables que podrían refinar
dicho valor, algo necesario ya que, en ocasiones, se presentan casos libres de afectación
ganglionar con un curso clínico desfavorable inesperado. Al estudiar los tumores de
pacientes con ganglios libres de tumor (clasificados como pN0), se encontraron diferencias
significativas en la supervivencia para los casos con densidades linfáticas elevadas (DLP y
DLG). Esta observación fue realizada en el grupo completo de CECC y en los tumores
laríngeos, pero no en el subgrupo faríngeo. Basándonos en nuestra propuesta de la variable
DLG como más fiable que DLI o DLP, proponemos que la determinación de DLG en los
carcinomas primarios de laringe de casos clasificados como pN0 podría contribuir a
mejorar el control locorregional, mediante seguimientos más frecuentes o tratamientos más
intensos, lo cual mejoraría las expectativas de estos pacientes.
Nuestro estudio aporta nuevas variables relacionadas con el fenómeno de la
linfangiogénesis cuya potencial utilidad en la práctica clínica deberá ser contrastada en
DISCUSIÓN
55
futuros análisis de series de CECC independientes. La presentación de los resultados de
nuestro trabajo de forma completa y transparente, siguiendo las guías recomendadas en
REMARK (REporting recommendations for tumor MARKer prognostic studies) permitirá
la valoración crítica de nuestros resultados y su comparación con los de futuros estudios,
encaminados a confirmar nuestras conclusiones.
CONCLUSIONES
56
6 CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
57
1 El fenómeno de la linfangiogénesis está presente en los carcinomas epidermoides de
cabeza y cuello.
2 La linfangiogénesis contribuye de forma diferencial a la progresión tumoral según la
localización anatómica del mismo, con una contribución significativa en la laringe.
3 La determinación de la densidad linfática global y la identificación de émbolos
tumorales, mediante el uso del anticuerpo D2-40 en tumores primarios podrían tener
valor como factores de pronóstico independiente en carcinomas de laringe.
4 La determinación de la densidad linfática global en los tumores de pacientes con
ganglios libres de tumor (pN0) podría contribuir a identificar aquellos con peor
supervivencia, que podrían beneficiarse de un seguimiento más frecuente o de
tratamientos adicionales.
5 La expresión de podoplanina en carcinoma epidermoide de laringe disminuye durante
la progresión tumoral y no se correlaciona con el potencial invasivo.
BIBLIOGRAFÍA
58
7 BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFÍA
59
Achen, M. G., B. K. McColl and S. A. Stacker (2005). "Focus on lymphangiogenesis in
tumor metastasis." Cancer Cell 7(2): 121-7.
Alitalo, K., T. Tammela and T. V. Petrova (2005). "Lymphangiogenesis in development
and human disease." Nature 438(7070): 946-53.
Atsumi, N., G. Ishii, et al. (2008). "Podoplanin, a novel marker of tumor-initiating cells in
human squamous cell carcinoma A431." Biochem Biophys Res Commun 373(1): 36-41.
Audet, N., N. J. Beasley, et al. (2005). "Lymphatic vessel density, nodal metastases, and
prognosis in patients with head and neck cancer." Arch Otolaryngol Head Neck Surg
131(12): 1065-70.
Baluk, P., J. Fuxe, et al. (2007). "Functionally specialized junctions between endothelial
cells of lymphatic vessels." J Exp Med 204(10): 2349-62.
Banerji, S., J. Ni, et al. (1999). "LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a
lymph-specific receptor for hyaluronan." J Cell Biol 144(4): 789-801.
Bazigou, E., S. Xie, et al. (2009). "Integrin-alpha9 is required for fibronectin matrix
assembly during lymphatic valve morphogenesis." Dev Cell 17(2): 175-86.
Beasley, N. J., R. Prevo, et al. (2002). "Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node
metastasis in head and neck cancer." Cancer Res 62(5): 1315-20.
Braakhuis, B. J., M. P. Tabor, J. A. Kummer, C. R. Leemans and R. H. Brakenhoff (2003).
"A genetic explanation of Slaughter's concept of field cancerization: evidence and clinical
implications." Cancer Res 63(8): 1727-30.
Breiteneder-Geleff, S., A. Soleiman, et al. (1999). "Angiosarcomas express mixed
endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker
for lymphatic endothelium." Am J Pathol 154(2): 385-94.
Califano, J., P. van der Riet, et al. (1996). "Genetic progression model for head and neck
cancer: implications for field cancerization." Cancer Res 56(11): 2488-92.
BIBLIOGRAFÍA
60
Clarijs, R., D. J. Ruiter and R. M. de Waal (2001). "Lymphangiogenesis in malignant
tumours: Does it occur?" J Pathol 193(2): 143-6.
Cueni, L. N. and M. Detmar (2008). "The lymphatic system in health and disease."
Lymphat Res Biol 6(3-4): 109-22.
Chen, Z., M. L. Varney, et al. (2005). "Down-regulation of vascular endothelial cell
growth factor-C expression using small interfering RNA vectors in mammary tumors
inhibits tumor lymphangiogenesis and spontaneous metastasis and enhances survival."
Cancer Res 65(19): 9004-11.
Dagenais, S. L., R. L. Hartsough, et al. (2004). "Foxc2 is expressed in developing
lymphatic vessels and other tissues associated with lymphedema-distichiasis syndrome."
Gene Expr Patterns 4(6): 611-9.
Danussi, C., P. Spessotto, et al. (2008). "Emilin1 deficiency causes structural and
functional defects of lymphatic vasculature." Mol Cell Biol 28(12): 4026-39.
Davis, S. and G. D. Yancopoulos (1999). "The angiopoietins: Yin and Yang in
angiogenesis." Curr Top Microbiol Immunol 237: 173-85.
Dumoff, K. L., C. Chu, et al. (2005). "Low D2-40 immunoreactivity correlates with
lymphatic invasion and nodal metastasis in early-stage squamous cell carcinoma of the
uterine cervix." Mod Pathol 18(1): 97-104.
Dvorak, H. F. (2005). "Angiogenesis: update 2005." J Thromb Haemost 3(8): 1835-42.
Evangelou, E., P. A. Kyzas and T. A. Trikalinos (2005). "Comparison of the diagnostic
accuracy of lymphatic endothelium markers: Bayesian approach." Mod Pathol 18(11):
1490-7.
Ferrara, N. (2002). "VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors." Nat Rev Cancer
2(10): 795-803.
Ferrara, N., H. P. Gerber and J. LeCouter (2003). "The biology of VEGF and its
receptors." Nat Med 9(6): 669-76.
BIBLIOGRAFÍA
61
Folkman, J. (1995). "Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease." Nat
Med 1(1): 27-31.
Franchi, A., O. Gallo, D. Massi, G. Baroni and M. Santucci (2004). "Tumor
lymphangiogenesis in head and neck squamous cell carcinoma: a morphometric study with
clinical correlations." Cancer 101(5): 973-8.
He, Y., T. Karpanen and K. Alitalo (2004). "Role of lymphangiogenic factors in tumor
metastasis." Biochim Biophys Acta 1654(1): 3-12.
He, Y., K. Kozaki, et al. (2002). "Suppression of tumor lymphangiogenesis and lymph
node metastasis by blocking vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling." J
Natl Cancer Inst 94(11): 819-25.
He, Y., I. Rajantie, et al. (2004). "Preexisting lymphatic endothelium but not endothelial
progenitor cells are essential for tumor lymphangiogenesis and lymphatic metastasis."
Cancer Res 64(11): 3737-40.
He, Y., I. Rajantie, et al. (2005). "Vascular endothelial cell growth factor receptor 3-
mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumor cell entry and spread via
lymphatic vessels." Cancer Res 65(11): 4739-46.
Hensen, E. F., M. J. De Herdt, et al. (2008). "Gene-expression of metastasized versus non-
metastasized primary head and neck squamous cell carcinomas: a pathway-based analysis."
BMC Cancer 8: 168.
Jackson, D. G., R. Prevo, S. Clasper and S. Banerji (2001). "LYVE-1, the lymphatic
system and tumor lymphangiogenesis." Trends Immunol 22(6): 317-21.
Jeltsch, M., T. Tammela, K. Alitalo and J. Wilting (2003). "Genesis and pathogenesis of
lymphatic vessels." Cell Tissue Res 314(1): 69-84.
Johnston, M., A. Zakharov, C. Papaiconomou, G. Salmasi and D. Armstrong (2004).
"Evidence of connections between cerebrospinal fluid and nasal lymphatic vessels in
humans, non-human primates and other mammalian species." Cerebrospinal Fluid Res
1(1): 2.
BIBLIOGRAFÍA
62
Joyce, J. A. and J. W. Pollard (2009). "Microenvironmental regulation of metastasis." Nat
Rev Cancer 9(4): 239-52.
Jurisic, G. and M. Detmar (2009). "Lymphatic endothelium in health and disease." Cell
Tissue Res 335(1): 97-108.
Kahn, H. J. and A. Marks (2002). "A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of
lymphatic invasion in primary tumors." Lab Invest 82(9): 1255-7.
Karpanen, T. and K. Alitalo (2008). "Molecular biology and pathology of
lymphangiogenesis." Annu Rev Pathol 3: 367-97.
Karpanen, T., M. Egeblad, et al. (2001). "Vascular endothelial growth factor C promotes
tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth." Cancer Res 61(5): 1786-90.
Kato, S., I. Itonaga, R. C. Ji and M. Miura (1996). "Enzyme triple staining for
differentiation of lymphatics from venous and arterial capillaries." Lymphology 29(1): 15-
9.
Kato, Y., M. Kaneko, et al. (2005). "Enhanced expression of Aggrus
(T1alpha/podoplanin), a platelet-aggregation-inducing factor in lung squamous cell
carcinoma." Tumour Biol 26(4): 195-200.
Keck, P. J., S. D. Hauser, et al. (1989). "Vascular permeability factor, an endothelial cell
mitogen related to PDGF." Science 246(4935): 1309-12.
Kerjaschki, D., N. Huttary, et al. (2006). "Lymphatic endothelial progenitor cells
contribute to de novo lymphangiogenesis in human renal transplants." Nat Med 12(2): 230-
4.
Kerjaschki, D., H. M. Regele, et al. (2004). "Lymphatic neoangiogenesis in human kidney
transplants is associated with immunologically active lymphocytic infiltrates." J Am Soc
Nephrol 15(3): 603-12.
Kimura, N. and I. Kimura (2005). "Podoplanin as a marker for mesothelioma." Pathol Int
55(2): 83-6.
BIBLIOGRAFÍA
63
Kleihues, P. and B. W. Stewart. (2003). "World cancer report." from
http://www.myilibrary.com?id=71450
Knudson, A. G., Jr. (1971). "Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma." Proc
Natl Acad Sci U S A 68(4): 820-3.
Kreppel, M., M. Scheer, U. Drebber, L. Ritter and J. E. Zoller (2010). "Impact of
podoplanin expression in oral squamous cell carcinoma: clinical and histopathologic
correlations." Virchows Arch 456(5): 473-82.
Kubota, Y., K. Takubo, et al. (2009). "M-CSF inhibition selectively targets pathological
angiogenesis and lymphangiogenesis." J Exp Med 206(5): 1089-102.
Kuchler, A. M., E. Gjini, et al. (2006). "Development of the zebrafish lymphatic system
requires VEGFC signaling." Curr Biol 16(12): 1244-8.
Kyzas, P. A., S. Geleff, A. Batistatou, N. J. Agnantis and D. Stefanou (2005). "Evidence
for lymphangiogenesis and its prognostic implications in head and neck squamous cell
carcinoma." J Pathol 206(2): 170-7.
Laakkonen, P., M. Waltari, et al. (2007). "Vascular endothelial growth factor receptor 3 is
involved in tumor angiogenesis and growth." Cancer Res 67(2): 593-9.
Leu, A. J., D. A. Berk, A. Lymboussaki, K. Alitalo and R. K. Jain (2000). "Absence of
functional lymphatics within a murine sarcoma: a molecular and functional evaluation."
Cancer Res 60(16): 4324-7.
Leung, D. W., G. Cachianes, W. J. Kuang, D. V. Goeddel and N. Ferrara (1989). "Vascular
endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen." Science 246(4935): 1306-9.
Longatto Filho, A., T. G. Oliveira, et al. (2007). "How useful is the assessment of
lymphatic vascular density in oral carcinoma prognosis?" World J Surg Oncol 5: 140.
Maby-El Hajjami, H. and T. V. Petrova (2008). "Developmental and pathological
lymphangiogenesis: from models to human disease." Histochem Cell Biol 130(6): 1063-
78.
BIBLIOGRAFÍA
64
Makinen, T., R. H. Adams, et al. (2005). "PDZ interaction site in ephrinB2 is required for
the remodeling of lymphatic vasculature." Genes Dev 19(3): 397-410.
Mandriota, S. J., L. Jussila, et al. (2001). "Vascular endothelial growth factor-C-mediated
lymphangiogenesis promotes tumour metastasis." Embo J 20(4): 672-82.
Martin-Villar, E., F. G. Scholl, et al. (2005). "Characterization of human PA2.26 antigen
(T1alpha-2, podoplanin), a small membrane mucin induced in oral squamous cell
carcinomas." Int J Cancer 113(6): 899-910.
Maruyama, K., M. Ii, et al. (2005). "Inflammation-induced lymphangiogenesis in the
cornea arises from CD11b-positive macrophages." J Clin Invest 115(9): 2363-72.
Mattila, M. M., J. K. Ruohola, et al. (2002). "VEGF-C induced lymphangiogenesis is
associated with lymph node metastasis in orthotopic MCF-7 tumors." Int J Cancer 98(6):
946-51.
Maula, S. M., M. Luukkaa, et al. (2003). "Intratumoral lymphatics are essential for the
metastatic spread and prognosis in squamous cell carcinomas of the head and neck region."
Cancer Res 63(8): 1920-6.
McShane, L. M., D. G. Altman, et al. (2005). "Reporting recommendations for tumor
marker prognostic studies (REMARK)." J Natl Cancer Inst 97(16): 1180-4.
Mebius, R. E. (2003). "Organogenesis of lymphoid tissues." Nat Rev Immunol 3(4): 292-
303.
Mouta Carreira, C., S. M. Nasser, et al. (2001). "LYVE-1 is not restricted to the lymph
vessels: expression in normal liver blood sinusoids and down-regulation in human liver
cancer and cirrhosis." Cancer Res 61(22): 8079-84.
Mustonen, T. and K. Alitalo (1995). "Endothelial receptor tyrosine kinases involved in
angiogenesis." J Cell Biol 129(4): 895-8.
Norrmen, C., K. I. Ivanov, et al. (2009). "FOXC2 controls formation and maturation of
lymphatic collecting vessels through cooperation with NFATc1." J Cell Biol 185(3): 439-
57.
BIBLIOGRAFÍA
65
Ny, A., M. Koch, et al. (2005). "A genetic Xenopus laevis tadpole model to study
lymphangiogenesis." Nat Med 11(9): 998-1004.
Oliver, G. (2004). "Lymphatic vasculature development." Nat Rev Immunol 4(1): 35-45.
Ordonez, N. G. (2006). "Podoplanin: a novel diagnostic immunohistochemical marker."
Adv Anat Pathol 13(2): 83-8.
Otsuki, Y., S. Magari and O. Sugimoto (1986). "Lymphatic capillaries in rabbit ovaries
during ovulation: an ultrastructural study." Lymphology 19(2): 55-64.
Padera, T. P., A. Kadambi, et al. (2002). "Lymphatic metastasis in the absence of
functional intratumor lymphatics." Science 296(5574): 1883-6.
Padera, T. P., B. R. Stoll, et al. (2004). "Pathology: cancer cells compress intratumour
vessels." Nature 427(6976): 695.
Parkin, D. M., F. Bray, J. Ferlay and P. Pisani (2001). "Estimating the world cancer
burden: Globocan 2000." Int J Cancer 94(2): 153-6.
Partanen, T. A., K. Alitalo and M. Miettinen (1999). "Lack of lymphatic vascular
specificity of vascular endothelial growth factor receptor 3 in 185 vascular tumors." Cancer
86(11): 2406-12.
Pepper, M. S. (2001). "Lymphangiogenesis and tumor metastasis: myth or reality?" Clin
Cancer Res 7(3): 462-8.
Pepper, M. S., J. C. Tille, R. Nisato and M. Skobe (2003). "Lymphangiogenesis and tumor
metastasis." Cell Tissue Res 314(1): 167-77.
Petrova, T. V., T. Karpanen, et al. (2004). "Defective valves and abnormal mural cell
recruitment underlie lymphatic vascular failure in lymphedema distichiasis." Nat Med
10(9): 974-81.
Rahadiani, N., J. Ikeda, et al. (2010). "Tumorigenic role of podoplanin in esophageal
squamous-cell carcinoma." Ann Surg Oncol 17(5): 1311-23.
BIBLIOGRAFÍA
66
Risau, W. (1997). "Mechanisms of angiogenesis." Nature 386(6626): 671-4.
Roberts, N., B. Kloos, et al. (2006). "Inhibition of VEGFR-3 activation with the
antagonistic antibody more potently suppresses lymph node and distant metastases than
inactivation of VEGFR-2." Cancer Res 66(5): 2650-7.
Sabattini, E., K. Bisgaard, et al. (1998). "The EnVision++ system: a new
immunohistochemical method for diagnostics and research. Critical comparison with the
APAAP, ChemMate, CSA, LABC, and SABC techniques." J Clin Pathol 51(7): 506-11.
Schacht, V., S. S. Dadras, et al. (2005). "Up-regulation of the lymphatic marker
podoplanin, a mucin-type transmembrane glycoprotein, in human squamous cell
carcinomas and germ cell tumors." Am J Pathol 166(3): 913-21.
Schacht, V., M. I. Ramirez, et al. (2003). "T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal
lymphatic vasculature formation and causes lymphedema." Embo J 22(14): 3546-56.
Scholl, F. G., C. Gamallo, S. Vilaro and M. Quintanilla (1999). "Identification of PA2.26
antigen as a novel cell-surface mucin-type glycoprotein that induces plasma membrane
extensions and increased motility in keratinocytes." J Cell Sci 112 ( Pt 24): 4601-13.
Senger, D. R., S. J. Galli, et al. (1983). "Tumor cells secrete a vascular permeability factor
that promotes accumulation of ascites fluid." Science 219(4587): 983-5.
Shibahara, J., T. Kashima, Y. Kikuchi, A. Kunita and M. Fukayama (2006). "Podoplanin is
expressed in subsets of tumors of the central nervous system." Virchows Arch 448(4): 493-
9.
Shibuya, M. (2001). "Structure and function of VEGF/VEGF-receptor system involved in
angiogenesis." Cell Struct Funct 26(1): 25-35.
Shimada, Y., G. Ishii, et al. (2009). "Expression of podoplanin, CD44, and p63 in
squamous cell carcinoma of the lung." Cancer Sci 100(11): 2054-9.
Shimizu, K., H. Kubo, et al. (2004). "Suppression of VEGFR-3 signaling inhibits lymph
node metastasis in gastric cancer." Cancer Sci 95(4): 328-33.
BIBLIOGRAFÍA
67
Skobe, M., T. Hawighorst, et al. (2001). "Induction of tumor lymphangiogenesis by
VEGF-C promotes breast cancer metastasis." Nat Med 7(2): 192-8.
Slaughter, D. P., H. W. Southwick and W. Smejkal (1953). "Field cancerization in oral
stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin." Cancer 6(5):
963-8.
Sleeman, J. P. and W. Thiele (2009). "Tumor metastasis and the lymphatic vasculature."
Int J Cancer 125(12): 2747-56.
Sobin, L. H., Wittekind, C, Ed. (2002). TNM classification of malignant tumors. New
York, Wiley-Liss.
Soker, S., S. Takashima, H. Q. Miao, G. Neufeld and M. Klagsbrun (1998). "Neuropilin-1
is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular
endothelial growth factor." Cell 92(6): 735-45.
Sonne, S. B., A. S. Herlihy, et al. (2006). "Identity of M2A (D2-40) antigen and gp36
(Aggrus, T1A-2, podoplanin) in human developing testis, testicular carcinoma in situ and
germ-cell tumours." Virchows Arch 449(2): 200-6.
St John, M. A., M. Dohadwala, et al. (2009). "Proinflammatory mediators upregulate snail
in head and neck squamous cell carcinoma." Clin Cancer Res 15(19): 6018-27.
Stacker, S. A., M. G. Achen, L. Jussila, M. E. Baldwin and K. Alitalo (2002).
"Lymphangiogenesis and cancer metastasis." Nat Rev Cancer 2(8): 573-83.
Stacker, S. A., C. Caesar, et al. (2001). "VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor
cells via the lymphatics." Nat Med 7(2): 186-91.
Suzuki-Inoue, K., G. L. Fuller, et al. (2006). "A novel Syk-dependent mechanism of
platelet activation by the C-type lectin receptor CLEC-2." Blood 107(2): 542-9.
Suzuki-Inoue, K., Y. Kato, et al. (2007). "Involvement of the snake toxin receptor CLEC-
2, in podoplanin-mediated platelet activation, by cancer cells." J Biol Chem 282(36):
25993-6001.
BIBLIOGRAFÍA
68
Tammela, T., B. Enholm, K. Alitalo and K. Paavonen (2005). "The biology of vascular
endothelial growth factors." Cardiovasc Res 65(3): 550-63.
Tammela, T., A. Saaristo, et al. (2007). "Therapeutic differentiation and maturation of
lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation." Nat Med 13(12): 1458-
66.
Valtola, R., P. Salven, et al. (1999). "VEGFR-3 and its ligand VEGF-C are associated with
angiogenesis in breast cancer." Am J Pathol 154(5): 1381-90.
Veikkola, T., M. Karkkainen, L. Claesson-Welsh and K. Alitalo (2000). "Regulation of
angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors." Cancer Res 60(2): 203-12.
Vleugel, M. M., R. Bos, et al. (2004). "Lack of lymphangiogenesis during breast
carcinogenesis." J Clin Pathol 57(7): 746-51.
Vyberg, M., Nielsen, S. (1998). "Dextran polymer conjugate two-step visualization system
for immunohistochemistry. A comparison of EnVision with two three step avidin-biotin
techniques." Appl Immunohistochem 6: 3-10.
White, J. D., P. W. Hewett, et al. (2002). "Vascular endothelial growth factor-D expression
is an independent prognostic marker for survival in colorectal carcinoma." Cancer Res
62(6): 1669-75.
Wick, N., P. Saharinen, et al. (2007). "Transcriptomal comparison of human dermal
lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro." Physiol Genomics 28(2): 179-92.
Wicki, A. and G. Christofori (2007). "The potential role of podoplanin in tumour
invasion." Br J Cancer 96(1): 1-5.
Wicki, A., F. Lehembre, et al. (2006). "Tumor invasion in the absence of epithelial-
mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton."
Cancer Cell 9(4): 261-72.
BIBLIOGRAFÍA
69
Wiedorn, K. H., T. Goldmann, C. Henne, H. Kuhl and E. Vollmer (2001). "EnVision+, a
new dextran polymer-based signal enhancement technique for in situ hybridization (ISH)."
J Histochem Cytochem 49(9): 1067-71.
Wigle, J. T., N. Harvey, et al. (2002). "An essential role for Prox1 in the induction of the
lymphatic endothelial cell phenotype." Embo J 21(7): 1505-13.
Wigle, J. T. and G. Oliver (1999). "Prox1 function is required for the development of the
murine lymphatic system." Cell 98(6): 769-78.
Wilting, J., Y. Aref, et al. (2006). "Dual origin of avian lymphatics." Dev Biol 292(1): 165-
73.
Williams, C. S., R. D. Leek, et al. (2003). "Absence of lymphangiogenesis and
intratumoural lymph vessels in human metastatic breast cancer." J Pathol 200(2): 195-206.
Wong, S. Y., H. Haack, et al. (2005). "Tumor-secreted vascular endothelial growth factor-
C is necessary for prostate cancer lymphangiogenesis, but lymphangiogenesis is
unnecessary for lymph node metastasis." Cancer Res 65(21): 9789-98.
Yamanashi, T., Y. Nakanishi, et al. (2009). "Podoplanin expression identified in stromal
fibroblasts as a favorable prognostic marker in patients with colorectal carcinoma."
Oncology 77(1): 53-62.
Yanai, Y., T. Furuhata, et al. (2001). "Vascular endothelial growth factor C promotes
human gastric carcinoma lymph node metastasis in mice." J Exp Clin Cancer Res 20(3):
419-28.
Yaniv, K., S. Isogai, et al. (2006). "Live imaging of lymphatic development in the
zebrafish." Nat Med 12(6): 711-6.
Yuan, P., S. Temam, et al. (2006). "Overexpression of podoplanin in oral cancer and its
association with poor clinical outcome." Cancer 107(3): 563-9.
Zumsteg, A., V. Baeriswyl, et al. (2009). "Myeloid cells contribute to tumor
lymphangiogenesis." PLoS One 4(9): e7067.
BIBLIOGRAFÍA
70