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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
EVALUACIÓN FARMACOGNÓSTICA Y ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE Corynaea crassa
Hook f. DE DOS LUGARES DE PROCEDENCIA.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO
REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE
QUÍMICA Y FARMACÉUTICA
AUTOR:
Génesis Alexandra Sempértegui Morocho
TUTORA:
Q.F. Alexandra López Barrera M.Sc.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2019
A mi padre, Jorge Antonio Sempértegui Parrales (QEPD) a quién le
prometí que culminaría mi carrera, sé que anhelabas tanto este
momento y hubiera sido tan especial para ti.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primer lugar al creador por haberme permitido llegar a
este momento de mi vida, por darme esa fortaleza y sabiduría para
seguir adelante.
A mi madre Zoila Morocho Moreira, que siempre estuvo conmigo,
brindándome su apoyo en cada etapa de mi vida, gracias por todo lo
que has hecho para que yo cumpla mis sueños y que, a pesar de mis
errores, he contado siempre con tu apoyo incondicional, tus palabras
de aliento, tus consejos y tu amor.
Agradezco infinitamente a mis tíos, el Lcdo. Bolívar Avendaño
Delgado (QEPD) y la Lcda. Gloria Iturralde Parrales, por bendecir y
encaminar mi vida, por tocar mi corazón con cada una de sus
palabras, queriendo siempre lo mejor para mí.
Agradezco a mi mejor amiga Doménica Bravo por compartir conmigo
tantos años de amistad, por su paciencia y su comprensión.
Agradezco a mi buen amigo Qf. Jairo Jaime por la colaboración y la
enseñanza brindada en este proceso.
Agradezco a mi Chris por la paciencia, su apoyo incondicional y
brindarme su amor durante estos once meses.
Agradezco a mi tutora Q.F. Alexandra López Barrera M.Sc. por
compartir sus conocimientos, consejos, paciencia y compromiso, por
confiar en mí, brindándome su apoyo y supervisión del presente
trabajo. A la Dra. Migdalia Miranda PhD. por su guía en el desarrollo
de la investigación.
ÍNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN..................................................................................................I
ABSTRACT ............................................................................................... II
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
CAPITULO I: PROBLEMA ........................................................................ 3
I.1.- PLANTEAMIENTO Y FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................. 3
I.2.- JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA ............................................................ 5
I.3.- HIPÓTESIS ......................................................................................... 5
I.4.- OBJETIVOS ........................................................................................ 7
I.4.1.- Objetivo general ........................................................................ 7
I.4.2.- Objetivos específicos ................................................................ 7
CAPITULO II: MARCO TEÓRICO ............................................................. 8
II.1.- ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ................................................ 8
II.2.- CORYNAEA CRASSA ........................................................................... 8
II.3. METABOLITOS SECUNDARIOS............................................................... 9
II.3.1. Funciones .................................................................................. 9
II.4. RADICALES LIBRES ........................................................................... 10
II.5. ESTRÉS OXIDATIVO ........................................................................... 10
II.6. ANTIOXIDANTES ............................................................................... 11
II.6.1. Clasificación de los antioxidantes ............................................ 11
II.6.2. Antioxidantes naturales ........................................................... 11
II.6.3. Antioxidantes sintéticos ........................................................... 12
II.6.4. Antioxidantes fenólicos ............................................................ 12
II.6.5. Flavonoides ............................................................................. 13
II.7.- MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE SUSTANCIAS NATURALES ...................... 14
II.7.1.- Maceración ............................................................................ 14
II.7.2.- Percolación ............................................................................ 14
II.7.3. Decocción ............................................................................... 14
II.8.- FARMACOGNOSIA ............................................................................ 15
II.9.- PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS ......................................................... 15
II.10. ESTUDIO FITOQUÍMICO .................................................................... 15
II.10.1.- Tamizaje fitoquímico ............................................................ 16
II.11.-CROMATOGRAFÍA ........................................................................... 16
II.11.1.-Cromatografía de capa fina ................................................... 17
II.12.-ESPECTROSCOPIA ......................................................................... 17
II.12.1.- Espectroscopia ultravioleta ................................................... 17
II.12.2.-Espectroscopia infrarroja ....................................................... 18
II.13. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .............................................................. 19
II.13.1. Determinación directa ............................................................ 19
II.13.2. Determinación indirecta ......................................................... 21
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS ........................................... 23
III.1. MATERIAL VEGETAL ......................................................................... 23
III.2. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS .............. 23
III.2.1. Obtención de extractos por percolación.................................. 23
III.2.2. Obtención de extractos por maceración ................................. 24
III.2.3. Obtención de extractos acuosos ............................................ 24
III.3. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE CALIDAD DE LOS EXTRACTOS ......... 25
III.4. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS EXTRACTOS ................. 27
III.4.1. Tamizaje fitoquímico............................................................... 27
III.5. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA ................................................. 28
III.6. ANÁLISIS POR ESPECTROSCOPIA UV - VISIBLE ................................. 29
III.7. ANÁLISIS POR ESPECTROSCOPIA INFRARROJA .................................... 29
III.8. CUANTIFICACIÓN DE FENOLES Y FLAVONOIDES ................................... 29
III.8.1. Fenoles totales ....................................................................... 29
III.8.2. Flavonoides totales................................................................. 30
III.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ..................................................................... 31
III.10. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE............................................................... 31
III.10.1. Ensayo FRAP ....................................................................... 31
III.10.2. Ensayo DPPH ...................................................................... 33
III.10.3. Ensayo ABTS●+ ................................................................... 34
III.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................... 35
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................... 37
IV.1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS ............. 37
IV.2. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE CALIDAD DE LOS EXTRACTOS ......... 37
IV.3. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS EXTRACTOS ................ 41
IV.3.1. Tamizaje fitoquímico .............................................................. 41
IV.3.2. Cromatografía en capa delgada ............................................. 43
IV.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS ESPECTROSCÓPICOS ..................................... 46
IV. 4.1. Espectroscopia ultravioleta visible (uv-visible)....................... 46
IV.4.2. Espectroscopia infrarroja (IR) ................................................. 48
IV.5. DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMÉTRICAS ................................... 50
IV.5.1. Contenido de fenoles totales .................................................. 51
IV.5.2. Flavonoides totales ................................................................ 53
IV.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ................................................................ 54
IV.4.1. Actividad antioxidante por el método de FRAP ...................... 55
IV.4.2. Actividad antioxidante por el método de DPPH ...................... 59
IV.4.3. Actividad antioxidante por el método de ABTS....................... 61
CONCLUSIONES .................................................................................... 65
RECOMENDACIONES............................................................................ 66
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA .......................................................... 67
ANEXOS ................................................................................................. 77
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I Parámetros físico-químicos de los extractos hidroalcohólicos y
acuosos de C. crassa ecuatoriana y peruana .......................................... 37
Tabla II Tamizaje fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos de C.
crassa ...................................................................................................... 42
Tabla III Tamizaje fitoquímico de los extractos acuosos de C. crassa ..... 42
Tabla IV Contenido de fenoles totales en los extractos de C. crassa ...... 52
Tabla V Contenido de flavonoides totales en los extractos de C. crassa . 54
Tabla VI Actividad ferro-reductora de los extractos de C. crassa
expresada en μM equivalentes de ácido ascórbico. ................................. 56
Tabla VII Actividad ferro-reductora de los extractos de C. crassa
expresada en μM equivalentes de FeSO4 ............................................... 57
Tabla VIII Capacidad secuestradora del radical DPPH de los extractos de
C. crassa ................................................................................................. 60
Tabla IX Capacidad secuestradora del radical ABTS●+ de los extractos
de C. crassa ............................................................................................ 62
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Reacciones de tamizaje fitoquímico realizadas a los extractos
hidroalcohólicos y acuosos de C. crasa ................................................... 28
Figura 2 Análisis capilar de los extractos hidroalcohólicos de C. crassa . 40
Figura 3 Análisis capilar de los extractos Acuosos de C. crassa ............. 41
Figura 4 Cromatografía en capa delgada de los extractos hidroalcohólicos
de C. crassa ............................................................................................ 44
Figura 5 Cromatografía en capa delgada de los extractos acuosos de C.
crassa ...................................................................................................... 45
Figura 6 Espectros UV-Visibles de los extractos hidroalcohólicos de C.
crassa obtenidos por maceración ............................................................ 47
Figura 7 Espectros UV-Visibles de los extractos hidroalcohólicos de C.
crassa obtenidos por percolación ............................................................ 47
Figura 8 Espectros UV-Visibles de los extractos acuosos de C. crassa .. 48
Figura 9 Espectros infrarrojos de los extractos hidroalcohólicos de C.
crassa por maceración ............................................................................ 48
Figura 10 Espectros infrarrojos de los extractos hidroalcohólicos de C.
crassa por percolación ............................................................................. 49
Figura 11 Espectros infrarrojos de los extractos acuosos de C. crassa
ecuatoriana .............................................................................................. 50
Figura 12 Espectros infrarrojos de los extractos acuosos de C. crassa
peruana ................................................................................................... 50
Figura 13 Curva de calibración del ácido gálico para la determinación de
fenoles totales ......................................................................................... 52
Figura 14 Curva de calibración de la quercetina para la determinación de
flavonoides totales ................................................................................... 53
Figura 15 Curvas de calibración del ácido ascórbico y el FeSO4 para la
determinación de la capacidad antioxidante por FRAP ............................ 56
Figura 16 Actividad antioxidante por FRAP de los extractos de C. crassa
expresada como μM equivalentes de ácido ascórbico ............................. 57
Figura 17 Actividad antioxidante por FRAP de los extractos de C. crassa
expresada como μM equivalentes de FeSO4 .......................................... 58
Figura 18 Comportamiento de la capacidad secuestradora del radical
DPPH de los extractos de C. crassa y las sustancias de referencias ....... 60
Figura 19 Comportamiento de la capacidad secuestradora del radical
ABTS de los extractos de C. crassa y las sustancias de referencia ......... 62
INDICE DE ANEXOS
Anexo A Corynaea crassa ..................................................................................... 75
Anexo B Métodos de extracción continuos y discontinuos ..................................... 75
Anexo C Actividad antioxidante por método espectrofotométrico ........................... 76
Anexo D Recolección de Corynaea crassa Hook f. ................................................ 77
Anexo E Informe de resultados (cromatografía capa fina y
espectroscopia Uv-Vis de extractos acuosos) .......................................................... 77
Anexo F Informe de resultados (espectroscopia infrarroja extractos
acuosos) .................................................................................................................. 78
Anexo G Informe de resultados (cuantificacion de fenoles y flavonoides,
extractos acuosos)................................................................................................... 78
Anexo H Estructura química del Trolox y la Vitamina C (sustancias de
referencia) ............................................................................................................... 79
I
RESUMEN
Los extractos hidroalcohólicos de las especies Corynaea
crassa Hook f de Ecuador y Perú fueron por percolación y
maceración. Además, se obtuvieron extractos acuosos mediante el
método de decocción. Se determinaron los parámetros de calidad de
la preparación, así como el perfil químico. Por tamizaje fitoquímico,
cromatografía de capa fina, el análisis espectrofotométrico, en el
espectro UV, el rango visible y el IR indicaron una diversidad de
componentes químicos, destacando compuestos fenólicos,
triterpenoides y esteroides. La actividad antioxidante de los extractos
también se determinó mediante los métodos FRAP, DPPH y ABTS,
utilizando vitamina C y Trolox como sustancias de referencia. Las
muestras presentaron una alta actividad antioxidante en los tres
métodos con resultados similares o superiores a las sustancias de
referencia con diferencias significativas entre las muestras de los dos
lugares de cosecha.
Palabras claves: Corynaea crassa, composición química, actividad
antioxidante, FRAP, DPPH, ABTS.
II
ABSTRACT
Hydroalcoholic extracts of the especies Corynaea crassa Hook f from
Ecuador and Peru were prepared by percolation and maceration. In addition,
aqueous extracts were obtained through the decoction method. The quality
parameters of the preparation were determined, as well as the chemical profile.
Phytochemical screening, this layer chromatography, spectrophotometric
analysis in the UV, visible range and IR indicated a diversity of chemical
constituents, highlighting phenolic compounds, triterpenoids and steroids. The
antioxidant activity of the extracts was also determined by the FRAP, DPPH and
ABTS methods, using vitamin C and Trolox as reference substances. The
samples presented a high antioxidant activity in the three methods with similar or
superior results to the reference substances with significant differences between
the samples of the two harvest places.
Keyword: Corynaea crassa, chemical composition, antioxidant activity,
ABTS, DPPH, FRAP.
1
INTRODUCCIÓN
La especie Corynaea crassa Hook f. es una planta
hemiparásita, registrada en una variedad de plantas hospedantes,
incluyendo a Eupatorium angulare B.L. Rob. (Asteraceae) y sobre
brotes de bambú (Tropicos, 2012).
Es originaria de América, extendiéndose desde Costa Rica
hasta Bolivia, encontrándose en zonas neotrópicas a una altitud de
1250 a 3600 metros. Perú es un país rico en biodiversidad, con una
tradición milenaria de curanderos que hacen uso de la flora. C.
crassa no solo es utilizada en la medicina tradicional como una
planta afrodisíaca o comúnmente conocida como “viagra peruana”,
también existen informes de extractos etanólicos que han mostrado
actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (Bussmann
et al., 2011).
Tradicionalmente, los seres humanos han usado extractos de
diferentes partes de plantas, entre ellos, corteza, hojas, cáscara,
semilla y tallo, debido al potencial que presentan para múltiples usos,
como, fuente de compuestos puros, agentes curativos o como ayuda
para el descubrimiento de nuevos medicamentos debido a su
diversidad química (Rakholiya, Kaneria, & Chanda, 2013).
Existen investigaciones realizadas en Ecuador por Pita,
(2018) sobre el estudio farmacognóstico y fitoquímico de la especie
Corynaea crassa, donde se establecieron las especificaciones de
calidad, determinando también las concentraciones de fenoles y
flavonoides de la muestra cruda cultivada en Ecuador y Perú. Por
otra parte Romero, (2018) utilizando la muestra cruda peruana y a
través, de dos métodos de extracción obtuvo los extractos de C.
crassa con el objetivo de determinar la composición química,
teniendo en cuenta el método de extracción idóneo para llevar a
cabo la caracterización.
2
Se ha establecido que los radicales libres, especialmente el
superóxido (O2), el óxido nítrico (NO) y otras especies reactivas como
el H2O2, se producen continuamente “in vivo” causando
enfermedades. Por lo tanto, una ingesta adecuada de productos altos
en antioxidante, disminuye significativamente los efectos adversos
ocasionados por el estrés oxidativo (Pisoschi & Pop, 2015).
La flora ecuatoriana es muy diversa, en su mayoría exótica,
una parte de ellas contienen propiedades antioxidantes, que son
ampliamente usadas por su baja toxicidad. Debido, a que la especie
vegetal se desarrolla en bosques altos andinos se podrá aprovechar
los recursos naturales, para confirmar la presencia de metabolitos
responsables de dicha actividad. Por lo que es necesario e importante
buscar nuevas fuentes de agentes antioxidantes a partir de las
plantas.
Existen varias técnicas para determinar la actividad
antioxidante in vitro, sus ventajas y limitaciones, aún están bajo
discusión y no existe un consenso para definir un método estándar
único capaz de abarcar todas las peculiaridades exhibidas por las
diferentes clases de antioxidantes (Tiveron, et al., 2012). Por tanto,
es necesario trabajar con varios métodos para facilitar la
comparación e interpretación de los resultados (Medina, 2010; Shah,
et al., 2014).
Los métodos, generalmente, se basan en la evaluación de la
capacidad de captura de radicales libres o en la evaluación de su
capacidad reductora, constituyendo el grupo de “métodos químicos”.
Estos métodos ofrecen información muy diversa a la que aportan
aquellos basados en medidas biológicas o metabólicas que
determinan o evalúan las capacidades antioxidantes específicas
(Kuskoski et al., 2005; Jayathilake, et al., 2016).
3
CAPITULO I: PROBLEMA
I.1.- Planteamiento y formulación del problema
La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por
sus siglas en inglés) define a los antioxidantes como suplementos
dietéticos que deben tomarse, además del consumo normal de
alimentos, en un esfuerzo por prevenir diversos problemas de salud,
ocasionado por el desequilibrio en las células causado por el
aumento de los radicales libres, al que se conoce como estrés
oxidativo (Anuj et al., 2016).
Por su parte, un radical libre (RL) es cualquier especie química
capaz de existir de forma independiente y que presenta uno o más
electrones desapareados en su estructura. Son conocidos como especies
reactivas oxigénicas o del oxígeno (ROS) y especies reactivas del
nitrógeno (RNS). Son responsables del daño oxidativo de macromoléculas
biológicas como el DNA, lípidos, carbohidratos y proteínas (Agudo, 2010;
Bhattacharya, 2015).
El estrés oxidativo, causado por un desequilibrio entre especies
reactivas de oxígeno y los sistemas de defensa antioxidante, se considera
la principal razón de muchas enfermedades, como algunos tipos de
cáncer, diabetes, patologías cardiovasculares, procesos reumáticos,
patologías gastroentéricas, afecciones broncopulmonares o procesos
neurodegenerativos y otros (Shah & Modi, 2015; Mengfei et al., 2018;
Sánchez-Valle & Méndez-Sánchez, 2018).
Una manera saludable de prevenir estos efectos adversos de
especies reactivas sobre las funciones normales del cuerpo, es la
ingesta diaria controlada de alimentos ricos en antioxidantes, ya que
4
el consumo desmedido que pueden figurar las fórmulas comerciales
o mezclas herbales llevarían a problemas de toxicidad (Coronado, et
al., 2015).
Existen sustancias derivadas de las plantas, denominadas
"fitonutrientes" o "fitoquímicos"; son cada vez más conocidas por su
actividad antioxidante. Los compuestos tales como flavonoides se
encuentran en toda la especie vegetal. Se ha demostrado que éstos
presentan actividades: antiinflamatoria, antialérgica, antiviral,
antienvejecimiento y anticancerígena. Los amplios efectos
terapéuticos pueden atribuirse en gran medida a sus propiedades
antioxidantes (Rowland, Dong, & Migdal, 2018).
En la mayoría de la población; el conocimiento vegetal es de
gran importancia porque reafirma la identificación y los valores
nacionales que se pierden en los procesos complementarios de la
modernización y la globalización (Bussmann, et al., 2015).
La utilización de productos naturales ha impactado diversos
aspectos de la medicina, considerado como tratamientos accesibles
y asequibles disponibles. Elaborando sustancias que ejerzan un
efecto beneficioso y en ocasiones resultando más asimilables para el
organismo, además de tener menos efectos adversos. Se establece
que, a pesar de la creciente disponibilidad de tratamientos médicos,
las plantas medicinales siguen proporcionando una de las mejores
alternativas para subsanar los problemas asociados a la mala
calidad vida (Ospina, et al., 2015).
Según datos del Herbario de la Universidad Católica del
Ecuador en el 2008, este país mantuvo una diversidad biológica muy
grande por la cantidad de especies, variedad de ecosistemas y
recursos genéticos. Se estimó que la participación en el mercado
mundial de productos naturales fue solo del 0,03%. Se han utilizado
más de 2800 especies vegetales con propiedades medicinales y solo
5
un pequeño porcentaje de estas y sus derivados se comercializaron
dentro y fuera del país.
Al noroccidente de Quito – Ecuador, se cosechan más de 600
variedades de plantas de todo el mundo, en su mayoría exóticas,
una parte de ellas tienen propiedades antioxidantes. En el año 2013
se determinó la actividad antioxidante y el contenido total de fenoles
en 73 extractos de 40 plantas medicinales, que correspondieron a 27
familias botánicas (Armijos, 2015).
De acuerdo a lo antes expuesto se plantea la siguiente interrogante
en el presente trabajo de investigación:
¿Presentarán los extractos de la especie Corynaea crassa de dos
lugares de procedencia, características farmacognósticas y actividad
antioxidante similares?
I.2.- Justificación e importancia
En Ecuador existe muy poca información sobre
investigaciones fitoquímica, fisicoquímica y química con relación a la
especie C. crassa, por esta razón se propone realizar un estudio
farmacognóstico sobre la composición química, a través de análisis
de calidad, cuantificación de metabolitos secundarios presentes y su
respectiva determinación antioxidante a los extractos de Corynaea
crassa de dos lugares de procedencia: Ecuador y Perú, para
demostrar y dejar un registro de las diferencias o similitudes,
brindando un aporte a la flora ecuatoriana para futuras
investigaciones; además de enaltecer a la especie que se ha
encontrado excluida por investigadores y por la población en
general.
I.3.- Hipótesis
La determinación de los parámetros farmacognósticos y la
6
actividad antioxidante de los extractos de Corynaea crassa de dos
lugares de procedencia presentarán igual comportamiento.
7
I.4.- Objetivos
I.4.1.- Objetivo general
Evaluar los parámetros farmacognósticos y la actividad
antioxidante de extractos de C. crassa de dos lugares de
procedencia.
I.4.2.- Objetivos específicos
1. Determinar los principales parámetros físico-químicos de los
extractos de Corynaea crassa.
2. Identificar por tamizaje fitoquímico, métodos cromatográficos y
espectrofotométricos los principales metabolitos secundarios
presentes en los extractos de C. crassa.
3. Evaluar la actividad antioxidante “in vitro” de los extractos
considerando los metabolitos secundarios presentes en los
mismos.
8
CAPITULO II: MARCO TEÓRICO
II.1.- Antecedentes de la investigación
En la investigación titulada “Constituents of Corynaea crassa
(Peruvian Viagra)”, se realizó un estudio fitoquímico sobre el
descubrimiento de compuestos bioactivos, mediante extractos
obtenidos de las raíces secas, a través de métodos cromatográficos
y espectrofotométricos. En las pruebas cualitativas del extracto
crudo se logró identificar esteroides, triterpenos, flavonoides,
cardiotónicos, taninos y antocianinas, y no se detectaron alcaloides.
Siendo de interés el aislamiento y la caracterización de
constituyentes como β-sitosterol y dos mezclas1:1 de triterpenos
como: lupenona / β-amirona y lupeol / β-amirina (Malca et al., 2015).
Los triterpenos abundan fundamentalmente en los vegetales,
a partir de su precursor se forman también los esteroides; entre sus
principales actividades farmacológicas se destaca su poder
antiinflamatorio, aunque hay literatura sobre la acción estimulante y
depresora del sistema nervioso central. Se puede decir que los
principales componentes identificados pueden estar relacionados
con la actividad antiinflamatoria, antiespasmódica y antioxidante
(Gutiérrez et al., 2019).
II.2.- Corynaea crassa
Corynaea es un género que consta de cuatro especies, C.
crassa, C purdiei, C. sphaerica, C. sprucei Eichler, perteneciente a la
familia Balanophoraceae. Corynaea crassa Hook. f, es una especie
originaria de América, que se localiza en los bosques altos andinos,
con un rango altitudinal de 1300 – 3000 msnm (Ver anexo A), (Sato
& Gonzalez, 2016).
9
Sus raíces están conformadas por tubérculos subterráneos,
subesféricos a elipsoides, irregularmente divididos. Esta especie
vegetal no muestra atributos foliares, es decir, es una planta áfila,
que no presenta hojas. Sin embargo, sus atributos florales son
diminutos y unisexuales, embebidas en una densa capa de tricomas
filiformes, de colores blancos a rosados. Sus frutos se presentan en
pequeños aquenios de una semilla cada uno (Sato & Gonzalez,
2016).
Su recolección en el Ecuador se da en bosques tropicales del
Azuay, Carchi, Chimborazo, Cotopaxi, Imbabura, Loja, Morona
Santiago, Napo, Pichincha, Sucumbíos, Tungurahua y Zamora
Chinchipe a una altitud aproximada de 1050 a 3000 msnm. En Perú
se localiza en el Amazonas, Cajamarca, Cusco, La Libertad,
Lambayeque y Pasco a una elevación de 26 a 3300 msnm
(Tropicos, 2012).
II.3. Metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios se encuentran combinados en
diferentes partes de la planta (hojas, raíces, brotes, corteza), en diferentes
etapas de crecimiento (plántulas, semillas, plántulas, árboles maduros),
bajo diferentes presiones ambientales (microbios invasivos, herbívoros),
en numerosas combinaciones de formas por diferentes clases de plantas
(Delgoda & Murray, 2017).
II.3.1. Funciones
Los metabolitos secundarios se usan para una variedad de
actividades como agentes antimicrobianos y antiparasitarios,
inhibidores de enzimas, agentes antitumorales y agentes
inmunosupresores, etc. Sirven como armas competitivas contra otros
seres vivos (Thirumurugan et al., 2018).
10
II.4. Radicales libres
Los radicales libres se forman como parte de nuestro
metabolismo natural, pero debido a factores ambientales, como
fumar, pesticidas, radiación y contaminación. Los radicales libres se
transforman en moléculas inestables que reaccionan fácilmente con
las moléculas esenciales del cuerpo, incluyendo el ADN, las grasas y
las proteínas (Chun et al., 2016).
Los radicales libres son moléculas que tienen un electrón de
más o demasiado bajo para ser estables. Es decir, que intentan
robar o dar electrones a otras moléculas, cambiando así su
estructura química, provocando daño celular, proceso al que se lo
conoce como “estrés oxidativo” (Chun et al., 2016).
II.5. Estrés oxidativo
Cuando la concentración de especies reactivas (radicales
libres) no está controlada por mecanismos de defensa internos como
los antioxidantes (tocoferoles, ácido ascórbico y glutatión) o las
enzimas involucradas en la eliminación de radicales de oxígeno
(catalasa, peroxidasa y superóxido dismutasa), se produce un daño
oxidativo a las proteínas. Dicho proceso podría deberse a lo
siguiente: la presencia de xenobióticos, la activación del sistema
inmunitario en respuesta a microorganismos invasores (inflamación),
y la radiación, lo que hace del estrés oxidativo un denominador
común de toxicidad o estrés (Sies, Berndt, & Jones, 2017).
Según Yoshikawa & Naito, (2015) una definición más útil de
estrés oxidativo puede ser "un estado donde las fuerzas oxidativas
superan a los sistemas antioxidantes debido a la pérdida del
equilibrio entre ellos".
La protección contra el estrés oxidativo depende de la
11
adecuación de diversas sustancias antioxidantes que se derivan
directa o indirectamente de la dieta. Por consiguiente, una ingesta
inadecuada de nutrientes antioxidantes puede comprometer el
potencial antioxidante, lo que incrementa el estrés oxidativo general
(Rowland et al., 2018).
II.6. Antioxidantes
Los antioxidantes protegen los componentes estructurales y
funcionales en los organismos contra el estrés oxidativo. La mayoría
de los antioxidantes son de origen vegetal ya que las plantas están
constantemente expuestas al estrés oxidativo (radiación UV,
reacciones fotosintéticas). Metabolitos como los carotenoides o los
flavonoides son agentes antioxidantes y antirradicales prominentes
que a menudo aparecen juntos en los tejidos de las plantas y actúan
en medios lipófilos e hidrófilos, respectivamente. Son
complementarios en su actividad antirradical (Chambers et al.,
2019).
II.6.1. Clasificación de los antioxidantes
Los antioxidantes se pueden clasificar en dos tipos según su
fuente, es decir, antioxidantes naturales y sintéticos.
II.6.2. Antioxidantes naturales
Los antioxidantes naturales se sintetizan en el cuerpo humano
mediante un proceso metabólico o se complementan con otras
fuentes naturales, y su actividad depende en gran medida de sus
propiedades físicas y químicas, además, de su mecanismo de
acción. Se puede dividir en dos categorías, es decir, antioxidantes
enzimáticos y antioxidantes no enzimáticos (Xu et al., 2017).
Los antioxidantes enzimáticos se producen únicamente en el
organismo y se pueden subdividir en primarios y secundarios. Los
12
antioxidantes primarios incluyen la catalasa (CAT), superóxido
dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa (GPx). los antioxidantes
secundarios incluyen a la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH) y al glutatión reductasa (GR) (Xu et al., 2017).
Los antioxidantes no enzimáticos, no están presentes en el
cuerpo de manera natural, sin embargo, deben ser suplementados
de acuerdo al metabolismo. Algunos de los antioxidantes no
enzimáticos conocidos son minerales, vitaminas, carotenoides,
polifenoles y otros antioxidantes (Xu et al., 2017).
II.6.3. Antioxidantes sintéticos
Son compuestos sintetizados químicamente y se agregan a
los alimentos como conservantes para ayudar a prevenir la oxidación
de lípidos. Debido a la inestabilidad inherente de los antioxidantes
naturales, se han usado como antioxidantes sintéticos el hidroxi
butiladoisole (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT), para estabilizar
las grasas y los aceites (Atta, Mohamed, & Abdelgawad, 2017).
II.6.4. Antioxidantes fenólicos
Los compuestos fenólicos son un gran grupo de metabolitos
secundarios muy extendidos en el reino vegetal. Se clasifican en
clases según su estructura y se subcategorizan dentro de cada clase
según el número y la posición del grupo hidroxilo y la presencia de
otros sustituyentes. El grupo más amplio y diverso de los polifenoles
son los flavonoides que se construyen sobre el esqueleto de flavona
C6-C3-C6. Además, otros compuestos fenólicos. como el ácido
benzoico o los derivados del ácido cinámico han sido Identificado en
frutas y verduras (Atta et al., 2017).
Los compuestos fenólicos, especialmente los flavonoides,
poseen diferentes actividades biológicas, pero las más importantes
13
son la actividad antioxidante, el efecto protector de los capilares y el
efecto inhibidor. Los fenólicos son capaces de eliminar especies
reactivas de oxígeno debido a sus propiedades de donación de
electrones. Su efectividad antioxidante depende de la estabilidad en
los diferentes sistemas, así como del número y la ubicación de los
grupos hidroxilo. En muchos estudios in vitro, los compuestos
fenólicos demostraron una mayor actividad antioxidante que las
vitaminas y los carotenoides (Atta et al., 2017).
Los principales compuestos antioxidantes, a saber, son los
ácidos fenólicos como el ácido gálico, protocatequímico, cafeico y
rosmarínico, flavonoides entre ellos la quercetina y catequina,
además de aceites volátiles por ejemplo el eugenol, carvacrol, timol,
y mentol. Los ácidos fenólicos generalmente actúan como
antioxidantes atrapando los radicales libres mientras que los
flavonoides pueden eliminar los radicales libres y los quelatos de
metal (Atta et al., 2017).
II.6.5. Flavonoides
Los flavonoides son sustancias fenólicas aisladas de una
amplia gama de plantas vasculares, con más de 8000 compuestos
individuales conocidos. Actúan en las plantas como antimicrobianas,
fotorreceptores, atractores visuales, repelentes de alimentación y
para la detección de luz. También, exhiben actividades biológicas,
incluyendo acciones antialérgicas, antivirales, antiinflamatorias,
vasodilatadoras y la capacidad para reducir la formación de radicales
libres y eliminarlos (Pietta, 2015).
Dependiendo del grado de oxidación del anillo central, se
obtienen las diferentes estructuras de cada compuesto flavonoide en
particular. Dentro de las principales clases de flavonoides están
comprendidos: chalconas, flavanonas, flavononas, flavonoles,
isoflavonas, flavan-3-oles y antocianidinas (Ringuelet & Viña, 2013).
14
II.7.- Métodos de extracción de sustancias naturales
Los extractos son preparaciones concentradas de
consistencia liquida, semisólida o sólida que se obtienen
generalmente a partir de partes del material vegetal por acción de
soluciones extractivas (Ver anexo B). De acuerdo con las
características fisicoquímicas que presentan los principios
contenidos en la especie vegetal de interés, o la utilización que se
pretenda hacer del extracto, se encuentran distintos tipos de
procesos que se puede llevar a cabo (Ferraro, et al., 2015).
II.7.1.- Maceración
Está basada en colocar la especie vegetal en contacto con el
disolvente, durante varios días, con agitación ocasional, dando como
producto un equilibrio de concentración entre la muestra y el
solvente. Una gran desventaja es la lentitud y el hecho de no ser
posible alcanzar la extracción completa de la muestra (Sharapin, et
al., 2000).
II.7.2.- Percolación
La percolación consiste en hacer pasar el disolvente a través
de la especie vegetal, hasta su extracción completa, renovando
siempre el disolvente, lo que vendría a ser una desventaja por el alto
consumo del mismo. En pequeña escala, se lleva a cabo en
percoladores de cuerpo cilíndrico o cónico, provistos de un grifo en
la parte inferior, para limitar el flujo del disolvente (Sharapin et al,
2000).
II.7.3. Decocción
La decocción se utiliza para ingredientes activos que no se
15
modifican con la temperatura, se debe aplicar la decocción para
extraer los principios activos de las partes más duras, raíces,
semillas y tallos, que consiste en hervir la planta en agua a fuego
lento durante 3-15 minutos. Cuando hierve el líquido, se retira del
fuego, se deja reposar y se cuela. Además, están preparadas para
su uso en el momento y no deben almacenarse durante más de 24
horas (Boxler, 2014)
II.8.- Farmacognosia
La Farmacognosia estudia los principios activos de origen
natural provenientes de vegetales, animales, hongos o protozoarios.
En virtud de ello, se encarga de investigar varios aspectos de la
especie vegetal como las características botánicas, su origen
geográfico, condiciones de cultivo, recolección, almacenamiento,
características morfológicas, composición química, etc. (Salazar, et
al., 2016).
II.9.- Parámetros fisicoquímicos
Los parámetros físico-químicos dan una información
extensa de la naturaleza de las especies químicas y sus
propiedades físicas, sus análisis suelen ser más rápidos y pueden
ser monitoreados con mayor frecuencia (Pérez et al., 2018).
Para la determinación de parámetros de calidad de
extractos se realizan análisis organolépticos, humedad, sólidos
totales, densidad relativa, índice de refracción, pH, tamizaje
fitoquímico, análisis capilar, sustancias extraíbles, cenizas totales,
cenizas solubles en agua, cenizas insolubles en ácido clorhídrico,
entre otros (Ochoa,et al., 2015).
II.10. Estudio fitoquímico
Este tipo de metodología proporciona conocimiento de los
16
constituyentes biológicamente activos, indicando la presencia o
ausencia de metabolitos en la especie vegetal, como son los
alcaloides, antraquinonas y naftoquinonas, esteroides y
triterpenos, flavonoides, taninos, saponinas, cumarinas, lactonas
terpénicas y cardiotónicos. Los resultados obtenidos proporcionan
una orientación a la investigación y permiten hacer una distinción
de las plantas a estudiar (Gahramanova., 2019).
II.10.1.- Tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico o también conocido como screening
fitoquímico, es un análisis cualitativo que se realiza a través de
varios ensayos, que permite obtener información de los
principales grupos químicos presentes en una planta y a partir de
allí, orientar la extracción o fraccionamiento de los extractos para
el aislamiento de los grupos de mayor interés (Ocaña, 2015).
II.11.-Cromatografía
La cromatografía es una técnica analítica cualitativa
destinada a efectuar separaciones sencillas o muy complejas de
los constituyentes de una mezcla en solución, y muy útil en la
identificación de metabolitos. Desde otro punto de vista la
cromatografía puede usarse no solo para el reconocimiento
cualitativo, sino también para su determinación cuantitativa
(Erickson, 2018).
Actualmente constituye un método indispensable en
estudios bioquímicos, toxicológicos, estructurales, en el análisis
orgánico e inorgánico, etc., debido a que su utilización presenta
cualidades de mucho provecho. Es un procedimiento sencillo y
rápido, utilizado desde la escala micro analítica hasta la industrial.
Se puede obtener un registro permanente del análisis
denominado cromatograma y es aplicable a sustancias lábiles
siendo una técnica poca o nada destructiva (Wolff et al., 2019).
17
II.11.1.-Cromatografía de capa fina
La cromatografía de capa fina, debido a su simplicidad y
velocidad permite conocer de manera rápida y sencilla cuantos
componentes hay presentes en una muestra problema,
proporciona mejores separaciones y se puede elegir diferentes
adsorbentes. La fase estacionaria consiste en una capa delgada
de adsorbentes como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa
depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, una
lámina de aluminio o de plástico (Ocaña, 2015).
II.12.-Espectroscopia
La espectroscopia se refiere a todos los conocimientos
referentes al análisis del espectro luminoso. Este método permite
detectar la cantidad de radiación electromagnética absorbida o
emitida por un cuerpo y la relación con los niveles de energía
implicados en una transición cuántica. Además, determina las
posiciones relativas de los átomos dentro de la molécula y la
intensidad de las fuerzas que los mantiene unidos Cabe destacar
que un espectro no es más que la distribución y representación
gráfica de la intensidad de una radiación en función de una magnitud
característica, como la longitud de onda, la frecuencia o la masa
(Camps, Vázquez, & Escolano, 2017).
II.12.1.- Espectroscopia ultravioleta
La espectroscopia ultravioleta se utiliza tanto
cuantitativamente como cualitativamente a todas las moléculas que
absorben los rayos ultravioletas, ya sea en una sola longitud de onda
o realizar una exploración del rango en el espectro. La región UV
varía desde 190 a 400 nm (Görög, 2018).
Este método sigue la Ley de Beer-Lambert, establece que
18
siempre que un haz de luz monocromática pasa a través de una
solución con una sustancia absorbente, la velocidad decreciente de
la intensidad de radiación junto con el espesor de la solución
absorbente es en realidad proporcional a la concentración de la
solución y la radiación incidente. En resumen, que cuanto mayor sea
el número de moléculas que son capaces de absorber la luz en una
cierta longitud de onda, mayor será el grado de absorción de la luz
(Ankur, 2017).
Además, la espectroscopia UV tiene varias aplicaciones una
de ellas es para identificar compuestos desconocidos. El espectro de
un compuesto desconocido se comparará con el espectro de un
compuesto de referencia. Si ambos espectros coinciden, el
compuesto será identificado con éxito (Ankur, 2017).
II.12.2.-Espectroscopia infrarroja
Al igual que con todas las técnicas espectroscópicas, se
puede utilizar para identificar y estudiar sustancias químicas. Para
una muestra dada, que puede ser sólida, líquida o gaseosa, el
método o la técnica de la espectroscopia infrarroja utiliza un
espectrómetro infrarrojo para producir un espectro infrarrojo
(Speight, 2017).
La espectroscopia infrarroja estudia la absorción o emisión de
energía radiante originada por la interacción entre la radiación
electromagnética y el material en estudio. Se basa en que las
moléculas tienen la posibilidad de rotar y vibrar a distintas
frecuencias, o sea que, una molécula puede absorber la energía de
fotones en el rango energético de Infrarrojo (IR) en el caso en que
exista una diferencia en el momento bipolar de la molécula mientras
ocurre un movimiento vibracional rotacional y cuando la frecuencia
asociada con la radiación resuena con el movimiento vibracional
(Kremer, Gibbons, & Kennedy, 2019).
19
El espectro infrarrojo se divide en: Infrarrojos Cercanos
(NIRS), permite el estudio de armónicos y vibraciones armónicas o
combinadas. Infrarrojos Medios (MIRS) estudia las vibraciones
fundamentales y la estructura de rotación-vibración de moléculas
pequeñas. Infrarrojos lejanos se utilizan para las vibraciones de los
átomos pesados. La luz infrarroja (IR) es una radiación
electromagnética (EM) con una longitud de onda más largo que el de
la luz visible: ≤ 700nm (Tsuchikawa & Kobori, 2015).
II.13. Capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante se puede evaluar con varios
métodos que se clasifican en una de las dos categorías generales, a
saber: ensayos basados en una reacción de transferencia de
electrones que se controla mediante el cambio de color en el
oxidante a medida que se reduce; y ensayos basados en una
reacción de transferencia de átomos de hidrógeno donde el
antioxidante y el sustrato compiten por los radicales libres (Pradas,
Moreno, & Luque, 2015). En el Anexo C se refieren varios métodos
para medir la actividad antioxidante por espectrofotometría.
II.13.1. Determinación directa
El radical se emplea como un factor de cuantificación (produce
una señal analítica). La adición del antioxidante, antes o después de
la generación del radical, provoca una disminución de la señal. En el
ensayo de post-adición se forma el radical en ausencia de la muestra
y así, cuando se añade la sustancia antioxidante se produce un
descenso en la señal debido a la disminución de la concentración del
radical. En ensayos de inhibición, la muestra se añade a los sustratos
de oxidación antes que sea generado el radical. La reacción comienza
con la adición del oxidante. Entre los ensayos se encuentran:
• Ensayo del ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-6-sulfónico
20
(ABTS●+): es una técnica que se usa para medir la capacidad
antioxidante de un material biológico, compuestos puros o
extractos de frutas y verduras de naturaleza hidrofílica o
lipofílica. Involucra un compuesto coloreado de origen radical
(ABTS•+), con la finalidad de simular especies reactivas de
oxígeno y nitrógeno; de esta manera la presencia del
antioxidante conduce a la desaparición de este radical
coloreado; dicho radical se genera a partir de su precursor el
ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-6-sulfónico (ABTS). El
radical catiónico obtenido es un compuesto de color verde-
azulado, estable y con un espectro de absorción en el UV-
visible (734 nm) (Re, et al., 1999; Arnao, et al., 2001; Medina,
2010; Floegel, et al., 2011; Biskup, et al., 2013; Pardo, et al.,
2018; Vargas, et al., 2018).
La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en
muestras hidrosolubles como liposolubles, eligiendo el disolvente
apropiado en cada caso (Medina, 2010).
Existen varios métodos de generación del radical ABTS●+:
enzimáticamente (mioglobina, peroxidasa de rábano), químicamente
(dióxido de manganeso, persulfato potásico, radicales peroxilo) y
electroquímicamente (Medina, 2010).
• La metodología del 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH) (Brand-
Williams, et al., 1995; Molyneux, 2004; Kedare & Singh, 2011;
Bokhari, et al., 2013; Afsar, et al., 2018): es una técnica
espectrofotométrica que se caracteriza por emplear el 2,2-
difenil-1-picrilhidrazilo como radical libre. Al unirse una solución
de DPPH con una sustancia que puede donar átomos de
hidrógeno la concentración del DPPH disminuye mientras
aparece la forma reducida DPPH-H. Como consecuencia
ocurre un cambio de coloración de morado a amarillo y
21
disminuye la absorbancia de la reacción. El cambio de color es
monitoreado espectrofotométricamente a 517 nm y es utilizado
para la determinación de los parámetros de las propiedades
antioxidantes.
En la actualidad este ensayo comenzó a utilizarse más seguido
para la caracterización de propiedades antioxidantes. Muchos
laboratorios han adoptado esta técnica e incluso han realizado
modificaciones a conveniencia sin afectar el procedimiento original
(Ojha, et al., 2012).
Los resultados se pueden expresar de diferentes formas, la
mayoría de los estudios son expresados como el valor de la
concentración máxima de la media inhibitoria (IC50), lo que indica la
cantidad de antioxidante necesaria para disminuir la concentración
inicial de DPPH al 50 %. Este valor se calcula graficando el porciento
de inhibición contra la concentración del extracto (Deng, et al., 2011).
II.13.2. Determinación indirecta
La presencia de radicales libres produce la pérdida o aparición
de un reactivo, y, por tanto, en presencia de un antioxidante se
provoca el aumento o disminución de la señal. Entre los métodos
utilizados se encuentran:
• FRAP (de sus siglas en inglés Ferric Reducing Antioxidant
Power): fue introducido por (Benzie & Strain 1996) para estimar
la capacidad de reducir el ion férrico que contiene el plasma,
como medida de su estado antioxidante, sin embargo, se ha
utilizado para el ensayo de antioxidantes en plantas (Szőllősi &
Szőllősi-Varga, 2002; Csepregi, et al., 2016).
Este método determina la cantidad del catión férrico (Fe3+) que
se reduce a ferroso (Fe2+) en presencia de un agente acomplejante,
22
el denominado TPTZ (2,4,6-tri(piridil)-1,3,5-triazina). El complejo de
TPTZ y el Fe3+ actúan con las sustancias antioxidantes dando como
producto un ion complejo de Fe2+, TPTZ y sustancias oxidadas. Este
ion complejo [Fe(TPTZ)2]2+ resultante es de color azul intenso y tiene
una absorción máxima a 593 nm (Roginsky & Lissi 2005; Muselík, et
al., 2007; Song, et al., 2010; Afsar, et al., 2018).
23
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS
III.1. Material vegetal
La especie vegetal utilizada fue Corynaea crassa Hook. f,
procedentes de Ecuador y Perú, recolectada en el mes de julio del
2017 en la localidad de Libertad-Trujillo-Perú, y la especie ecuatoriana
se recolecto en la reserva ecológica Yanacocha, al norte de la
provincia de Quito, en el mes de agosto del 2018 (Ver anexo D).
De las colectas realizadas se empleó la planta completa,
previamente lavada con agua potable. Las especies vegetales se
secaron en estufa de recirculación de aire a una temperatura de 40 0C
y posteriormente se fragmentaron en un molino artesanal para su
procesamiento y análisis.
III.2. Métodos de extracción y obtención de los extractos
III.2.1. Obtención de extractos por percolación
Se siguió el procedimiento descrito por Miranda & Cuéllar
(2000)
Materiales y reactivos
• Recipiente de vidrio para humectar la muestra
• Percolador
• Algodón
• Papel de filtración mediana.
• Frasco de color ámbar.
• Muestra fragmentada.
• Solvente seleccionado (etanol al 98 % y al 80%).
Procedimiento:
La muestra previamente humectada con los disolventes
24
anteriormente señalados se dejó reposar por 15 min. Posteriormente
se transfirió la muestra al percolador previamente preparado. Se
vertió el solvente con el orifico de salida del percolador abierto y
cuando este comenzó a salir se cerró el mismo. Se siguió vertiendo
solvente hasta que este cubrió la masa vegetal y quedó de 3-5 cm por
encima de ella. Se maceró durante 24 h. Luego se obtuvo una
primera fracción de 85 % de extracto, los que se guardaron en un
recipiente. Se detuvo la extracción y con el volumen de solvente
requerido. Se maceró durante 24 h y se hizo una extracción hasta el
agotamiento de la muestra. El extracto obtenido se concentró a un 15
% y se unió con la primera fracción. El extracto se refrigeró por cuatro
días a 10 -15 0C y después se filtró para sus análisis
correspondientes.
III.2.2. Obtención de extractos por maceración Materiales y reactivos
• Recipiente de vidrio para humectar la muestra
• Frasco de color ámbar
• Muestra fragmentada.
• Solventes seleccionados (etanol al 98 % y al 80%).
Procedimiento:
A partir del material vegetal se elaboraron extractos a razón de
20 g de muestra por 100 ml de disolvente (etanol al 98% y al 80%),
por el método de maceración, durante un periodo de siete días, con
agitación en zaranda, a una temperatura de 30 °C ± 2 °C, utilizando
como disolventes los señalados anteriormente. Se siguió el
procedimiento descrito en la norma cubana NRSP 312 (1992) y por
Miranda & Cuéllar (2000).
III.2.3. Obtención de extractos acuosos
25
Se siguió el procedimiento descrito por Miranda & Cuéllar (2000)
Materiales y reactivos
• Recipiente de vidrio para humectar la muestra
• Beaker
• Papel de filtración rápida.
• Frasco de color ámbar.
• Muestra fragmentada.
• Solvente seleccionado (agua destilada).
Procedimiento:
A partir de la especie vegetal se elaboró un extracto acuoso por decocción
a razón de 20 g de la muestra por 100 mL de disolvente, durante un
periodo 15 minutos. Se siguió el procedimiento descrito en la norma
cubana NRSP 312 (1992) y por Miranda & Cuéllar (2000).
III.3. Parámetros físico-químicos de calidad de los extractos
Las determinaciones de calidad se llevaron a cabo mediante el
procedimiento descrito en la NRSP 312 (1992) y por Miranda &
Cuéllar (2000). Se realizaron cinco réplicas para cada experimento,
siendo evaluados los parámetros siguientes: propiedades
organolépticas, sólidos totales, índice de refracción, densidad relativa
y análisis capilar (donde se utilizó una banda de papel de filtro de 4
cm/20 cm y se colocó en una cámara durante 2 horas).
a) Requisitos organolépticos
Determinación del olor: se tomó una tira de papel secante de
aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de longitud y se introdujo
un extremo en la muestra de ensayo. Se percibió y se determinó si
corresponde con la característica del producto.
Determinación del color: se tomó un tubo para ensayos, que se
26
llenó hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se
observó el color, la transparencia, la presencia de partículas y la
separación en capas.
b) pH
Para la determinación del pH se utilizó un pH-metro modelo
Basic 20 Crizon, previamente ajustado con soluciones buffer a pH =
4,01 y 7.
c) Sólidos totales
Se realizó a partir de 5 mL de extracto, los cuales se
transfirieron a una cápsula de porcelana previamente tarada. Se
sometió la muestra a 105 0C hasta evaporación del disolvente y peso
constante. La cantidad de sólidos totales (St), expresados en %, se
calculó por la expresión siguiente:
Donde:
Pr = masa de la cápsula más el residuo (g)
P = masa de la cápsula vacía (g)
V = volumen de la porción de ensayo (mL)
100 = factor matemático
d) Densidad relativa
Se realizó por picnometría y se utilizó una balanza analítica
monoplato marca Sartorius. De la muestra de ensayo se tomó la
cantidad necesaria de acuerdo con la capacidad del picnómetro y se
enfrió a 25 °C. La densidad relativa a 25 °C se calculó mediante la
fórmula siguiente:
SP P
Vt
r=−
100
27
D25=
M2 - M
M1 - M
Donde:
M = masa del picnómetro vacío (g)
M1= masa del picnómetro con la muestra de ensayo (g)
M2= masa del picnómetro con agua (g)
D= densidad relativa (g/mL)
e) Índice de refracción
La determinación se realizó a una temperatura de 25 oC con un
refractómetro ABBE digital.
f) Análisis capilar
Este ensayo se desarrolló según lo descrito en la NRSP 312
(1992) y por Miranda & Cuéllar (2000), a partir de 20 mL de extracto,
empleando papel Whatman # 1. El tiempo de corrida fue de 2 horas y
la temperatura de trabajo de 25 ºC (± 1). Para el análisis e
interpretación de la imagen capilar se tuvieron en cuenta los aspectos
siguientes:
• Color
• Altura
• Descripción de las diferentes partes (franja, sub-franja, banda y
sub-banda)
• Cambios de coloración con vapores de amoníaco
III.4. Análisis de la composición química de los extractos
III.4.1. Tamizaje fitoquímico
Se desarrolló el tamizaje fitoquímico de acuerdo al
procedimiento descrito por Miranda & Cuéllar (2000), donde se
efectuaron los ensayos correspondientes al extracto alcohólico
(Figura 1)
28
Figura 1 Reacciones de tamizaje fitoquímico realizadas a los extractos hidroalcohólicos y acuosos
de C. crasa Fuente: Miranda & Cuéllar (2000)
III.5. Cromatografía en capa delgada
Se utilizaron placas de gel de sílice F254 de la Merck, sobre
soporte de aluminio. El desarrollo cromatográfico fue de forma
ascendente, utilizando como fase móvil cloroformo: metanol: n-
propanol: agua (5:6:1:6). Para el revelado de las placas se emplearon
vapores de amoníaco, solución acuosa de tricloruro férrico al 5 %
(FeCl3), luz UV (254 nm) y ácido sulfúrico al 5 % en etanol/calor (105
0C).
29
III.6. Análisis por espectroscopia UV - VISIBLE
Los extractos se concentraron (1 mL) a sequedad, se
redisolvieron en 10 mL de metanol y posteriormente se analizaron en
un espectrofotómetro UV-Visible, marca Analytikjena, modelo
SPECORD-200 Plus de procedencia alemana. Se realizó un barrido
de 200 a 800 nm.
III.7. Análisis por espectroscopia infrarroja
Los extractos (5 mL) se concentraron a sequedad, el sólido
obtenido se añadió a una tableta de KBr. Las mediciones se
realizaron en un equipo infrarrojo marca Jasco, modelo FT/IR-460
plus de procedencia japonesa. El espectro infrarrojo se obtuvo en la
región de 4000 a 600 cm-1.
III.8. Cuantificación de fenoles y flavonoides
III.8.1. Fenoles totales
El contenido de fenoles totales se determinó por el método de
Folin-Ciocalteu (Singleton, et al., 1999., McDonald, et al., 2001;
Pourmorad, et al., 2006., Memnune, et al., 2009., Chlopicka, et al.,
2012).
Muestras y soluciones
• Extractos alcohólicos al 80%, 98% y extractos acuosos de C.
crassa procedentes de Perú y Ecuador
• Sustancia de referencia: ácido gálico
• Solución diluida de Folin-Ciocalteu: se tomó 10 ml del reactivo
Folin Ciocalteu y se diluyó a 100 ml con agua destilada.
• Solución de carbonato de sodio 7,5 %: se pesó 75 g de
Na2CO3 anhidro y se disolvió en un litro de agua destilada.
30
Procedimiento
En tubos de ensayos de aproximadamente 50 mL de
capacidad se adicionaron: 200 µL de la muestra (extracto acuoso y
solución de referencia de ácido gálico), 10 mL de solución diluida de
Folin-Ciocalteu y 1,8 mL de agua destilada. Se agitó y esperó cinco
minutos, luego se adicionaron 8 mL de solución 7,5 % de Na2CO3 y
se agitó nuevamente. Se dejó en reposo durante dos horas y se leyó
la absorbancia a 765 nm. El blanco estuvo constituido por las
soluciones señaladas anteriormente sin las muestras de ensayos.
Curva patrón
Se pesaron 500 mg de ácido gálico y se disolvieron en 20 mL
de etanol al 96 %. Se transfirió cuantitativamente a un matraz aforado
de 50 mL y se enrasó con agua destilada. De esta solución
concentrada de ácido gálico se tomaron alícuotas de 1, 2, 3, 4 y 5 mL
y se diluyeron a 100 mL. Estas diluciones correspondieron a las
concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 mg/100 mL de ácido gálico,
con las que se construyó una curva de calibración de absorbancia
contra concentración. El contenido de fenoles totales se expresó en
mg/mL.
III.8.2. Flavonoides totales
Se llevó a cabo por el método colorimétrico del tricloruro de
aluminio (Chang, et al., 2002; Pourmorad, et al., 2006; Kim, 2016).
Muestras y soluciones
• Extractos alcohólicos al 80%, 98% y extractos acuosos de C.
crassa procedentes de Perú y Ecuador
• Solución de tricloruro de aluminio al 10 % en etanol al 96 %
• Solución de acetato de potasio (CH3CO2K) diluida en agua (1
M)
31
• Sustancia de referencia: quercetina y se preparó una solución
madre de 10 mg/mL en etanol al 96 % y de ahí se prepararon
soluciones de 5, 20, 50, 60 y 80 µg/mL.
Procedimiento
En tubos de ensayos se adicionaron: 0,5 mL de extracto o
solución patrón de quercetina; 1,5 mL de etanol al 96 %; 0,1 mL de
tricloruro de aluminio al 10 %; 0,1 mL de acetato de potasio 1 M; 2,8
mL de agua destilada, luego esperar 30 minutos y leer a 415 nm; el
blanco es etanol al 96 % El contenido de flavonoides totales se
expresó en base a quercetina (mg/mL)
III.9. Análisis estadístico
Los resultados correspondientes al control de calidad de los
extractos y las determinaciones de fenoles totales y flavonoides
totales fueron procesados para calcular los valores medios y
desviaciones estándar. Se utilizó el programa Statgraphics®Plus,
versión 5.0, llevándose a cabo un test de normalidad (Kolmogorov-
Smirnov), posteriormente un análisis de varianza a través de ANOVA-
1, para un nivel de confianza del 95 %, y para la comparación de las
medias se utilizó el test de Rangos Múltiples de Duncan.
III.10. Actividad antioxidante
III.10.1. Ensayo FRAP
La capacidad de reducción de los extractos hidroalcohólicos
fue medida acorde al procedimiento descrito por Benzie & Strain
(1996). Las determinaciones fueron de carácter espectrofotométrico,
se empleó un espectrofotómetro UV- visible a una absorbancia de 593
nm.
Materiales y reactivos:
32
• Micropipetas de 5-1000 μL
• Tubos de ensayos
• Acetato de sodio anhidro
• Ácido acético (99,7 %)
• 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) (Aldrich)
• Ácido clorhídrico (37 %)
• FeCl3
• FeSO4 x 7 H2O (sustancia de referencia)
• Ácido ascórbico (99 % pureza, Aldrich) (sustancia de
referencia)
Muestras:
Extractos hidroalcohólicos y acuosos de C. crassa a las
concentraciones de 0,75, 2, 6, 10 y 15 μg/mL.
Procedimiento:
Para conformar el reactivo de FRAP, se mezcló buffer acetato
de sodio 300 mM (pH 3,6), 10 mM de TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina) y
20mM de cloruro férrico (25:2,5:2,5 v:v:v). Se tomaron 30 μL de cada
dilución de los extractos (a las concentraciones de 0,75, 2, 6, 10 y 15
μg/mL) y se mezclaron con 900 μL de la disolución FRAP y 90 μL de
agua destilada. Una vez realizada la mezcla, la reacción que ocurre
mide la reducción del complejo férrico-TPTZ, en la cual el hierro
férrico (Fe3+ - TPTZ) se reduce a ion ferroso a bajo pH, causando la
formación de un complejo ferroso-tripiridiltriazina (Fe2+ - TPTZ) de
color azul intenso con un máximo de absorción a una longitud de
onda de 593 nm. El blanco consistió en 120 μL de agua y 900 μL de
reactivo. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado.
Los resultados fueron expresados como μmol equivalentes de
ácido ascórbico (EAA) y como μmol equivalentes de FeSO4, a partir
del cálculo interpolando la densidad óptica (D.O) de las muestras en
33
las curvas de calibración de ambas sustancias de referencia a las
concentraciones de 100, 200, 400, 800 y 1000 μM. Las lecturas se
realizaron por triplicado a los cuatro minutos.
III.10.2. Ensayo DPPH
Para la determinación cuantitativa se utilizó el método del
radical libre DPPH (radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo). Se empleó un
espectrofotómetro UV- visible y las determinaciones fueron medidas a
517 nm al cabo de los 30 min. (Brand-Williams, et al., 1995; Kedare &
Singh, 2011).
Materiales:
• Micropipetas de 5-1000 μL
• Tubos de ensayos
Reactivos:
• DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidracilo) (Sigma)
• Etanol absoluto calidad para análisis
• Ácido ascórbico (99 % pureza, Aldrich) y Trolox (sustancia de
referencia)
Muestras:
Extractos hidroalcohólicos y acuosos de C. crassa a las
concentraciones de 2, 6, 10, 15 y 20 μg/mL.
Procedimiento:
Se tomaron 10 µL de cada concentración de los extractos (2, 6,
10, 15 y 20 μg/mL) y de las sustancias de referencia a las mismas
concentraciones, se mezclaron con 900 µL del reactivo DPPH (0,075
mg/mL) y 90 µL de etanol absoluto. El blanco consistió en una mezcla
de 900 µL de DPPH y 100 µL de etanol absoluto. La reacción se dejó
en la oscuridad durante 30 minutos en un espectrofotómetro y
34
posteriormente se leyeron las muestras a una longitud de onda de
517 nm. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado.
Los resultados fueron expresados como porcentaje de
inhibición del radical DPPH según la fórmula siguiente:
% de inhibición del radical DPPH = [(Ab - Am)/Ab] x 100
Donde:
Ab: absorbancia del blanco (nm)
Am: absorbancia de la muestra (nm)
Se determinó la concentración inhibitoria media (IC50) con
ayuda del programa estadístico Graphprism 5.0. Valores cercanos a
20 μg/mL se consideran de interés.
III.10.3. Ensayo ABTS●+
Ensayo del ABTS●+ (ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-
6-sulfónico). Se realizó según la metodología de Re, et al., (1999),
Arnao, et al., (2001) y Agudo (2010).
Materiales y reactivos:
• Micropipetas de 5-1000 μL
• Tubos de ensayos
• ABTS (ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6-sulfónico)
• Persulfato de potasio
• Etanol al 96 %
• Ácido ascórbico (99 % pureza, Aldrich) y Trolox (sustancia de
referencia)
Muestras:
Extractos hidroalcohólicos y acuosos de C. crassa a las
35
concentraciones de 100, 300, 400, 500 y 600 μg/mL.
El ensayo fue basado en la habilidad de diferentes sustancias
de secuestrar el radical catiónico ABTS●+, el cual fue preparado
mezclando una solución de ABTS 7mM y persulfato de potasio 2,45
mM (1/1, v/v). La mezcla se mantuvo en la oscuridad por 16 horas
para la formación del radical. La solución ABTS●+ fue diluida con
etanol al 96% hasta lograr una absorbancia de 0,700 ± 0,05 a 734 nm.
Se mezcló 980 µL de la solución de ABTS radicálico con 20 µL
de los extractos ensayados y las sustancias de referencia (ácido
ascórbico y trolox) a las concentraciones de 100, 300, 400, 500 y 600
μg/mL. Se incubó por 30 min para su posterior lectura a 734 nm en un
espectrofotómetro UV- visible. Cada determinación se llevó a cabo
por triplicado
Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición del
radical ABTS●+ según la fórmula siguiente:
% de inhibición = [A734 (ABTS)-A734 (antioxidante)]/A734
(ABTS) x 100
Se determinó la concentración inhibitoria media (IC50) con
ayuda del programa estadístico Graphprism 5.0.
III.11. Análisis estadístico
Los valores experimentales se expresaron como la media ±
desviación estándar (DE). Se utilizó el programa Statgraphics®Plus,
versión 5.0, llevándose a cabo un test de normalidad (Kolmogorov-
Smirnov), posteriormente un análisis de varianza a través de ANOVA-
1, para un nivel de confianza del 95 %, y para la comparación de las
medias se utilizó el test de Rangos Múltiples de Duncan con una p ≤
0,05.
36
37
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV.1. Métodos de extracción y obtención de los extractos
Se utilizó la percolación y maceración por ser métodos muy
empleados en la obtención de extractos y menos agresivos para el
material vegetal, donde no es necesario aplicar temperatura. Para la
selección de los solventes en el proceso de extracción (mezclas
hidroalcohólicas al 80 % y 98 %) se consideró la mayor posibilidad de
aplicación de dichos disolventes y estabilidad de las preparaciones a
partir de la muestra. El método de extracción utilizado para la
obtención de extractos acuosos fue la decocción considerando el uso
dado a la especie y la forma de preparación tradicional.
IV.2. Parámetros físico-químicos de calidad de los extractos
Con el propósito de determinar la calidad de los extractos, se
procedió al análisis de los parámetros físico-químicos.
Tabla I Parámetros físico-químicos de los extractos hidroalcohólicos y acuosos de C. crassa ecuatoriana y peruana
Extractos
Resultados
pH Sólidos
totales (%) Índice de refracción
Densidad
Relativa (g/mL)
EP-98 % - Ec 4,79 ± 0,01a 10,53 ± 0,23f 1,3880 ± 0,0002n 0,9200 ± 0,0001q
EP-98 % - Pe 4,97 ± 0,01b 8,04 ± 0,03g 1,3761 ± 0,0004o 0,8633 ± 0,0050r
EP-80 % - Ec 4,75 ± 0,00a 14,43 ± 0,26h 1,3863 ± 0,0002n 0,9760 ± 0,0001s
EP-80 % - Pe 4,88 ± 0,00c 11,57 ± 0,13i 1,3881 ± 0,0003n 0,9678 ± 0,0001t
EM-98 % - Ec 4,91 ± 0,01d 3,90 ± 0,01j 1,3628 ± 0,0002p 0,8259 ± 0,0001v
EM-98 % - Pe 5,42 ± 0,05e 2,53 ± 0,03k 1,3656 ± 0,0002p 0,8543 ± 0,0003w
EM-80 % - Ec 4,91 ± 0,02d 4,48 ± 0,10l 1,3662 ± 0,0001p 0,8776 ± 0,0002x
EM-80 % - Pe 5,43 ± 0,03e 3,70 ± 0,07m 1,3641 ± 0,0001p 0,8802 ± 0,0008y
EA-Ec 4,51 ± 0,02a 1,67 ± 0,01c 1,3306 ± 0,0001e 1,0166 ± 0,0008g
EA-Pe 4,60 ± 0,04a 1,36 ± 0,04d 1,3293 ± 0,0002f 1,0129 ± 0,0004h
EP: extracto por percolación, EM: extracto por maceración, Pe: Perú, Ec: Ecuador, 98 % y 80 %: mezclas hidroalcohólicas utilizadas, EA: extractos acuosos. Letras iguales
muestran que no existen diferencias significativas (p>0,05) y letras diferentes que si existen diferencias significativas (p<0,05) para pun 95 % de confianza (en la misma
columna). Fuente: Autora
38
Desde el punto de vista de las propiedades organolépticas los
extractos obtenidos por percolación con etanol al 98 % y 80 % se
mostraron como líquidos de color rojo vino intenso y pocos
traslúcidos. Los extractos obtenidos por maceración con ambos
disolventes presentaron el mismo color, pero a la luz visible fueron
traslúcidos. Los extractos acuosos mostraron un color pardo. En todos
los extractos se pudo percibir un olor característico.
La determinación del pH indica el carácter ácido o básico de
una solución, haciéndose necesario su control para garantizar la
estabilidad de un extracto. Los resultados obtenidos oscilaron entre
4,51 y 5,43, mostrándose las características ácidas de las
preparaciones. El comportamiento ácido pudo estar dado por la
presencia de compuestos fenólicos en cuyas estructuras se presentan
grupos funcionales como los hidroxilos fenólicos que aportan esta
característica al medio. Se encontraron diferencias significativas entre
los métodos de percolación y maceración para un mismo disolvente,
independientemente del lugar de procedencia.
Se asigna el término de sólidos totales a la variación de la
masa, debido a la pérdida o eliminación de sustancias volátiles por
acción del calor, mediante un proceso de evaporación de la porción
de ensayo (Miranda & Cuéllar, 2000). Sirve de base para el ajuste de
dosis, en estudios farmacológicos y toxicológicos, cuando no se
conoce la concentración del principio activo que ejerce la acción.
El análisis de varianza mostró diferencias significativas entre
los extractos, siendo mayores para los extractos procedentes de
Ecuador, lográndose mayor contenido de sólidos totales con los
extractos hidroalcohólicos al 80 % obtenidos por el método de
percolación, siendo la muestra procedente de Ecuador la que mostró
el mayor porcentaje. Los resultados pueden asociarse al poder
extractivo del disolvente utilizado, al método de extracción que logró
39
un mayor agotamiento de los metabolitos presentes en la muestra y a
la influencia de factores extrínsecos, especialmente, a las
características del ecosistema donde creció el vegetal, que propició
variaciones en el contenido de metabolitos y por ende en el contenido
de sólidos totales.
El índice de refracción representa la relación entre el seno del
ángulo de incidencia de la luz y el seno del ángulo de refracción
cuando la luz pasa oblicuamente a través del medio. El análisis de
varianza también mostró que existen diferencias significativas entre
los dos métodos de extracción ensayados, donde no fue determinante
el porcentaje de la mezcla hidroalcohólicas.
La densidad relativa indica el peso específico de cada extracto.
Los resultados de esta determinación muestran la presencia de
sustancias extraídas a partir de cada disolvente utilizado. El análisis
estadístico evidenció diferencias significativas entre los métodos
empleados con los dos disolventes utilizados.
Finalmente, se llevó a cabo el análisis capilar, el cual se basa
en el fenómeno de repartición de sustancias a través de los espacios
capilares del material inerte que constituye el papel de filtro.
Constituye un método ingenioso e interesante para la caracterización
de extractos, permitiendo obtener una huella de los mismos (Miranda
& Cuéllar 2000).
Como se puede observar en la figura 2 la altura de la imagen
capilar varía en dependencia del método de extracción utilizado y el
disolvente, mostrándose menor altura en los extractos obtenidos por
percolación, los cuales debido a su viscosidad por el alto contenido de
metabolitos hace que el desplazamiento de los diferentes
componentes del extracto sea menor. Por su parte, las menores
alturas de la imagen capilar estuvieron asociadas a los extractos con
mayor porcentaje de etanol (98 %), debido a una menor afinidad de
40
este disolvente por las fibras de celulosa que constituyen el papel de
filtro.
También se apreciaron variaciones en las tonalidades de las
imágenes y complejidad de las mismas, aspecto que pudiera estar
relacionado con la concentración y tipo de metabolito presente en los
diferentes extractos.
Figura 2 Análisis capilar de los extractos hidroalcohólicos de C. crassa Fuente: Autora
En la figura 3 los dos extractos tuvieron una imagen capilar alta
(≥ 8 cm), siendo menor la altura para el extracto procedente de
Ecuador, dada la mayor concentración del mismo. La franja se
presentó profundamente dentada. No se pudieron distinguir las
diferentes zonas (sub-franja, banda y sub-banda). Frente a los
vapores de amoníaco la imagen se tornó más intensa, lo cual es
indicativo de metabolitos con características ácidas como compuestos
41
fenólicos. Frente a la luz ultravioleta la franja se tornó fluorescente.
Figura 3 Análisis capilar de los extractos Acuosos de C. crassa Fuente: Autora
El análisis capilar brinda información importante sobre los
posibles cambios por alcalinidad, cuando se expone la muestra a
vapores de amoníaco, y la presencia de compuestos con
características fluorescentes, cuando la misma se analiza a la luz
ultravioleta. Frente a los vapores de amoníaco todas las imágenes
intensificaron su color, mostrando tonalidades pardo-amarillentas, lo
cual es indicativo de metabolitos con características ácidas como
compuestos fenólicos. Frente a luz ultravioleta la franja se tornó
fluorescente.
IV.3. Análisis de la composición química de los extractos
IV.3.1. Tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico es una técnica sencilla que permite
identificar los metabolitos presentes en la planta. Se basa en
reacciones de coloración sobre grupos funcionales. No obstante, esta
técnica no es conclusiva debido a la existencia de falsos positivos o
negativos que se pueden presentar. A pesar de esto, continúa siendo
una técnica eficiente en los estudios preliminares y ayuda al
investigador a dirigir sus objetivos de trabajo. En la tabla II y III se
presentan los resultados de los ensayos efectuados a los extractos de
42
C. crassa.
Tabla II Tamizaje fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos de C. crassa
Ensayos
Metabolitos
EP
98%
Ec
EP
98%
Pe
EP
80%
Ec
EP
80%
Pe
EM
98%
Ec
EM
98%
Pe
EM
80%
Ec
EM
80%
Pe
Catequinas Catequinas + + + + + + + +
Espuma Saponinas + + ++ + + + ++ +
Resina Resinas ± ± - - ± ± - -
Ninhidrina Aminoácidos ± ± ± ± ± ± ± ±
Fehling Sustancias
reductoras + + ++ ++ + + ++ ++
FeCl3 Fenoles y/o
taninos ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Lieberman-
Burchard
Triterpenos y/o
esteroides ++ ++ + + ++ ++ + +
Borntrager Quinonas ++ + ++ + + + ++ +
Dragendorff Alcaloides + + ++ ++ + + + +
Mayer Alcaloides + + ++ ++ + + + +
Wagner Alcaloides + + ++ ++ + + + +
Baljet Lactonas y
coumarinas + + + + + + + +
Kedde Cardiotónicos - - - - - - - -
Antocianidinas Antocianidinas + + ++ ++ + + ++ +
Shinoda Flavonoides ++ ++ ++ ++ + + ++ +
EP: extracto por percolación, EM: extracto por maceración, Pe: Perú, Ec: Ecuador, 98 % y 80 %:
mezclas hidroalcohólicas utilizadas.
+ ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo; ±: ensayo dudoso.
Fuente: Autora
Tabla III Tamizaje fitoquímico de los extractos acuosos de C. crassa
Ensayos Metabolitos EA-Ec EA-Pe
Espuma Saponinas + +
Fehling Sustancias reductoras ++ ++
FeCl3 Fenoles y/o taninos ++ ++
Dragendorff Alcaloides - -
Mayer Alcaloides - -
Wagner Alcaloides - -
Shinoda Flavonoides ++ ++
EA: extracto acuoso, Pe: Perú, Ec: Ecuador.
+ ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo;
±: ensayo dudoso.
43
Fuente: Autora
No se apreciaron diferencias en la composición química
determinada por tamizaje fitoquímico en los diferentes extractos, pero
si en las intensidades de color para algunos ensayos, principalmente,
para los extractos obtenidos por percolación en las muestras
procedentes del Ecuador. No obstante, se manifestó de forma muy
evidente la presencia de compuestos de naturaleza fenólica (taninos,
flavonoides), sustancias reductoras, triterpenoides y esteroides.
Dichos compuestos fueron detectados en estudios previos efectuados
a extractos de la especie por Malca, et al, (2015).
Importante destacar la presencia de alcaloides en todos los
extractos, los cuales manifestaron ensayos muy positivos en las
percolaciones efectuadas con mezcla hidroalcohólica al 80 % para los
extractos de ambas procedencias. Entre las acciones farmacológicas
de dichos compuestos se encuentra la acción estimulante sobre el
Sistema Nervioso Central (Díaz, 2017; Marcano, 2018), lo que pudiera
asociarse con la actividad afrodisíaca referida tradicionalmente para la
especie.
IV.3.2. Cromatografía en capa delgada
La cromatografía en capa delgada, dada su sencillez y
recursos necesarios para su desarrollo, resulta de gran utilidad para
ser aplicada en los laboratorios o entidades que trabajan con
productos naturales, ya que suministra un perfil visible e intuitivo de
los constituyentes químicos (Kartik, et al., 2010; Neeraj & Bhupinder,
2011).
El desarrollo cromatográfico de los extractos se realizó con la
fase móvil cloroformo: metanol: n-propanol: agua (5:6:1:6), luego de
varias experiencias con otros sistemas de disolventes y el empleo de
varias condiciones de revelado. En la figura IV se muestra el
cromatograma de los extractos.
44
Todos los extractos mostraron poca complejidad
cromatográfica en examen visual. Al exponer las cromatoplacas a los
vapores de amoníaco (A), todas las manchas intensificaron su color y
algunas se mostraron amarillo-naranjas, algo indicativo de
compuestos con presencia de grupos fenólicos libres. Al igual que los
extractos procedentes de Ecuador y Perú (B)
M: maceración, P: percolación, Ec: Ecuador; Pe: Perú; 98 % y 80 %; A: vapores de amoníaco; B:
FeCl3; C: luz UV254 nm; D: H2SO4/calor;
Figura 4 Cromatografía en capa delgada de los extractos hidroalcohólicos de C. crassa Fuente: Autora
EA: extracto acuoso, Ec: Ecuador, Pe: Perú; A: revelado con H2SO4/calor; B: revelado frente a vapores de amoníaco
EA-Pe EA-Ec EA-Ec EA-Pe
A B
45
Figura 5 Cromatografía en capa delgada de los extractos acuosos de C. crassa Fuente: Autora
El revelado con tricloruro férrico al 5 % en agua (B) mostró
manchas de color verde negruzco, lo que sugiere compuestos
fenólicos derivados del catecol, así como otras de color pardo-rojizo
en el punto de aplicación, propio también de este tipo de compuesto,
fundamentalmente, glicosilados (Lock, 1988; Miranda & Cuéllar,
2001).
En el revelado físico mediante luz UV (C) se observó en todas
las muestras evaluadas fluorescencia en un gran número de
manchas, lo cual confirma la presencia de moléculas con grupos
cromóforos conjugados en su estructura. Las coloraciones entre
parda-amarillenta y naranja pudieran estar relacionadas con
compuestos de naturaleza fenólica.
Con ácido sulfúrico al 5 % en etanol y la posterior exposición al
calor, se observó una buena visualización de todas las manchas
presentes en los extractos hidroalcohólicos (D), destacándose una
mancha de Rf 0,6, de color violeta-rojiza común en todos los extractos
que pudiera estar asociada a estructura tipo triterpenoides. Otras
manchas de color marrón y rojizas fueron detectadas que pudieran
estar relacionadas con compuestos fenólicos y con estructuras de tipo
triterpénica. En los extractos acuosos (ver anexo E) de las dos
localidades se hizo notorio una coloración negruzca lo que se puede
deducir la presencia de compuestos fenólicos (Lock, 1988).
Respecto al comportamiento cromatográfico de los extractos,
es de señalar que la fase móvil empleada logró separar los
componentes según su polaridad, pudiendo sugerir un perfil similar en
una misma muestra, independientemente del método de extracción y
el disolvente empleado. Por otra parte, también se apreciaron otras
manchas retenidas en el punto de aplicación, algo indicativo de
46
compuestos muy polares, como metabolitos glicosilados.
Es importante destacar que los extractos vegetales suelen ser
muy complejos en cuanto a su composición química. Como
consecuencia, los metabolitos presentes pueden solaparse entre si no
logrando buenas resoluciones en muchas ocasiones, pues es común
que una mancha esté compuesta por varios de ellos, por dichas
razones se requieren otros métodos que permitan complementar el
perfil fitoquímico de un extracto determinado.
IV.4. Métodos de análisis espectroscópicos
IV. 4.1. Espectroscopia ultravioleta visible (uv-visible)
La espectroscopía ultravioleta visible de los extractos
hidroalcohólicos procedentes del Ecuador, por maceración y
percolación (figura 6 y 7); además, del extracto acuoso (figura 8)
reveló, que los mismos tenían una apariencia espectral similar, con
dos absorciones fundamentales, una entre 281,5 nm y 319,5 nm. Este
comportamiento pudiera estar relacionado con la presencia de
compuestos fenólicos en los extractos, especialmente, flavonoides,
los cuales exhiben dos bandas en la región del ultravioleta/visible, la
banda I que aparece en un rango de los 300 a 400 nm y la banda II,
ubicada entre los 200 y 285 nm (Lock, 1988; Markham, 1989; roj;
Martínez et al., 2012).
47
Figura 6 Espectros UV-Visibles de los extractos hidroalcohólicos de C. crassa obtenidos por maceración Fuente: Autora
Figura 7 Espectros UV-Visibles de los extractos hidroalcohólicos de C. crassa
obtenidos por percolación Fuente: Autora
Por su parte, los extractos hidroalcohólicos procedentes de
Perú (figura 6 y 7) manifestaron una banda importante alrededor de
los 280 nm, que es típica de todos los compuestos orgánicos
naturales que tienen un anillo aromático; también está relacionada
con la presencia de grupos carbonilos insaturados o fenoles
insaturados. Presentó igual comportamiento el espectro obtenido de
extractos acuosos (figura 8) (anexo E).
Extracto acuoso- Ecuador
Extracto acuoso- Perú
48
Figura 8 Espectros UV-Visibles de los extractos acuosos de C. crassa Fuente: Autor
El análisis por UV-Visible mostró diferencias en la apariencia
espectral de los extractos con respecto al lugar de procedencia, sin
embargo, los métodos de extracción y los disolventes utilizados no
provocaron variaciones en los espectros. Es importante destacar que
esta técnica, aunque es útil para la caracterización fitoquímica,
solamente ofrece una orientación respecto a la posible presencia de
grupos funcionales.
IV.4.2. Espectroscopia infrarroja (IR)
Al analizar los extractos hidroalcohólicos (figura 9 y 10), se
observó una banda ancha e intensa entre 3500 y 3200 cm-1,
indicativa de las vibraciones de valencia de alcoholes o fenoles
asociados. Entre 3000 y 2800 cm-1, se apreciaron bandas indicativas
de vibraciones de valencia C-H. También se visualizó una banda
alrededor de los 1600-1500 cm-1 que pudieran estar relacionadas con
las vibraciones de valencia de C–C de compuestos con dobles
enlaces, entre ellos, compuestos con agrupamiento aromático. Se
constató una banda entre los 1200 y 1000 cm-1, aproximadamente,
indicativa de la presencia de enlaces C-O, principalmente de fenoles.
Otras bandas en la región de 900-690 cm-1, las mismas pueden
relacionarse con sustituciones en el agrupamiento aromático (Lock,
1988; Wong, 2015; Dahlbacka, 2018).
Figura 9 Espectros infrarrojos de los extractos hidroalcohólicos de
49
C. crassa por maceración Fuente: Autora
Figura 10 Espectros infrarrojos de los extractos hidroalcohólicos de C. crassa por percolación Fuente: Autora
Las diferencias estuvieron asociadas al lugar de procedencia
del extracto y no al método y disolvente empleado. Los extractos
provenientes de Perú, manifestaron varias bandas en la región de
900- 650 cm-1, en contraste con los extractos de Ecuador.
En el barrido espectral de los extractos acuosos (figura 11 y
12), se pudo identificar señales de compuestos dentro de la
frecuencia 3305.51cm-1 obteniendo vibración de estiramiento del
enlace O-H, presentando una banda abundante dentro de esta zona,
siendo característico de un polimerico, también pueden esperarse la
presencia de las vibraciones de valencia de alcoholes o fenoles
asociados en rangos de 3500-3200 cm-1. La segunda señal con
mayor frecuencia se la encontró en la sección 2340-2130.84 cm-1,
siendo enlaces carbonimida –N=C=N- de naturaleza aromático, los
aromáticos dan doblete asimétrico. En la posición 1636.59 se logra
identificar una señal intensa, característica del grupo carbonilo,
provocando un estiramiento del carbonilo R-C=O, el grupo funcional
que se pudo notar en esta posición es la cetonas que presentan rango
de frecuencia de 1765-1540 cm-1 (Ver anexo F) (Meñaca, Restrepo,
50
& Colmenares, 2015).
Figura 11 Espectros infrarrojos de los extractos acuosos de C. crassa ecuatoriana Fuente: Autora
Figura 12 Espectros infrarrojos de los extractos acuosos de C. crassa peruana
Fuente: Autora
Es de notar, que los extractos manifestaron un perfil IR con
varias bandas coincidentes, pero con diferencias en la intensidad y
ancho de las mismas; pudiendo sugerir en todos los casos la
presencia de compuestos de naturaleza fenólica.
IV.5. Determinaciones espectrofotométricas
Como parte importante del control de la calidad de los
extractos y dentro de los métodos usados para valorar su perfil
EA- Ecuador
EA- Perú
51
Concentración de ácido gálico (mg/100 mL)
Absorb
ancia
0 10 20 30 40 50
0
0,2
0,4
0,6
0,8
químico, se cuantificó el contenido de fenoles totales y flavonoides
totales, metabolitos ampliamente distribuidos en el reino vegetal.
También se consideraron los resultados obtenidos en el análisis por
tamizaje fitoquímico, cromatografía en capa delgada, análisis
espectroscópicos, así como los informes en la literatura sobre la
composición química de la especie.
IV.5.1. Contenido de fenoles totales
El contenido de fenoles totales en los extractos fue
determinado por el método de Folin-Ciocalteau, donde el reactivo
utilizado es una mezcla de ácidos de coloración amarilla
(fosfowolfrámico y fosfomolíbdico), que, al reaccionar con los
compuestos fenólicos presentes en una preparación, dan lugar a
óxidos de color azul (óxidos de wolframio y molibdeno) que exhiben
un máximo de absorción a 765 nm, lo cual permite su cuantificación
por espectroscopía de UV/VISIBLE. La intensidad de la absorción de
luz a esa longitud de onda, es proporcional a la concentración de
compuestos fenólicos, la cual se expresa en equivalentes de ácido
gálico (Martínez, et al., 2000).
En la figura 13 se muestra la curva de calibración del estudio.
Se logró una buena correlación entre las concentraciones ensayadas
de la sustancia de referencia (ácido gálico) y las absorbancias,
obteniendo una ecuación de la recta: Y=0,0129X+0,0236, con un
coeficiente de correlación de 0,9993 (≥0,99).
Y=0,0129X+0,0236 R2=0,9993
52
Figura 13 Curva de calibración del ácido gálico para la determinación de fenoles
totales
Fuente: Autora
El análisis estadístico de los resultados permitió constatar
diferencias significativas en el contenido de dichos metabolitos en los
extractos evaluados, siendo mayor la concentración para los extractos
hidroalcohólicos al 80 % de Ecuador y Perú obtenido por el método de
percolación. En la tabla IV se evidencian las cuantificaciones
efectuadas.
Tabla IV Contenido de fenoles totales en los extractos de C. crassa
Extractos
Concentración de fenoles totales
mg/mLX+-DS_
EP-98 % - Ec 32,05 ± 0,16a
EP-98 % - Pe 32,11 ± 0,12a
EP-80 % - Ec 43,52 ± 0,10b
EP-80 % - Pe 43,28 ± 0,16c
EM-98 % - Ec 12,72 ± 0,12d
EM-98 % - Pe 11,18 ± 0,42e
EM-80 % - Ec 15,22 ± 0,04f
EM-80 % - Pe 14,62 ± 0,06g
EA – Ec 14,90 ± 0,12a
EA – Pe 10,92 ± 0,23b
EP: extracto por percolación, EM: extracto por maceración, Pe: Perú, Ec: Ecuador, 98 % y 80 %:
mezclas hidroalcohólicas utilizadas. Letras iguales muestran que no existen diferencias
significativas y letras diferentes que si existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
Fuente: Autora
Teniendo en cuenta el método de extracción ensayado, la
percolación permitió un mayor agotamiento de la muestra, lo cual se
reflejó en el mayor contenido de fenoles totales. Por otra parte, al
analizar el lugar de procedencia, se pudo constatar que los extractos
provenientes de Ecuador mostraron el mayor porcentaje de dichos
metabolitos, lo que pudiera estar relacionado con el ecosistema
donde se desarrolló el vegetal, que propició mayor producción de
53
estos metabolitos (Ver anexo G).
IV.5.2. Flavonoides totales
Los flavonoides totales en los extractos fueron determinados
por el método colorimétrico del tricloruro de aluminio. En esta prueba
los flavonoides reaccionan con el cloruro de aluminio en etanol,
produciendo un complejo de color amarillo que posee un pico de
absorción de luz a 415 nm. La concentración se expresa equivalente
a quercetina. En la figura 14 se muestra la curva de calibración
obtenida para la sustancia de referencia.
Figura 14 Curva de calibración de la quercetina para la determinación de flavonoides totales Fuente: Autora
Se logró una buena correlación entre las concentraciones
ensayadas del patrón de quercetina y las absorbancias, obteniendo
una ecuación de la recta Y=0,0036X-0,0102, con un coeficiente de
correlación de 0,9988 (≥0,99); esto es indicativo del buen ajuste de la
ecuación del modelo de los datos experimentales.
También se constaron diferencias estadísticamente
significativas, alcanzándose el mayor valor parta el extracto
hidroalcohólico al 80 % procedente de Ecuador, obtenido por el
método de percolación. Las diferencias pudieran estar asociadas con
el poder extractivo de los disolventes, el método de extracción
utilizado y la procedencia de las muestras evaluadas (Tabla V).
Y=0,0036X-0,0102 R2=0,9988
54
Tabla V Contenido de flavonoides totales en los extractos de C. crassa
Extractos
Concentración de flavonoides totales
mg/mLX+-DS_
EP-98 % - Ec 4,85 ± 0,07a
EP-98 % - Pe 3,84 ± 0,04b
EP-80 % - Ec 5,81 ± 0,07c
EP-80 % - Pe 4,02 ± 0,04d
EM-98 % - Ec 1,65 ± 0,03e
EM-98 % - Pe 1,32 ± 0,02f
EM-80 % - Ec 1,81 ± 0,01g
EM-80 % - Pe 1,79 ± 0,01g
EA - Ec 2,37 ± 0,07a
EA - Pe 1,63 ± 0,02b
EP: extracto por percolación, EM: extracto por maceración, Pe: Perú, Ec: Ecuador, 98 % y 80 %:.
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen
diferencias significativas para un 95 % de confianza.
Fuente: Autora
IV.4. Actividad antioxidante
La actividad antioxidante de extractos de plantas depende
grandemente de su composición y del sistema de prueba. Es
necesario realizar más de un tipo de ensayo para medir la capacidad
antioxidante y así tener una medida del mecanismo de acción
antioxidante (Song et al., 2010). Existen varios métodos para este
análisis, entre los más utilizados se encuentran FRAP, DPPH y ABTS.
Como sustancias de referencias se utilizaron la vitamina C y el
trolox. La vitamina C es un potente antioxidante soluble en agua que
se asocia con varios efectos beneficiosos en el sistema inmune, en el
proceso de envejecimiento, en la integridad endotelial y en el
metabolismo de las lipoproteínas. El trolox es un antioxidante soluble
en agua, que se sintetizó como un derivado de la vitamina E y se ha
utilizado como un antioxidante estándar para estos ensayos de
55
capacidad antioxidante (Ver anexo H).
IV.4.1. Actividad antioxidante por el método de FRAP
La actividad antioxidante por la técnica FRAP se basa en el
poder reductor de un antioxidante que reduce el ion férrico (Fe3+) a
ion ferroso (Fe2+), formando un complejo azul. Una absorción alta a
una longitud de onda de 593 nm indica un poder de reducción alto del
fitoquímico, es decir, una actividad antioxidante alta (Roginsky & Lissi,
2005).
Todos los extractos a las cinco concentraciones ensayadas
mostraron desde el punto de vista cualitativo un cambio del color a
azul intenso. Este comportamiento se debe a la presencia de
sustancias antioxidantes que redujeron el ion férrico del complejo
Fe3+-TPTZ a ion ferroso, formándose el complejo Fe2+-TPTZ.
Los resultados expresaron la capacidad reductora del catión
Fe3+ de cada extracto, como μM equivalentes de ácido ascórbico y
μM equivalentes de FeSO4 (sustancias de referencias utilizadas y
reconocidas por tener un alto valor antioxidante), a partir de las curvas
de calibración de dichos patrones obtenidas por regresión lineal
(figura 15) con sus respectivas ecuaciones, donde Y es la
absorbancia y X la concentración.
Se logró una buena correlación entre las concentraciones
ensayadas de las sustancias de referencia y las densidades ópticas,
con un coeficiente de correlación ≥0,99; esto es indicativo del buen
ajuste de la ecuación del modelo de los datos experimentales.
56
Figura 15 Curvas de calibración del ácido ascórbico y el FeSO4 para la determinación de la capacidad antioxidante por FRAP
Fuente: Autora
En la tabla VI se muestran los resultados del ensayo de FRAP
asociada a los extractos, expresados como μM equivalentes de ácido
ascórbico. Se evidenció actividad ferro-reductora de manera
concentración-dependiente, alcanzándose la mayor actividad
antioxidante a la concentración de 15 μg/mL. El análisis estadístico
permitió constatar diferencias significativas entre algunos extractos a
una misma concentración, fundamentalmente, cuando se cambia el
disolvente de extracción.
Tabla VI Actividad ferro-reductora de los extractos de C. crassa expresada en μM equivalentes de ácido ascórbico.
Extractos
μM equivalentes de ácido ascórbico ± DE
Concentraciones (μg/mL)
0,75 2 6 10 15
EP-98%-Ec 345,0 ± 16,4a 425,0 ± 20,7ac 538,3 ± 30,8a 750,8 ± 26,4a 972,5 ± 21,3a
EP-98%-Pe 359,2 ± 31,5a 405,0 ± 25,1a 554,2 ± 25,2a 729,1 ± 48,7a 955,0 ± 25,0a
EP-80%-Ec 441,7 ± 13,8b 588,3 ± 30,1b 813,3 ± 33,7b 950,0 ± 94,1b 1206,7 ± 25,0b
EP-80%-Pe 429,2 ± 26,3b 467,6 ± 28,5c 635,0 ± 12,9c 903,3 ± 26,2b 1105,8 ± 34,4c
EM-98%-Ec 143,4 ± 12,6cd 184,2 ± 31,4de 258,3 ± 48,2d 580,0 ± 27,5c 649,1 ± 26,4d
EM-98%-Pe 140,8 ± 10,1c 169,2 ± 31,4d 215,0 ± 31,9d 557,5 ± 47,6ce 635,8 ± 40,6d
EM-80%-Ec 176,7 ± 30,1d 213,3 ±28,9e 386,7 ± 40,4e 532,5 ± 8,6ce 874,1 ± 23,6e
EM-80%-Pe 137,5 ± 7,5c 181,7 ± 1,5de 326,7 ± 22,5f 508,3 ± 17,7e 775,0 ± 33,8f
EA-Ec 246,7 ± 20,2e 465,0 ± 23,8c 739,2 ± 21,8g 829,1 ± 18,7f 1019,1 ± 13,7g
57
EA-Pe 240,8 ± 23,2e 458,3 ± 30,1c 726,7 ± 40,7g 770,0 ± 24,6af 940,0 ± 13,9a
Se indica la media (n=3) ± desviación estándar (DE). Letras diferentes en una columna para la misma
concentración indica diferencias significativas y letras iguales que no existen diferencias significativas
(p≤ 0,05), según Duncan
Fuente: Autora
En la figura 16 se muestra como los extractos obtenidos por
percolación, utilizando como disolvente mezcla hidroalcohólica al 80%
son los que presentan mayor μM equivalentes de ácido ascórbico,
seguido de los extractos acuosos. Las muestras procedentes de
Ecuador mostraron la mayor actividad.
Figura 16 Actividad antioxidante por FRAP de los extractos de C. crassa expresada como μM equivalentes de ácido ascórbico
Fuente: Autor
En la tabla VII se reflejan los resultados del ensayo de FRAP
asociada a los extractos, expresados como μM equivalentes de
sulfato de hierro. Se evidenció actividad ferro-reductora de manera
concentración-dependiente, alcanzándose la mayor actividad
antioxidante a la concentración de 15 μg/mL. El análisis estadístico
también permitió constatar diferencias significativas entre algunos
extractos a una misma concentración, fundamentalmente, cuando se
cambia el disolvente de extracción.
Tabla VII Actividad ferro-reductora de los extractos de C. crassa expresada en μM equivalentes de FeSO4
Extractos
μM equivalentes de FeSO4± DE
Concentraciones (μg/mL)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0,75 2 6 10 15
μM
eq
uiv
alen
tes
de
ácid
o
ascó
rbic
o
Concentración (μg/ml)
EP-98%-Ec
EP-98%-Pe
EP-80%-Ec
EP-80%-Pe
EM-98%-Ec
EM-98%-Pe
EM-80%-Ec
EM-80%-Pe
EA-Ec
EA-Pe
58
0,75 2 6 10 15
EP-98%-Ec 295,5 ± 14,9a 368,2 ± 18,6af 538,3 ± 30,8a 664,4 ± 24,0a 865,9 ± 19,4af
EP-98%-Pe 308,3 ± 28,5a 350,0 ± 22,7a 485,6 ± 22,8b 644,7 ± 44,3a 850,0 ± 22,7a
EP-80%-Ec 372,0 ± 23,8b 415,9 ± 20,4b 559,1 ± 11,8a 803,0 ± 23,8b 987,1 ± 31,3b
EP-80%-Pe 383,4 ± 12,5b 516,7 ± 27,4c 721,2 ± 30,6c 887,9 ± 29,3c 1078,8 ± 22,8c
EM-98%-Ec 112,1 ± 11,4cd 149,3 ± 28,5de 216,7 ± 43,8d 509,1 ± 25,0d 572,0 ± 24,0d
EM-98%-Pe 109,9 ± 9,1c 135,6 ± 13,3d 177,3 ± 29,0d 488,7 ± 3,3de 559,9 ± 36,9d
EM-80%-Ec 142,4 ± 27,4d 175,8 ± 26,2e 333,4 ± 36,7e 465,9 ± 7,8de 749,3 ± 21,4e
EM-80%-Pe 106,8 ± 6,8c 147,0 ± 10,5de 278,8 ± 20,5f 444,0 ± 16,1e 686,4 ± 30,7f
EA-Ec 206,1 ± 18,3e 404,6 ± 21,6f 653,8 ± 19,8g 735,6 ± 17,0f 893,2 ± 17,1g
EA-Pe 209,9 ± 17,3e 398,5 ± 27,4f 642,4 ± 37,0g 681,8 ± 22,3a 836,4 ± 12,6a
Se indica la media (n=3) ± desviación estándar (DE). Letras diferentes en una columna para la misma
concentración indica diferencias significativas y letras iguales que no existen diferencias significativas
(p≤ 0,05), según Duncan
Fuente: Autora
En la figura 17 se representa el comportamiento de los
diferentes extractos, evidenciándose que los extractos elaborados con
mezcla hidroalcohólica al 80 %, seguido de los extractos acuosos,
fueron los que alcanzaron la mayor actividad antioxidante equivalente
a FeSO4.
Figura 17 Actividad antioxidante por FRAP de los extractos de C. crassa expresada como μM equivalentes de FeSO4
Fuente: Autora
0
200
400
600
800
1000
1200
0,75 2 6 10 15
μM
eq
uiv
alen
tes
de
FeSO
4
Concentración (μg/ml)
EP-98%-Ec
EP-98%-Pe
EP-80%-Ec
EP-80%-Pe
EM-98%-Ec
EM-98%-Pe
EM-80%-Ec
EM-80%-Pe
EA-Ec
EA-Pe
59
IV.4.2. Actividad antioxidante por el método de DPPH
En la técnica del DPPH ocurre una reducción de dicho radical,
que se monitorea por la disminución en la absorbancia a una longitud
de onda característica. En su forma de radical libre, el DPPH• absorbe
a 517 nm y cuando sufre reducción por un antioxidante esta absorción
desaparece. En consecuencia, la desaparición del DPPH• proporciona
un índice para estimar la capacidad del compuesto de prueba para
atrapar radicales (Bokhari, et al., 2013; Afsar, et al., 2018).
Desde el punto de vista cualitativo se pudo apreciar cambio de
coloración de púrpura a amarillo en los dos extractos evaluados a
medida que aumentaba la concentración de las muestras ensayadas.
Esto es causado por la presencia de sustancias antirradicales que
redujeron el radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) en conjunto con
la pérdida de absorbancia en la disolución.
En la figura 18 se muestra un gráfico de % de inhibición del
radical DPPH contra concentración para cada extracto y sustancias
de referencias ensayados. Existe una tendencia al aumento de la
capacidad de inhibición de dicho radical a medida que aumenta la
concentración, siendo mayor la actividad antioxidante para los
extractos hidroalcohólicos al 80 % por percolación a las
concentraciones de 2 a 10 μg/mL, donde a partir de las cuales la
vitamina C y el Trolox, alcanzan el mayor porcentaje de inhibición.
60
Figura 18 Comportamiento de la capacidad secuestradora del radical DPPH de los extractos de C. crassa y las sustancias de referencias
Fuente: Autora
Como se puede observar en la tabla VIII, en términos
generales se presentaron diferencias significativas entre las muestras
a una misma concentración. Los extractos elaborados por el método
de percolación con etanol al 80% manifestaron a las menores
concentraciones (2 y 6 μg/mL) porcentajes de inhibiciones mayores
del 60%, significativamente superiores a los dos patrones ensayados.
No obstante, los otros extractos evidenciaron también un buen poder
antioxidante por esta técnica.
De las muestras evaluadas, las que presentaron menor IC50
(valor de concentración al cual se alcanza el 50 % de inhibición del
efecto máximo de secuestro de DPPH) fueron los extractos
hidroalcohólicos al 80% obtenidos por percolación procedentes de
Ecuador y Perú con valores de 5,51 y 5,73 μg/mL, respectivamente.
Tabla VIII Capacidad secuestradora del radical DPPH de los extractos de C. crassa
Extractos
Porciento de secuestro del radical DPPH (%) ± DE
Concentraciones (μg/mL)
2 6 10 15 20 IC50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2 6 10 15 20
% d
e In
hib
ició
n d
e D
PP
H
Concentración (μg/ml)
EP-98%-Ec
EP-98%-Pe
EP-80%-Ec
EP-80%-Pe
EM-98%-Ec
EM-98%-Pe
EM-80%-Ec
EM-80%-Pe
EA-Ec
EA-Pe
Trolox
Vitamina C
61
EP-98%-Ec 61,2 ± 0,6a 69,1 ± 1,5a 74,5 ± 0,4a 74,5 ± 0,1a 75,8 ± 0,2a 6,45
EP-98%-Pe 60,8 ± 1,0a 69,3 ± 0,2b 70,0 ± 0,5b 73,4 ± 0,4b 74,9 ± 0,2b 5,91
EP-80%-Ec 65,9 ± 0,3b 74,4 ± 0,2c 76,7 ± 0,3c 77,8 ± 0,4c 79,9 ± 0,5c 5,51
EP-80%-Pe 64,6 ± 0,3c 71,8 ± 0,1d 74,9 ± 0,2da 75,3 ± 0,2d 77,4 ± 0,3d 5,73
EM-98%-Ec 53,8 ± 2,3d 64,6 ± 0,3eg 70,0 ± 0,2b 71,8 ± 0,1e 73,5 ± 0,3eg 5,76
EM-98%-Pe 55,4 ± 1,4d 63,7 ± 0,4fh 68,4 ± 0,2e 71,5 ± 0,2e 72,6 ± 0,4fh 6,33
EM-80%-Ec 55,8 ± 1,7d 65,9 ± 0,2g 70,8 ± 0,2f 72,6 ± 0,3f 74,2 ± 0,8bg 5,80
EM-80%-Pe 54,3 ± 1,0d 64,3 ± 0,2e 68,8 ± 0,4e 71,7 ± 0,4e 73,3 ± 0,5ef 6,06
EA-Ec 63,0 ± 0,8f 63,6 ± 0,4f 70,4 ± 0,2f 70,4 ± 0,1g 74,0 ± 0,5g 9,55
EA-Pe 62,7 ± 0,1f 64,2 ± 0,1h 66,2 ± 0,2g 68,6 ± 0,1h 72,3 ± 0,6h 11,57
Trolox 60,2 ± 0,3a 69,3 ± 0,2b 75,8 ± 0,3h 80,1 ± 0,2i 82,0 ± 0,9i 6,90
Vitamina C 48,4 ± 0,2i 64,8 ± 0,1g 74,2 ± 0,3a 76,0 ± 0,2j 78,6 ± 0,2j 5,74
Se indica la media (n=3) ± desviación estándar (DE). Letras diferentes en una columna para la
misma concentración indica diferencias significativas y letras iguales que no existen diferencias
significativas (p≤ 0,05), según Duncan.
IC50 : concentración inhibitoria media
Fuente: Autora
Según esta técnica, se considera de interés las muestras que
en una concentración cercana a 20 µg/mL inhiben el 50 % de la
decoloración del DPPH, por lo que se pude considerar que, en estas
condiciones de trabajo, todos los extractos presentan un buen poder
antioxidante.
IV.4.3. Actividad antioxidante por el método de ABTS
Durante el desarrollo de este método, se observó una
decoloración del radical catiónico ABTS•+ a todas las concentraciones
evaluadas, debido a la capacidad de las muestras de neutralizar dicho
radical, esto se ve reflejado en un descenso de absorbancia y una
disminución del color azul-verde intenso hasta su decoloración.
En la figura 19 se muestra el % de inhibición del radical
ABTS•+ contra concentración para cada extracto y la sustancia de
referencia evaluada. Existe una tendencia al aumento de la capacidad
de inhibición de dicho radical a medida que aumenta la concentración.
62
Figura 19 Comportamiento de la capacidad secuestradora del radical ABTS de los extractos de C. crassa y las sustancias de referencia
Fuente: Autora
En la tabla IX se presentan los porcentajes de inhibición del
radical ABTS, lográndose una capacidad de secuestro superior al
50% a partir de la concentración de 300 μg/mL para todas las
muestras. De los extractos ensayados los de percolación con etanol al
80% mostraron la mayor actividad antirradicalaria, incluso, con
valores similares a la vitamina C y trolox a la máxima concentración.
De las muestras evaluadas, las que presentaron menor IC50
(valor de concentración al cual se alcanza el 50 % de inhibición del
efecto máximo de secuestro de ABTS) fueron, la sustancia de
referencia Vitamina C y los extractos hidroalcohólicos al 80 %
elaborados por percolación procedentes de Ecuador y Perú, con
valores de 303,90, 331,60 y 333,90 y μg/mL, respectivamente,
indicando los mejores efectos antioxidantes, lo que se traduce en una
buena habilidad para secuestrar el radical ABTS.
Tabla IX Capacidad secuestradora del radical ABTS●+ de los extractos de C. crassa
Extractos
Porciento de secuestro del radical ABTS●+ (%) ± DE
Concentraciones (μg/mL)
0
20
40
60
80
100
120
100 300 400 500 600
% d
e In
hib
ició
n d
e A
BTS
Concentración (μg/ml)
EP-98%-Ec
EP-98%-Pe
EP-80%-Ec
EP-80%-Pe
EM-98%-Ec
EM-98%-Pe
EM-80%-Ec
EM-80%-Pe
EA-Ec
EA-Pe
Vitamina C
Trolox
63
100 300 400 500 600 IC50
EP-98%-Ec 66,1 ± 1,3a 75,9 ± 1,4a 84,9 ± 1,6a 92,4 ± 0,8abg 93,5 ± 0,7ad 336,00
EP-98%-Pe 64,8 ± 1,1a 72,6 ± 0,8b 84,4 ± 1,4a 91,4 ± 0,3a 93,4 ± 0,8ad 350,30
EP-80%-Ec 66,8 ± 1,9a 77,6 ± 1,2a 87,9 ± 2,3b 93,8 ± 0,8bg 96,0 ± 1,1b 331,60
EP-80%-Pe 65,2 ± 0,8a 76,5 ± 1,5a 87,4 ± 1,3ba 92,0 ± 1,4ab 96,0 ± 0,8b 333,90
EM-98%-Ec 45,5 ± 1,1bf 58,0 ± 0,8c 72,6 ± 0,8cd 89,7 ± 0,6ca 91,2 ± 0,4cd 360,40
EM-98%-Pe 44,2 ± 0,7b 57,3 ± 0,4c 71,6 ± 1,5cd 87,4 ± 1,2dc 90,2 ± 1,3cd 359,20
EM-80%-Ec 46,2 ± 2,4bf 62,4 ± 1,9d 74,1 ± 2,1d 88,6 ± 1,5dc 91,3 ± 0,9cd 344,30
EM-80%-Pe 48,2 ± 2,1c 62,8 ± 2,0d 73,2 ± 3,4cd 88,3 ± 2,4dc 91,3 ± 1,8cd 352,50
EA-Ec 30,5 ± 1,2e 51,4 ± 0,5f 70,5 ± 1,0cf 75,3 ± 1,8e 93,6 ± 0,7ed 357,80
EA-Pe 35,1 ± 1,5d 49,7 ± 0,6e 71,5 ± 0,5cd 72,7 ± 1,5f 91,9 ± 1,3d 371,80
Vitamina C 48,1 ± 1,7f 70,5 ± 1,1g 90,2 ± 0,9e 94,3 ± 0,3b 95,2 ± 0,7eb 303,90
Trolox 42,0 ± 1,4g 63,7 ± 0,6d 68,5 ± 1,2f 93,0 ± 0,1g 94,7 ± 0,5eb 346,40
Se indica la media (n=3) ± desviación estándar (DE). Letras diferentes en una columna para la
misma concentración indica diferencias significativas y letras iguales que no existen diferencias
significativas (p≤ 0,05), según Duncan
IC50 : concentración inhibitoria media
Fuente: Autora
Se cree que el estrés oxidativo es un importante contribuyente
a la patogénesis de varias enfermedades crónicas, y es por esta
razón que el comportamiento antioxidante es una de las actividades
biológicas más comúnmente determinadas en extractos de plantas.
Una amplia variedad de ensayos de antioxidantes se utiliza para
determinar la actividad antioxidante de los extractos de plantas, dos
de los cuales se basan en la eliminación del radical DPPH (2,2-difenil-
1-picrilhidrazilo) (ensayo DPPH) y el potencial de actividad de
reducción férrica (ensayo FRAP). Muchos utilizan los ensayos DPPH
y FRAP en sus programas de detección de la actividad de las plantas,
presumiblemente suponiendo que una combinación de los datos
proporcionaría una mejor descripción de la actividad antioxidante que
la obtenida de un único ensayo (Clarke, et al., 2013).
Por otra parte, los métodos ABTS y DPPH se correlacionan
entre si ya que se basan en una de las estrategias más aplicadas en
la medida in vitro de la capacidad antioxidante total de un compuesto,
64
mezcla o alimento, la cual consiste en determinar la actividad del
antioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radical,
por lo que el cambio de la intensidad del color ocurre de forma
proporcional con la concentración de antioxidantes de la muestra
(Kuskoski, et al., 2005).
El sinergismo entre los antioxidantes de una mezcla provoca
que la actividad antioxidante no solo dependa de su concentración
sino de la interacción entre ellos. La capacidad antioxidante de un
extracto no viene dada solo por la suma de las capacidades
antioxidantes de cada uno de sus componentes, también depende del
microambiente en que se encuentran los mismos. Los compuestos
interactúan entre sí pudiendo producirse efectos sinérgicos o
inhibitorios (Kuskoski, et al., 2005).
65
CONCLUSIONES
➢ Se determinaron los principales parámetros físico-químicos de
calidad de los extractos en función de los métodos de extracción
ensayados, encontrándose diferencias, fundamentalmente en el
contenido de sólidos totales para los extractos hidroalcohólicos al
80%, elaborados por el método de percolación.
➢ Se identificó a través del tamizaje fitoquímico, métodos
cromatográficos y espectrofotométricos los principales metabolitos
secundarios presentes en los extractos. Se observaron algunas
similitudes y diferencias entre ellos; sugirieron la presencia
mayoritaria de flavonoides y fenoles en general, con diferencias en
la concentración de los mismos según el método de extracción,
disolvente utilizado y lugar de procedencia. Siendo los extractos
provenientes de Ecuador los que mostraron el mayor porcentaje de
dichos metabolitos, lo que pudiera estar relacionado con el
ecosistema donde se desarrolló el vegetal.
➢ Los extractos evaluados manifestaron una elevada actividad
antioxidante por los tres métodos ensayados (FRAP, DPPH y
ABTS), con resultados similares o superiores a las sustancias de
referencia (Vitamina C y Trolox). Los extractos hidroalcohólicos al
80% procedente de Ecuador elaborados por percolación mostraron
la mayor capacidad antioxidante.
66
RECOMENDACIONES
➢ Estandarizar los parámetros de calidad de los extractos para el
desarrollo de futuras monografías de la especie.
➢ Profundizar en el estudio de los componentes químicos de la
planta.
➢ Evaluar otros métodos antioxidantes que permitan medir el real
alcance de la actividad.
67
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ANEXOS
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Anexo B Métodos de extracción continuos y discontinuos
Fuente: Ferraro, et al.,(2015)
77
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Anexo C Actividad antioxidante por método espectrofotométrico
Ensayo de
capacidad
Antioxidante
Principio del método Producto final
Determinación
DPPH Reacción antioxidante con un producto orgánico
radical Colorimetría
ABTS Reacción antioxidante con un producto orgánico.
radical catiónico Colorimetría
FRAP Reacción antioxidante con un Fe (III).
Complejo Colorimetría
PFRAP
Reducción de ferricianuro de potasio por
Antioxidantes y reacción posterior.
de ferrocianuro de potasio con Fe3 +
Colorimetría
CUPRAC Cu (II) reducción a Cu (I) por
Antioxidantes Colorimetría
ORAC
Reacción antioxidante con peroxil.
Radicales inducidos por la AAPH.
(2,2'-azobis-2-amidino-propano)
Pérdida de
fluorescencia o
Fluoresceína
HORAC
Capacidad antioxidante para apagar OH
Radicales generados por un Co (II) basado en
Sistema tipo fenton
Pérdida de
fluorescencia o
Fluoresceína
TRAP
Capacidad antioxidante para eliminar
Radicales derivados del luminol, generados.
de la descomposición de la AAPH
Quimioluminiscencia
Templo
Fluorimetría
Emisión de luz por una sustancia.
que ha absorbido la luz u otra
radiación electromagnética de un
diferente longitud de onda
Grabación de
excitación de
fluorescencia/ Los
espectros de emisión
Fuente Pisoschi, (2014)
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Anexo D Recolección de Corynaea crassa Hook f.
Fuente: Autora
Anexo E Informe de resultados (cromatografía capa fina y espectroscopia Uv-Vis de extractos
acuosos)
Fuente: Autora
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Anexo F Informe de resultados (espectroscopia infrarroja extractos acuosos)
Fuente: Autora
Anexo G Informe de resultados (cuantificación de fenoles y flavonoides, extractos acuosos)
Fuente: Autora
Anexo H Estructura química del Trolox y la Vitamina C (sustancias de referencia)
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Trolox Vitamina C
Fuente: Song et al.,(2010)