David Gonzalez y Rubn Varea

AAAAPPPPUUUUNNNNTTTTEEEESSSS DDDDEEEE EEEESSSSPPPPEEEECCCCTTTTRRRROOOOSSSSCCCCOOOOPPPPIIIIAAAA

NDICE

1. INTRODUCCIN

1.1. Origen

2. RADIACIN ELECTROMAGNTICA (R.E.M.)

2.1. Espectro electromagntico2.2. Interaccin de la radiacin electromagntica con la materia

3. INSTRUMENTACIN

3.1. Fuente de radiacin3.2. Selectores de longitud de onda o analizadores3.2.1. Filtros3.2.2. Monocromadores3.3. Recipientes para muestras3.4. Receptores de radiacin3.4.1. Detectores de fotones3.4.2. Detectores de calor3.5. Sistemas de salida de datos

4. TIPOS DE ESPECTROSCOPIA

4.1. Espectroscopa molecular de absorcin infrarroja4.2. Espectroscopa molecular de fluorescencia y fosforescencia4.3. Espectroscopa de absorcin atmica4.4. Espectroscopa atmica de emisin4.5. Espectroscopa de fluorescencia atmica4.6. Espectroscopa Raman4.7. Espectroscopa de resonancia magntica nuclear (R.M.N.)4.8. Espectroscopa de electrones4.9. Espectroscopa de rayos X

5. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ULTRAVIOLETA-VISIBLE

5.1. Conceptos previos. Ley de Lambert-Beer5.2. Los electrones absorbentes de la radiacin5.3. Instrumentacin de la espectroscopa de absorcin UV-V5.4. Tipos de instrumentacin5.5. Aplicaciones de la espectroscopa molecular de absorcin UV-V5.5.1. Aplicaciones a nivel cualitativo5.5.2. Aplicaciones a nivel cuantitativo5.6. Espectroscopa fotoacstica5.6.1. Aplicaciones de la espectroscopa fotoacstica

6. INSTALACIN Y EMPLEO DEL ESPECTROFOTMETRO

7. PRCTICAS

7.1. Determinacin del coeficiente de extincin molar para una sustancia absorbente7.2. Determinacin de la constante de velocidad de reaccin para la oxidacin de una sustancia7.3. Determinacin de la constante de disociacin de un cido7.4. Determinacin de la concentracin de los componentes de una muestra binaria7.5. Clculo del espectro de absorcin de un vegetal

8. BIBLIOGRAFA

1. INTRODUCCIN

En este estudio se intenta mostrar los principios fundamentales de lastcnicas instrumentales espectroscpicas as como dar una apreciacin delos tipos de espectrofotmetros existentes en el momento, su instrumenta-cin y funciones.

Estas tcnicas se basan en una serie de caractersticas de un focoluminoso. Los focos luminosos emiten energa radiante que es recogida poruna serie de sensores. En el caso del hombre el sensor es la retina, demanera que la radiacin va a llegar a sta produciendo una estimulacin queconlleva a una sensacin. Para medir las sensaciones en los anlisis de sus-tancias es imprescindible utilizar instrumentos adecuados ya que la sensibi-lidad del ojo humano est limitada a la regin visible del espectro.

Debido a esto se han diseado y construido los espectroscopios sen-sibles a cualquier regin del espectro de manera que se pueda medir deforma cuantitativa la intensidad de un foco luminoso.

Actualmente los cientficos precisan de aparatos como el espectro-fotmetro para conseguir informacin de la materia. Esta tcnica es de utili-dad en diversos campos como la biologa, bioqumica, geologa, qumica,medicina, ingeniera, medio ambiente, fsica, entre otros.

1.1 Origen.

En los comienzos de la qumica, la mayora de los anlisis se realiza-ban separando los componentes de inters de una muestra (analitos)mediante, precipitacin, extraccin o destilacin. En los anlisis cualitativoslos componentes separados se trataban con reactivos originando productosque podan identificarse por sus colores, punto de ebullicin o de fusin, sussolubilidades en una serie de disolventes, sus olores, sus actividades pti-cas. En los anlisis cuantitativos la cantidad de analito se determinaba pormedidas gravimtricas (se determina la masa del analito o de algn com-puesto producido a partir de l) y volumtricas (se determina el volumen o elpeso de un reactivo estndar que reaccionase completamente con el anali-to).

Fue a partir de mediados de los aos treinta cuando se empezaron aexplotar otros fenmenos distintos de los descritos anteriormente para laresolucin de los problemas analticos. As, empezaron a utilizarse para elanlisis de los analitos sus propiedades fsicas tales como conductividad,potencial de electrodo, absorcin o emisin de la radiacin electromagnticay fluorescencia. Estos fenmenos anteriormente citados se conocen desdehace ms de un siglo. En 1864 Maxwell propuso que la luz era de naturale-za electromagntica, es decir que une los conceptos de electricidad y mag-netismo. Sin embargo, su aplicacin se retras por falta de una instrumenta-cin sencilla y fiable. Fue con el desarrollo de la industria electrnica cuandose produjo su aprovechamiento.

Los primeros instrumentos espectroscpicos que aparecieron sedesarrollaron para utilizarse en la regin visible de la radiacin electro-magntica y por tanto se denominan instrumentos pticos. Hoy en da estetrmino se ha ampliado con el fin de incluir tambin a los instrumentos quetrabajan con longitudes de onda de la radiacin electromagntica distintas dela regin visible.

Los espectrofotmetros son aparatos que trabajan con una longitud dela radiacin electromagntica determinada que vara segn las necesidadesdel usuario.

2. RADIACIN ELECTROMAGNTICA (R.E.M.)

Es una forma de energa radiante que se propaga en el espacio agrandes velocidades. A diferencia de otras energas no necesita un soportematerial propagndose en el vaco a una velocidad c = 299700 Km/s. Susmanifestaciones ms conocidas son la luz y el calor, siendo menos eviden-tes los rayos X, rayos yyggfdsaeegg,microondas, radiofrecuencias.

Para explicar parte de sus propiedades se la considera como unaonda y para explicar su interaccin con la materia se considera como un con-junto de partculas altamente energticas, los fotones. Por lo tanto la radia-cin electromagntica tiene doble naturaleza onda-partcula.

Modelo ondulatorio: La radiacin electromagntica se consideracomo un onda armnica simple que es un campo elctrico que lleva asocia-do perpendicularmente un campo magntico. En este fenmeno ondulatoriose define:

Longitud de onda (g): Distancia entre dos mximos de un ciclo com-pleto del movimiento ondulatorio, sus unidades en el Sistema Internacionalde Unidades (SI) es el nanmetro (nm) que es la milsima del micrmetro omilmillonsima del metro.

Frecuencia (u): Nmero de ciclos por segundo, es inversamente pro-porcional a la longitud de onda. Sus unidades son el Hertz o 1/s.u=c/g

x

y

Direccion depropagacion

zCampo magntico

Ca

mp

o e

lc

tric

o, yCampo elctrico

Modelo corpuscular: La radiacin electromagntica se considera como part-culas, fotones, cuya energa segn Einstein es proporcional a la frecuencia.E=hu=hc/g

Siendo h la constante de Plank h = 6,6210 J/s molc.

2.1. Espectro electromagntico:

Cubre un amplio intervalo de energa radiante que va aumentando desderadio frecuencia hasta rayos g.

RAYOS g RAYOS X ULTRAVIOLETA VISIBLE INFRARROJO MICROONDAS Longitudde 0,1 1 180 390 750 400000onda(nm)

Tabla del espectro electromagntico.

2.2. Interaccin de la radiacin electromagntica con la materia:

Debido a la interaccin entre la radiacin electromagntica y la mate-ria se producen una serie de fenmenos como refraccin, reflexin, disper-sin, absorcin y emisin. Siendo estos dos ltimos la base de la espectros-copia.

Absorcin de radiacin: Proceso en el que la energa electromagnti-ca se transfiere a los tomos, iones o molculas de muestra, promueve aestas partculas desde su estado fundamental a un estado excitado.

Los cambios producidos en las partculas dependen de sus propiascaractersticas y de la longitud de onda de la energa incidente. Las partcu-las excitadas tienden a volver a su estado fundamental desprendiendo laenerga absorbida en forma de energa cintica, dando calor. Este es el pro-ceso de relajacin no radiante.

Tipos:- Absorcin atmica: La muestra es sometida a una disgrega-cin molecular o atomizacin, siendo los tomos los que se excitan por laradiacin, dando espectros bien definidos.

- Absorcin molecular: Las molculas de la muestra son las quese excitan por la radiacin, dando espectros con menor definicin que losatmicos.

Emisin de radiacin: Producido por el mecanismo de relajacinradiante que consiste en que las partculas excitadas se relajan a niveles demenor energa en forma de fotones. La emisin se puede dar en forma deespectros continuos (todas las longitudes de onda presentes) o espectrosdiscontinuos (algunas longitudes de onda).

Tipos: -Radiacin trmica -Emisin de radiacin de rayos X -Fluorescencia y fosforescencia

3. INSTRUMENTACIN

El conjunto de todas las tcnicas instrumentales basadas en la absor-cin y emisin de la radiacin electromagntica se conocen por espectros-copa.

En la actualidad, son muchos los tipos y modelos de espectrofotme-tros que existen, esto complica la descripcin de sus partes o por lo menosel orden de estas. No obstante aqu seguiremos la clasificacin ms general.

El espectroscopio consta de cinco partes:

- Fuente de radiacin.- Selector de longitud de onda o analizador.- Recipiente para contener la muestra - Detector de energa radiante.- Sistema de registro de datos.

3.1 Fuente de radiacin.

Es la encargada de proporcionar energa radiante que puede ser enforma visible o no visible. Debe generar un haz de radiacin con potenciasuficiente para ser detectada y medida con facilidad. Adems tiene que serestable y no provocar fluctuaciones.

Las fuentes son de dos tipos: continuas y discontinuas o de lneas.

Fuentes continuas: Emiten radiacin en un amplio rango de longitudde onda de la misma potencia o intensidad. Se utiliza sobre todo en absor-cin molecular. En ultravioleta visible e infrarrojo.

Las fuentes continuas ms comunes son:

- Lmpara de filamento de tungsteno, para visible y UV prximo.- Lmpara de filamentos de haluros de tungsteno, emiten con mayor

intensidad y la ms comn es la de yoduro de tungsteno. - Lmparas de hidrgeno y deuterio, para la regin ultravioleta.

Fuentes discontinuas o de lneas: Emiten un nmero determinado debandas de radiacin, un intervalo determinado de longitudes de onda. Se

emplean en absorcin atmica, espectroscopa de fluorescencia y espec-troscopa Raman. La ms comn es la lmpara de vapores de mercurio.

Tambin los lseres son utilizados como fuentes debido a que tienenuna gran intensidad, una pequea anchura de banda y una naturaleza cohe-rente en sus seales de salida.

3.2 Selectores de longitud de onda o analizadores.

En los anlisis espectroscpicos es necesario que la radiacin esteformada por un grupo continuo y limitado de longitudes de onda estrechas,llamado banda. Cuanto menor sea el ancho de banda mayor ser la sensibi-lidad en las medidas.

Existen dos clases de analizadores, los filtros y los monocromadores.Si el aparato utiliza filtros se denomina fotmetro, si utiliza monocromadoresse denomina espectrofotmetro.

3.2.1.Filtros.

Los filtros estn compuestos por un material que transmite selectiva-mente una longitud de onda, absorbiendo todas las dems.

Existen dos tipos de filtros:

- Filtros de interferencia: Se basan en las interferencias pticas, paraas proporcionar bandas de radiacin estrechas. Constan de un dielctricotransparente (fluoruro de calcio o de magnesio) que est delimitado por dospelculas metlicas semitransparentes. Al incidirle la radiacin parte de estase refleja en las pelculas metlicas producindose interferencias constructi-vas o destructivas, reforzando o disminuyendo la radiacin.

- Filtros de absorcin: Absorben una amplia gama de longitudes deonda y deja transmitir el resto. Normalmente se componen de una gelatinacoloreada o un vidrio coloreado. Tienen un ancho de banda mayor que los deinterferencia. Dentro de estos se encuentran los filtros de corte, que transmi-ten casi al 100% en una zona del espectro, pero a partir de un determinadovalor la transmitancia es igual a cero.

3.2.2. Monocromadores.

Son capaces de dar bandas espectrales mucho ms estrechas que losfiltros y adems pueden ajustarse fcilmente dentro de la zona del espectro.La calidad de un monocromador depende de la pureza de la radiacin desalida, de su capacidad para resolver longitudes de onda adyacentes, de supoder de captacin de luz y de su anchura espectral. Tienen diferentes par-tes:

- Rendija de entrada: Reducen al mximo la luz difusa y evita que laluz dispersa entre en el sistema.

- Lente colimadora: Produce un haz paralelo de radiacin electro-magntica.

- Prisma o red de difraccin, dispersan la radiacin en sus longitudesde onda individuales.

- Lente para enfocar la radiacin electromagntica.- Rendija de salida: Impide que la luz difusa atraviese la cubeta.

Tipos: - Monocromadores de red.- Monocromadores de prisma.

MONOCROMADORES DE RED:

Consiste en una superficie dura, pulida y pticamente plana, en la quese ha gravado un nmero de surcos paralelos prximos y a distancias igua-les entre si. Al incidir la radiacin electromagntica sobre estos se descom-pone en distintas longitudes de onda, que se reforzarn o no, dependiendodel ngulo de refraccin con el que salgan.

Rendijade entrada

Reddereflexin

Rendijade salida

Planofocal

Espejosconcavos

A B2 1

Para las regiones ultravioleta y visible tiene de 300 a 2000 surcos/mm.y para la infrarroja de 10 a 200 surcos/mm.

- Red en escalerilla: Como su nombre indica tiene forma de escalera.Esta geometra proporciona una difraccin muy eficiente de la radiacin.

- Red en escalera: Similar a la anterior pero con menos surcos.- Red cncava: Similar a la anterior pero formada en una superficie

cncava. Este diseo permite un monocromador sin espejos o lentes coli-madores y focalizadores.

- Red hologrfica: El gravado de los surcos se hace con tecnologalser. (Red Littrow)

MONOCROMADORES DE PRISMA:

Fragmentos con forma de cua, de vidrio, cuarzo, cloruro sdico u otromaterial que permita el paso de la radiacin. La radiacin que penetra en elprisma se dispersa en mayor o menor medida debido al ndice de refraccinque este tiene.

Hay dos tipos de diseo:

- Cornu: Compuesto por dos prismasfsicamente unidos, uno es dextrgiro (desvala radiacin hacia la derecha) y otro levgiro(desva la radiacin hacia la izquierda).Debido a esto, el haz paralelo se desdobla endistintas longitudes de onda.

Lente deenfoque

Lentecolimadora

Prisma

Rendijade salidaRendija

de entrada

1

2

Fuente

Celda demuestra

b

ri

- Littrow: Prisma en el que una cara es un espe-jo. Cuando le llega la radiacin electromagntica hay uncambio de direccin y una reflexin debido al espejo,por lo que la radiacin se desdobla en distintas longitu-des de onda. Es ms pequeo y compacto que el deCornu.

3.3 Recipientes para muestras.

Exceptuando la espectroscopa de emisin se precisa de recipientesque contengan la muestra en los estudios espectroscpicos. Estos recipien-tes, cubetas, deben ser de un material que permita el paso de la radiacin dela regin espectral de inters. Por lo tanto para el estudio en diferentes regio-nes del espectro se utilizan diferentes materiales:

- cuarzo o slice fundido para ultravioleta- vidrios de silicato de 350 a 2000 nm- cristal ptico y plstico, en el visible- cloruro de sodio cristalino, en la regin infrarroja

Las cubetas suelen tener un espacio interior de 10 mm de espesor,aunque tambin pueden tener un espacio superior o inferior dependiendo dela muestra con que se trabaje.

Las mejores cubetas tienen ventanas que son perfectamente perpen-diculares a la direccin del haz, con estas caras planas minimizan las prdi-das por reflexin. A veces se emplean cubetas cilndricas para el ultraviole-ta-visible, en este caso hay que tener cuidado en repetir la posicin de lacubeta respecto del haz de radiacin.

Existen cubetas con paredes laterales engrosadas para muestrasescasas o muy valiosas llamadas cubetas semimicro o micro.

La calidad de los datos de absorbancia dependen de la forma, uso ymantenimiento de las cubetas. Las huellas dactilares, la grasa u otras man-chas en las paredes alteran la transmisin a travs de la cubeta. Hay espec-trofotmetros que poseen portacubetas con varias posiciones, lo que posibi-lita una mayor rapidez y eficacia en el trabajo.

Espejo

r

3.4 Detectores de radiacin.

Los primeros detectores fueron el ojo humano y las pelculas o placasfotogrficas, posteriormente se han sustituido por transductores que convier-ten la energa radiante en una seal elctrica.

El detector ideal debe responder a un amplio rango de longitudes deonda, tener alta sensibilidad, una elevada relacin entre la seal/ruido, unarespuesta constante. Adems la seal producida debe ser proporcional a lapotencia y amplificable.

Se utilizan dos tipos de detectores, los que responden a los fotones ylos que responden al calor.

3.4.1. Detectores de fotones.

Cuando la radiacin incide sobre el detector puede producir un des-prendimiento de electrones (efecto fotoelctrico) o promover electrones aotros niveles energticos (fotoconduccin).

Existen diferentes tipos de detectores de fotones:

- Clulas fotovoltaicas: Al incidir-le la radiacin electromagntica al cto-do promueve electrones a nivelesenergticos ms altos, provocandohuecos que favorecen el paso decorriente elctrica. Se utilizan en lazona visible.

- Detectores semiconductores: Al igual que los anteriores se basan enla fotoconduccin. Sensibles al infrarrojo cercano.

Ampolla de vidrio

nodoCtodo

Luz

Clula fotoelctrica

A

- Fototubos: Constan de un ctodo semicilndrico y un nodo. Cuandole llega la radiacin al ctodo se desprenden electrones. Aplicando una dife-rencia de potencial entre el ctodo y el nodo se crea una corriente elctri-ca. Se utilizan en la regin ultravioleta-visible.

- Fotomultiplicadores: Como los anteriores se basan en el efecto foto-elctrico. Llevan ctodos adicionales llamados dnodos que vuelven a emitirms electrones amplificando la seal.

3.4.2. Detectores de calor.

Son detectores trmicos compuestos por un cuerpo negro que absorbe todala radiacin que le llega aumentando su temperatura que es lo que medimos.Se utiliza sobre todo en el infrarrojo.

Existen varios tipos de detectores de calor:

- Termopar: Consiste en dos metales unidos por dos puntos, uno pro-tegido de la radiacin electromagntica y otro expuesto a ella por lo queaumenta su temperatura. Entre la dos uniones se genera un potencial quevaria dependiendo de la diferencia de temperatura.

- Bolmetro o termmetro de resistencia: Compuesto por materialesque forman un puente elctrico y presentan un cambio de resistencia relati-vamente grande con los cambios de temperatura.

luz

Ctodo

200V 400V

100V 300V 500V

e-

Fotomultiplicador

- Clulas de Golay o termmetro de gas: Compuesto por un gas ence-rrado en un compartimento de pared elstica, al llegar la radiacin el gasaumenta su temperatura y por lo tanto aumenta el volumen provocando cam-bios en la pared elstica. Esto hace que se modifique el haz de radiacinsobre un espejo y eso es lo que se mide.

3.5. Sistemas de salida de datos.

El procesador de seales es un dispositivo electrnico donde se refle-jan en sistemas de lectura y presentacin de datos la seal elctrica deldetector. Los sistemas de lectura pueden ser: de lectura directa que van apli-cados a aparatos con detectores de tipo fotoclula o pueden producir unaamplificacin previa de la seal como ocurre en los aparatos con fototubos.

La mayora de las seales analticas son seales analgicas. Lostransductores de los instrumentos convierten normalmente las sealesanalgicas qumicas en seales analgicas elctricas, vindose en un for-mato analgico o digital. Las visualizaciones analgicas se representanmediante la posicin de una aguja en un medidor de escala, una imagen enla pantalla de un tubo de rayos catdicos o la posicin de una bombilla en unregistrador de papel. Una visualizacin digital se representa a travs de unaescala de nmeros.

Actualmente existen unos dispositivos de salida que permiten unaunin con un ordenador, de manera que el usuario puede ampliar el rango deoperaciones realizadas con los datos obtenidos.

4.TIPOS DE ESPECTROSCOPA.

A continuacin ofrecemos a modo de esquema las ms importantestcnicas espectroscpicas dependiendo de la regin del espectro con la quese trabaje, su reaccin ante la radiacin electromagntica (absorcin y emi-sin), y si la muestra est en estado atmico o molecular.

- Espectroscopa molecular de absorcin de infrarrojo.- Espectroscopa molecular de absorcin de ultravioleta visible.- Espectroscopa molecular de fluorescencia y fosforescencia.- Espectroscopa atmica de absorcin.- Espectroscopa atmica de emisin.- Espectroscopa atmica de fluorescencencia. - Espectroscopa Raman.- Espectroscopa de resonancia magntica nuclear.- Espectroscopa de electrones.- Espectroscopa de rayos X.

Antes de entrar con las caractersticas de los mtodos espectroscpi-cos, vamos a ver los distintos tipos de aparatos atendiendo a la disposicinde los componentes fotomtricos. Segn esto pueden clasificarse espectro-fotmetros de haz simple o de doble haz en el espacio y en el tiempo.

- Espectrofotmetros de haz simple: Constan de una fuente de radia-cin que pasa a travs de analizador el cual selecciona la longitud de ondadeseada, unas rendijas de entrada y salida que evitan la luz difusa, una cube-ta que contiene la muestra y un detector de la radiacin no absorbida por lamuestra.

Fuentede luz

Rendija deentrada

Monocromador Rendija desalida

Detector Medidor

Fig.: 7. Espectrofotometro de haz simple

- Espectrofotmetro de doble haz en el espacio: Todos los componen-tes del espectrofotmetro simple aparecen por duplicado excepto la fuentede luz. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo a travs de los diferentescomponentes separados en el espacio.

- Espectrofotmetro de doble haz en el tiempo: Suele utilizar los mis-mos componentes de un instrumento de haz simple. En estos dos haces deluz pasan a travs de los mismos componentes, pero no al mismo tiempo porla accin de un instrumento rotativo del haz luminoso llamado chopper. Elchopper est colocado a continuacin de la rendija de salida y un sistema deespejos se encarga de dirigir la porcin de radiacin hacia una cubeta dereferencia o hacia la muestra. As el detector ve alternativamente el haz deluz procedente de la muestra y el de referencia.

a

Fuente de luz

Espejo

Rendijasde entrada

Monocromadores Rendijasde salida

Cubetas Detectores

Medidor

Fuentede luz

Rendijade entrada

Monocromador Rendijade salida

Muestra

Detector

Referencia

Medidor

EspejoEspejo

EspejoEspejo

Otra caracterstica diferenciadora de los espectroscopios es que enlos de emisin la fuente de radiacin suele estar colocada de forma perpen-dicular al detector en vez de en paralelo como en la de absorcin. Con estose evita la interferencia entre la emisin de la fuente y la de la muestra. Asel detector solamente registra la emisin de la muestra.

A continuacin describiremos brevemente las distintas tcnicasespectroscpicas salvo la correspondiente a ultravioleta-visible que ser des-crita posteriormente con mayor amplitud debido a su mayor utilidad e impor-tancia.

4.1.Espectroscopa molecular de absorcin infrarroja.

Se basa en los cambios que se producen en los niveles de vibraciny rotacin de las molculas. Es conveniente subdividir el espectro de infra-rrojo en tres regiones: cercano, medio y lejano.

En cuanto a la instrumentacin cabe destacar que como fuente deradiacin utiliza un slido que se calienta y se lleva a incandescencia(Lmpara incandescente de Nerst, fuente Globar y filamento incandescen-te).Utiliza detectores sensibles al calor como termopares, bolmetros y clu-las de Golay.

Tiene gran aplicacin en el anlisis cualitativo y cuantitativo:

- Determinacin de sustancias. Cada sustancia da un espectro carac-terstico en el infrarrojo como si fueran huellas dactilares.

- Determinacin de estructuras qumicas (grupos funcionales)- Determinacin de la concentracin de sustancias. - Determinacin de parmetros fsico-qumicos.

4.2. Espectroscopa molecular de fluorescencia y fosforescencia.

Cuando alguna sustancia es irradiada con radiacin ultravioleta-visiblese excita y al volver a su estado fundamental emite fotoluminiscencia.

La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia es que a la primerale cuesta menos tiempo pasar del estado excitado al fundamental.

En cuanto a la instrumentacin se utiliza un espectrofluormetro ofluormetro. Estos aparatos disponen de dos filtros o monocromadores, unoanterior al compartimento de la muestra y otro posterior. Normalmente soninstrumentos de doble haz. Como fuente se utiliza la lmpara de arco y comodetector un fotomultiplicador.

Existen una serie de factores que afectan a la fluorecencia:

- Estructura qumica de la muestra: los enlaces que dan fluorescenciason los p (dobles espacios de compuestos aromticos).

- Temperatura y disolvente. Al aumentar la temperatura disminuye lafluorescencia y al aumentar la viscosidad del disolvente aumenta la fluores-cencia.

- El pH. - El oxgeno disuelto, que acta de quencher o amortiguador disminu-

yendo la fluorescencia.

- Rigidez estructural, a mayor rigidez mayor fluorescencia.

- Concentracin de la muestra, la fluorescencia est en relacin linealcon la concentracin. Al aumentar la concentracin aumenta la fluorescen-cia.

La fluorescencia es una tcnica muy sensible y selectiva, puede apli-carse al estado slido, lquido y gaseoso. Pero tiene la desventaja de que notodas las sustancias presentan este fenmeno de fluorescencia.Las aplicaciones ms importantes son las siguientes:

- Determinacin de especies orgnicas e inorgnicas.- Medidas y clculos del tiempo de vida de las sustancias.

4.3. Espectroscopa de absorcin atmica.

La caracterstica principal de la espectroscopa atmica es la atomi-zacin de la muestra. La atomizacin se realiza a travs de un atomizador dellama que consta de un nebulizador y de un quemador. Los atomizadores uti-lizan dos gases uno combustible y otro oxidante que variarn segn los ele-mentos que se vayan a analizar.

Es muy importante controlar la temperatura de la llama para evitar quese produzca una ionizacin en vez de una atomizacin.

Con esta tcnica se obtienen espectros ms precisos de lneas dis-cretas, que pueden tener cierta anchura debido al movimiento de los tomos(efecto Doppler) o al choque de los tomos (efecto de presin).

Hay otros sistemas para atomizar la muestra como son el arco y lachispa.

Estos son materiales conductores que se calientan calcinando lamuestra y llevndola a estado atmico.

Las fuentes de espectroscopa atmica difieren de las de espectros-copa molecular ya que son discontinuas en vez de continuas. La lamparams utilizada es la de ctodo hueco, donde se coloca como fuente de radia-cin el mismo elemento que se va analizar.

Utiliza dos monocromadores uno anterior a la muestra y otro posterior.Uno de ellos hace que la radiacin de la llama llegue continua al detector, asse podr diferenciar de la procedente de la muestra que llega de forma alter-na.

Sus principales aplicaciones son:

- Determinacin de metales pesados.- Determinacin cuantitativa de ms de 60 elementos metlicos o

metaloides.- Empleado tambin en toxicologa y determinacin de metales en

agua.

4.4. Espectroscopa atmica de emisin.

La muestra puede estar en estado slido, lquido o gaseoso.

Para atomizar la muestra se emplean la tcnica de llama, el arco o lachispa.

La temperatura de la llama debe ser mayor que en espectroscopaatmica de absorcin pero teniendo la precaucin de que no se de ioniza-cin. El sistema de atomizacin de la muestra se emplea a su vez como sis-tema excitador de la misma. Posteriormente se mide lo que la muestra emiteal relajarse del estado excitado.

Como detector se utilizan detectores fotogrficos y fotomultiplicadores.

Cuando se utiliza la llama para la atomizacin se denomina fotometrade llama y se aplica para:

- Determinar en lquidos y tejidos biolgicos: Li, Na, K, Ca.- Determinacin de Na y Ca en suero sanguneo.- Anlisis de suelos, cemento, vidrio y agua.

Existe otra forma de atomizar y excitar la muestra denominada espec-troscopa de emisin de plasma. El plasma es un gas fuertemente ionizadocompuesto por electrones, iones positivos y tomos. Se alcanzan altasmuestra. El plasma se genera por corriente continua, por radiofrecuencias ymicroondas.

Esta tcnica tiene gran precisin detectando cantidades como partespor milln (ppm) y partes por billn (ppb).

Las aplicaciones de esta tcnica son:

- Anlisis cuantitativo y cualitativo de muchos elementos del sistemaperidico.

- Anlisis de metales txicos en muestras biolgicas.

4.5. Espectroscopa de fluorescencia atmica.

Se basa en la excitacin de los tomos de una muestra con la radia-cin electromagntica y medir la radiacin que emiten esos tomos al volvera su estado fundamental.

Como fuente de radiacin electromagntica se utiliza una fuente con-tinua (lmpara de arco, lmpara de ctodo hueco, lmpara de vapor dexenon y lmpara lser). Para atomizar la muestra se utiliza la llama o los hor-nos de grafito y de carbn.

Sus aplicaciones son:

- Determinacin de elementos traza en materiales biolgicos (sangre,suero, orina, tejidos)

- Determinacin de elementos en suelos , fertilizante, residuos, mine-rales, cementos.

4.6 Espectoscopa Raman.

En 1928, el fsico hind C. V. Raman descubri que la longitud deonda de una fraccin de la radiacin dispersada por ciertas molculas, difie-re de la longitud de onda de la radiacin incidente y que estos desplaza-mientos de la longitud de onda dependen de la estructura qumica de lasmolculas responsables de la dispersin.

En esto consiste la espectroscopa Raman. Al irradiar una muestracon una fuente lser de radiacin monocromtica visible o infrarroja se pro-duce una dispersin de la radiacin. Con un espectrofotmetro adecuado seregistra la radiacin dispersada a un cierto ngulo que suele ser de 90 . Laintensidad mxima de las lneas Raman es el 0,001% de la intensidad de lafuente, por lo que su deteccin y medicin resulta difcil.

El espectro de dispersin Raman y el espectro de absorcin de infra-rrojo suelen parecerse mucho para algunas especies determinadas. La prin-cipal ventaja de los espectroscopios Raman respecto a la de infrarrojo, esque el agua no interfiere, por lo que en Raman se pueden obtener espectrosde disoluciones acuosas. Esto es muy importante para sistemas biolgicos,inorgnicos y estudios relacionados con la contaminacin del agua.

Los instrumentos para espectroscopa Raman constan de tres com-ponentes: una fuente lser que suele ser de helio/nen, un sistema de ilumi-nacin de la muestra y un espectrofotmetro adecuado que suele emplear undoble monocromador para evitar que la radiacin parasitaria alcance aldetector.

La aplicaciones de esta tcnica son:

- Anlisis cualitativos y cuantitativos de sistemas inorgnicos, orgni-cos y biolgicos.

- Gracias a la sensibilidad del lser se ha utilizado para determinaranalitos de clulas bacterianas simples, aerosoles atmosfricos y especiesen inclusiones microscpicas en minerales.

4.7. Espectroscopa de resonancia magntica nuclear (R.M.N.)

Se basa en la medida de la radiacin electromagntica en la regin deradiofrecuencias, en este proceso de absorcin estn implicados los ncleosde los tomos. Hay que colocar la muestra en un campo magntico de mane-ra que aparece la energa en los ncleos que hace posible la absorcin.

En la actualidad existen dos tipos de espectrmetros de resonanciamagntica nuclear, los de onda continua (cw) y los de impulsos o transfor-mado de Fourier (F.T.N.M.R.). En la actualidad estos ltimos son los ms uti-lizados.

Cabe destacar un componente fundamental que es el imn, encarga-do de generar el campo magntico.

Las aplicaciones de esta tcnica espectroscpica son:

- Identificacin estructural de molculas orgnicas, organometlicas ybioqumicas.

- Calculo de la concentracin de las sustancias.- Anlisis de mezclas multicomponentes.- Anlisis de la estructura elemental (concentracin de un tipo de

ncleo magntico)

4.8. Espectroscopa de electrones.

La seal producida por excitacin del analito es un haz de electrones.Se mide la potencia del haz en funcin de la energa.

La excitacin de la muestra se lleva a cabo por irradiacin con un hazde rayos X.

Se pueden diferenciar tres tipos: la ms comn es con irradiacin derayos X monocromticos llamada espetroscopa de electrones para anlisisqumicos (ESCA) o espectroscopa fotoelctrica de rayos X (XPS).El segun-do tipo es la espectroscopa de electrones Auger (AES) donde el espectro se

excita por un haz de electrones. El ltimo tipo es la espectroscopia fotoelc-trica ultravioleta (UPS).

La espectroscopa de electrones se ha aplicado con xito en gases yslidos.

Se utiliza para:

- Anlisis cualitativo de slidos (metales, aleaciones, semiconducto-res, catalizadores).

- Anlisis cuantitativo (muy limitado).

4.9. Espectroscopa de rayos X.

Se producen saltos electrnicos desde las capas internas del tomode manera que quedan huecos que son rellenados por electrones de capasexternas.

Los rayos X se pueden obtener de tres formas: bombardeando unmetal con electrones acelerados (esto es lo que ocurre en el tubo Coolidge),irradiando una sustancia con rayos X puede que emita rayos X (fluorescen-cia de rayos X) y a travs de un cuerpo radiactivo. Estas tres formas consti-tuyen las distintas fuentes existentes en la instrumentacin. Hay dos tipos dedetectores, los de ionizacin y los de centelleo.

Los espectros de absorcin de rayos X dan lugar a lneas caracters-ticas para cada elemento, tienen lugar a nivel atmico, pero no es necesarioatomizar la muestra. Se utiliza en determinaciones biolgicas de elementospesados, un ejemplo es la determinacin del calcio en los huesos.

En fluorescencia de rayos X el espectro que se produce es carac-terstico para cada sustancia. Se utiliza para la identificacin de elementospesados.

La difraccin de rayos X se utiliza para determinar la estructura crista-lina en la que se ordenan los distintos tomos. Se consigue determinar dis-tancias entre los tomos y la ordenacin en el espacio de estos.

5. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ULTRAVIOLETA VISIBLE.

Las molculas absorben luz. La longitud de onda absorbida y la can-tidad de sta, dependen tanto de la estructura de la molcula como del medioen el que se halla.

En la espectroscopa de absorcin de ultravioleta visible, la muestraabsorbe radiacin electromagntica de una fuente, la cantidad absorbida varelacionada con la concentracin de la sustancia que se desea analizar endisolucin.

En este tipo de espectroscopa se suele hablar de longitudes de onda,en el orden de 200 a 800 nm. De 100 a 200 nm es la regin ultravioleta leja-no, de 200 a 400 la de ultravioleta prximo y de 400 a 800 luz visible.

Esta tcnica es la ms utilizada por su sencillez instrumental y susdiversas aplicaciones en distintos campos de investigacin.

5.1. Conceptos previos. Ley de Lambert-Beer.

Antes de detallar las caractersticas de esta espectroscopa es nece-sario explicar como interacciona la luz con la materia.

Cuando una radiacin incide sobre un medio homogneo (que absor-be luz a una determinada longitud de onda), es parcialmente absorbida y par-cialmente transmitida. As el haz de luz que sale tras atravesar el medio tieneuna intensidad menor que la del haz incidente.

La relacin incidente y la transmi-tancia fue estudiada por Lambert yextendida por Beer en el caso de disolu-ciones.

Sea una disolucin de concentra-cin C contenida en un recipiente deespesor b. Si sobre dicha disolucinincide una radiacin monocromtica deintensidad Io, y parte de la radiacin seha absorbido, la intensidad que se trans-mite I, ser inferior a Io.

Io I

db

b

La ley de Lambert-Beer establece que la disminucin de la intensidadde la radiacin es proporcional a la intensidad, a la concentracin y al espe-sor atravesado. Para un elemento de espesor db se cumplir:

-dI = K I C db

Donde K es una constante de proporcionalidad, un coeficiente de absorcinde la sustancia en disolucin. Integrando y haciendo operaciones queda:

dI/I = -K C db dI = -K C db

ln I/Io = -K C b ; log I/Io =(-K/2,302) C b = a b C

log Io/I = a b C

Donde a es un nuevo coeficiente de absorcin denominado absortividad.

Un concepto muy importante es la absorbancia (A) que es la fraccinde la luz absorbida por la disolucin.

A = log Io/I

La absorbancia va a depender de la naturaleza del medio, es decir dela composicin y de la longitud de la trayectoria de la luz en el medio.

Otro parmetro es la transmitancia (T) que se define como la relacinentre la luz incidente y la luz transmitida, es decir la fraccin de luz transmi-tida por la disolucin.

T = I/Io

En la practica se utiliza el porcentaje de transmitancia (%T)

%T = 100 T = 100 I/Io

Tanto la absorbancia como la transmitancia son parmetros adimen-sionales y por lo tanto no llevan unidades.

Estos parmetros descritos se relacionan entre si de la siguiente forma:

A = log Io/I = -log T = -log %T/100

A = 2 - log%T

Por lo tanto la absorbancia es la relacin logartmica entre la intensi-dad incidente y la intensidad transmitida, la ley de Lambert-Beer queda de lasiguiente forma:

A = a b C

Su representacin grfica se ajusta a una lnea recta que pasa por elorigen de coordenadas. Si la concentracin C se expresa en mol/litro, el coe-ficiente a se denomina absortividad molar o coeficiente de extincin molarrepresentado por e. La ley de Lambert-Beer queda entonces:

A = e b C

Normalmente el espesor de la cubeta b se mide en centmetros.

La relacin entre la concentracin de una solucin y su transmitanciaes inversa y logartmica, mientras que la relacin entre la absorbancia y laconcentracin es directamente proporcional.

Si la sustancia transmite toda la radiacin, I = Io y por lo tanto la trans-mitancia es igual a 1, el %T es igual a 100 y la absorbancia es igual a 0.

Si la sustancia absorbetoda la radiacin que le llega I = 0y por tanto la transmitancia esigual a 0, el %T es igual a 0 y laabsorbancia es igual a infinito .

La representacin grficaen un eje de coordenadas de laabsorbancia (ordenadas) frente ala concentracin (en el eje deabcisas) se denomina curva decalibracin.

A

concentracinx y

Curva de calibracin con los lmites de linealidad

Para obtener la curva de calibracin se ensayan varias soluciones deconcentraciones conocidas, y se determinan sus absorbancias.

As se construye la curva de calibracin, que debe ser una recta,representando las concentraciones frente a las absorbancias grficamente.De este modo para calcular la concentracin de una muestra problema slotenemos que hallar la absorbancia de la disolucin problema y extrapolarlaen la curva de calibrado.

Esta tcnica slo es vlida si la muestra cumple la ley de Lambert-Beer y si las soluciones estndar y las problema son ledas en las mismascondiciones. En las determinaciones espectrofotomtricas se cumple la leyde Lambert-Beer cuando la curva de calibrado sigue la llamada linealidad,que es el intervalo de concentraciones de la muestra entre las cuales existeuna relacin lineal entre concentracin y absorbancia.

La ley de Lambert-Beer tiene una serie de limitaciones; slo es apli-cable para la luz monocromtica y las soluciones utilizadas para el anlisis,en teora, no deben tener concentraciones inferiores a 0,01M (moles/litro),aunque en la prctica se trabaja sin problemas con concentraciones msbajas. Otras posibles fuentes de error que originan desviaciones en la curvade calibrado y por ello en la ley de Lambert-Beer son:

- las altas concentraciones de la muestra

- que los lados de la cubeta estn rayados o con algo de suciedad

- si la muestra se disocia, asocia o reacciona con la solucin

- longitudes de onda parsitas

- incertidumbres o ruido asociado al instrumento

5.2. Los electrones absorbentes de la radiacin

La absorcin de la radiacin ultravioleta o visible se puede considerarque es un proceso en dos etapas, primero hay una excitacin electrnica yposteriormente se produce una relajacin.

La absorcin de la radiacin ultravioleta o visible proviene de la exci-tacin de los electrones enlazantes, la espectroscopia de absorcin molecu-lar es por tanto valiosa para la identificacin de los grupos funcionales de unamolcula. Pero son ms importantes las aplicaciones de la espectroscopia deabsorcin ultravioleta y visible para la determinacin cuantitativa de com-puestos.

Todos los compuestos orgnicos son capaces de absorber radiacinelectromagntica ya que contienen electrones de valencia que pueden serexcitados. La absorcin de radiacin ultravioleta y visible de longitud de ondalarga se restringe a un grupo funcional llamado cromforo. Los electronesque intervienen en la absorcin de las molculas orgnicas son los que seencuentran en la formacin de enlaces entre los tomos y los electroneslocalizados alrededor del tomo y que no participan en la formacin de enla-ces. Las regiones entre los tomos en las que se encuentran los electronesenlazantes se denominan orbitales moleculares. Al conbinarse dos orbitalesatmicos se forma un orbital molecular enlazante de baja energa o un orbi-tal molecular antienlazante de alta energa.

Los orbitales moleculares que se encuentran asociados a los enlacessencillos se llaman orbitales sigma, sal igual que los electrones que los cons-tituyen. Los dobles enlaces de las molculas orgnicas poseen dos tipos deorbitales moleculares, uno de ellos es p y el otro es un orbital molecular pi, (asociado al anterior. Adems de estos existen los orbitales sigma y pi antien-lazantes, con mayor energa s* y p*.

Ocurre tambin que muchos compuestos orgnicos tienen electronesno enlazantes n, cuyo nivel de energa est entre los orbitales enlazantes yantienlazantes pi y sigma.

De esta forma al absorber la radiacin se producen una serie de tran-siciones electrnicas:

- Transiciones s s*. Es una transicin que requiere gran cantidad deenerga y que corresponde con la regin del ultravioleta de vaco. Esta tran-sicin la presentan molculas alifticas, que tienen enlaces sencillos.

- Transiciones n s*. Requieren menor energa que las anteriores, seproducen en la zona entre 150 y 250 nm.

- Transiciones p p* y n p*. Lamayor parte de las aplicaciones dela espectroscopa de absorcin encompuestos orgnicos se basa enestas transiciones que se dan en laregin de 200 a 700 nm. Estas sonlas transiciones que requieren losgrupos cromforos. Cuando hayvarios de estos grupos cromforosprximos entre s pueden dar lugaral efecto de conjugacin.

5.3. Instrumentacin de la espec-troscopa de absorcin UV-V

Los componentes de los espectrofotmetros en general ya los hemostratado en el punto 3, pero cabe ampliar brevemente las caractersticas delos instrumentos que trabajan en esta regin.

- Fuentes de radiacin. Se utilizan fuentes continuas que deben emi-tir a alta intensidad sin que se produzcan fluctuaciones. Son de dos tipos,lmparas de arco y fuentes de incandescencia.

Lmparas de arco: Constituidas por un gas que est en el interior deun recipiente al que se le somete una descarga elctrica y emite radiacinelectromagntica. La excitacin elctrica puede ser a baja presin (lamparade deuterio e hidrgeno), o a alta presin (lmpara de xenn).

Lmpara de deuterio e hidrgeno: El mecanismo anteriormente citadosupone la formacin de una especie molecular excitada, que posteriormentese disocia dando dos especies atmicas ms un fotn ultravioleta. Comoresultado se produce un espectro continuo desde unos 160 nm hasta el ini-cio de la regin visible.

Con estas lmparas suelen usarse ventanas de cuarzo ya que el vidrioabsorbe fuertemente longitudes de onda menores de los 350 nm.

Lmpara de xenn: Al pasar una corriente a travs de una atmsferade xenn se produce una intensa radiacin. El espectro producido va desde250 a 600 nm teniendo un mximo en los 500 nm.

Enlazante

Enlazante

No enlazante

Antienlazante

Antienlazante

Energa

Niveles de energa moleculares eectrnicos

n

Fuente incandescente:

Constan de un slido calenta-do a alta temperatura. Para lazona visible del espectro ( 400-800 nm) se utiliza un filamentode tungsteno colocado en elinterior de una ampolla devidrio. En la zona del UV seusan lmparas halgenas o deyoduro-tunsteno.

Lmparas de filamento de tungsteno. La distribucin de energa deesta lmpara depende de la temperatura. Se utiliza para la regin espectralque va desde 350 a 2500 nm. Para que la fuente sea estable se requiere unestricto control del voltaje

Los aparatos que emiten en la zona del UV-visible tienen dos lmpa-ras distintas, una de arco y otra de incandescencia. El paso de una lmparaa otra puede ser manual o automtico.

- Analizador: Se utilizan filtros, prismas y redes de difraccin. (ya des-critos en el punto 3).

Los prismas ms utilizados son los de tipo Littrow, en cuanto a filtrosse utilizan los de absorcin sobre todo en la regin visible.

- Compartimento para la muestra: Como ya se ha comentado para elvisible basta con que sean de vidrio, pero para la regin del ultravioletadeben de ser de cuarzo. Pueden tener forma prismtica o circular.

- Detector: Normalmente se utilizan las fotoclulas o los fotomultipli-cadores. Suele ser un ctodo revestido de un metal que liberar electronesque son conducidos hacia el nodo.

5.4. Tipos de instrumentos

El instrumento ms sencillo es el de haz simple, en el que el selectorde la longitud de onda es o un filtro o un monocromador. La determinacinde la transmitancia de la muestra supone tres pasos; primero, un ajuste del0% de transmitancia, segundo, ajuste al 100% de transmitancia con el disol-vente solo, y por ltimo la medicin del % de transmitancia de la muestracolocada. Si existe alguna fluctuacin en la fuente realizaremos una lecturano exacta de la muestra.

Tambin existen aparatos de doble haz, en los que un espejo rotato-rio dirige la radiacin procedente del filtro o monocromador alternativamentea una cubeta de referencia y a la cubeta de la muestra. En estos instrumen-tos si hay alguna fluctuacin en la fuente se afecta por igual a la muestra y ala referencia, por lo tanto el error es menor.

Un tercer tipo de aparato es aquel que se basa en una serie de dio-dos. Precisan de una ptica sencilla; una fuente de radiacin electromagn-tica y una red de refraccin que dirija la radiacin a la serie de diodos. Estosinstrumentos se diferencian de los anteriores en que la muestra se colocaentre la fuente y el analizador.

En el mercado existen gran variedad de modelos disponibles con dis-tintas calidades, costes y diseos. Pueden ser fotmetros o espectrofotme-tros, ambos de haz simple o doble que pueden estar o no controlados porordenador. Pueden ser de doble dispersin con el fin de mejorar la resolucinespectral que llevan dos prismas o redes.

5.5. Aplicaciones de la espectroscopa molecular de absorcin UV-V

En el trabajo con esta tcnica se encuentran unas extensas aplicacio-nes tanto en las determinaciones cualitativas como en las aplicaciones cuan-titativas de especies moleculares.

5.5.1. Aplicaciones a nivel cualitativo

- La aplicacin principal es la determinacin de los grupos funcionaleso estructuras qumicas de las sustancias analizadas. Sobre todo se detectala presencia de ciertos grupos funcionales que actan como cromforos. Una

sustancia en unas determinadas condiciones tiene un espectro caractersti-co que la identifica pero siempre en unas condiciones fijas; tipo de disol-vente, pH, concentracin, etc. Es muy utilizado en el control de calidad.

5.5.2. Aplicaciones a nivel cuantitativo

- Son muchos los campos que se sirven de esta tcnica para la reso-lucin de sus problemas de informacin qumica cuantitativa. Un claro ejem-plo de esto es que el 95% de las determinaciones cuantitativas llevadas acabo en el campo de la sanidad se realizan por espectrofotometra ultravio-leta-visible.

- Determinacin cuantitativa de una sustancia.

Lo primero que tenemos querealizar es un espectro para determinara que longitud de onda vamos a traba-jar. Siempre trabajaremos en un mxi-mo de longitud de onda donde la sen-sibilidad es mayor y se produce unamenor desviacin de la ley deLambert-Beer. Viendo la absorbanciade distintas concentraciones de la sus-tancia hacemos una recta de calibrado.Como sabemos que A = abC, a partirde la recta de calibrado y el valor deabsorbancia obtenemos la concentra-cin.

Una tcnica aproximativa para calcular una concentracin problema apartir de una concentracin y absorbancia conocida es:

Ar/Ax = Cr/Cx

Siendo Ar la absorbancia de la muestra referencia , Cr la concentra-cin de dicha muestra referencia, Ax la absorbancia de la muestra problemay Cx la concentracin problema.

Absorbancia de lasustancia desconocida

Concentracinde la sustanciadesconocida

A

C

- Determinacin de varios componentes de una muestra. La absor-bancia total de una disolucin es igual a la suma de las absorbancias de losconstituyentes individuales de una mezcla. Supongamos una muestra dondetenemos dos componentes A y B, con espectros de absorcin diferentes, unanlisis de ambos es imposible en una nica medida. Pero podemos hallarlas absorbancias de la muestra a dos longitudes de onda distintas l y l. Demanera que podemos expresar:

A = A b CA + eB b CB ( a l)

A = eA b CAA+ eB b CB (a l)

Las absortividades molares pueden obtenerse a partir de disolucionesestndar individuales de A y de B o a partir de las pendientes de sus repre-sentaciones de la ley de Beer. Las absorbancias se determinan experimen-talmente al igual que la anchura de la cubeta. Sabiendo estos datos nosqueda resolver este sistema de dos ecuaciones en el que hay dos incgnitasque son CA y CB que son las concentraciones de cada componente.

De esta forma se pueden analizar muestras con ms de dos compo-nentes si se hacen ms medidas de la absorbancia para cada componenteaadido. Pero las indeterminaciones en los resultados obtenidos son cadavez mayores.

- Medidas de constantes de equilibrio: Es posible la determinacin delas constantes de disociacin o de equilibrio de indicadores cido-basemediante espectrofotometra de absorcin uv-visible, ya que los espectros deesas sustancias varan con el pH del medio.

Un indicador AH se puede disociar segn la siguiente ecuacin:

AH $ A- + H+

Al trabajar con una disolucin la constante de equilibrio sera:

Ka = [H+][A-]/[HA]Siendo [ ] concentracin en moles/litro

Tomando logaritmos queda de la siguiente manera:

pH = pKa + log [A-]/[HA]

La relacin entre la concentracin de las formas inica y no inica sepuede conocer a partir de sus absorbancias, ya que representando estasfrente al pH, a una longitud de onda seleccionada (la correspondiente a unmximo), se obtendr una grfica en forma de S, es decir una curva sigmoi-dea.

Cuando trabajemos con la longitud de onda mxima de la forma bsi-ca, la absorbancia mnima representa la medida de la forma no ionizada HA,mientras que el valor de absorbancia mxima corresponder a la forma diso-ciada A-.

La absorbancia mediaobtenida de la semisuma de lasabsorbancias mnima y mxima,corresponde a la semidisociacindonde las concentraciones de HAy A- son iguales, de manera que ellogaritmo de HA/A- es igual acero. De esta forma el pH serigual al pKa, de forma que podre-mos calcular Ka, es decir la cons-tante de equilibrio.

- Calculo de la constante de reaccin: La constante de una reaccinse puede calcular fcilmente conociendo la concentracin inicial de un reac-tivo y la concentracin de dicho reactivo a un tiempo t desde que empez lareaccin:

ln Cr/Cro = - Kt

Siendo t el tiempo de reaccin, Cr la concentracin del reactivo altiempo t y Cro la concentracin inicial y K la constante de reaccin.

Pero como sabemos podemos expresar la concentracin en funcinde la absorbancia de manera que la expresin quedara:

A A-

AH

pH

ln At-A$/Ao-A& = -Kt

Siendo t el tiempo de reaccin, At la absorbancia de la muestra a esetiempo, Ao la absorbancia antes de que se de la reaccin, A( la absorbanciadespus de la reaccin y K la constante. De esta manera conociendo losdatos de absorbancia podemos calcular fcilmente la constante de la reac-cin.

-Valoraciones fotomtricas: Las medidas espectrofotomtricas puedenutilizarse con el fin de encontrar el punto de equivalencia de una valoracin,siempre que en sta algn elemento absorba la radiacin. Para ello seemplean curvas de valoracin fotomtricas que son una representacin de laabsorbancia con respecto al volumen de la sustancia valorante. La repre-sentacin consta de dos zonas de lneas rectas con diferente pendiente, unaal principio de la valoracin y otra cuando se ha pasado el punto de equiva-lencia. El punto final es el de la interseccin de ambas lneas. Para poder uti-lizar esta tcnica es necesario que el elemento o elementos que absorben laradiacin cumplan la ley de Lambert-Beer y tambin hay que corregir laabsorbancia frente a los cambios de volumen.

Las valoraciones se realizan en un espectrofotmetro modificado parapermitir que el recipiente donde se da la valoracin est en la zona de pasode radiacin.

Los resultados obtenidos suelen ser ms precisos puesto que se rea-lizan varias medidas. Una ventaja que tiene es que se pueden valorar solu-ciones muy diluidas.

5.6. Espectroscopa fotoacstica.

Esta espectroscopa se desarroll en 1970, y proporciona un mediopara la obtencin de espectros de absorcin ultravioleta y visible de lquidosturbios, semislidos y slidos. Esta tcnica supuso un gran avance ya quehasta entonces era muy difcil debido a problemas que apareca con la dis-persin y reflexin de la radiacin.

La tcnica se basa en el efecto de absorcin de la luz, lo podemos vercuando un gas que se encuentra en una celda es irradiado con un haz deradiacin intermitente de una longitud de onda que absorbe el gas, esto pro-duce una serie de fluctuaciones regulares de la presin del gas en el interior

de la cmara. Si la intermitencia corresponde al intervalo de la frecuenciaacstica los pulsos de presin pueden ser detectados por un micrfono.

La muestra se pone en una celda cerrada que contiene aire u otro gasque no absorbe la radiacin y un micrfono sensible. El efecto fotoacsticose observa cuando la radiacin es absorbida por la muestra, la potencia delsonido que se obtiene est relacionada con el grado de absorcin. Estemtodo tiene la ventaja de que la radiacin dispersada o reflejada por lamuestra no tiene efecto en el micrfono.

Existen instrumentos de haz simple y de doble haz, que en general tie-nen la fuente de radiacin, el monocromador, la celda fotoacstica, amplifi-cadores y el analizador.

5.6.1. Aplicaciones de la espectroscopa fotoacstica.

En la espectroscopa convencional, incluso haciendo diluciones muydiluidas de sangre se produce la dispersin de la luz. Con la espectroscopafotoacstica permite estudios de la sangre sin necesidad de una separacinpreliminar de las molculas que la componen.

Otras aplicaciones del mtodo incluyen el estudio de minerales, algasmarinas, tejidos de animales, baos de superficies, superficies catalticas,semiconductores, etc.

6. INSTALACIN Y EMPLEO DEL ESPECTROFOTMETRO.

En este tema vamos a tener en cuenta las consideraciones generalesen cuanto a la disposicin y el empleo de cualquier tipo de espectrofotme-tro UV VIS.

El espectrofotmetro es un instrumento ptico de precisin, de formaque debe ser tratado de forma suave y sin brusquedades, no se deben des-montar las piezas pticas ni manipular incorrectamente las partes mecni-cas.

Para evitar errores en el funcionamiento o que llegue a estropearse, elespectrofotmetro debe ser colocado sobre una mesa plana, en posicinhorizontal, mantenindolo alejado del polvo, del calor, de la humedad y lasvibraciones. Hay que evitar las corrientes de aire sobre el aparato ya que sise produce este fenmeno la lampara emitir la radiacin de forma inestable.Previamente a su utilizacin es conveniente familiarizarse con sus principiosbsicos y saber para que sirven las diferentes funciones de los controles.Adems por seguridad es conveniente revisar el aparato previo a su utiliza-cin.

Una vez encendido el aparato se selecciona la longitud de onda dese-ada. Es conveniente esperar al menos unos veinte minutos para que el ins-trumento pueda estabilizarse. Pasado este tiempo se realiza el ajuste de 0%de transmitancia con el control de ajuste a 0, despus colocaremos unacubeta con disolvente (sin muestra) y se realiza el ajuste del 100% de trans-mitancia mediante el control de ajuste de 100. Debemos tener en cuenta queexisten instrumentos que pueden realizar el ajuste a 0, el ajuste a 100, oambos ajustes de manera automtica si necesidad de que empleemosningn control. Existen varios niveles de ajuste de sensibilidad, siempreemplearemos el nivel menor posible, que nos permita alcanzar empleando elcontrol de ajuste a 100 cuando estemos realizando un blanco. Despus deajustar a 0 y a 100 se introduce la cubeta con la muestra y se mide la trans-mitancia o la absorbancia.

Cada vez que se haga un cambio de la longitud de onda es necesarioajustar de nuevo a 0 y a 100. Si la longitud de onda es modificada conside-rablemente ser necesario esperar durante un tiempo despus del ajuste a 0y a 100.

Como blanco se puede emplear aire, agua destilada, soluciones colo-readas, filtros neutros.

Es conveniente conforme se va utilizando el aparato (tras utilizar elaparato en largos periodos) comprobar la longitud de onda para asegurarnosde su exactitud.

Una vez que finalicemos el trabajo el aparato debe ser desconectadoy cubierto con una funda de plstico para evitar una contaminacin por polvou otras partculas.

Para un anlisis espectrofotomtrico preciso es necesario el uso decubetas de buena calidad. Es necesario calibrarlas de forma regular paracomprobar y detectar las diferencias que pueden surgir por ralladuras y des-gaste. Es muy importante tambin el uso de tcnicas adecuadas de limpiezay de secado. Para el limpiado de las caras externas de las cubetas Ericksony Surles propusieron la siguiente tcnica de limpiado:

- Las superficies de la celda se limpian con un papel para lentes empa-pado con metanol, el papel se debe coger con una pinza.

- Despus de la limpieza el etanol se evapora dejando las superficiesde las cubetas quedan libres de contaminantes.

Esta tcnica evita que no queden hilos ni pelculas de papel, que sue-len quedar cuando se limpian las cubetas con el papel para lentes seco.

Como hemos podido comprobar la utilizacin de estos instrumentosrequiere una cierta comprensin de cmo es su funcionamiento, de cualesson sus partes, cual es el modo de trabajar con ellos , que aplicaciones y limi-taciones tienen, etc. Esperamos que haya podido ofrecer cierta informacinpara el usuario con el fin de que se interese ms por este tema. A continua-cin mostraremos una serie de prcticas sencillas para realizar con el espec-trofotmetro con el fin de ilustrar mejor lo citado anteriormente y conseguiruna mayor compresin en las aplicaciones que tienen las tcnicas espec-troscpicas.

7. PRCTICAS.

Las prcticas descritas a continuacin son una seleccin arbitraria quepretende mostrar algunas de las aplicaciones que tiene la espectroscopa deabsorcin ultravioleta y visible, tcnica que sin lugar a dudas es la msempleada y expandida actualmente.

7.1. Determinacin del coeficiente de extincin molar para una sustanciaabsorbente.

Con esta prctica se permite comprobar la ley de Lambert-Beer parauna disolucin y a partir de ella determinar el coeficiente de absorcin molarde la sustancia absorbente, en la longitud de onda en la que se opere.Un ejemplo de sustancia absorbente puede ser una disolucin acuosa deferricianuro potsico, Fe(CN)6 K3, que absorbe a una longitud de onda de420 nm.

Realizacin de la practica:

- Preparar 250 ml de disolucin 510 molar de ferrricianuro potsicomediante pesada (masa molar 329,3).

- A partir de esta disolucin y mediante disoluciones adecuadas, pre-parar 10 ml de las siguientes concentraciones molares:

- 4,510-4 M- 4,010-4 M- 3,510-4 M- 3,010-4 M- 2,510-4 M- 2,010-4 M- 1,510-4 M- 1,010-4 M- 0,510-4 M

- Ahora se miden en el espectrofotmetro las absorbancias de cadauna de estas disoluciones, a la longitud de onda de 420 nm.

- Construir en papel milimetrado una grfica de absorbancias (orde-nadas), frente a concentraciones molares (abcisas). Si se cumple la ley de

Lambert-Beer se debe obtener una lnea recta que pase por el origen decoordenadas.

- De la pendiente de la recta y mediante mnimos cuadrados, determi-nar el coeficiente de extincin molar del ferricianuro potsico, a la longitud deonda indicada.

7.2. Determinacin de la constante de velocidad de reaccin para la oxida-cin de una sustancia.

Vamos a calcular la constante de velocidad, para la reaccin corres-pondiente a la oxidacin del ion ferrocianuro con el peroxidisulfato.

La velocidad de una reaccin se define con la variacin de la concen-tracin de una de las sustancias, reactivo o producto en el tiempo.

Sea la reaccin:

A+B+ C+....= D+E+F+....

La velocidad de la reaccin se puede expresar de la forma:

-[A]/dt ; -[B]/dt ; -[C]/dt ; [D]/dt ; [E]/dt ; [F]/dt ; .....

Las expresiones para los reactivos llevan signo negativo porque susconcentraciones disminuyen con el tiempo, las de los productos llevan signospositivos porque aumentan; as la velocidad es siempre positiva.

Si la reaccin tiene diferentes coeficientes estequiomtricos, la veloci-dad de reaccin, as definida, depende del componente elegido. Si se quie-re que sea independiente de la estequiometria, se debe de tener en cuentalos citados coeficientes. As para la reaccin:

aA+bB+cC+......= dD+eE+fF+ ......

La velocidad en este caso ser:

-1/a*[A]/dt = -1/b*[B]/dt = 1/d*[D]/dt = 1/e*[E]/dt

En este caso la reaccin que se pretende estudiar es la siguiente:

2 Fe (CN)6-4 + S2O8-4 $ 2 Fe (CN)6-3 + 2 SO4-2

Al partir de una concentracin inicial de ferrocianuro a , de peroxidi-sulfato b y la concentracin de ferrocianuro que ha reaccionado es x, la ecua-cin de velocidad quedara de la siguiente forma:

-1/2*d(a-x)/dt = K*(a-x)*(b-x)/2

Cuando consideramos que la concentracin de peroxidisulfato esmucho mayor que la de ferrocianuro (b-x)/2 quedara constante por lo tantola ecuacin de velocidad sera:

dx/dt = K (a-x) 2b = K (a-x)

Integrando la ecuacin:

$ dt/a-x = $ Kdt ; ln a/a-x = K t ; ln(a-x) = lna - Kt

Toda esta cintica se puede seguir de un modo muy sencillo espec-trofotomtricamente, puesto que el ferricianuro, que es uno de los productosabsorbe a 420 nm. Lo que se realiza entonces es medir la absorbancia aintervalos de tiempo determinados. La concentracin de ferricianuro queexiste en cada momento coincide con la que desaparece x, por lo tanto pode-mos escribir:

A = e b x

en este caso b es el espesor de la cubeta y ( el coeficiente de extincin molarque se puede determinar siguiendo las instrucciones de la prctica 7.1.

De esta forma la ecuacin quedara de la siguiente manera:

1/(a-A/eb) = 1/a + K t

La parte experimental consiste en preparar 100 mililitros de una diso-lucin 2*10-3 M de ferrocianuro potsico, debemos saber que cristaliza con 3molculas de agua Fe(CN)6K4 * 3H2O, que la masa molar es 422,41.

Por otro lado se prepara una disolucin de 100 mL 10-2 M de peroxi-disulfato cuya masa molar es 270,33.

Tomamos 25 mL de cada disolucin y se vierte la disolucin de ferro-cianuro sobre la de peroxidisulfato. Pondremos en marcha el cronmetro ymedimos la absorbancia a 420 nm a determinados tiempos:5, 10, 15, 20, 25,30, 35, 40, 50 y 60 minutos.

Representando grficamente 1/(a-A/eb) frente al tiempo se debe obte-ner una recta cuya pendiente es la constante de velocidad. Tenemos quetener en cuenta que la concentracin inicial de ferrocianuro es 10-3 M en vezde 2*10-3 M ya que al principio se mezclaron las dos disoluciones iniciales.

7.3. Determinacin de la constante de disociacin de un cido.

Esta practica la realizaremos con el cido azul de bromofenol median-te la tcnica de especroscopa ultravioleta-visible.

Es posible determinar la constante debido a que el espectro de estasustancia vara con el pH del medio. De esta manera se puede determinar yrelacionar las distintas concentraciones de las distintas especies qumicas deun equilibrio en disociacin.

- A partir de una solucin stock al 0,002% de azul de bromofenol pre-parar una disolucin cida tomando 5 ml de la solucin stock, aadiendo 4ml de cido sulfrico 0,5 molar y 1 ml de agua destilada.

- Por otro lado preparar una solucin alcalina de azul de bromofenol,tomando 5 ml de la solucin stock, aadiendo 0,5 ml de hidrxido sdico 0,5normal y 4,5 ml de agua destilada.

- Se preparan tambin las siguientes soluciones tampn:

100ml de una solucin de cido ctrico 0,1 M

100ml de una solucin de PO4HNa2 0,2 M

A partir de estas soluciones prepararemos las siguientes:

1. 1,5 ml de cido ctrico + 18,5 ml de PO4HNa22. 5,0 ml de cido ctrico + 15,0 ml de PO4HNa23. 6,5 ml de cido ctrico + 13,5 ml de PO4HNa24. 8,0 ml de cido ctrico + 12,0 ml de PO4HNa25. 9,0 ml de cido ctrico + 11,0 ml de PO4HNa26. 10,0 ml de cido ctrico + 10,0 ml de PO4HNa27. 11,0 ml de cido ctrico + 9,0 ml de PO4HNa28. 19,5 ml de cido ctrico + 0,5 ml de PO4HNa2

- Medimos el pH de las disoluciones anteriormente preparadas solu-ciones tampn, solucin cida de azul de bromofenol y solucin alcalina debromofenol.

- En 8 tubos de ensayo se hacen las siguientes disoluciones:Tomaremos 4 ml de cada una de las soluciones tampn, se le aade 5 ml deazul de bromofenol ( solucin stock) y un ml de agua destilada.

- Finalmente se miden las absorbancias de las disoluciones prepara-das a una longitud de onda de 590nm que es la zona del mximo de absor-cin de indicador. Posteriormente se realiza una representacin grfica de laabsorbancia frente al pH.

Donde hay mxima absorbancia, el indicador estar en forma [A-],donde hay mnima absorbancia estar en forma [HA]. Calculando la mediade ambas absortividades podremos extrapolar de la representacin grfica elpH, que en este caso coincide con el pKa. A partir de el cual podemos cal-cular el valor de Ka que es la constante de disociacin del cido.

Segn la formula: pH = pKa + log[A-]/[HA] en condiciones de absorbanciamedia, [A-] = [HA], el pH = pKa.

7.4. Determinacin de la concentracin de los componentes de una muestrabinaria.

Dado que las absorbancias son aditivas, la absorbancia total de unadisolucin a una determina longitud de onda es la suma de las absorbancias

de cada componente de la disolucin .

El objetivo de la prctica es calcular las concentraciones de Ni2+ y elCo2+ , en una disolucin que contiene a los complejos de ambos iones.

Se parte de tres disoluciones stock : 0,2 M de Cl2Co, de Cl2Ni y unadisolucin de HCl 1 M.

Se preparan dos series de disoluciones patrones deCl2Ni y Cl2Co delas siguientes concentraciones, 0,04 -0,05 - 0,06 - 0,08 - 0,10 M Tomando losvolmenes necesarios de las disoluciones estndar y aadiendo de la diso-lucin de HCl 1 M hasta completar 10 ml. Se aade el HCl para asegurar laformacin de un complejo nico de cloro.

Medir la absorbancia de todas las disoluciones a 400 y 525 nm yrepresentar dichas absorbancias frente a las concentraciones correspon-dientes. Como patrn blanco utilizaremos el HCl 1 M.

A partir de las rectas obtenidas calcular grficamente y por ajuste demnimos cuadrados calcularlas absortividades molares para cada compo-nente a las longitudes de onda.

Conociendo las absortividades molares de cada elemento y a cadalongitud de onda podremos calcular las concentraciones de una mezcla pro-blema de ambos componentes al medir la absorbancia.

Para ello nos basamos en la siguiente ecuacin:

A = em b Cm + en b Cn

A = em b Cm + en b Cn

Siendo m Cl2Ni y n Cl2Co. A es la absorbancia a 400 nm y A absor-bancia a 525 nm.

7.5. Clculo del espectro de absorcin de un vegetal.

En primer lugar obtendremos un estracto de pigmentos de una hojaya que son stos los que realizan la absorcin de la luz. Los pigmentos msimportantes son las clorofilas y los carotenos, aunque tambin hay otros

como las xantofilas que ayudan a majorar la captacin.

Para ello se macera en un mortero 0,1 gramos de hoja de alubia,maz, o cualquier otra planta que se desee, con 10 ml de acetona al 80%.Tras permanecer toda una noche en la nevera, el estrato se filtrar a travsde un filtro millipore, enrasando a continuacin hasta 10 ml con acetona al80%.

Para realizar un espectro de absorcin se mide en un espectrofot-metro en todas las longitudes de onda (en pasos de 20 nm) desde 740 a400nm.

Los resultados del espectro de absorcin obtenidos de los pigmentosde las hojas frescas maceradas se representan grficamente relacionandolongitudes de onda con la absorbancia. Se obtienen dos picos mximos deabsorcin uno sobre los 400 nm y el otro a unos 710 nm que correspondencon los carotenos y las clorofilas respectivamente.

Para comparar, se puede realizar un espectro de absorcin de unestracto feofitinizado (tratado con HCl), donde se han destruido las clorofilas(por el intercambio del tomo de magnesio por un protn) y se han formadofeofitinas que son pigmentos pardos.

8. BIBLIOGRAFA.

- Douglas A. Skoog; James J. Leary: Anlisis instrumental. Editorial McGraw-Hill./Interamericana de Espaa, S.A. 1994.

- Santiago Prieto; Silvia Amich; Maria Luisa Salve: Laboratorio clnico.Principios generales. Editorial McGraw-Hill / Interamericana de Espaa S.A.1993.

- Antonio Martn Prez: Mtodos fisicoqumicos de anlisis.

- Benito del Castillo; Oriol Valls: Tcnicas instrumentales de farmacia y tc-nicas de salud.

- Erving: Material instrumental de anlisis qumico.

- Diccionario enciclopdico Labor.

- Departamento de qumica y edafologa, facultad de ciencias, Universidadde Navarra: Prcticas de tcnicas instrumentales.

- Enciclopedia general Argos.

- Luis y. Garca Gonzlez; Manuel J. Garca Sanz; Manuel e. RodrguezGonzlez: Tecnologa General. Editorial Everest, S.A.